DE19811313A1 - Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Inosin 5'-monophosphat dehydrogenase - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Inosin 5'-monophosphat dehydrogenase (IMPDH) im Blut eines Patienten, das insbesondere zur diagnostischen Überwachung von IMPDH-behandelten Patienten geeignet ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Inosin-5'-monophosphat dehydrogena­ se (IMPDH) im Blut von Patienten sowie die Anwendung dieses Verfahrens zum therapeutischen Monitoring sowie zum Monitoring des immunsuppressiven Status von Patienten, welche mit IMPDH-In­ hibitoren behandelt wurden. Gegenstand der Erfindung ist au­ ßerdem ein Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens.

Das Enzym Inosin 5'-monophosphat dehydrogenase (IMPDH : NAD Oxidoreductase, E.C. 1.2.1.14) ist das Schlüsselenzym des Bio­ synthesewegs von Guanin-Nucleotiden. In einer NAD-abhängigen Reaktion wird Inosin 5'-monophosphat (IMP) durch IMPDH zu Xan­ thosin 5'-monophosphat (XMP) oxidiert. Proliferierende Zellen benötigen hohe Mengen an Guanosin-triphosphat (GTP), so daß die IMPDH-katalysierte Reaktion zum geschwindigkeitsbestimmen­ den Schritt bei der Bereitstellung von GTP wird. Die Biosyn­ these von Guanin-Nucleotiden wird schematisch in Fig. 1 darge­ stellt

In humanem Gewebe sind zwei Formen von IMPDH unterscheid­ bar. Struktur und katalytische Eigenschaften beider Formen, als Typ I und Typ II bezeichnet, sind gut charakterisiert. Northern-Blot Analysen von mRNA, aus verschiedenem Gewebe iso­ liert, ergaben, daß beide Isoformen exprimiert werden (Senda M, Natsumeda, Y.: Tissue Differential Expression of Two Di­ stinct Genes for Human IMP Dehydrogenase (E.D.1.1.1.205), Life Sciences 54, Nr. 24, 1917-1926 (1994)). Befunde allerdings, wonach in proliferierenden Zellen quantitativ Typ II-IMPDH überwiegt, in ruhenden Zellen dagegen Typ I, führten zur Klas­ sifizierung in die "konstitutive Typ I-IMPDH" und die "induzierbare Typ II-IMPDH" (Nagai, M., Natsumeda, Y., Weber, G.: Proliferation-linked Regulation of Type II IMP Dehydroge­ nase Gene in Human Normal Lymphocytes and HL-60 Leukemic Cells, Cancer Research 52, 258-261 (1992)).

In Tumorzellen und proliferierenden Lymphozyten konnten substantiell erhöhte Enzymaktivitäten gemessen werden (Konno Y, Natsumeda Y, Nagai M, Yamaji Y, Ohno S, Suzuki K, Weger G: Expression of Human IMP Dehydrogenase Types I and II in Esche­ richia coli and Distribution in Human Normal Lymphocytes and Leukemic Cell Lines, The Journal of Biological Chemistry 266, No. 1, 506-509 (1991); Collart FR, Huberman E: Expression of IMP Dehydrogenase in Differentiating HL-60 Cells, Blood 75, No. 3, 570-576 (1990); Collart FR, Chupp CB, Mirkin BL, Hu­ berman E: Increased Inosine-5'-phosphate Dehydrogenase Gene Expression in Solid Tumor Tissues and Tumor Cell Lines, Cancer Research 52, 5826-5828 (1992); Kiguchi K, Collart FR, Hen­ ning-Chubb C, Huberman E: Induction of Cell Differentiation in Melanoma Cells by Inibitors of IMP Dehydrogenase: Altered Pat­ terns of IMP Dehydrogenase Expression and Acitvity, Cell Growth & Differentiation 1, 259-270 (1990); Stadler PB, Pen­ nacchi J, Sherley JL: Inosine-5'-Monophosphate Dehydrogenase Activity is Maintained in Immortalized Murine Cells Growth- Arrested by Serum Deprivation, Advan Enzyme Regul 34, 91-106 (1994); Huberman E, Glesne D, Collart F: Regulation and Role of Inosine-5'-Monophosphate Dehydrogenase in Cell Replication, Malignant Transformation and Differentiation, Advances in Ex­ perimental Medicine and Biology 370, 741-746 (1995)). Daher ist die Arzneistoff-vermittelte Hemmung der IMPDH ein mögli­ cher Ansatzpunkt ("target") zur Therapie von Krebserkrankungen und insbesondere zur Immunsuppression nach Organtransplantati­ on.

