CN101477055A - 检测水体中综合毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种环境保护领域的检测水体中综合毒性的方法。本发明利用荧光素酶代替发光细菌进行水体综合毒性检测，荧光素酶对环境中或水体中存在的痕微量有毒有害物质非常敏感。当水体中存在有害物质，会改变荧光素酶的活性，从而使该荧光素酶在三磷酸腺苷存在的条件下催化D－荧光素的反应受到抑制，导致该反应所产生的光强度随着水样中毒物量的含量而改变，根据化学发光强度的降低程度来判定水样的综合毒性。本发明具有检测灵敏度高、操作简便、检测时间短、稳定性及重复性好、不需要贵重仪器的优点，可实现现场检测水样的综合毒性，也非常适用于国家举办大型社会活动时应急检测和防恐需要。
Description
技术领域
本发明涉及一种环保中的检测水质技术领域的方法，具体涉及一种利用荧光素酶反应体系检测水体中综合毒性的方法。
背景技术
当前国际上检测饮用水中主要有害化学污染物的确证性方法为气相色谱法、高效液相色谱法、色谱一质谱联用法；饮用水中有机污染物分析的富集方法主要有顶端空间分配法、疏水吸附法、气相提取法、溶剂萃取法、固相萃取法、大孔树脂吸附法及反渗透法。中国对饮用水质的检测规范遵循国家标准GB5750-85中的“生活饮用水标准检测方法”和建设部行业标准CJ/T206-2005中的“城市供水水质标准”，对饮用水中有害化学污染物质的检测基本上以仪器分析法为主，为我国大型水系及主要大城市水源污染状况提供了非常重要的数据。但这些确证性检测方法的一次性检测范围较窄，且非常耗时和费力。由于饮水中有机物染物种类繁多，且大多数有机物在水中含量极微，要全部分析监测和研究这些污染成分，工作量非常巨大。这些仪器方法的检测时间长、操作复杂、需要昂贵的仪器，且不能在短时间内确定水体样品是否有生物毒性；另外，即使定性或定量检测出单种或多种有害物，也无法判定这些有害物质的综合生物毒性作用，因为不同毒性物质的拮抗作用或协同作用所产生的生物毒性效果并不能以这些毒物的具体的量来推算。因此这些确证性的方法在检测水质综合毒性时具有很大的缺限性。近十多年来，欧美一些发达国家非常重视水质综合毒性检测技术，如德国、美国、荷兰、意大利及西班牙等国家将水质及环境样品综合毒性测试列入国家标准。该技术的核心是一种基于生物传感技术的检测系统，具体为一种利用发光细菌的急性毒性测试技术，已被很多国家用于检测大城市饮用供水系统。该传感器具有携带方便，检测时间短、检测范围广等优点。中国于1995年制定了水质急性毒性的检验标准方法，标准号为GB/T15441-1995，该标准中利用有毒有害物质对海洋发光杆菌T3的生物发光具有抑制作用的原理来判定水质的综合毒性，但该方法为维持T3菌的正常生存，需在测试体系中加入较高浓度的NaCl(2％～3％)。但大量氯离子或钠离子的存在会在相当程度上影响样品中一些污染物的生物可利用性和毒性顺序，同时也对测试淡水体系样品中污染物毒性存在一定的局限性和矛盾。
经对现有技术文献检索发现，专利申请号为200610150846.9的中国专利，名称为“一种浓缩预处理用于水体综合毒性检测的方法”，该专利方法首先以超滤膜、反渗透膜对水样品进行浓缩处理，然后利用有害物质对发光细菌的发光抑制特性来测定水样品的综合毒性。该方法的优点是能检测水样品的综合毒性，检测时间短，灵敏度较高；但该方法在应用中需要对发光细菌进行冻存复活处理，需要特定的培养设施及冷冻设备，因而使这种方法在现场水样综合毒性的检测受到一定的限制；另外，由于在冻存、复活及培养过程中，不同批次所得到的空白对照样品的发光强度差异较大，使得这种方法的稳定性及重复性不佳。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出了一种检测水体中综合毒性的方法，用荧光素酶反应体系代替发光细菌进行水体综合毒性检测，具有检测灵敏度高、操作简便、检测时间短、稳定性及重复性好、不需要贵重仪器的优点，可实现现场检测水样的综合毒性，也非常适用于国家举办大型社会活动时应急检测和防恐需要。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明利用荧光素酶代替发光细菌进行水体综合毒性检测，荧光素酶是一种从荧火虫体内提取出来的或利用基因工程技术得到的商品化的酶制剂，该酶对环境中或水体中存在的痕微量有毒有害物质非常敏感。当水体中存在有害物质，包括重金属、无机化工污染物、有机污染物等，会改变荧光素酶的活性，从而使该荧光素酶在三磷酸腺苷存在的条件下催化D-荧光素的反应受到抑制，导致该反应所产生的光强度随着水样中毒物量的含量而改变，根据化学发光强度的降低程度来判定水样的综合毒性。
