CN103105388A - 一种用于水质生物毒性快速检测的发光菌试纸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物分析检测技术领域，具体是一种能够快速现场检测水体生物毒性的发光菌试纸及其制备方法。该种发光菌试纸以普通试纸材料为基底，通过水凝胶包裹发光菌，在紫外灯的照射下由液态凝固为固态，从而将发光菌固定在试纸上。将试纸投入待测水体，通过试纸上发光菌的初始发光量和15分钟（或30分钟）后发光量对比得出抑光率，从而实现对该水体生物毒性的检测。本发明具有快速、高效、便捷、低价等特点，也具有高灵敏度和对外界条件变化的高耐受性，适用于各种水环境的毒性快速现场检测。
Description
技术领域
本发明属于生物分析检测技术领域，具体涉及一种能够快速现场检测水体生物毒性的发光菌试纸，并提供了该试纸的制备方法。
背景技术
随着工业化程度的升高以及各类化工产品污染水体事件的突发，各种化学物质数量猛增，给人类生存环境造成很大影响，迫切需要对日益增多的环境污染物进行急性毒性鉴定。传统的化学分析方法能准确定量分析污染物中主要成分的含量，但不能直接而又及时地反映各种有毒物质对环境和生物的综合影响。传统的动物毒性实验以哺乳类、鱼类等为受试对象，虽然能反映毒物对生物的直接影响，但方法繁琐，实验周期长，不满足水质急性毒性检测的需求。针对传统毒性检测方法的不足，目前国内外研究者建立了各种各样的生物实验方法，包括微生物、藻、底栖软体动物、浮游生物、鱼等，用来监测环境污染物对水生生物的毒性，其中发光菌因其独特的生理特性，与现代光电检测手段完美匹配的特点而倍受关注。
发光菌最特别的生理代谢特征是在其生长的一定时间内，能够发射可见光，简单来说，细菌发光可概括如下：
细菌身体内可以合成一种酶，该酶可以催化还原型的黄素单核苷酸（FMNH2）和长链脂肪醛（RCHO，至少含8个C）并在O2的参与下发生氧化反应而放出光子。该氧化反应并不放热，所以发光菌发出的是典型的“冷”光。
发光波长在490nm左右。这种发光过程极易受到外界条件的影响，凡是干扰或损害细菌呼吸或生理过程的任何因素都能使细菌发光强度发生变化。当有毒有害物质与发光菌接触时，发光强度立即改变，并随着毒物浓度的增加而发光减弱。利用发光菌遇到毒性物质即减弱发光这一特性，可以快速而又相对准确地测试出水体的生物急性毒性。
水凝胶（hydrogels）是一种亲水性但不溶于水的高分子聚合物,是一类集吸水、保水、缓释于一体并且发展迅速的功能高分子材料。水凝胶具有独特的吸水、保水及仿生特性，因而被广泛应用于工业、农业、医药和生物工程材料领域。水凝胶还具有优良生物相容性，亲水性的水凝胶与被固定的酶或细胞的相互作用极弱，固定在水凝胶中的生物分子的活性能够长时间保持。目前水凝胶已成功应用于固定哺乳动物细胞、DNA杂交分析等等。
但是，目前还未见将发光细菌固定在水凝胶中，用于快速水体生物毒性的的报道。
将发光细菌固定在水凝胶中，使得整个检测过程更为简便，测量结果更为稳定，由于细菌被固定在水凝胶中，因而对外界的条件变化适应性更好。此外由于试纸的便携性，检测时可将试纸直接投入待测水样中，待反应时间结束后将试纸拿出然后进行发光度检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够快速现场检测水体生物毒性的发光菌试纸。该试纸同现行的检测技术相比具有稳定、低价、便携和灵敏性更高的特点。
本发明提供的能够快速现场检测水体生物毒性的发光菌试纸，以普通试纸材料为基底，通过水凝胶包裹发光菌，在紫外灯的照射下凝固为固态，从而将发光菌固定在试纸上而得到。该发光菌试纸放于-20oC冰箱保存，待用。
本发明提供的发光菌试纸的制备方法，具体步骤如下：
（a）准备试纸基底，裁剪成需要的尺寸；
（b）将发光菌菌粉和水凝胶按混合；
（c）将发光菌菌粉和水凝胶的混合物滴加于试纸基底上；
（d）将试纸置于紫外灯下照射固定。
本发明提供的发光菌试纸的用于检测的方法如下：将发光菌试纸放入2%的氯化钠溶液进行复苏，（约13--18分钟）复苏完毕后，将发光菌试纸投入待测水体，检测发光菌试纸上发光菌的初始发光量和15分钟（或30分钟）后的发光量，对比得出抑光率，从而实现对该水体生物毒性的检测。
