CN101865850A - 利用atp生物发光进行水环境急性毒性检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用ATP生物发光进行水环境急性毒性检测的方法，向反应试管中依次先后加入ATP反应试剂、虫荧光素酶、ATP标准品、待检测水体，置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为30s，以此为实验组；将标准品替换为蒸馏水，以此为对照组；实验组和对照组均重复操作检测三次；通过计算相对发光率K判断水体的毒性。本发明方法具有测试效果稳定、灵敏的特点，测试时间最多不超过3分钟，可达到发光细菌测试的效果，对有机有毒物质的响应比发光细菌还要灵敏。本发明采用的是便携式ATP手持仪，使用直流电源，因此便于携带适合现场测试。
Description
技术领域
本发明涉及环境保护和食品安全等技术领域，具体地说涉及利用ATP发光的变化进行水环境有毒有害物质急性毒性检测的方法。
背景技术
近年来，突发性环境污染事故呈增加趋势，这直接威胁了国家的生态安全和人体健康，而要解决此类问题则需要从毒性监测的角度对水环境质量进行定量的评价。
目前控制水体中毒性的方法主要是对特定的有毒化学物质进行单个指标控制，通过对控制项目检测结果的判定来推断待检样品中是否有毒性。但对水体中可能存在多种对人体有害或有潜在致病风险的化合物，在事故发生后短时间内利用化学分析确定其组分并判断是否有害是不现实的。因此急需一种快速、简便、经济的检测方法以便给决策者提供参考。在实践应用中，水的毒性效应是一项综合的生物学参数，目前已使用的对水毒性的测试的传统生物学方法包括浮游动物试验、藻类试验和鱼类试验等。但是它们都因时间长、费用高，操作繁琐，不适宜突发环境事件的预警。
近年来，一些快速、简便、经济的现代化的检测方法逐步发展起来，比如生物发光毒性检测方法、化学发光毒性检测方法等。其中生物发光毒性检测方法是应用最为广泛也是较为成熟的技术，它可分为热发光和冷发光两种方式。热发光的典型代表是发光细菌毒性检测技术，它是基于毒性物质对发光细菌发光强度的抑制作用而设计的，通过测定发光细菌发光强度的变化，评价环境样品中重金属和有机物质的急性毒性。国内外已经有了许多的研究和改进，已经从原来的发光机理研究转向发光应用的研究，在环境方面，开发出能实时连续监控的各种发光细菌生物传感器，检测的领域包括水、土壤、大气。虽然发光细菌毒性检测具有快速、灵敏、操作简单的优点，但是成套设备较昂贵，一次测试的时间最少需要15分钟。所以人们根据萤火虫发光的原理，在体外创造发光的环境开发出了冷发光的检测方法即ATP生物发光法。
ATP生物发光法在环境的应用大都是检测环境中的微生物数量方面，取代操作繁琐的平板计数法，通过裂解剂处理样品，使其释放出ATP，然后向样品中加入发光试剂虫荧光素-虫荧光素酶，根据发光强度与ATP的关系推断出样品的微生物量。应用较多的是各种水体、食品、乳制品中的微生物数量的检测，但ATP生物发光法用于环境急性毒性检测的鲜有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作方便、可用于现场测试且测试成本较低的利用ATP生物发光进行水环境急性毒性检测的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种利用ATP生物发光进行水环境急性毒性检测的方法，向反应试管中依次先后加入ATP反应试剂、虫荧光素酶、ATP标准品、待检测水体，置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为30s，以此为实验组；向反应试管中依次先后加入与实验组相同的检测试剂(即相同的ATP反应试剂、虫荧光素酶和ATP标准品)，以蒸馏水为无毒的参照物，置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为30s，以此为对照组；实验组和对照组均重复操作检测三次；
所述的ATP反应试剂包含如下浓度的组分：所述的ATP反应试剂包含如下浓度的组分：虫荧光素10～100mg/L、Mg2+5～100mmol/L、EDTA 0.5～50mmol/L、Tris-HCl缓冲液10～100mmol/L；ATP反应试剂优选包含如下浓度的组分：虫荧光素20mg/L、Mg2+10mmol/L、EDTA 1mmol/L、Tris-HCl缓冲液25mmol/L；
