CN104730012A - 一种小体系快速测定水体硝酸盐的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小体系快速测定水体硝酸盐的方法。本发明设计了1ml的反应体系，通过优化1ml反应体系中各溶液用量，以及锌卷用量以及反应时间，使得体系的稳定性好，还原率高，本发明操作简单、耗时少、需要样品量少等，解决了常规水体硝酸盐测定方法使用样品量多、耗时长、过程繁琐等问题，是一种在海上简单、准确、实时测定水体微量硝酸盐的方法。

Description

一种小体系快速测定水体硝酸盐的方法

技术领域：

本发明属于地球化学领域，具体涉及一种小体系快速测定水体硝酸盐的方法。

背景技术：

海水中氮、磷、硅都是浮游植物繁殖和生长必不可少的营养要素之一，对海水中硝酸盐含量的测定是海洋环境监测、海洋生态环境调查的重要组成部分(陈水土等，2004)，同时硝酸盐氮也是水体污染评价的重要指标(张勇等，2008)，因此其浓度值是许多研究的一项基本数据，具有重要的研究意义。目前检测水体硝酸盐氮的方法主要有：镉铜柱法(MORRIS A W,1936；虞灿银等，1979)、锌镉法(国家海洋局，海洋调查规范(第4部分：海水化学要素调查))、铜锌法(李宝良，2006)等。而常用于船上现场测量硝酸盐的方法是锌镉法。

锌-镉还原法测定水体中硝酸盐的原理：硝酸盐水样在锌片和氯化镉溶液中被定量还原为亚硝酸盐，生成的亚硝酸盐在酸性介质中与磺胺进行重氮化反应后，与盐酸萘乙二胺偶合生成红色偶氮化合物，于543nm波长下测定，接着对原有的亚硝酸盐进行校正，从而计算出硝酸盐含量。(国家海洋局，海洋调查规范(第4部分：海水化学要素调查))

该方法一般采用25ml反应体系，使用3×5cm²锌卷，反应10min，最后使用分光光度计测定。然而，进行实验之前需进行广口玻璃瓶的清洗、烘干等工作，过程繁琐、耗时长，玻璃仪器在船上操作不方便。同时，每次进行样品测定时，使用的样品量多，即使不在船上进行现场测定，也需花费一定人力物力将样品带回实验室，况且样品不宜保存太久。

由于上述诸多影响因素，急需开发一种在船上简单、准确、实时测定水体微量硝酸盐的方法。

发明内容：

本发明的目的是提供一种能在船上简单、准确、实时测定水体硝酸盐的小体系快速方法，该方法能够有效的解决常规锌镉还原法过程繁琐、耗时长、使用样品量多等不足，测定的水体样品不仅仅局限于低硝酸氮浓度、高盐度的海洋水体，对于高硝酸氮浓度、低盐度的河口样品也适用。且为小体系同位素培养提供了解决本底硝酸盐测定过程样品量不足的可行方法。

本发明的小体系快速测定水体硝酸盐的方法，其特征在于，包括以下步骤：

一、当待测样品为淡水样品时：

A、标准工作曲线的制定：

配制硝酸盐标准溶液，采用盐度为5.0的人工海水进行梯度稀释，再取各梯度稀释的硝酸盐溶液1.0ml，在其中加入面积1×1.5cm²锌卷，再加入20μl 20g/L的氯化镉溶液，用涡旋混合器震荡涡旋混合10min，然后将锌卷取出，再加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，放置5min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min，将待测溶液转移到酶标板中，以盐度为5.0的人工海水作参比，用酶标仪于543nm波长处测定吸光值As，An＝As-A_b，其中A_b为空白吸光值，An为扣除空白后的吸光值，以An为纵坐标，硝酸盐-氮的浓度Cs为横坐标绘制标准工作曲线，并用线性回归法求出标准工作曲线截距a和斜率b；

