CN113311052A - 一种基于凝胶电泳法评估口蹄疫疫苗中有效抗原含量及纯度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于凝胶电泳法评估口蹄疫疫苗中有效抗原含量及纯度的方法，以146S抗原的主要组成成分VP1、VP2和VP3为评价对象，开发出一种操作简单、重复性好、快速、准确，在多数实验室均可以实施的口蹄疫灭活疫苗有效抗原含量的评价方法。该评价方法所用设备在普通实验室一般均有配置，从根本上破除了对昂贵仪器设备，如超高速离心机、液相色谱仪和毛细管电泳仪的依赖；同时，所用到的试剂为常用试剂，均可以购买到商品化的产品，保证了该方法在不同实验室实施时均具有良好的重复性。与现有方法相比，由于不需要制备标准抗原及多克隆抗体的血清，极大缩短了整个评价的时间，通常可以在6‑8小时内完成目的疫苗的评价。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于凝胶电泳法评估口蹄疫疫苗中有效抗原含量及纯度的方法，属于分子检测技术领域。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMD virus，FMDV)感染引起的一种急性、烈性传染病，主要发病动物为猪、牛、羊等偶蹄动物，易感动物多达70余种。该病传播速度极快，发病后会严重影响动物的生产性能，同时也严重制约了动物和畜产品的正常国际贸易，世界动物卫生组织将其列为A类动物疫病，我国将其划为一类动物传染病。
FMDV属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，病毒粒子无囊膜，主要由结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成，其中VP1、VP2和VP3位于病毒粒子表面，VP4位于病毒衣壳的内部。VP1蛋白由213～221个氨基酸组成，与病毒吸附、入侵、保护性免疫应答和血清特异性有关。VP2由219个氨基酸组成在病毒粒子稳定和成熟过程中起主要作用。VP3由219～221个氨基酸组成，主要维持衣壳稳定，具有重要的构象性表位。VP4大约由70个氨基酸组成，具有增强内涵体膜通透性，释放病毒RNA的功能。因此，结构蛋白负责组装病毒衣壳，决定抗原特异性，是病毒最重要的抗原成份。纯化的病毒粒子经裂解后，通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色，理想情况下可以清楚看到VP1-VP33个条带，但多数情况下因为蛋白分子量的重叠，会在分子量为25-37KD区间内出现特异性的双条带。
我国采取以预防为主的综合防控策略防控口蹄疫，对口蹄疫易感动物接种灭活疫苗是最常用的免疫措施，使用的灭活疫苗以双向油乳剂疫苗为主。所述的灭活疫苗是口蹄疫田间毒株经病毒培养系统大量扩增、灭活，然后通过纯化获得高纯度的病毒粒子，再和相应佐剂乳化复配而成，为控制我国口蹄疫的大流行起到了重要作用。灭活疫苗中的有效抗原含量及纯度是关键性的技术指标之一，很大程度上决定了疫苗的效力。当前疫苗生产企业主要将146S的含量作为疫苗生产的质控指标之一，146S指的是通过蔗糖密度梯度离心法纯化病毒粒子时对应的沉降系数。当前，已开发出了多种基于146S的疫苗质量评价体系，但在应用上均存在一定制约因素。
经检索，申请号CN201510025994.7的文件公开一种口蹄疫疫苗抗原146S测定方法，需用到超高速离心机和高效液相色谱仪，这虽然可以提供准确的定量数据，但是用到的昂贵设备却不是普通实验室所能具备的，限制了该方法的应用。申请号为CN201510878606.X的文件公开一种确定口蹄疫疫苗组份及估计抗原含量的方法，同样需要超高速离心机，并且需要制备针对146S抗原的兔多抗血清，操作时间长，且不易进行标准化。因此，提供一种便捷的口蹄疫疫苗有效抗原含量和纯度的评价方法对于广大养殖企业来说具有重要的临床意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种基于凝胶电泳法评估口蹄疫疫苗中有效抗原含量及纯度的方法，以146S抗原的主要组成成分VP1、VP2和VP3为评价对象，开发出一种操作简单、重复性好、快速、准确，在多数实验室均可以实施的口蹄疫灭活疫苗有效抗原含量的评价方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种基于凝胶电泳法评估口蹄疫疫苗中有效抗原含量及纯度的方法，包括以下步骤：
(1)待测口蹄疫疫苗的破乳及抗原相的分离
在离心管中加入待测疫苗液和正丁醇，充分混匀后，在20-25℃条件下，于多功能试管旋转摇床中以30转/分的速度破乳1h；之后在4℃下静置1h，此时液体分为上、中、下三层，下层水相即为分离出的抗原相，移入新的离心管，备用；