所述的ATP标准品浓度为10-10～10-3mol/L，优选浓度为10-5mol/L；
按下式计算相对发光率K：
相对发光率K＝实验组三次试验发光强度之和/对照组三次试验发光强度之和；
当K＞70％，则毒性级别为低毒；
当50％＜K≤70％，则毒性级别为中毒；
当30％＜K≤50％，则毒性级别为重毒；
当0％＜K≤30％，则毒性级别为高毒；
当K＝0，则毒性级别为剧毒。
其中，所述的ATP反应试剂加入体积为10μL～4mL，优选400μL。
其中，所述的虫荧光素酶加入体积为10μL～250μL，优选25μL。
其中，所述的ATP标准品加入体积为10μL～250μL，优选25μL。
其中，所述的待检测水体加入体积为20μL～0.5mL，优选50μL。
其中，所述的ATP荧光检测仪为便携式。
上述相对发光率K和毒性强弱关系的判别标准参考使用发光细菌的检测方法(国标GB/T 15441～1995)。本发明根据生物发光的原理，在体外提供生物发光所需的物质ATP、荧光素酶、荧光素以及一些辅助物质模拟生物发光，在有毒性物质存在时会抑制荧光素酶的活性，从而使降低发光，依次达到检测的目的。与发光细菌的原理相同，只不过发光细菌在毒性物质存在时的新陈代谢受到抑制，从而影响ATP的产生和荧光素酶活性，抑制发光。因此是可以适用的。
其中，所述的ATP荧光检测仪为便携式。
本发明是基于在虫荧光素酶的催化下底物虫荧光素与ATP会发生反应，在反应过程中会发出荧光，当样品中存在毒性物质时会影响虫荧光素酶的活性，从而影响该反应的进行，通过发光强度的变化就可以确定样品毒性的强弱。
有益效果：本发明方法与现有技术相比，具有如下优点：
本发明通过构建虫荧光素-虫荧光素酶发光体系，用ATP手持仪测试ATP生物发光，对有毒有害物质急性毒性进行测试，具有测试效果稳定、灵敏的特点，测试时间最多不超过3分钟，可达到发光细菌测试的效果，对有机有毒物质的响应比发光细菌还要灵敏。本发明采用的是便携式ATP手持仪，使用直流电源，因此便于携带适合现场测试，适宜于饮用水、污水处理厂进出水水质及化工厂排水口水质毒性的快速检测，还可用于大气、土壤等的综合毒性的检测。而其他的分析方法，需要交流电源，仪器昂贵笨重，不适宜现场测试。
附图说明
图1是虫荧光素酶对发光体系的影响；
图2是虫荧光素对发光体系的影响；
图3是EDTA对发光体系的影响；
图4是Tris-HCl对发光体系的影响；
图5是ATP标准品浓度对发光体系的影响；
图6是各浓度苯酚的响应时间；
图7是苯酚的毒性效应曲线；
图8是硫酸锌的毒性效应曲线。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：试剂及仪器的准备：
1、试剂的准备：
(1a)虫荧光素酶的准备：
虫荧光素酶的制备方法参考专利200910109584.5，得到的虫荧光素酶用10-5mol/mL的标准ATP进行测量发光强度应不低于1000RLU/S，放于-20℃备用。
(1b)ATP反应试剂的准备：
虫荧光素购于美国progema公司，50mg，保存于-20℃备用；
用MgCl2·6H2O配成浓度为0.1mol/L的Mg2+母液；
EDTA·2Na配成浓度为0.5mol/L的EDTA母液；
配制pH为7.8的0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液。
(1c)ATP标准品的准备：
配制10-3mol/L的ATP标准品试剂。吸取0.5mL 10-3mol/L的标准ATP试剂加入到4.5mL 8.5g/L NaCl中，得到10-4mol/L的ATP标准品试剂。重复以上过程，直至将ATP溶液稀释成10-16mol/L。
2、测试仪器的准备：
便携式ATP测量仪(深圳市朗石生物仪器有限公司，LumiFox 2000)；发光强度范围为0～10000RLU/S。
以下实施例所使用的试剂和仪器均来源于本实施例中的试剂和仪器。
实施例2：虫荧光素-虫荧光素酶发光体系的构建。
(1)虫荧光素酶：