本发明采用的荧光素酶为由荧火虫中提取的酶制剂；荧光素为由荧火虫中提取的D-荧光素，通过市售，如可以直接从美国Sigma公司购买。通过检测与水样中有毒有害物质作用后的荧光索酶所催化的化学发光强度来判定水样是否受到污染或确定饮用水是否安全可饮用。
本发明包括如下步骤：
第1步：反应体系缓冲液的制备：所述的反应体系缓冲液，包括A液—酶促反应缓冲液、B液—底物稀释液、C液—荧光素酶贮存液及D液—底物应用液。
其中A液的配制方法如下：0.025mol/L的N-三羟甲基甘氨酸20ml～100ml，pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液5ml～20ml，将这两种缓冲液混合，将混合液的pH用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L NaOH调为6.0～8.5。
其中B液的配制方法如下：称取牛血清白蛋白5mg～20mg，MgCl2·6H2O 30mg～60mg，二硫苏糖醇2mg～10mg，最后用A液定容至10毫升。
其中C液的配制方法如下：将购得的荧光素酶冻干粉用0.01mol/L～0.05mol/L pH7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为0.15mg/ml～0.55mg/ml的酶贮存液，按100微升每管，分装冻存于-80℃～-20℃冰箱中。
其中D液的配制方法如下：先将D-荧光素用pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为0.2mg/ml～1.0mg/ml溶液，然后取该溶液5μL～15μL，B液500μL～1500μL，C液50μL～150μL，最后将这三种溶液混合即成为底物应用液D。
第2步：三磷酸腺苷二钠贮存液及应用液的配制：用pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为2.0mg/ml～10.0mg/ml的三磷酸腺苷二钠贮存液；配制应用液时，用pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液稀释5～50倍即可。
第3步：水体综合毒性的检测：取6个聚四氟乙烯材料制成的透光性良好的反应杯，或可应用普通的48塑料孔养板。进行空白测试时，每次做三个平行样，先向每杯或每孔中分别加入A液250μL，D液50μL，二次蒸馏水100μL，室温孵育15分钟～25分钟；然后将上述各反应杯或培养板放入发光检测仪中，向反应杯或反应孔中加入三磷酸腺苷二钠应用液100μL，用移液枪吹打混匀；15秒～30秒后记录发光强度。在测试每个水样时，也做三个平行样，测试方法基本同空白样测试，不同之处时用待测水样替代二次蒸馏水。按照下面的公式计算待测水样的发光强度：
相对发光强度＝样品三个平行样的平均发光值÷空白三个平行样的平均发光值×100％
根据计算出的发光强度，参照中国1995年制定的水质急性毒性的检验标准方法——GB/T15441-1995中的结果判定方法，查对表1。
表1
根据查表结果得出待测水样的综合毒性：安全、可疑或不安全。
本发明利用荧光素酶对毒物反应非常灵敏的特点，建立了检测水体中综合毒性的新方法，与现有检测方法相比，本发明具有以下特点及优势：