B、水样测定：

将该淡水样品的盐度调整为5～10，取调整盐度后的淡水样品1ml，在其中加入面积1×1.5cm²锌卷，再加入20μl 20g/L的氯化镉溶液，用涡旋混合器震荡涡旋混合10min，然后将锌卷取出，再加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，放置5min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min，将待测溶液转移到酶标板中，以该淡水样品空白吸光值作为参比，用酶标仪于543nm波长处测定吸光值，该吸光值减去参比空白吸光值即为待测水样的吸光值A_w；

同时测定待测水样中原有亚硝酸盐的净平均吸光值

C、锌镉还原率测定

a、淡水样品：各量取1.0ml盐度为5.0的人工海水和用盐度为5.0的人工海水配制含有5.0、10.0μmol/L硝酸盐溶液，分别在其中加入面积1×1.5cm²锌卷，再加入20μl 20g/L的氯化镉溶液，用涡旋混合器震荡涡旋混合10min，然后将锌卷取出，再加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，放置5.0min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min，将待测溶液转移到酶标板中，用酶标仪于543nm波长处测定吸光值，其中A_b1、A_b2相同，都为盐度为5.0的人工海水的吸光值，分别为含有5.0、10.0μmol/L硝酸盐溶液的吸光值(已扣除试剂空白)；

b、各取1.0ml盐度为5.0的人工海水和用盐度为5.0的人工海水配制含有5.0、10.0μmol/L亚硝酸盐溶液，在其中加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，放置5min，再加入20μl 1g/L1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min，将待测溶液转移到酶标板中，用酶标仪于543nm波长处测定吸光值，其中A_b0为盐度为5的人工海水的吸光值，分别为含有5.0、10.0μmol/L亚硝酸盐溶液的吸光值(已扣除试剂空白)；

二、当待测样品为海水样品时

A、标准工作曲线的制定：

配制硝酸盐标准溶液，采用盐度为20的人工海水进行梯度稀释，再取各梯度稀释的硝酸盐溶液1ml，在其中加入面积1×1.5cm²锌卷，再加入20μl 20g/L的氯化镉溶液，用涡旋混合器震荡涡旋混合10min，然后将锌卷取出，再加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，放置5min，再加入20μl 1g/L1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min，将待测溶液转移到酶标板中，以盐度为20的人工海水作参比，用酶标仪于543nm波长处测定吸光值As，An＝As-A_b，其中A_b为空白吸光值，An为扣除空白后的吸光值，以An为纵坐标，硝酸盐-氮的浓度Cs为横坐标绘制标准工作曲线，并用线性回归法求出标准工作曲线截距a和斜率b；

B、水样测定：

将该海水样品的盐度调整为17～35，取调整盐度后的海水样品1ml，在其中加入面积1×1.5cm²锌卷，再加入20μl 20g/L的氯化镉溶液，用涡旋混合器震荡涡旋混合10min，然后将锌卷取出，再加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，放置5min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min，将待测溶液转移到酶标板中，以该海水样品空白吸光值作为参比，用酶标仪于543nm波长处测定吸光值，该吸光值减去参比空白吸光值即为待测水样的吸光值A_w；

同时测定待测水样中原有亚硝酸盐的净平均吸光值

C、锌镉还原率测定

a、海水样品：各取1ml盐度为20的人工海水和用盐度为20的人工海水配制含有5.0、10.0μmol/L硝酸盐溶液，分别在其中加入面积1×1.5cm²锌卷，再加入20μl 20g/L的氯化镉溶液，用涡旋混合器震荡涡旋混合10min，然后将锌卷取出，再加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，放置5min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min，将待测溶液转移到酶标板中，用酶标仪于543nm波长处测定吸光值，其中A_b3、A_b4相同，都为盐度为20的人工海水的吸光值，分别为含有5.0、10.0μmol/L硝酸盐溶液的吸光值；

b、各取1ml盐度为20的人工海水和用盐度为20的人工海水配制含有5.0、10.0μmol/L亚硝酸盐溶液，在其中加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，放置5min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min，将待测溶液转移到酶标板中，用酶标仪于543nm波长处测定吸光值，其中A_b0为盐度为20的人工海水的吸光值，分别为含有5.0、10.0μmol/L亚硝酸盐溶液的吸光值(已扣除试剂空白)；