Das Konzept der Immunsuppression durch IMPDH-Hemmung gründet auf der Tatsache, daß mit Hemmung der IMPDH gezielt die Proliferation der für die Immunantwort verantwortlichen T- und B-Lymphozyten gehemmt werden kann, da beide Zelltypen den "Salvage-pathway" zur Nucleotidsynthese nicht aktivieren kön­ nen, während andere Zellen den GTP-Pool durch den alternativen Versorgungsweg auffüllen können (Ransom, JT: Mechanism of Action of Mycophenolate Mofetil, Therapeutic Drug Monitoring 17, Nr. 6, 681-684 (1995)).

Mit Bredinin® (Wirkstoff: Mizoribine) und CellCept® (Wirkstoff: Mycophenolat mofetil) wurden zwei IMPDH-In­ hibitoren klinisch entwickelt und werden heute erfolgreich zur immunsupressiven Therapie eingesetzt, wobei Bredinin® bis­ lang nur in Japan zugelassen ist. Ein weiterer Wirkstoff, VX-497 (Pressemitteilung der Fa. Vertex, Cambridge, MA, 2. Dezem­ ber 1996), der im Vergleich zu den bislang eingesetzten IMPDH-In­ hibitoren wesentlich weniger Nebenwirkungen verursachen soll, soll auch für die Behandlung chronischer Autoimmuner­ krankungen, wie Asthma, Psoriasis, rheumatoide Arthritis und systemischen Lupus erythematodes, geeignet sein.

Nachteiligerweise beruht die Dosierung dieser immunsup­ pressiven Medikamente allein auf Erfahrungen von klinischen Prüfungen und auf deren pharmakokinetischen Eigenschaften. In­ dividuelle Dosisanpassungen sind derzeit nicht möglich, da nach heutigem Kenntnisstand die quantitative Bestimmung des Wirkstoffs in Blut keine Aussage über den immunsuppressiven Status zuläßt. Daher wurde die Bestimmung der IMPDH-Aktivität als pharmakodynamischer Parameter als mögliche Alternative zur Optimierung der Therapie mit IMPDH-Inhibitoren in mehreren Pu­ blikationen diskutiert (Langman LJ, LeGatt DF, Yatscoff RW: Pharmacodynamic Assessment of Mycophenolic Acid-Induced Immu­ nosuppression by Measuring IMP Dehydrogenase Activity, Clin Chem 41, No. 2, 295-299 (1995); Langman LJ, Shapiro AJ, La­ key RT, LeGatt DF, Kneteman NM, Yatscoff RW: Pharmacodynamic assessment of mycophenolic acid induced immunosuppression by measurement of IMP dehydrogenase in a canine model, Transplan­ tation 61, 87-92 (1996); Langman LJ, LeGatt DF, Halloran PF, Yatscoff RW: Pharmacodynamic Assessment of Mycophenolic Acid-In­ duced Immunosuppression in Renal Transplant Recipients, Transplantation 62, 666-672 (1996); Langman LJ, Nakakura H, Thliveris JA, LeGatt DF, Yatscoff RW: Pharmacodynamic Monito­ ring of Mycophenolic Acid in Rabbit Heterotopic Heart Trans­ plant Model, Therapeutic Drug Monitoring 19, 146-152 (1997)).