1、快速。在30分钟之内可得出检测结果。在实际检测时，只需要将已配制并贮存的反应体系缓冲液、三磷酸腺苷二钠液现场稀释，再加入待检水样孵育十几分钟后即可进行测试。不需要像背景技术那样，要对毒物敏感发光菌进行复苏与重培养，从发光细菌处理至一个样品测试完成，实际需要2小时以上。而本发明从配制试剂到获得检测结果，只需20至30分钟，从而大大节省时间。如果应用目前的国家标准的检测法检测水体受有毒有害物质污染情况，则需要几天才有结果，不能实现现场快速预警河流水质、城市供水系统及市售饮用水的安全情况。
2、检测灵敏度高。本发明采用的荧火虫源性荧光素酶对不同毒物的反应非常灵敏，即痕微量的毒性物质即可显著抑制荧光素酶的活性。另外，本发明所用的发光仪是利用现代光子技术来检测发光信号，该技术能检测到微弱的化学或生物发光，并能区分微小的光强变化。因而本发明所建立的发光体系检测水体综合毒性的灵敏度要比利用其它酶类的检测方法高数千倍，比一般生物或生物细胞的检测方法高出数十倍至数百倍。
3、能检测待检水样中所有毒物的综合毒性。采用国标的某一种方法只能检针对性地检测某种物质，无法判定规定检测项目之外的有毒有害物质，因而很容易导致漏检。而本发明方法是利用荧光素酶检测结果来判定待检样品中所有毒有害物质的综合毒性，因此，即使人类还未发现的毒物或从未出现过的新化学合成毒物，也会显著影响荧光素酶的活性，通过本发明所述的方法可检测其毒性的强弱。
4、可检测的物质的范围宽广，可达数百种有毒有害物质综合毒性的检测：①重金属类离子及其化合物，如无机汞、甲基汞、硫柳汞、镉、铅、铜、银等；②无机化合物，如氰化物、砷化合物、硒化合物、氨水等；③有机化合物及农药，如苯酚、对氨基苯酚、苯胺、联苯胺、甲醛、五氯苯酚、苯、二恶英、四苯基甲苯、氰化苯酰、四苯基甲苯、三硝基甲苯、百草枯、二嗪农、马拉硫磷、其它有机磷类农药及有机氯类农药等；④生物毒素类，如番木鳖碱、赭曲霉素、肉毒毒素、黄曲霉毒素等。
5、应用范围广。本发明可应用到：①地表水毒性的检测；②由于泄露事故、环境污染、自然灾害，以及人为破坏而造成的饮用水污染情况的检测；③食品加工用水毒性的检测；④江、河、湖泊及水产养殖用水中综合毒性的检测；⑤重大社会性活性中饮用水质安全监测；⑥城市供水系统安全性检测。
6、实用型强。本发明所建立的检测水体综合毒性的方法简单，只需将配制好的测试缓冲液及底物混合进行反应，然后将其放置在化学发光仪上检测即可得到结果。在现场检测时，除利用便携式发学发光仪外，不需要其它特殊的仪器及装置，检测时间短、操作方便，可实现现场水样综合毒性的检测。
附图说明
图1为不同浓度的汞对荧光素酶的抑制作用示意图；
图2为不同浓度的镉对荧光素酶的抑制作用示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1检测重金属污染水样的综合毒性
1、重金属污染水样的获得
在本实施例中，首先人工制备重金属汞、铅、镉、铜污染水样。在人工配制汞污染水样时，于双蒸水中分别加入氯化汞标准液，使水样中的汞含量分别为0.006mg/L、0.03mg/L、0.15mg/L、0.75mg/L、3.75mg/L、18.75mg/L、93.75mg/L。按上述方法分别利用硝酸铅、氯化镉、硫酸铜配制重金属铅、镉、铜的人工污染水样。单独或混合重金属污染水样的配制如下：①浓度0.03mg/L的汞污染水样；②浓度为0.03mg/L的铅污染水样；③浓度为0.75mg/L的镉污染水样；④浓度为0.75mg/L的铜污染水样；⑤浓度为0.03mg/L的汞污染水样+0.15mg/L的铅污染水样；⑥浓度为0.03mg/L的汞污染水样+0.15mg/L的铅污染水样+0.75mg/L铜污染水样；⑦0.006mg/L汞污染水样+0.03mg/L铅污染水样+0.15mg/L镉污染水样；⑧浓度为0.15mg/L的铅污染水样+0.75mg/L的镉污染水样+3.75mg/L的铜污染水样；⑨自来水样。
2、反应体系缓冲液的制备
反应体系缓冲液的制备同前述的技术方案中步骤1：
在配制A液时，用0.025mol/L的N-三羟甲基甘氨酸40ml，pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液10ml，其它步聚同前所述；