在测定玻璃管中加入400uL ATP反应试剂(所述的ATP反应试剂包含如下浓度的组分：虫荧光素20mg/L、Mg2+10mmol/L、EDTA 1mmol/L、Tris-HCl缓冲液的浓度为25mmol/L)、不同量的虫荧光素酶、25μL 10-5mol/L的ATP标准品试剂，轻轻摇晃使其混匀，立即往测定管中加入50μL纯净水，立即盖上样品室的盖子，测其发光强度。虫荧光素酶是反应中的催化剂，在一定的范围内，其量越大，催化能力越强，见图1。在较高的ATP浓度范围内，25uL的酶可以满足需要。
(2)虫荧光素：
将虫荧光素稀释成不同的浓度，配制成不同的ATP反应试剂。在测定玻璃管中加入400uL ATP反应试剂(所述的ATP反应试剂包含如下浓度的组分：不同浓度的虫荧光素、Mg2+10mmol/L、EDTA 1mmol/L、Tris-HCl缓冲液的浓度为25mmol/L)、25μL虫荧光素酶、25μL 10-5mol/L的ATP标准品试剂，轻轻摇晃使其混匀，立即往测定管中加入50μL纯净水，立即盖上样品室的盖子，测其发光强度。D-虫荧光素是反应中的底物，必须保证其过量，才能保证对ATP的定量检测。D-虫荧光素的量不能低于20mg/L，否则，会显著抑制反应的进行，见图2。
(3)Mg2+：
将0.1mol/L的Mg2+母液稀释成不同的浓度，配制成不同的ATP反应试剂。在测定玻璃管中加入400uLATP反应试剂(所述的ATP反应试剂包含如下浓度的组分：20mg/L虫荧光素、不同浓度的Mg2+、EDTA 1mmol/L、Tris-HCl缓冲液的浓度为25mmol/L)、25μL虫荧光素酶、25μL 10-5mol/L的ATP标准品试剂，轻轻摇晃使其混匀，立即往测定管中加入50μL纯净水，立即盖上样品室的盖子，测其发光强度。Mg2+是虫荧光素酶的辅酶，在适宜的浓度会促进发光，所以选择浓度为10mmol/L。
(4)EDTA：
将0.5mol/L的EDTA母液液稀释成不同的浓度，配制成不同的ATP反应试剂。在测定玻璃管中加入400μL ATP反应试剂(所述的ATP反应试剂包含如下浓度的组分：20mg/L虫荧光素、10mmol/L Mg2+、不同浓度的EDTA、Tris-HCl缓冲液的浓度为25mmol/L)、25μL虫荧光素酶、25μL 10-5mol/L的ATP标准品试剂，轻轻摇晃使其混匀，立即往测定管中加入50μL纯净水，立即盖上样品室的盖子，测其发光强度。本试验结果表明，1mmol/L EDTA对反应没有显著性影响，但5mmol/L的EDTA显著抑制反应的进行，见图3。
(5)Tris-HCl缓冲液：
将pH为7.8的0.05mol/L的Tris-HCl缓冲体系稀释成不同的浓度，配制成不同的ATP反应试剂。在测定玻璃管中加入400μL ATP反应试剂(所述的ATP反应试剂包含如下浓度的组分：20mg/L虫荧光素、10mmol/L Mg2+、1mmol/L EDTA、不同浓度的Tris-HCl缓冲液的浓度)、25μL虫荧光素酶、25μL 10-5mol/L的ATP标准品试剂，轻轻摇晃使其混匀，立即往测定管中加入50μL纯净水，立即盖上样品室的盖子，测其发光强度。确定Tris-HCl缓冲液的浓度为25mmol/L，见图4。
(6)ATP标准品；
在测定玻璃管中加入400μL ATP反应试剂(所述的ATP反应试剂包含如下浓度的组分：20mg/L虫荧光素、10mmol/L Mg2+、1mmol/L EDTA、不同浓度的Tris-HCl缓冲液的浓度)、25μL虫荧光素酶、25μL不同浓度的ATP标准品试剂，轻轻摇晃使其混匀，立即往测定管中加入50μL纯净水，立即盖上样品室的盖子，测其发光强度。ATP浓度越大所测得的发光强度就越大，所以选择了10-5mol/L浓度的ATP，见图5。
综上，最终确定虫荧光素-虫荧光素酶发光体系为400μL的ATP反应试剂、25μL虫荧光素酶、25μL 10-5mol/L ATP标准品、50μL待检测水体。所述的ATP反应试剂包含如下浓度的组分：虫荧光素20mg/L、Mg2+10mmol/L、EDTA 1mmol/L、Tris-HCl缓冲液25mmol/L。
实施例3：毒性测试
有毒有机样品以苯酚为典型代表，配成3000mg/L的苯酚稀释液，用铝箔包住放于4℃备用；
重金属以硫酸锌为典型代表，配成1000mg/L的硫酸锌稀释液，放于4℃备用在反应试管里。