In der Vergangenheit wurden verschiedene Methoden zur Messung der IMPDH-Enzymaktivität publiziert. Diese sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle 1

Publizierte Verfahren zur Bestimmung der IMPDH-Aktivität

Die Methoden [1]-[6] sind in den folgenden Literatur­ stellen näher erläutert:
Methode [1]: Hager PW, Collart FR, Huberman E, Mitchell B: Recombinant Human Inosine Monophosphate Dehydrogenase Type I and Type II Proteins, Biochemical Pharmacology 49, No. 9, 1323-1329 (1995);
Methode [2]: Ikegami T, Natsumeda Y, Welor G: Direct as­ say method for inosine 5'-monophosphate dehydrogenase activi­ ty, Anal Biochem 150, 155-166 (1985);
Methode [3]: Proftitt RT, Pathak VK, Villacorte DG, Pres­ ant CA: Sensitive radiochemical assay for inosine 5'-mo­ nophosphate dehydrogenase and determination of activity in murine tumor tissue extracts, Cancer Res 43, 1620-1623 (1983);
Methode [4]: Langman LJ, LeGatt DF, Yatscoff RW: Pharmacodynamic Assessment of Mycophenolic Acid-Induced Im­ munosuppression by Measuring IMP Dehydrogenase Activity, Clin Chem 41, No. 2, 295-299 (1995);
Methode [5]: Balzarini JB, de Clercq E: Assay method for monitoring the inhibitory effects on antimetabolites on the activity of inosine dehydrogenase in intact human CEM lym­ phocytes, Biochemistry 287, 785-790 (1992);
Methode [6]: Montero C, Duley JA, Fairbanks LD, McBride MB, Micheli V, Cant AJ, Morgan G: Demonstration of induction of erythrocyte inosine monophosphate dehydrogenase activity in Ribavirin-treated patients using a high performance liquid chromatography linked method., Clin Chem Acta 238, 169-178 (1995).

Das Verfahren von Balzarini und de Clercq (Methode [5]), das auf der Verwendung von [³H]-markiertem Hypoxanthin oder [³H]-markiertem Inosin beruht und aufgrund der Membrangängig­ keit von Hypoxanthin (HX) und Inosin (Ino) mit intakten Zellen durchgeführt wird, wurde von der Arbeitsgruppe von Yatscoff weiterentwickelt [Methode [4]) und als Möglichkeit zum pharma­ kodynamischen Monitoring vorgestellt. Die Autoren führten die Untersuchungen jedoch in aus Vollblut gewonnenen Zellfraktio­ nen durch und berichteten, daß die in diesem Kompartiment be­ stimmte Aktivität auch die in Lymphozyten vorhandene Aktivität repräsentiere. Aus eigenen Untersuchungen der Anmelderin geht jedoch hervor, daß diese Aussage zwar für Vollblut von gesun­ den Versuchspersonen zutrifft und somit auch für die beschrie­ benen Tierexperimente, in deren Rahmen ein IMPDH-Inhibitor einmalig verabreicht wurde, zutreffen kann. Bei Transplantati­ onspatienten allerdings, denen ein IMPDH-Inhibitor täglich verabreicht wird, konnte dieser Befund durch die Untersu­ chungsergebnisse der Anmelderin überraschenderweise nicht be­ stätigt werden.

Ein weiterer Nachteil ist darin zu sehen, daß Hypoxanthin (HX) auch Substrat der ubiquitär vorkommenden Xanthin-Oxidase (XO) ist. Bei der XO-vermittelten Oxidation von HX zu Xanthin und weiter zu Harnsäure wird aus dem Substrat [2,8-³H₂]-HX ebenfalls ³H freigesetzt. Sollte diese Reaktion in größerem Umfang ablaufen, repräsentiert das gemessene Tritium nicht nur die IMPDH-, sondern auch die XO-Aktivität.