(2)抗原相的浓缩
取步骤(1)获得的抗原相吸取4mL，加入Amicon Ultra-10K的蛋白浓缩管中，在4℃下以5000g的离心力进行离心，待体积浓缩为400μL后停止离心；用磷酸盐缓冲液调整浓缩样品的体积为0.5mL，得到浓缩抗原液，于-40℃或-80℃保存，备用；
(3)蛋白样品的制备
取步骤(2)获得的浓缩抗原液80μL，加入离心管中，然后加入20μL SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5x)，于100℃下加热5min，得到蛋白样品，备用；
(4)SDS-PAGE电泳分析
对步骤(3)制备的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析，其中变性蛋白预制胶的质量分数为12％或15％，蛋白样品的上样量为20μL，蛋白Marker的分子量范围为10-180KDa；得到蛋白胶，备用；
(5)考马斯亮蓝染色、脱色
将步骤(4)获得的蛋白胶浸入考马斯亮蓝染色液染色0.5～1h，然后浸入考马斯亮蓝脱色液脱色1.5～2h，期间更换考马斯亮蓝脱色液2-3次；
(6)根据目的条带情况判定待测口蹄疫疫苗有效抗原的含量及纯度。
所述待测疫苗液与正丁醇的体积比为9:1。
电泳的程序为：先以80V电压电泳10～15min，待样品进入分离胶后，再将电压调至120V电泳40～60min，当溴酚蓝指示剂达到蛋白胶的底部时，即停止电泳。
1L考马斯亮蓝染色液的配方包括：甲醇，450mL；蒸馏水，450mL；冰乙酸，100mL；考马斯亮蓝，2.5g。
1L考马斯亮蓝脱色液的配方包括：乙醇，50mL；冰乙酸，100mL；蒸馏水，850mL。
目的条带中有效抗原组分VP1、VP2和VP3的分子量在25-37KDa之间，显示为2条蛋白条带；其它位置的条带均为杂蛋白的条带，为病毒增殖过程中所用细胞的蛋白组分。
所述的方法在口蹄疫疫苗初步评价中的应用。
本发明有益效果：
本发明评价方法所用到的设备在普通实验室一般均有配置，从根本上破除了对昂贵仪器设备(如超高速离心机、液相色谱仪和毛细管电泳仪)的依赖；同时，所用到的试剂为常用试剂，均可以购买到商品化的产品，保证了该方法在不同实验室实施时均具有良好的重复性。与现有方法相比，由于不需要制备标准抗原及多克隆抗体的血清，极大缩短了整个评价的时间，通常可以在6-8小时内完成目的疫苗的评价。
本发明所提供的评价方法，可以为养殖企业在进行疫苗选购时提供参考，通过对疫苗有效抗原含量和纯度的评估，可以在疫苗使用前对疫苗质量进行初步评估，从而避免选择到不合格的产品。
本方法操作简单、成本低、重复性好，可在绝大多数实验室进行实施，具有良好的应用场景。
附图说明
图1为6种商业化口蹄疫疫苗的电泳图谱。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
一种基于凝胶电泳法评估口蹄疫疫苗中有效抗原含量及纯度的方法，包括以下步骤：
(1)对待测口蹄疫疫苗进行破乳，分离出抗原相。
取9mL待测疫苗液加入15mL的离心管中，然后再加入1mL正丁醇，充分混匀后，室温(20-25℃)条件下，置于多功能试管旋转摇床，以30转/分的速度作用1h进行破乳；然后将离心管放入4℃冰箱，静置1h，可见液体分为上、中、下三层，下层水相即为分离出的抗原相，将抗原相移入新的离心管，备用。
(2)对抗原进行约10倍浓缩。
取步骤(1)获得的抗原相4mL，加入Amicon Ultra-10K的蛋白浓缩管中，在4℃下，以5000g的离心力进行离心，期间进行观察，待体积浓缩至400μL左右时(10倍浓缩)，即可停止离心。用磷酸盐缓冲液(PBS)调整浓缩样品的体积为0.5mL，得到浓缩抗原液，保存到-40℃或-80℃冰箱，备用。
(3)蛋白样品制备。
取步骤(2)获得的浓缩抗原液80μL，加入1.5mL离心管中，然后加入20μL SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5x)，于100℃下加热作用5min，得到蛋白样品，备用。
(4)SDS-PAGE电泳。
对步骤(3)制备的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析。
其中变性蛋白预制胶的质量分数为12％或15％，蛋白样品的上样量为20μL，蛋白Marker的分子量范围为10-180KDa；电泳按下列程序进行：80V电压电泳约10～15min，待样品进入分离胶后，再将电压调至120V电泳40～60min，期间进行观察，溴酚蓝指示剂达到蛋白胶的底部时即可停止，得到蛋白胶，备用。
(5)考马斯亮蓝染色、脱色。
将步骤(4)获得的蛋白胶浸入考马斯亮蓝染色液染色约1小时，然后在浸入脱色液脱色约2小时，期间更换脱色液2-3次。