在配制B液时，称取牛血清白蛋白10mg，MgCl2.6H2O 40mg，二硫苏糖醇5mg，其它步聚同前所述；
在配制C液时，将购得的荧光素酶冻干粉用0.03mol/L pH7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为0.35mg/ml的酶贮存液，其它步聚同前所述；
在配制D液时，将D-荧光素用pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为0.5mg/ml溶液，然后取该溶液10μL，B液1000μL，C液100μL混合成底物应用液D。
三磷酸腺苷二钠贮存液及应用液的配制同前述的技术方案中步骤2，具体配制时，用pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为5.0mg/ml的三磷酸腺苷二钠贮存液；配制应用液时，用pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液稀释20倍即可。
3、重金属污染水样综合毒性的检测
重金属污染水样综合毒性的检测同前述的技术方案中步骤3，空白对照样及每个检测样做三个平行，反应过程中室温孵育的时间为20分钟，记录发光强度的时间为20秒。
按上述方法分别测试上述8种人工重金属污染水样及自来水样，所对应的化学发光强度，查对表1，判定结果如下：①不安全；②可疑；③不安全；④可疑；⑤不安全；⑥不安全；⑦可疑；⑧不安全；⑨安全。同时该方法也能灵敏地反映出不同汞浓度及不同镉浓度对荧光素酶的抑制作用，分别见图1及图2，图1中的阿位伯数字1、2、3、4、5、6、7分别表示汞的浓度为0.00mg/L、0.03mg/L、0.15mg/L、0.75mg/L、3.75mg/L、18.75mg/L、93.75mg/L。图2中的阿位伯数字1、2、3、4、5、6、7、8、9分别表示镉的浓度为0.00mg/L、0.03mg/L、0.15mg/L、0.75mg/L、3.75mg/L、18.75mg/L、93.75mg/L、200.0mg/L、400.0mg/L。采用国家标准GB/T15441-1995所采用的水质急性毒性的检验方法对上述水样进行测试，结果如下：①不安全；②安全；③不安全；④可疑；⑤不安全；⑥不安全；⑦安全；⑧可疑；⑨安全。说明该方法基本与国家标准方法检测结果吻合，但同时表明该方法对检测微量毒性方面要比现有国家标准方法灵敏。
实施例2检测江河水、地表水及工业废水的综合毒性
1、水样品的获得：江河水样3个采自黄浦江下游上海市闵行区段的水样；地表水样3个分别采自上海市闵行区、徐汇区及普陀区公园的地表水样；工业废水样3个分别采自上海三个食品加工厂的已处理过的废水。
2、反应体系缓冲液的制备
反应体系缓冲液的制备同前述的技术方案中步骤1：
在配制A液时，用0.025mol/L的N-三羟甲基甘氨酸20ml，pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液5ml，其它步聚同前所述；
在配制B液时，称取牛血清白蛋白5mg，MgCl2.6H2O 30mg，二硫苏糖醇2mg，其它步聚同前所述；
在配制C液时，将购得的荧光素酶冻干粉用0.01mol/L pH7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为0.15mg/ml的酶贮存液，其它步聚同前所述；
在配制D液时，将D-荧光素用pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为0.2mg/ml溶液，然后取该溶液5μL，B液500μL，C液50μL混合成底物应用液D。
三磷酸腺苷二钠贮存液及应用液的配制同前述的技术方案中步骤2，具体配制时，用pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为2.0mg/ml的三磷酸腺苷二钠贮存液；配制应用液时，用pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液稀释5倍即可。