本发明中，用于凝固试纸上水凝胶和发光菌的紫外灯，可选用一般市面上售卖的便携式手提紫外灯即可。用于检测发光菌试纸上发光菌的发光量的装置选用杭州绿洁公司的光子探测仪。
本发明中，水凝胶可选用聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA），并用2-羟基-2-甲基苯基苯酮（HMPP）作为光引发剂 ，其中光引发剂为水凝胶体积的4%-6%，优选5%；菌种：费氏弧菌冻干粉（Vibrio fischeri），市售的一般费氏弧菌冻干粉都可以满足实验要求。该实验在一般常温条件下即可进行。
本发明中，发光菌菌粉和水凝胶的混合物的用量比例范围为：3~4mg菌粉和100uL的水凝胶混合。
本发明中，紫外灯下照射固定时间为8—15秒。
本发明提供的发光菌试纸，大小可为10cm×1cm。
本方明中，抑光率测量步骤和数据处理方法参考ISO11348。具体实验参数和试纸制备见下文具体实施方式。
具体实施方式
试纸准备。将发光菌冻干粉溶于水凝胶（95%的PEGDA和5%的HMPP）中，按一次检测用量溶于100μL水凝胶进行溶解（例：如传统实验中该管冻干粉用于三次测试，则在制备试纸时与300μL水凝胶混合）。取100μL水凝胶和细菌冻干粉混合物滴于试纸上，面积大约为1×1cm2，将试纸放于紫外灯下照射10s左右，水凝胶即凝固，置于-20oC的冰箱内保存待用。
菌粉复苏。需要进行水质生物毒性检测时，将固定有水凝胶的试纸放入2%的NaCl溶液（至少1mL）中在室温条件下先进行菌粉复苏，15分钟即可复苏完毕，此时菌粉已溶解，发光菌也恢复活性并被固定于水凝胶中。
生物毒性检测。将复苏后的发光菌试纸放入待测水样中，立即读取发光量，然后等待15分钟（或30分钟），待发光菌与水中毒性物质反应完毕，再次读取发光量，然后根据ISO11348提供的方法进行抑光率和EC50值的计算，从而评估出该水样的生物毒性。
为了佐证该新型试纸的准确性和可靠性，我们利用三种毒性物质水样（硫酸锌、重铬酸钾以及3,5-二氯苯酚）以及三种实际样品（地表水、自来水厂进厂水和污水厂进厂水）分别进行了传统发光菌和发光菌试纸毒性测试。结果证明，两种方法得出的结果相近，抑光率和水样毒性之间的关系曲线趋势一致。同时，在该试纸的条件优化实验中，由于发光菌被固定在固态水凝胶中，因此受外界液体环境的渗透压影响较小，在实际操作中，可以省去调节水样渗透压的步骤。实验结果更为稳定且更具重现性。因此可以认定该方法可靠可行，具有实际应用价值。
Claims (6)
1. 一种能够快速现场检测水体生物毒性的发光菌试纸，其特征在于以普通试纸材料为基底，通过水凝胶包裹发光菌，在紫外灯的照射下凝固为固态，从而将发光菌固定在试纸上而得到。
2. 如权利要求1所述的发光菌试纸的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
（a）准备试纸基底，裁剪成需要的尺寸；
（b）将发光菌菌粉和水凝胶按混合；
（c）将发光菌菌粉和水凝胶的混合物滴加于试纸基底上；
（d）将试纸置于紫外灯下照射固定。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述水凝胶选用聚乙二醇二丙烯酸酯，并用2-羟基-2-甲基苯基苯酮作为光引发剂 ，其中光引发剂为水凝胶体积的4%-6%。
4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发光菌菌粉和水凝胶的混合物的用量比例范围为：3~4mg菌粉对应和100uL的水凝胶混合。
5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述紫外灯下照射固定时间为8—15秒。
6. 如权利要求1所述发光菌试纸的用于检测的方法如下：将发光菌试纸放入2%的氯化钠溶液进行复苏，复苏完毕后，将发光菌试纸投入待测水体，检测发光菌试纸上发光菌的初始发光量和15分钟或30分钟后的发光量，对比得出抑光率，从而实现对该水体生物毒性的检测。
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