CN106596876B - 一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法 - Google Patents

一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，包括以下步骤：将油佐剂疫苗破乳，将破乳后的抗原样品进行定量分析，同时采用凝胶电泳的手段进行纯化，然后将纯化后的抗原样品进行定性检测；所述破乳方法为：将油佐剂疫苗与正丁醇混合，然后加入竞争剂混匀后，离心，取水相溶液超滤、洗滤后，进行真空冷冻干燥或浓缩，即得抗原样品。本发明通过加入竞争剂与表面活性剂竞争抗原结合位点，从而将油佐剂疫苗中的抗原释放至水相中，大大提高了水相中的抗原回收率；通过将破乳后的抗原采用电泳进行分离纯化，提高了抗原的纯度，使抗原中的表面活性剂杂质含量基本为0，从而使纯化后的样品定性检测时重复性良好，提高了检测结果的准确性。

Description

一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法
技术领域
本发明涉及口蹄疫疫苗检测技术领域，具体涉及一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法。
背景技术
现有的疫苗质量标准中规定效力检验必须采用本动物进行检验，由于国家实行100％的强化免疫政策，很难选出易感的检验用动物，而且动物攻毒对实验设施要求高(BSL3级实验室)、耗时长(一个月以上)、资金花费大。如果采用血清中和试验选择易感动物，在技术上难以排除具有细胞免疫的非易感动物，在检验实际中经常发生检验数据不规律的问题，影响检验的准确性。因此口蹄疫疫苗尤其是用于牛的疫苗的质量检测一直困扰着兽药监测部门和相关生产企业。因此需要尽快研制体外检验技术，代替现有的本动物试验。
当前国家对疫苗的检验正逐步过渡到对疫苗内抗原的检测，而当前较为普遍的方法为疫苗破乳后对抗原进行检测，通过将疫苗进行破乳处理，使抗原转移至水相中，继而对其进行后续的检测分析。众所周知，疫苗是由抗原与佐剂以一定比例、按特定程序乳化而成的，然而佐剂却为疫苗破乳检测带来了巨大障碍。
现有技术中主流的样品纯化手段为各类层析，而层析过程所需要的样品量大，不仅会造成约30％～50％的样品损失(在起始样品量低时更易引起扩散作用)，同时对设备依赖性较高。油佐剂疫苗中的抗原浓度为微克级，经过破乳过程后会造成一部分抗原的损失，再使用层析的方式进行纯化，其抗原回收率极低，无法用于检测，若加大疫苗破乳量，则会造成疫苗浪费，且油佐剂中杂质会加速缩短层析填料使用寿命，其经济性不佳。
现有的凝胶电泳纯化技术中，所分离的复杂样品其成分均为生物分子及其同类物，而非其他复杂性质的物质，其中处理的样品成分相比于破乳后水相其样品状态更为简单。现有的蛋白质电泳后胶内酶解技术，其程序较多，步骤复杂，经过操作后其回收率低，微量样品经过处理后所能回收的样品已无法满足检测要求。
目前国内各大厂家都在探索一种实用的方法，能够对经破乳处理的疫苗中抗原进行处理，减少抗原中的杂质对其后续定性定量检测分析的影响。破乳后水相中存在的表面活性剂等物质在业内被公认为最难处理的杂质，业内现有技术并不能对破乳后水相直接进行检测。本发明中针对的样品成分复杂，且疫苗中蛋白浓度低并不适合传统纯化方法，破乳后水相中又含有的表面活性剂等杂质，不仅以游离状态存在，其双亲的性质还会与蛋白相结合，在电场力的作用下会使得杂质与蛋白的结合键打开，在凝胶中实现分离纯化。通过凝胶电泳的方式纯化相比传统方式其所需的样品量将大大减少，并大幅降低对操作人员及仪器设备的依赖性，同时可使与蛋白黏连的杂质与蛋白分离。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，包括以下步骤：将油佐剂疫苗破乳，将破乳后的抗原样品进行定量分析，同时采用凝胶电泳的手段进行纯化，然后将纯化后的抗原样品进行定性检测；
所述破乳方法为：将油佐剂疫苗与正丁醇混合，然后加入竞争剂混匀后，离心，取水相溶液超滤、洗滤后，进行真空冷冻干燥或浓缩，即得抗原样品。
优选地，所述竞争剂为氨基酸及其衍生物中的至少一种。
优选地，所述竞争剂为赖氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和脯氨酸中的一种。