向反应试管中依次先后加入400μL的ATP反应试剂(ATP反应试剂包含如下浓度的组分：虫荧光素20mg/L、Mg2+10mmol/L、EDTA 1mmol/L、Tris-HCl缓冲液25mmol/L)、25uL虫荧光素酶、25uLATP标准品，轻轻摇晃使其混匀，最后加入50uL的蒸馏水，迅速盖好盖子放入反应槽里进行测量，此次测试作为对照组。
向反应试管中依次先后加入400μL的ATP反应试剂(ATP反应试剂包含如下浓度的组分：虫荧光素20mg/L、Mg2+10mmol/L、EDTA 1mmol/L、Tris-HCl缓冲液25mmol/L)、25μL虫荧光素酶、25μLATP标准品，轻轻摇晃使其混匀，最后加入50μL的待检测水体，迅速盖好盖子放入反应槽里进行测量，此次测试作为实验组。待检测水体为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L苯酚，测试顺序从低浓度样本向高浓度逐一进行。每个浓度的实验组和对照组均重复三次。苯酚的半数抑制浓度为64mg/L，比发光细菌的要灵敏一个数量级。硫酸锌的测量浓度及方法同苯酚，硫酸锌的半数抑制浓度为18.98mg/L。图7和图8分别是苯酚和硫酸锌的毒性效应曲线。
实施例4：确定响应时间
进行不同浓度的苯酚、硫酸锌测试，以其发光变化达到最小来确定响应时间。在加入毒性物质后的10s都能灵敏的反应，见图6，在10～30s的时间范围内发光值波动都很小，故确定响应时间为30s。
实施例5：毒性判断
按下式计算相对发光率K：
相对发光率K＝实验组三次试验发光强度之和/对照组三次试验发光强度之和；根据K值大小确定毒性大小，参见国标GB/T 15441-1995。具体见表1。
表1
| 相对发光率(K)(％) | 等当量的HgCl2溶液浓度(C)(mg/L) | 毒性级别 |
| K＞70 | CHg＜0.07 | 低毒 |
| 50＜K≤70 | 0.07≤CHg＜0.09 | 中毒 |
| 30＜K≤50 | 0.09≤CHg＜0.12 | 重毒 |
| 0＜K≤30 | 0.12≤CHg＜0.16 | 高毒 |
| K＝0 | CHg≥0.16 | 剧毒 |
实施例6：
检测方法：向反应试管中依次先后加入400μL的ATP反应试剂、25μL虫荧光素酶、25μL 10-5mol/LATP标准品、50μL待检测水体，置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为30s，以此为实验组；向反应试管中依次先后加入400μL的ATP反应试剂、25μL虫荧光素酶、25μLATP标准品、50μL蒸馏水，置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为30s，以此为对照组；实验组和对照组均重复操作检测三次；所述的ATP反应试剂包含如下浓度的组分：虫荧光素20mg/L、Mg2+10mmol/L、EDTA1mmol/L、Tris-HCl缓冲液25mmol/L。
配制2000mg/L的氯化汞母液，按比率稀释成0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18mg/L的氯化汞标准液，按上述方法进行测量，相对发光率分别为66％、52％、35％、12％、5％、0.01％、0，与发光细菌的测试基本符合，毒性级别分别为低毒，中毒，重毒，高毒，剧毒，剧毒。
配制了0.1、1、10mg/L氯化镉按上述方法测试K值分别为90％、20％、0，毒性级别分别为低毒、高毒、剧毒。
配制0.02、0.2、2mg/L溴氰菊酯进行测试K值分别为92％、40％、17％，毒性级别分别为低毒、重毒、高毒。
以等比的方式配制Cd、Pb的混合毒物溶液，0.005+0.005、0.05+0.05、0.125+0.125、0.25+0.25mg/L，按上述方法测试K值分别为81％、70％、45％、20％，毒性级别分别为低毒，中毒，重毒，高毒，与周秀艳的结果接近。
实施例7：