Die Methode [4] ist demnach zur IMPDH-Ak­ tivitätsbestimmung in mit IMPDH-Inhibitoren behandelten Transplantationspatienten nicht geeignet. Ursache hierfür ist, daß die IMPDH-Aktivität in Erythrocyten von gesunden Personen sehr gering ist, unter Therapie mit IMPDH-Inhibitoren jedoch auf ein Vielfaches des Basiswerts ansteigt und die in Lym­ phocyten vorhandene Aktivität völlig überlagert. Außerdem erfor­ dern die Methoden [4] und [5] den Einsatz tritiierter Verbin­ dungen, was gesundheitlich bedenklich ist und außerdem aufwen­ dige Sicherheitsmaßnahmen erfordert. Gleiches gilt für die Verwendung des teuren Kohlenstoffisotops ¹⁴C gemäß den Verfah­ ren nach den Methoden [2] und [3]. Die Methode [1] erfordert die aufwendige Reinigung der IMPDH und die Methode [6] mißt lediglich die IMPDH-Aktivität in Erythrozyten. Die Methoden [4] und [5] besitzen außerdem den konzeptionellen Nachteil, daß aufgrund der verwendeten Substrate (Hypoxanthin und Inosin) die der eigentlichen IMPDH-katalysierten Reaktion vorgeschalteten enzymatischen Umsetzungen im Test miterfaßt werden. Störungen dieser vorgeschalteten enzymatischen Umsetzungen bergen die po­ tentielle Gefahr einer Fehlinterpretation der ermittelten Mess­ ergebnisse.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, ein Ver­ fahren zur Bestimmung der Aktivität des Enzyms IMPDH bereitzu­ stellen, das die oben beschriebenen Nachteile des Standes der Technik vermeidet.

Die vorliegende Aufgabe wird überraschenderweise gelöst durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung der en­ zymatischen Aktivität von IMPDH im Blut eines Säugers, insbe­ sondere eines Menschen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man mit einem Lysat einer mononukleäre Zellen enthaltenden Zellfraktion aus dem Blut des Säugers eine IMPDH-katalysierte enzymatische Reaktion in einem radioaktivitätsfreien Reakti­ onsansatz durchführt und aus der pro Zeiteinheit gebildeten Menge eines dabei entstehenden nicht-radioaktiven Reaktions­ produkts die IMPDH-Aktivität im Blut des Säugers ermittelt.

Der verwendete Reaktionsansatz umfaßt dabei wenigstens ein nicht-radioaktives Substrat für IMPDH und gegebenenfalls wenigstens ein nicht-radioaktives Cosubstrat für IMPDH.

Ein besonders bevorzugt eingesetztes Substrat ist Inosin-5'-mo­ nophosphat (IMP), welches von IMPDH in Gegenwart des Co­ substrats Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) unter Bildung von NADH in Xanthosin-5'-monophosphat (XMP) umgewandelt wird. Aus der Menge an gebildetem XMP (i.e. Produkt) bzw. NADH (i.e. Co­ produkt) kann anschließend auf die IMPDH-Aktivität in der un­ tersuchten Blutprobe zurückgerechnet werden. Die genaue Auswer­ tung wird später durch Angabe von Berechnungsformeln detail­ liert erläutert. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung von IMP als Substrat beschränkt. Genauso denkbar ist die Verwendung nicht-radioaktiver IMP-Analoga, d. h. von Verbindungen, welche von IMPDH ebenfalls umgesetzt werden.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Er­ findung werden dem Lysat als nicht-radioaktives Substrat IMP und als nicht-radioaktives Cosubstrat NAD in geeigneten Kon­ zentrationen, wie z. B. im Bereich von 0,1 bis 10 mM, zuge­ setzt. Eine bevorzugte NAD- bzw. IMP-Konzentration liegt z. B. bei etwa 0,25 mM. Die gewählte Substrat- bzw. Cosubstratkonzen­ tration sollte jedenfalls so gewählt sein, daß im jeweiligen Beobachtungszeitraum, wie z. B. 5 min bis 2 h, der Anstieg von XMP bzw. NADH, im Reaktionsansatz linear verläuft.