优选地，所述竞争剂的加入量为：每1ml油佐剂疫苗中加入1-40mg竞争剂。更优选1-20mg竞争剂。所述竞争剂的浓度过高，会导致竞争剂饱和析出，影响超滤过程；浓度过低，会导致竞争效果不佳，无法释放足够检测的抗原。
优选地，所述油佐剂疫苗与正丁醇的体积比为9：1～5：5。
更优选地，所述油佐剂疫苗与正丁醇的体积比为1:1。油佐剂疫苗与正丁醇的体积相同，可更好的保证疫苗完全破乳。
优选地，所述离心条件为：在4℃温度下，以3000r/min离心15分钟。
优选地，所述方法还包括将制得的水相抗原样品进行超滤、洗滤，再进行真空冷冻干燥或浓缩的步骤。
优选地，所述超滤采用超滤浓缩管。
优选地，所述洗滤采用5-10倍量的超纯水进行洗滤。
优选地，所述采用凝胶电泳的手段进行纯化的具体步骤为：
S1、将抗原样品进行凝胶电泳，然后进行染色确定目标蛋白条带；
S2、将含目标蛋白的凝胶切成1～2mm3大小的胶块进行脱色处理，然后进行样品处理；
S3、经处理后的胶块再进行超声萃取，所得上清液进行真空冷冻干燥或浓缩，即可。
优选地，所述采用凝胶电泳的手段进行纯化的具体步骤为：
所述采用凝胶电泳的手段进行纯化的具体步骤为：
S1、将抗原样品进行凝胶电泳，然后取其中一个泳道的凝胶进行染色确定目标蛋白条带位置；
S2、将未染色凝胶上与染色的凝胶上目标蛋白条带位置相同的凝胶切成1～2mm3大小的胶块进行样品处理；
S3、经处理后的胶块再进行超声萃取，所得上清液进行真空冷冻干燥或浓缩，即可。
优选地，步骤S1中，所述凝胶电泳采用的条件为：采用丙烯酰胺质量含量为5％的浓缩胶和丙烯酰胺质量含量为12％分离胶，210V电压下处理30-40min。
优选地，步骤S2中，所述消化具体包括以下步骤：
A1、将含目标蛋白的胶块经ddH2O清洗、乙腈震荡脱水后，加入含二硫苏糖醇的NH4HCO3水溶液进行第一次孵育；
A2、经第一次孵育后的胶块用乙腈震荡脱水后，再加入含碘乙酰胺的NH4HCO3水溶液进行第二次孵育；
A3、经第二次孵育后的胶块用乙腈震荡脱水后，加入含胰蛋白酶的NH4HCO3水溶液进行第三次孵育；
所述第一次孵育条件为：56℃下孵育30min；第二次孵育条件为：RT避光孵育20min；第三次孵育条件为：56℃下孵育3h。
优选地，所述超声萃取的温度为0-8℃，超声15min，采用的萃取液为80％ACN/5％FA或80％ACN/0.05％TFA。采用超声萃取，可加速胶内目标成分进入溶剂，促进提取的进行，同时缩短萃取时间。
优选地，所述超声萃取采用的萃取液为乙腈(ACN)质量含量80％、甲酸(FA)质量含量5％的混合溶液；或乙腈质量含量80％、三氟乙酸(TFA)质量含量0.05％的混合溶液。
所述萃取液更优选乙腈质量含量80％、甲酸质量含量5％的混合溶液，FA在质谱中对目标信号的掩盖较低，在进行高精度检测时优选FA。本发明采用超声萃取，利用超声波辐射压强产生的强烈空化应效应、机械振动、扰动效应、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行。
优选地，所述定量分析采用HPLC检测。
优选地，所述定性分析采用LC/MS检测。
本发明的原理是：本发明加入竞争剂与油佐剂中的表面活性剂竞争抗原结合位点，从而将油佐剂疫苗中的抗原更多的释放至水相中，大大提高了抗原回收效率；将破乳后得到的水相抗原样品采用凝胶电泳的纯化手段，可通过分子量大小对样品中残留的表面活性剂等杂质进行分离，且切取未染色的凝胶进行消化能够进一步降低杂质对后续检测的干扰，简化抗原样品处理步骤，可实现高效率纯化。
现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1)本发明通过加入竞争剂与表面活性剂竞争抗原结合位点，从而将油佐剂疫苗中的抗原释放至水相中，大大提高了水相中的抗原回收率。
2)本发明通过将破乳后的抗原采用电泳进行分离纯化，提高了抗原的纯度，使抗原中的表面活性剂杂质含量基本为0，从而使纯化后的样品检测重复性良好，提高了检测结果的准确性。
3)常规凝胶电泳后均会涉及到染色及脱色步骤，在后续处理步骤中每一步均会有蛋白损失，若进行脱色步骤，不仅会延长处理时间，且脱色剂在脱色的时也会造成蛋白的损失，同时脱色剂的残留也会影响到后续的检测过程，更会对检测仪器造成污染，增加设备维护及使用成本。而本发明将凝胶电泳的方法用于破乳后的抗原纯化，且在本发明中仅将染色样品泳道作为标准，对需后续处理的样品泳道不进行染色，对未染色的胶进行处理，直接跳过脱色步骤，能够有效避免常规电泳后续处理的上述问题发生，提高样品回收率的同时缩短了处理时间。