检测方法：向反应试管中依次先后加入160μL的ATP反应试剂、10μL虫荧光素酶、10μL 10-5mol/LATP标准品、20μL待检测水体，置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为30s，以此为实验组；向反应试管中依次先后加入160μL的ATP反应试剂、10μL虫荧光素酶、10uL10-5mol/L ATP ATP标准品、20μL蒸馏水，置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为30s，以此为对照组；实验组和对照组均重复操作检测三次；所述的ATP反应试剂包含如下浓度的组分：虫荧光素20mg/L、Mg2+10mmol/L、EDTA 1mmol/L、Tris-HCl缓冲液25mmol/L。
配制2000mg/L的氯化汞母液，按比率稀释成0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18mg/L的氯化汞标准液，按上述方法进行测量，相对发光率分别为76％、52％、35％、12％、5％、0.01％、0，与发光细菌的测试基本符合，毒性级别分别为低毒，中毒，重毒，高毒，高毒，高毒，剧毒。
实施例8：
检测方法：向反应试管中依次先后加入4mL的ATP反应试剂、250μL虫荧光素酶、250μL 10-5mol/LATP标准品、0.5mL待检测水体，置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为30s，以此为实验组；向反应试管中依次先后加入4ml的ATP反应试剂、250μL虫荧光素酶、250μLATP标准品、0.5mL蒸馏水，置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为30s，以此为对照组；实验组和对照组均重复操作检测三次；所述的ATP反应试剂包含如下浓度的组分：虫荧光素20mg/L、Mg2+10mmol/L、EDTA1mmol/L、Tris-HCl缓冲液25mmol/L。
配制2000mg/L的氯化汞母液，按比率稀释成0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18mg/L的氯化汞标准液，按上述方法进行测量，相对发光率分别为80％、66％、48％、26％、15％、1％、0，与发光细菌的测试基本符合，毒性级别分别为低毒，中毒，重毒，高毒，剧毒，剧毒。
Claims (6)
1.一种利用ATP生物发光进行水环境急性毒性检测的方法，其特征在于向反应试管中依次先后加入ATP反应试剂、虫荧光素酶、ATP标准品、待检测水体，置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为30s，以此为实验组；向反应试管中依次先后加入与实验组相同的检测试剂，以蒸馏水为无毒的参照物，置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为30s，以此为对照组；实验组和对照组均重复操作检测三次；
所述的ATP反应试剂包含如下浓度的组分：虫荧光素10～100mg/L、Mg2+5～100mmol/L、EDTA 0.5～50mmol/L、Tris-HCl缓冲液10～100mmol/L；
所述的ATP标准品浓度为10-10～10-3mol/L；
按下式计算相对发光率K：
相对发光率K＝实验组三次试验发光强度之和/对照组三次试验发光强度之和；
当K＞70％，则毒性级别为低毒；
当50％＜K≤70％，则毒性级别为中毒；
当30％＜K≤50％，则毒性级别为重毒；
当0％＜K≤30％，则毒性级别为高毒；
当K＝0，则毒性级别为剧毒。
2.根据权利要求1所述的利用ATP生物发光进行水环境急性毒性检测的方法，其特征在于所述的ATP反应试剂加入体积为10μL～4mL。
3.根据权利要求1所述的利用ATP生物发光进行水环境急性毒性检测的方法，其特征在于所述的虫荧光素酶加入体积为10μL～250μL。
4.根据权利要求1所述的利用ATP生物发光进行水环境急性毒性检测的方法，其特征在于所述的ATP标准品加入体积为10μL～250μL。
5.根据权利要求1所述的利用ATP生物发光进行水环境急性毒性检测的方法，其特征在于所述的待检测水体加入体积为20μL～0.5mL。
6.根据权利要求1所述的利用ATP生物发光进行水环境急性毒性检测的方法，其特征在于所述的ATP荧光检测仪为便携式。
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