D、还原率的计算

按照下式计算镀铬锌卷的还原率R：

$R=\frac{A_{{\mathrm{NO}}_3^{-}-\mathrm{Nn}}-A_{\mathrm{bn}}}{A_{{\mathrm{NO}}_2^{-}-\mathrm{Nn}}-A_{b0}}\×100\%$

公式中对应的字母代号如下表所示：

E、计算

水样中硝酸盐-氮浓度按照下式计算：

$c\left({\mathrm{NO}}_3^{-}\right)=\frac{(\stackrel{\‾}{A_w}-A_b)-{\stackrel{\‾}{A}}_{{\mathrm{NO}}_2^{-}-N-a}}{b}$

式中：

——水样中硝酸盐浓度，单位为μmol/L；

——水样测得的平均吸光值；

A_b——样品空白吸光值(样品盐度对应下的人工海水空白吸光值)；

——该水样在“亚硝酸盐测定”时测得的已扣除空白吸光值的平均吸光值；

a——标准工作曲线截距；

b——标准工作曲线斜率。

优选，所述的硝酸盐标准溶液为0.1mmol/L硝酸盐溶液，然后分别用5、20的人工海水进行梯度稀释，使硝酸盐-氮的浓度依次为0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、14、16μmol/L，得到各梯度稀释的硝酸盐溶液。

由于本发明所使用的各个测试样品只需要1ml，因此装样的时候只需要使用2ml圆底离心管，操作过程简单，不需要洗刷广口玻璃瓶，降低了由于洗刷玻璃瓶不干净带来的实验误差，测定完毕之后离心管直接废弃，减少了人力物力，出海不需要携带超纯水、泡玻璃瓶的酸缸等，更防止了船上颠簸带来的玻璃仪器损坏。

采用1ml反应体系，相对于常规25ml体系，减少了水体样品的使用量，解决了每个航次CTD采水量不够，需要多次采样、船时长的问题，以及大规模海洋调查采样需携带水体样品量多、样品保存、后期处理困难等的问题，同时适合小体系水体硝酸盐的测定，例如测定不同时间12ml顶空进样甁(labco)小体系水体中本底硝酸盐浓度，若按照常规方法，则面临一个严重问题：水体样品不足，经过多次大体系采样之后，难以保持原有体系的状况，而采用1ml体系，根据样品浓度差异，每次需样量为50μl～800μl(样品浓度高时，只需少量样液，通过稀释即可，而样品浓度低，则需样液量多)，就能测定出本底硝酸盐浓度。

采用1×1.5cm²的锌卷，相对于常规方法的3×5cm²，减少了锌卷的消耗，充分利用锌卷，以最小的锌卷面积达到最大、最稳定的还原率。

采用vortex-genie2涡旋混合器使得锌-镉反应更为充分。常规方法是采用摇床，锌卷在广口玻璃瓶中左右旋转摇晃，空间较大，锌卷很难与玻璃瓶壁碰撞，若转速较快，即使发生碰撞也是频率不一致，发生不规则碰撞，而采用2ml离心管，在涡旋混合器震荡过程中，锌卷与管壁碰撞频率增加，发生着规律碰撞。由于锌卷与管壁碰撞频率增加，使得反应过程中，镉更容易镀在锌卷表面，反应速率增加，还原率变大。同时，使得影响常规锌-镉还原反应最重要的盐效应大大减弱，这也是我们方法改进后的一重要发现。

测定吸光值时使用96孔多功能酶标仪，测定过程变得更加简单，只需要使用移液枪依次转移300μl溶液至酶标板中，以人工海水为参照，于酶标仪中测定。与常规分光光度计法相比，省去了转移溶液、用纸巾擦拭比色皿表面溶液、逐一手动测定样品等的繁琐步骤，适用于船上实时测定大批量样品。