4)本发明经电泳后的抗原，通过三次孵育，第一次孵育是为了还原胶内抗原多肽，将抗原内半胱氨酸间二硫键还原为巯基，即还原半胱氨酸。第二次孵育是为了将第一次孵育后还原的半胱氨酸和组氨酸进行烷基化保护，使得抗原保持变性状态，以便于后续酶解及检测，第三次孵育为了将胶内抗原进行酶解。三次孵育后可提高抗原的酶解效率，达到极大降低检测所需起始样品量的目的。
5)采用本发明的纯化手段制备的样品进行质谱检测时，可显著降低图谱信噪比，突出目标分子。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1制备的样品的质谱扫描图谱；
图2为实施例4制备的样品的质谱扫描图谱；
图3为对比例1制备的水相抗原样品的HPLC检测图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供了一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，包括以下步骤：
1)取10ml待检疫苗(市售口蹄疫合成肽疫苗，浓度为75ug/ml)与正丁醇以体积比1:1混合，加入50mg组氨酸，震荡混匀，在4℃条件下，以3000r/min离心15分钟，离心后用10ml注射器小心抽取下层水相，即得水相抗原样品。
2)取0.1ml步骤1制得的水相抗原样品，采用HPLC检测样品的浓度为69.3ug/ml，破乳效率为92.4％。
3)将水相抗原样品进行精确定性分析
3.1样品处理：将步骤1获得的水相抗原样品经超滤、洗滤，然后冻干后得到的蛋白抗原粗样加入蛋白上样缓冲液中，采用95℃加热2min，进行凝胶电泳，将样品平均上于所有空白泳道中(采用丙烯酰胺质量含量为5％的浓缩胶和丙烯酰胺质量含量为12％分离胶)，210V，30～40min，切取其中一个蛋白泳道进行银染确定目标蛋白的条带位置，切取未染色凝胶上与经银染后样品中目标蛋白条带位置相同的凝胶进行样品消化。
3.2将切取的胶块切成1～2mm3大小的胶块置于EP管中，加入400ul ACN震荡脱水3min。
3.3弃去液体，室温干燥，加入溶有DTT的NH4HCO3溶液，56℃孵育30min。所述溶有DTT的NH4HCO3溶液中，DTT的浓度为0.01M。
3.4自然冷却后弃去液体，加入400ul ACN震荡脱水3min。
3.5弃去液体，自然风干，加入溶有碘乙酰胺的NH4HCO3溶液适量，RT避光孵育20min。所述溶有碘乙酰胺的NH4HCO3溶液中，碘乙酰胺的浓度为0.1M。
3.6弃去液体，加入400ul ACN震荡脱水3min。
3.7弃去液体，室温干燥，加入Trypsin浓度为12.5ng/ul的NH4HCO3溶液，RT吸涨。
3.8弃去液体，加入50mM NH4HCO3适量没过胶块，56℃孵育3h。
3.9移去溶液置于新EP管中，加入200ul 80％ACN和5％FA的混合溶液，冰水浴超声15min，重复3次，取上清置于新EP管中。
3.10将萃取后的水相真空冷冻干燥，每管以100μl 0.1％TFA溶液溶解真空冷冻干燥后粉末，进行LC/MS检测。
本实施例制得的粉末其质谱图如图1所示，样品中理论分子量之一为611AMU±0.1％，从该图中可得出，图中杂质丰度已经被降到极低的程度，而目标分子已成为图谱主峰，色谱检测中样品纯度达到90％以上。图1为经过本实施例所述步骤处理后所得样品的质谱扫描图谱，与样品理论分子量相比较，其中611.03AMU为本次实验中样品目标分子量之一。图中可见目标分子量丰度高，图谱信噪比低。
实施例2
本实施例提供了一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，包括以下步骤：
1)取10ml待检疫苗(市售口蹄疫合成肽疫苗，浓度为75ug/ml)与正丁醇以体积比1:1混合，加入10mg苯丙氨酸，震荡混匀，在4℃条件下，以3000r/min离心15分钟，离心后用10ml注射器小心抽取下层水相，即得水相抗原样品。
2)取0.1ml步骤1制得的水相抗原样品，采用HPLC检测样品的浓度为65.7ug/ml，破乳效率为87.6％。
3)将水相抗原样品进行精确定性分析