Vorzugsweise führt man die IMPHD-katalysierte enzymatische Reaktion außerdem in Gegenwart von Allopurinol und/oder EDTA durchführt, um gegebenenfalls Verfälschungen der Meßergeb­ nisse vorzubeugen (was später noch näher erläutert werden wird).

Die Auswertung des Nachweisverfahrens erfolgt vorzugswei­ se dadurch, daß man die Menge eines bei der enzymatischen Re­ aktion gebildeten nicht-radioaktiven Produkts (i.e. Reaktions­ produkt des eingesetzten Substrats) und/oder eines nicht­ radioaktiven Coprodukts (i. e. Reaktionsprodukt des eingesetz­ ten Cosubstrats) direkt oder nach deren weiteren chemischen oder enzymatischen Umsetzung, vorzugsweise quantitativ, be­ stimmt. Eine chemische oder enzymatische Umsetzung ist immer dann empfehlenswert, wenn dadurch ein einfacheres, störungs­ freieres oder empfindlicheres Nachweisverfahren für die zu analysierende Substanz ermöglicht wird.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform be­ stimmt man bei der Auswertung des erfindungsgemäßen Verfahrens das gebildete XMP, und zwar vorzugsweise nach chemischer De­ glycosidierung zu Xanthin und Ermittlung der Xanthinmenge. Ei­ ne andere bevorzugte Ausführungsform umfaßt die Bestimmung des gebildeten NADH's.

Die Mengenbestimmung des jeweils untersuchten Analyten kann dabei chromatographisch, photometrisch, fluorimetrisch oder luminometrisch erfolgen. Die Xanthinbestimmung erfolgt vorzugsweise chromatographisch; die NADH-Bestimmung erfolgt dagegen vorzugsweise photometrisch.

Die zur gebildeten XMP-Menge proportionale Menge an gebildetem NADH kann beispielsweise spektrophotometrisch durch Bestimmung der Extinktion bei 340 nm ermittelt werden. Weiterhin besteht die Möglichkeit, die gebildete NADH-Menge unmittelbar durch Fluorimetrie zu bestimmen. Zu diesem Zweck induziert man mit einer Anregungswellenlänge von z. B. 340 nm im Reaktionsgemisch Fluoreszenz und bestimmt bei einer Wellenlänge von z. B. 460 nm das emittierte Licht mit Hilfe eines Fluorimeters (vgl. z. B. Gleeson, M. et al., Clinica Chimica Acta, 166 (1987) 163-169). Zur Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit ist es außerdem denkbar, einen gekoppelten optischen Test durchzuführen. Ein geeignetes Testsystem stellt beispielsweise ein Biolumineszenz-Test­ system, basierend auf den Enzymen Flavindehydrogenase und bakterieller Luciferase, dar. Bei diesem System werden die anfallenden NADH-Reduktionsäquivalente mit Hilfe des Enzyms Flavindehydrogenase in Gegenwart von Flavinmononukleotid (FMN) in FMNH₂ überführt. Bakterielle Luciferase setzt FMNH₂ in Gegenwart von Luftsauerstoff und einem langkettigen, aliphatischen Aldehyd unter Lichtemission um. Das emittierte Licht ist bei etwa 490 nm nachweisbar und dem gebildeten NADH proportional (vgl. Holme, D. J. und Peck, H. Analytical Biochemistry (1983) Longman Group Ltd. Hrsg, S. 272. ff; Wieland, E. et al., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1985), 23, 99-103).

Die NADH-Bildung kann nicht nur wie oben beschrieben in Lösung durchgeführt werden. Vielmehr ist es auch denkbar, NAD oder geeignete Analoga in an sich bekannter Weise an eine stationäre Phase, wie z. B. einen Teststreifen oder ein Probenröhrchen, zu immobilisieren. Die oben beschriebene IMPDH-Nachweisreaktion wird dann in Gegenwart des immobilisierten NAD's durchgeführt. Zur Beendigung des Tests wird der Reaktionsansatz von der immobilisiertes NADH enthaltenden Phase abgetrennt und deren NADH-Gehalt wird in einem geeigneten Analysator, z. B. photometrisch, bestimmt.