采用该发明创造1h内可以测定36个样品。耗时如下：实验耗材准备(离心管、锌卷裁剪)共15min，添加锌卷震荡10min，加磺胺混合反应5min，加盐萘混合反应10min，转移液体至96孔板5min，酶标仪测定需时15min。

综上所述，本发明设计了1ml的反应体系，通过优化1ml反应体系中各溶液用量，以及锌卷用量以及反应时间，使得体系的稳定性好，还原率高，本发明操作简单、耗时少、需要样品量少等，解决了常规水体硝酸盐测定方法使用样品量多、耗时长、过程繁琐等问题，是一种在海上简单、准确、实时测定水体微量硝酸盐的方法。

附图说明：

图1是硝酸盐标准工作曲线(盐度为5)；适用于河口高硝酸盐浓度、低盐度淡水样品(盐度0～15)硝酸盐浓度测定。

图2是硝酸盐标准工作曲线(盐度为20)；适用于海洋低硝酸盐浓度、高盐度海水样品(盐度20～35)硝酸盐浓度测定。

图3是亚硝酸盐标准工作曲线；

图4是不同盐度下的还原率。相同浓度下，随着盐度的增加，还原率呈现急速上升后缓慢下降的趋势；相同盐度，不同浓度之间的还原率基本吻合。盐度在5～7之间，还原较高且稳定，适合河口淡水硝酸盐测定，而盐度在20～35之间，还原率基本相同，适合海水硝酸盐测定。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1、实验仪器与试剂

Infinite M200Pro多功能酶标仪(瑞士/Tecan)；vortex-genie2涡旋混合器(美国scientificindustry)。

硝酸盐标准溶液(0.1μmol/L)；亚硝酸盐标准溶液(0.1μmol/L)；人工海水(NaCl溶解于蒸馏水配制而成)；锌片(国药集团化学试剂有限公司，纯度99.99％，厚度0.1mm，面积1×1.5cm2，使用前用超纯水冲洗干净)；氯化镉溶液(20g/l)；对氨基苯磺酰胺溶液(10g/l)；1-奈替乙二胺二盐酸溶液(1g/l)。

2、标准工作曲线的制定：

2.1在两组各六个2ml圆底离心管中，分别使用移液枪依次移入硝酸盐标准使用液(0.1mmol/L)0μl、5μl、10μl、20μl、30μl、40μl、60μl、80μl、100μl、120μl、140μl、160μl，分别用盐度分别为5、20的人工海水稀释至1ml，混匀。此标准溶液系列硝酸盐-氮浓度依次为0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、14、16μmol/L。

2.2向上述离心管中依次放入一个锌卷(纯度99.99％，厚度0.1mm，面积1×1.5cm²，使用前用超纯水冲洗干净)，加入20μl氯化镉溶液(20g/l)，迅速使用涡旋混合器(美国scientificindustry)以最小震荡速率、涡旋混合10min。旋转后迅速将离心管中的锌卷取出。

2.3在离心管中加入20μl对氨基苯磺酰胺溶液(10g/l)，混匀，放置5min，再加入20μl1-奈替乙二胺二盐酸溶液(1g/l)，混匀，放置15min。颜色可稳定4h。

2.4颜色稳定后，使用移液枪依次转移300μl溶液至酶标板(96孔)中，在Infinite M200Pro多功能酶标仪(瑞士/Tecan)上，以各自相对应盐度的人工海水作参比，于543nm波长处测定吸光值As。An＝As-A_b，其中A_b为空白吸光值，An为扣除空白后的吸光值，以An为纵坐标，硝酸盐-氮的浓度Cs为横坐标绘制标准工作曲线，并用线性回归法求出标准工作曲线截距a和斜率b。(用盐度为5的人工海水稀释的硝酸盐标准工作曲线如图1所示，用盐度为20的人工海水稀释的硝酸盐标准工作曲线如图2所示)