3.1样品处理：将口蹄疫疫苗破乳后经超滤、洗滤，然后冻干后得到的蛋白抗原样品(抗原纯度为8％)，取蛋白抗原样品加入蛋白上样缓冲液中，采用95℃加热2min，进行凝胶电泳，将样品平均上于所有空白泳道中(采用丙烯酰胺质量含量为5％的浓缩胶和丙烯酰胺质量含量为12％分离胶)，210V，30～40min，切取其中一个蛋白泳道进行考染确定目标蛋白的条带位置，切取未染色凝胶上与经考染后样品中目标蛋白条带位置相同的凝胶进行样品消化。
3.2将切取的胶块切成1～2mm3大小的胶块置于EP管中，加入400ul ACN震荡脱水3min。
3.3弃去液体，室温干燥，加入溶有DTT的NH4HCO3溶液，56℃孵育30min。所述溶有DTT的NH4HCO3溶液中，DTT的浓度为0.01M。
3.4自然冷却后弃去液体，加入400ul ACN震荡脱水3min。
3.5弃去液体，自然风干，加入溶有碘乙酰胺的NH4HCO3溶液适量，RT避光孵育20min。所述溶有碘乙酰胺的NH4HCO3溶液中，碘乙酰胺的浓度为0.1M。
3.6弃去液体，加入400ul ACN震荡脱水3min。
3.7弃去液体，室温干燥，加入Trypsin浓度为12.5ng/ul的NH4HCO3溶液，RT吸涨。
3.8弃去液体，加入50mM NH4HCO3适量没过胶块，56℃孵育3h。
3.9移去溶液置于新EP管中，加入200ul 80％ACN和0.05％TFA的混合溶液，8℃水浴超声15min，重复3次，取上清置于新EP管中。
3.10将萃取后的水相真空冷冻干燥，每管以100μl 0.1％TFA溶液溶解真空冷冻干燥后粉末，进行LC/MS检测。
本实施例制得的粉末纯度达85％，所得样品的质谱扫描图谱的信噪比低，LC/MS检测结果为检到目标分子量为611.22AMU，与理论分子量相符。
实施例3
本实施例提供了一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，包括以下步骤：
1)取10ml待检疫苗(市售口蹄疫合成肽疫苗，浓度为75ug/ml)与正丁醇以体积比1:1混合，每管加入200mg脯氨酸，震荡混匀，在4℃条件下，以3000r/min离心15分钟，离心后用10ml注射器小心抽取下层水相，即得水相抗原样品。
2)取0.1ml步骤1制得的水相抗原样品，采用HPLC检测样品的浓度为71.1ug/ml，破乳效率为94.8％。
3)将水相抗原样品进行精确定性分析，其方法与实施例1完全相同。采用LC/MS检测方法分析结果为检到目标分子量为611.03AMU，与理论分子量相符。
实施例4
本对比例提供了一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，将实施例1破乳后的水相抗原样品采用以下步骤进行纯化和定性分析：
1)样品染色：将口蹄疫疫苗破乳后经超滤、洗滤，然后冻干后得到的蛋白抗原样品(抗原纯度为8％)加入蛋白上样缓冲液，95℃加热2min，凝胶电泳(5％浓缩胶，12％分离胶)，210V，30～40min，银染。
2)染色后的样品消化：将凝胶置于在超净工作台培养皿中用75％乙醇清洗，再用超纯水清洗。
3)在超净工作台中用手术刀片切取目标蛋白条带，并将其切成1～2mm3大小的胶块，置于EP管中。
4)在EP管中加入300ul脱色液，混匀静置，直至棕色完全消失；所述脱色液配制如下：100mmol/L Na2S2O3和30mmol/L K3Fe(CN)6溶液按照体积比1∶1混合而成。
5)弃去液体，加入400ul ddH2O清洗胶块，直至胶块变为透明。
6)弃去液体，加入400ul ACN震荡脱水3min。
7)弃去液体，室温干燥，加入DTT浓度为0.01M的NH4HCO3溶液适量，56℃孵育30min。
8)自然冷却后弃去液体，加入400ul ACN震荡脱水3min。
9)弃去液体，自然风干，加入碘乙酰胺浓度为0.1M的NH4HCO3溶液适量，RT避光孵育20min。
10)弃去液体，加入400ul ACN震荡脱水3min。
11)弃去液体，室温干燥，加入Trypsin浓度为12.5ng/ul的NH4HCO3溶液，RT吸涨。
12)弃去液体，加入50mM NH4HCO3适量没过胶块，56℃孵育3h。
13)移去溶液置于新EP管中，加入200ul 80％ACN和0.05％TFA的混合溶液，冰水浴超声15min，重复3次，取上清置于新EP管中。
14)将萃取后的水相真空冷冻干燥。