Eine weitere Möglichkeit zur Bestimmung des gebildeten NADH's besteht in dessen enzymatischer, NADH Oxidase­ katalysierter Umsetzung zu NAD unter Bildung von Wasserstoff­ peroxid. Die gebildete Peroxidmenge ist proportional zum gebildeten NADH und kann in verschiedener Weise bestimmt werden. Beispielsweise kann gebildetes Wasserstoffperoxid mittels einer oxidativen Kupplungsreaktion, wie beispielsweise beschrieben in der EP-A-0 530 732, nachgewiesen werden. Es ist aber auch denkbar, das gebildete Wasserstoffperoxid mit einer spezifischen Wasserstoffperoxid-Elektrode zu quantifizieren (vgl. z. B. Tabata, M., et al., Analytica Chimica Acta (1994), 298, 113-119). Eine andere Möglichkeit, NADH zu quantifizieren wird von Pandey in Anal. Biochem. (1994), 221, 392-396 beschrieben. Es wird vorgeschlagen, die NADH-Bildung mit einer elektrochemischen, durch Tetracyanochinodimethan (TCNQ) vermittelten, Oxidationsreaktion zu koppeln, wobei TCNQ in einer Graphitpasten-Elektrode eingebettet ist.

Zur weiteren Verbesserung der oben beschriebenen Nach­ weisverfahren für NADH ist die Immobilisierung einzelner oder aller an der jeweiligen Nachweisreaktion beteiligten Enzyme denkbar. Eine Immobilisierung besitzt nicht nur den Vorteil, daß die Nachweisempfindlichkeit der jeweiligen Reaktion erhöht wird. Eine Immobilisierung erhöht außerdem die Lebensdauer der verwendeten Enzyme und ermöglicht deren Wiederverwendung. Dies ist von besonderem Nutzen für eine Automatisierung des Nachweisverfahrens. Hochsensitive NADH-Nachweisverfahren, basierend auf verschiedenen immobilisierten Enzymsystemen werden beispielsweise beschrieben von Girotti, S. et al in Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, (1989) 3, 41-45; Roda, et al., in Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, (1989) 4, 423-435; und Ugarova, et al., Anal. Biochem (1988) 173, 221-227.

Eine automatisierte Auswertung des erfindungsgemäßen IMPDH-Tests könnte, ohne darauf beschränkt zu sein, beispielsweise nach folgendem Schema durchgeführt werden:
Nach dem Abstoppen der Reaktion, z. B. durch Zugabe von Säure, wird das NADH-haltige Reaktionsgemisch (Probenvolumen z. B. 5-100 : 1) mittels eines Samplers auf eine vorkonditionierte stationären Phase, wie z. B. eine Mikrosäule, aufgetragen. Auf der stationären Phase, wie z. B. Agarose, Sepharose oder Glasperlen, ist (sind) das (die) für die NADH-Umsetzung erforderliche Enzym(e), wie z. B. NADH Oxidase, Flavindehydrogenase, bakterielle Luciferase, immobilisiert.