3、水样测定：

根据水体样品的盐度分为两种方法：①淡水样品(盐度：0～15)和②海水样品(盐度：>15)。

当待测水样为淡水样品时，将该淡水样品的盐度调整为5～10；当待测水样为海水样品时，将该海水样品的盐度调整为17～35；然后取调整盐度后的淡水样品或者海水样品1ml，装入2ml离心管中，在其中加入面积1×1.5cm²锌卷(纯度99.99％，厚度0.1mm，面积1×1.5cm²，使用前用超纯水冲洗干净)，再加入20μl 20g/L的氯化镉溶液，迅速使用涡旋混合器(美国scientific industry)以最小震荡速率、涡旋混合10min。旋转后迅速将离心管中的锌卷取出。再加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，混匀，放置5min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min。颜色可稳定4h。颜色稳定后，使用移液枪依次转移300μl溶液至酶标板(96孔)中，使用Infinite M200Pro多功能酶标仪(瑞士/Tecan)，淡水样品以其样品空白吸光值作为参比，海水样品以其样品空白吸光值作为参比，于543nm波长处测定吸光值，该吸光值减去参比空白吸光值即为待测水样的吸光值A_w；

同时测定待测水样中原有亚硝酸盐的净平均吸光值具体方法是按照海洋调查规范-第4部分：海水化学要素调查中“亚硝酸盐测定”方法测得净平均吸光值(已扣除试剂空白)；

4、锌镉还原率测定

a、淡水样品：各量取1ml盐度为5的人工海水和用盐度为5的人工海水配制含有5.0、10.0μmol/L硝酸盐溶液，分别装入2ml离心管中，在其中加入面积1×1.5cm²锌卷(纯度99.99％，厚度0.1mm，面积1×1.5cm²，使用前用超纯水冲洗干净)，再加入20μl 20g/L的氯化镉溶液，迅速使用涡旋混合器(美国scientific industry)以最小震荡速率、涡旋混合10min。旋转后迅速将离心管中的锌卷取出。再加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，混匀，放置5min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min。颜色可稳定4h。颜色稳定后，使用移液枪依次转移300μl溶液至酶标板(96孔)中，使用Infinite M200Pro多功能酶标仪(瑞士/Tecan)，于543nm波长处测定吸光值，其中A_b1、A_b2相同，都为盐度为5的人工海水的吸光值，分别为含有5.0、10.0μmol/L硝酸盐溶液的吸光值(已扣除试剂空白)；

b、海水样品：各取1ml盐度为20的人工海水和用盐度为20的人工海水配制含有5.0、10.0μmol/L硝酸盐溶液，分别装入2ml离心管中，在其中加入面积1×1.5cm²锌卷(纯度99.99％，厚度0.1mm，面积1×1.5cm²，使用前用超纯水冲洗干净)，再加入20μl 20g/L的氯化镉溶液，迅速使用涡旋混合器(美国scientific industry)以最小震荡速率、涡旋混合10min。旋转后迅速将离心管中的锌卷取出。再加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，混匀，放置5min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min。颜色可稳定4h。颜色稳定后，使用移液枪依次转移300μl溶液至酶标板(96孔)中，在Infinite M200Pro多功能酶标仪(瑞士/Tecan)上，于543nm波长处测定吸光值，其中A_b3、A_b4相同，都为盐度为20的人工海水的吸光值，分别为含有5.0、10.0μmol/L硝酸盐溶液的吸光值(已扣除试剂空白)；

c、各取1ml盐度为5或20的人工海水和用相对应盐度为5或20的人工海水配制含有5.0、10.0μmol/L亚硝酸盐溶液，分别装入2ml离心管中，在其中加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，混匀，放置5min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min。颜色可稳定4h。颜色稳定后，使用移液枪依次转移300μl溶液至酶标板(96孔)中，在InfiniteM200Pro多功能酶标仪(瑞士/Tecan)上，于543nm波长处测定吸光值，其中A_b0为盐度为5或20的人工海水的吸光值，分别为含有5.0、10.0μmol/L亚硝酸盐溶液的吸光值(已扣除试剂空白)；