3、待测水样综合毒性的检测
待测水样综合毒性的检测同前述的技术方案中步骤3，空白对照样及每个检测样做三个平行，反应过程中室温孵育的时间为15分钟，记录发光强度的时间为15秒。
按上述方法分别测试上述水样，根据它们所对应的化学发光强度，查对表1，判定结果如下：①3个采自黄浦江下游上海市闵行区段的水样中，2个不安全，1个可疑；②3个上海市公园地表水样中，2个水样安全，1个可疑；③3个上海三个食品加工厂的废水样品均不安全。采用国家标准GB/T15441-1995所采用的水质急性毒性的检验方法对上述水样进行测试，结果如下：①3个采自黄浦江下游上海市闵行区段的水样中，1个不安全，2个可疑；②3个上海市公园地表水样中，2个水样安全，1个可疑；③3个上海三个食品加工厂的废水样品中，2个可疑，1个不安全。
实施例3检测市售桶装水及自来水综合毒性
1、水样品的获得：从上海市6个超市采集6个市售桶装水样品，从上海市郊区农贸市场采集6个桶装水样；3个自来水样采自上海市不同三个区的自来水样。
2、反应体系缓冲液的制备
反应体系缓冲液的制备同前述的技术方案中步骤1：
在配制A液时，用0.025mol/L的N-三羟甲基甘氨酸100ml，pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液20ml，其它步聚同前所述；
在配制B液时，称取牛血清白蛋白20mg，MgCl2.6H2O 60mg，二硫苏糖醇10mg，其它步聚同前所述；
在配制C液时，将购得的荧光素酶冻干粉用0.01mol/L pH7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为0.55mg/ml的酶贮存液，其它步聚同前所述；
在配制D液时，将D-荧光素用pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为1.0mg/ml溶液，然后取该溶液15μL，B液1500μL，C液150μL混合成底物应用液D。
三磷酸腺苷二钠贮存液及应用液的配制同前述的技术方案中步骤2，具体配制时，用pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为10.0mg/ml的三磷酸腺苷二钠贮存液；配制应用液时，用pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液稀释50倍即可。
3、待测水样综合毒性的检测
待测水样综合毒性的检测同前述的技术方案中步骤3，空白对照样及每个待检样做三个平行，反应过程中室温孵育的时间为20分钟，记录发光强度的时间为30秒。
按上述方法分别测试上述水样，根据它们所对应的化学发光强度，查对表1，判定结果如下：①6个超市中的市售桶装水样品全部为安全；农贸市场上的2个桶装水不安全，1个可疑，3个安全。②所抽查的3个上海市三个区的自来水样均为安全。采用国家标准GB/T15441-1995所采用的水质急性毒性的检验方法对上述水样进行测试，结果如下：①6个超市中的市售桶装水样品全部为安全；农贸市场上的3个桶装水不安全，2个可疑，1个安全。②所抽查的3个上海市三个区的自来水样均为安全。
以上实施例中，检测中采用的荧光素酶及D-荧光素酶冻干粉来自美国Sigma公司。从以上实施例可以看出，本发明具有检测灵敏度高、操作简便、检测时间短、稳定性及重复性好、不需要贵重仪器的优点，可实现现场检测水样的综合毒性。
Claims (8)
1、一种检测水体中综合毒性的方法，其特征在于利用荧光素酶代替发光细菌进行水体综合毒性检测，荧光素酶是一种从荧火虫体内提取出来的或利用基因工程技术得到的商品化的酶制剂，该酶对环境中或水体中存在的痕微量有毒有害物质非常敏感，当水体中存在有害物质时会改变荧光素酶的活性，从而使该荧光素酶在三磷酸腺苷存在的条件下催化D-荧光素的反应受到抑制，导致该反应所产生的光强度随着水样中毒物量的含量而改变，根据化学发光强度的降低程度来判定水样的综合毒性。
2、根据权利要求1所述的检测水体中综合毒性的方法，其特征是，包括如下步骤：