15)每管以100μl 0.1％TFA溶液溶解真空冷冻干燥后粉末，然后进行LC/MS检测。
采用本实施例的方法所得粉末的纯度为70％左右，图2为经过本实施例所述步骤处理后所得样品的质谱扫描图谱，LC/MS检测结果表明虽然能检测到与理论分子量相符的目标分子量，但相比于图1，其信噪比更高，且由其信号强度低于图1一个数量级。
对比例1
本对比例提供了一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于：本对比例中不加入竞争剂。
本对比例制得的水相抗原样品经HPLC检测其图谱如图3所示，从该图中可看出，在抗原理论保留时间内并未检出抗原，说明样品中含有的抗原量极低，抗原回收率基本为零，其破乳效率基本为零。不再进行后续的纯化和定性检测。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将油佐剂疫苗破乳，将破乳后的抗原样品进行定量分析，同时采用凝胶电泳的手段进行纯化，然后将纯化后的抗原样品进行定性检测；
所述破乳方法为：将油佐剂疫苗与正丁醇混合，然后加入竞争剂混匀后，离心，取水相溶液超滤、洗滤后，进行真空冷冻干燥或浓缩，即得抗原样品。
2.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，其特征在于，所述竞争剂为氨基酸及其衍生物中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，其特征在于，所述竞争剂为赖氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和脯氨酸中的一种。
4.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，其特征在于，所述竞争剂的加入量为：每1ml油佐剂疫苗中加入1-40mg竞争剂。
5.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，其特征在于，所述采用凝胶电泳的手段进行纯化的具体步骤为：
S1、将抗原样品进行凝胶电泳，然后进行染色确定目标蛋白条带；
S2、将含目标蛋白的凝胶切成1～2mm3大小的胶块进行脱色处理，然后进行样品处理；
S3、经处理后的胶块再进行超声萃取，所得上清液进行真空冷冻干燥或浓缩，即可。
6.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，其特征在于，所述采用凝胶电泳的手段进行纯化的具体步骤为：
S1、将抗原样品进行凝胶电泳，然后取其中一个泳道的凝胶进行染色确定目标蛋白条带位置；
S2、将未染色凝胶上与染色的凝胶上目标蛋白条带位置相同的凝胶切成1～2mm3大小的胶块进行样品处理；
S3、经处理后的胶块再进行超声萃取，所得上清液进行真空冷冻干燥或浓缩，即可。
7.根据权利要求5或6所述的油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述凝胶电泳采用的条件为：采用丙烯酰胺质量含量为5％的浓缩胶和丙烯酰胺质量含量为12％分离胶，210V电压下处理30-40min。
8.根据权利要求5或6所述的油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述样品处理具体包括以下步骤：
A1、将含目标蛋白的胶块经ddH2O清洗、乙腈震荡脱水后，加入含二硫苏糖醇的NH4HCO3水溶液进行第一次孵育；
A2、经第一次孵育后的胶块用乙腈震荡脱水后，再加入含碘乙酰胺的NH4HCO3水溶液进行第二次孵育；
A3、经第二次孵育后的胶块用乙腈震荡脱水后，加入含胰蛋白酶的NH4HCO3水溶液进行第三次孵育；
所述第一次孵育条件为：56℃下孵育30min；第二次孵育条件为：室温避光孵育20min；第三次孵育条件为：56℃下孵育3h。
9.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，其特征在于，所述定量分析采用HPLC检测。
10.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，其特征在于，所述定性分析采用LC/MS检测。
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