5、还原率的计算

按照下式计算镀铬锌卷的还原率R：

公式中对应的字母代号如下表所示：

6、计算

水样中硝酸盐-氮浓度按照下式计算：

式中：

——水样中硝酸盐浓度，单位为μmol/L；

——水样测得的平均吸光值；

A_b——样品空白吸光值(样品盐度对应下的人工海水空白吸光值)；

——该水样在“亚硝酸盐测定”时测得的已扣除空白吸光值的平均吸光值；

a——标准工作曲线截距；

b——标准工作曲线斜率。

(1)河口低盐度、高硝酸盐浓度样品测定

选取珠江口上游至下游2个采样点(A、B)的表层水，根据下表每个采样点盐度的不同，用盐度为30的人工海水进行稀释，终盐度为5。按照上述实验流程，测得硝酸盐标准曲线如图1，截距为0.0005，斜率为0.0319；测得亚硝酸盐标准曲线如图3，截距为0.001，斜率为0.0465；计算还原率为70％；再进行计算水样中硝酸盐-氮浓度，计算得到的硝酸盐浓度如下表2所示：

表2珠江口A、B站点水体参数

(2)海洋高盐度、低硝酸盐浓度样品测定

选取南海东北部SEATS站点(21.5°N,118°E)不同深度海水样品(共9层)，根据下表的稀释倍数，使用超纯水进行稀释，调整盐度为17～35。按照上述实验流程，测得硝酸氮标准曲线如图2，截距为0.0028，斜率为0.028；测得亚硝酸盐标准曲线如图3，截距为0.001，斜率为0.0465；还原率为60％；按照公式代入数值可以计算出结果，得到硝酸盐浓度如表3所示：

表3南海28#站点不同深度(共9层)海水样品参数

实施例2：

锌镉还原法测定水体硝酸盐浓度过程中最容易受到盐度影响，盐度影响实验的还原率，为了确定最佳实验反应条件，使得实验结果更加准确，本例按照以下的实验流程增加了盐度、影响的实验，具体流程如下：

A、盐度的影响：

通过在标准溶液(5μmol/L、10μmol/L)中加入不同量的标准海水，得到不同盐度的样品，共10个盐度梯度：0，1，2.5，5，7.5，10，15，20，30，35。各取1ml溶液分别装入2ml离心管中，在其中加入面积1×1.5cm²锌卷(纯度99.99％，厚度0.1mm，面积1×1.5cm²，使用前用超纯水冲洗干净)，再加入20μl 20g/L的氯化镉溶液，迅速使用涡旋混合器(美国scientific industry)以最小震荡速率、涡旋混合10min。旋转后迅速将离心管中的锌卷取出。再加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，混匀，放置5min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min。颜色可稳定4h。颜色稳定后，使用移液枪依次转移300μl溶液至酶标板(96孔)中，使用Infinite M200Pro多功能酶标仪(瑞士/Tecan)，于543nm波长处分别测定10个不同盐度下5μmol/L和10μmol/L硝酸盐浓度吸光值A_bn为对应盐度下的人工海水吸光值。

各取1ml盐度为5或20的人工海水和用相对应盐度为5或20的人工海水配制含有5.0、10.0μmol/L亚硝酸盐溶液，分别装入2ml离心管中，在其中加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，混匀，放置5min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min。颜色可稳定4h。颜色稳定后，使用移液枪依次转移300μl溶液至酶标板(96孔)中，使用InfiniteM200Pro多功能酶标仪(瑞士/Tecan)，于543nm波长处测定吸光值，其中A_b0为不同盐度下对应人工海水吸光值，分别为含有5.0、10.0μmol/L亚硝酸盐溶液的吸光值(已扣除试剂空白)；代入公式可以算出各自的还原率，以还原率为纵坐标，盐度梯度为横坐标作图。