考马斯亮蓝染色液的配方(1L)如下：甲醇，450mL；蒸馏水，450mL；冰乙酸，100mL；考马斯亮蓝，2.5g。
考马斯亮蓝脱色液的配方(1L)如下：乙醇，50mL；冰乙酸，100mL；蒸馏水，850mL。
(6)根据目的条带情况判定待测口蹄疫疫苗有效抗原的含量及纯度。
其中，有效抗原组分VP1、VP2和VP3的分子量在25-37KDa之间，通常显示为2条蛋白条带；其它位置的条带均为杂蛋白的条带，通常为病毒增殖过程中所用细胞的蛋白组分。
应用例
选用我国口蹄疫病毒灭活疫苗主要生产商的产品，用于本发明实施例1所建立方法的有效性分析，其中待测口蹄疫疫苗购自以下公司：中普生物制药有限公司、金宇保灵生物药品有限公司、中农威特生物科技股份有限公司、天康生物、内蒙古必威安泰生物科技有限公司，对待测口蹄疫疫苗进行编号，分别标记为待测疫苗样品1-6，结果如图1所示。6个泳道来自上述5家公司的产品，其中一家公司选了两个不同的生产批号。
由图1可知，有效抗原组分VP1、VP2和VP3分子量在25-37KDa之间，VP2和VP3的蛋白分子量基本一致，故条带上出现重叠，在25-37KDa之间出现特征性的2条蛋白条带；而其它位置的条带均为杂蛋白的条带，通常为病毒增殖过程中所用细胞的蛋白组分。分析可知，待测疫苗样品1和样品2有效抗原蛋白含量较高，且杂蛋白较少；样品3、4、5和6的有效抗原含量较低，其杂蛋白含量相对较多。
Claims (7)
1.一种基于凝胶电泳法评估口蹄疫疫苗中有效抗原含量及纯度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)待测口蹄疫疫苗的破乳及抗原相的分离
在离心管中加入待测疫苗液和正丁醇，充分混匀后，在20-25℃条件下，于多功能试管旋转摇床中以30转/分的速度破乳1h；之后在4℃下静置1h，此时液体分为上、中、下三层，下层水相即为分离出的抗原相，移入新的离心管，备用；
(2)抗原相的浓缩
取步骤(1)获得的抗原相吸取4mL，加入Amicon Ultra-10K的蛋白浓缩管中，在4℃下以5000g的离心力进行离心，待体积浓缩为400μL后停止离心；用磷酸盐缓冲液调整浓缩样品的体积为0.5mL，得到浓缩抗原液，于-40℃或-80℃保存，备用；
(3)蛋白样品的制备
取步骤(2)获得的浓缩抗原液80μL，加入离心管中，然后加入20μL SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5x)，于100℃下加热5min，得到蛋白样品，备用；
(4)SDS-PAGE电泳分析
对步骤(3)制备的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析，其中变性蛋白预制胶的质量分数为12％或15％，蛋白样品的上样量为20μL，蛋白Marker的分子量范围为10-180KDa；得到蛋白胶，备用；
(5)考马斯亮蓝染色、脱色
将步骤(4)获得的蛋白胶浸入考马斯亮蓝染色液染色0.5～1h，然后浸入考马斯亮蓝脱色液脱色1.5～2h，期间更换考马斯亮蓝脱色液2-3次；
(6)根据目的条带情况判定待测口蹄疫疫苗有效抗原的含量及纯度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测疫苗液与正丁醇的体积比为9:1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，电泳的程序为：先以80V电压电泳10～15min，待样品进入分离胶后，再将电压调至120V电泳40～60min，当溴酚蓝指示剂达到蛋白胶的底部时，即停止电泳。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，1L考马斯亮蓝染色液的配方包括：甲醇，450mL；蒸馏水，450mL；冰乙酸，100mL；考马斯亮蓝，2.5g。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，1L考马斯亮蓝脱色液的配方包括：乙醇，50mL；冰乙酸，100mL；蒸馏水，850mL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，目的条带中有效抗原组分VP1、VP2和VP3的分子量在25-37KDa之间，显示为2条蛋白条带；其它位置的条带均为杂蛋白的条带，为病毒增殖过程中所用细胞的蛋白组分。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法在口蹄疫疫苗初步评价中的应用。
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