第1步：反应体系缓冲液的制备，反应体系缓冲液包括A液—酶促反应缓冲液、B液—底物稀释液、C液—荧光素酶贮存液及D液—底物应用液，其中：
A液的配制方法：N-三羟甲基甘氨酸20ml～100ml，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液5ml～20ml，将这两种缓冲液混合，将混合液的pH调为6.0～8.5；
B液的配制方法：称取牛血清白蛋白5mg～20mg，MgCl2.6H2O 30mg～60mg，二硫苏糖醇2mg～10mg，最后用A液定容至10毫升；
C液的配制方法：将荧光素酶冻干粉用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为0.15mg/ml～0.55mg/ml的荧光素酶贮存液；
D液的配制方法：先将D-荧光素用pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为0.2mg/ml～1.0mg/ml溶液，然后取该溶液5μL～15μL，B液500μL～1500μL，C液50μL～150μL，最后将这三种溶液混合即成为底物应用液D；
第2步：用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为2.0mg/ml～10.0mg/ml的三磷酸腺苷二钠贮存液，配制应用液时，用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液稀释5～50倍；
第3步：取聚四氟乙烯材料制成的反应杯或48塑料孔养板，进行空白测试时，每次做三个平行样，先向每杯或每孔中分别加入A液250μL，D液50μL，二次蒸馏水100μL，室温孵育15分钟～25分钟，然后将上述各反应杯或培养板放入发光检测仪中，向反应杯或反应孔中加入三磷酸腺苷二钠应用液100μL，用移液枪吹打混匀，15秒～30秒后记录发光强度，在测试每个水样时，也做三个平行样，测试方法基本同空白样测试，不同之处时用待测水样替代二次蒸馏水，按照下面的公式计算待测水样的发光强度：
相对发光强度＝样品三个平行样的平均发光值÷空白三个平行样的平均发光值×100％；
根据计算出的发光强度，参照中国1995年制定的水质急性毒性的检验标准方法——GB/T15441-1995中的结果判定方法，确定检测水体中综合毒性。
3、根据权利要求2所述的检测水体中综合毒性的方法，其特征是，所述A液的配制方法中，N-三羟甲基甘氨酸浓度为0.025mol/L1，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液浓度为0.01mol/L，pH7.5。
4、根据权利要求2所述的检测水体中综合毒性的方法，其特征是，所述A液的配制方法中，混合液的pH用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L NaOH调为6.0～8.5。
5、根据权利要求2所述的检测水体中综合毒性的方法，其特征是，所述C液的配制方法中，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的浓度为0.01mol/L～0.05mol/L，pH7.4。
6、根据权利要求2所述的检测水体中综合毒性的方法，其特征是，所述C液的配制方法中，荧光素酶贮存液按100微升每管，分装冻存于-80℃～-20℃冰箱中。
7、根据权利要求2所述的检测水体中综合毒性的方法，其特征是，所述D液的配制方法中，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液浓度为0.01mol/L，pH7.5。
8、根据权利要求2所述的检测水体中综合毒性的方法，其特征是，所述第2步中，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液浓度为0.01mol/L，pH7.5。
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