$R=\frac{A_{{\mathrm{NO}}_3^{-}-\mathrm{Nn}}-A_{\mathrm{bn}}}{A_{{\mathrm{NO}}_2^{-}-\mathrm{Nn}}-A_{b0}}\×100\%$

结果如图4所示，发现：1、盐度为5～7时，还原率较高(>70％)，却达到稳定。2、盐度20～35时，还原率虽然不高，但也达到稳定。这一结果为我们提供了测定低盐度高硝酸盐浓度的河口水体以及高盐度低硝酸盐浓度的海洋水体的两种方法。河口水体浓度高需要稀释较多倍数，才能达到检测范围，按照盐度为5～7的范围，容易操作；而海洋水体盐度高浓度低，不能稀释过高倍数，因此选取盐度为5～7作为基质浓度的话，容易产生误差，造成测量不准，而这一种方法发现盐度20～35之间还原率达到稳定，因此给我们测定高盐度海水带来方便，甚至可以不用稀释，海水样品直接测定。

按照盐度区分淡水和海水硝酸盐测定方法在国内乃至还是首次提出。

Claims (2)

1.一种小体系快速测定水体硝酸盐的方法，其特征在于，包括以下步骤：

一、当待测样品为淡水样品时：

A、标准工作曲线的制定：

配制硝酸盐标准溶液，采用盐度为5.0的人工海水进行梯度稀释，再取各梯度稀释的硝酸盐溶液1.0ml，在其中加入面积1×1.5cm²锌卷，再加入20μl 20g/L的氯化镉溶液，用涡旋混合器震荡涡旋混合10min，然后将锌卷取出，再加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，放置5min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min，将待测溶液转移到酶标板中，以盐度为5.0的人工海水作参比，用酶标仪于543nm波长处测定吸光值As，An＝As-A_b，其中A_b为空白吸光值，An为扣除空白后的吸光值，以An为纵坐标，硝酸盐-氮的浓度Cs为横坐标绘制标准工作曲线，并用线性回归法求出标准工作曲线截距a和斜率b；

B、水样测定：

将该淡水样品的盐度调整为5～10，取调整盐度后的淡水样品1ml，在其中加入面积1×1.5cm²锌卷，再加入20μl 20g/L的氯化镉溶液，用涡旋混合器震荡涡旋混合10min，然后将锌卷取出，再加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，放置5min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min，将待测溶液转移到酶标板中，以该淡水样品空白吸光值作为参比，用酶标仪于543nm波长处测定吸光值，该吸光值减去参比空白吸光值即为待测水样的吸光值A_w；

同时测定待测水样中原有亚硝酸盐的净平均吸光值

C、锌镉还原率测定

a、淡水样品：各量取1.0ml盐度为5.0的人工海水和用盐度为5.0的人工海水配制含有5.0、10.0μmol/L硝酸盐溶液，分别在其中加入面积1×1.5cm²锌卷，再加入20μl 20g/L的氯化镉溶液，用涡旋混合器震荡涡旋混合10min，然后将锌卷取出，再加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，放置5.0min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min，将待测溶液转移到酶标板中，用酶标仪于543nm波长处测定吸光值，其中A_b1、A_b2相同，都为盐度为5.0的人工海水的吸光值，分别为已扣除试剂空白吸光值的含有5.0、10.0μmol/L硝酸盐溶液的吸光值；

b、各取1.0ml盐度为5.0的人工海水和用盐度为5.0的人工海水配制含有5.0、10.0μmol/L亚硝酸盐溶液，在其中加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，放置5min，再加入20μl 1g/L1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min，将待测溶液转移到酶标板中，用酶标仪于543nm波长处测定吸光值，其中A_b0为盐度为5的人工海水的吸光值，分别为已扣除试剂空白吸光值的含有5.0、10.0μmol/L亚硝酸盐溶液的吸光值；

二、当待测样品为海水样品时

A、标准工作曲线的制定：

配制硝酸盐标准溶液，采用盐度为20的人工海水进行梯度稀释，再取各梯度稀释的硝酸盐溶液1ml，在其中加入面积1×1.5cm²锌卷，再加入20μl 20g/L的氯化镉溶液，用涡旋混合器震荡涡旋混合10min，然后将锌卷取出，再加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，放置5min，再加入20μl 1g/L1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min，将待测溶液转移到酶标板中，以盐度为20的人工海水作参比，用酶标仪于543nm波长处测定吸光值As，An＝As-A_b，其中A_b为空白吸光值，An为扣除空白后的吸光值，以An为纵坐标，硝酸盐-氮的浓度Cs为横坐标绘制标准工作曲线，并用线性回归法求出标准工作曲线截距a和斜率b；

B、水样测定：

将该海水样品的盐度调整为17～35，取调整盐度后的海水样品1ml，在其中加入面积1×1.5cm²锌卷，再加入20μl 20g/L的氯化镉溶液，用涡旋混合器震荡涡旋混合10min，然后将锌卷取出，再加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，放置5min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min，将待测溶液转移到酶标板中，以该海水样品空白吸光值作为参比，用酶标仪于543nm波长处测定吸光值，该吸光值减去参比空白吸光值即为待测水样的吸光值A_w；

同时测定待测水样中原有亚硝酸盐的净平均吸光值

C、锌镉还原率测定

a、海水样品：各取1ml盐度为20的人工海水和用盐度为20的人工海水配制含有5.0、10.0μmol/L硝酸盐溶液，分别在其中加入面积1×1.5cm²锌卷，再加入20μl 20g/L的氯化镉溶液，用涡旋混合器震荡涡旋混合10min，然后将锌卷取出，再加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，放置5min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min，将待测溶液转移到酶标板中，用酶标仪于543nm波长处测定吸光值，其中A_b3、A_b4相同，都为盐度为20的人工海水的吸光值，分别为含有5.0、10.0μmol/L硝酸盐溶液的吸光值；

b、各取1ml盐度为20的人工海水和用盐度为20的人工海水配制含有5.0、10.0μmol/L亚硝酸盐溶液，在其中加入20μl 10g/L对氨基苯磺酰胺溶液，放置5min，再加入20μl 1g/L 1-奈替乙二胺二盐酸溶液，混匀，放置15min，将待测溶液转移到酶标板中，用酶标仪于543nm波长处测定吸光值，其中A_b0为盐度为20的人工海水的吸光值，分别为已扣除试剂空白吸光值的含有5.0、10.0μmol/L亚硝酸盐溶液的吸光值；

D、还原率的计算

按照下式计算镀铬锌卷的还原率R：

$R=\frac{A_{{\mathrm{NO}}_3^{-}-\mathrm{Nn}}-A_{\mathrm{bn}}}{A_{{\mathrm{NO}}_2^{-}-\mathrm{Nn}}-A_{b0}}\×100\%$

公式中对应的字母代号如下表所示：

E、计算

水样中硝酸盐-氮浓度按照下式计算：

$c\left({\mathrm{NO}}_3^{-}\right)=\frac{(\stackrel{\‾}{A_w}-A_b)-{\stackrel{\‾}{A}}_{{\mathrm{NO}}_2^{-}-N}-a}{b}$

式中：

——水样中硝酸盐浓度，单位为μmol/L；

——水样测得的平均吸光值；

A_b——样品盐度对应下的人工海水空白吸光值；

——该水样在“亚硝酸盐测定”时测得的已扣除空白吸光值的平均吸光值；

a——标准工作曲线截距；

b——标准工作曲线斜率。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的硝酸盐标准溶液都为0.1mmol/L硝酸盐溶液，然后分别用盐度5或20的人工海水进行梯度稀释，使硝酸盐-氮的浓度依次为0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、14、16μmol/L，得到各梯度稀释的硝酸盐溶液。