Bevorzugt man einen auf Peroxid basierenden elektrochemischen NADH-Nachweis, so verwendet man immobilisierte NADH-Oxidase als stationäre Phase. Das beim Durchgang durch die stationäre Phase gebildete Wasserstoffperoxid gelangt in eine mit einer Wasserstoffperoxid-Elektrode ausgestatteten Durchflußzelle. Der dabei fließende elektrische Strom wird aufgezeichnet und daraus die NADH-Konzentration ermittelt (vgl. Tabata, M. et al. a.a.O.). Nach Abschluß der Messung werden stationäre Phase und Meßzelle durch Waschen und Äquilibrieren auf einen neuen Testzyklus vorbereitet. Peroxid könnte ebenfalls durch Anregung von Chemilumineszenz, wie von DeLuca, M. und McElroy, W. D. in Methods Enzymol (1986), 133, 331-584, beschrieben, quantifiziert werden. Es wäre beispielsweise nämlich denkbar, obige Peroxidelektrode durch eine Chemiluminezenzreaktor zu ersetzen, welcher immobilisierte Peroxidase, wie z. B. Merettich-Peroxidase, enthält. Das Peroxidgemisch wird vor Einleiten in den Reaktor mit Luminol-haltigem Puffer versetzt. Die Intensität des bei Reaktionsablauf emittierten Lichts wird dann photometrisch bestimmt.

Geeignete Vorrichtungen für eine automatisierte, auf Biolumineszenz basierende photometrische NADH-Analyse sind beispielsweise von Roda et al., a.a.O. oder Girotti et al., a.a.O. beschrieben worden. Girotti et al., beschreiben einen in ein Luminometer eingesetzten Biolumineszenzreaktor. Dieser umfaßt als stationäre Phase einen Nylon-Schlauch mit co­ immobilisierter bakterieller Luciferase und Flavindehydro­ genase. Das NADH-haltige Gemisch wird nach Vermischen mit den für die Nachweisreaktion erforderlichen Cofaktoren (FMN) und Substrate (Decanal) durch den Biolumineszenzreaktor geleitet und die Intensität des emittierten Lichts bestimmt. In Abwandlung davon ist auch eine zweistufige Reaktionsführung über zwei verschiedene stationäre Phasen, wie von Roda et al. vorgeschlagen, anwendbar. Das NADH-haltige Gemisch versetzt man zunächst mit einem FMN-haltigen Puffer und leitet es über eine erste stationäre Phase an welcher Flavindehydrogenase immobilisiert ist. Das dabei anfallende FMNH₂-haltige Eluat vermischt man mit einem Biolumineszenzsubstrat enthaltenden Puffer und leitet diese Mischung in den Biolumineszenzreaktor, der lediglich Luciferase in immobilisierter Form enthält. Nach Beendigung der Messung werden die stationären Phasen gespült und äquilibriert und stehen für einen erneuten Testzyklus zur Verfügung.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird nach Abstoppen der Reaktion das gebildete XMP im Sauren und gegebenenfalls unter Wärmezufuhr zu Xanthin deglycosidiert und die auf diese Weise gebildete Xanthinmenge chromatographisch, insbesondere durch HPLC-Chromatographie, quantitativ erfaßt. Durch Zugabe von Allopurinol zum Reaktionsansatz wird die unerwünschte, durch Xanthinoxidase katalysierte Bildung von Xanthin aus Hypoxanthin verhindert.

In den folgenden Abschnitten wird die Gewinnung der zu untersuchenden Blutproben, die erforderliche Probenvorbereitung, die Durchführung und die Auswertung des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens näher erläutert:
Bei der Entnahme der Blutprobe sollte darauf geachtet werden, daß das Entnahmeröhrchen eine anti-koagulierende Sub­ stanz, beispielsweise EDTA oder Li-Heparin, enthält, um ein Gerinnen des Blutes zu vermeiden.

Die Isolierung der mononukleäre Zellen enthaltenden Frak­ tion erfolgt nach üblichen Verfahren, beispielsweise durch Zentrifugation und Abdekantieren des Blutplasmas aus der unge­ rinnbar gemachten Blutprobe. Unter "mononukleären Zellen" ver­ steht man erfindungsgemäß Lymphozyten und Monozyten.

In einer bevorzugten Ausführungsform isoliert man die mo­ nonukleäre Zellen enthaltende Fraktion so, daß nichtmononu­ kleäre Zellen entfernt werden und die so gewonnene Probe im Wesentlichen frei von Erythrozyten, Granulozyten und Thrombo­ zyten, insbesondere im Wesentlichen frei von Erythrozyten ist. Plasma wird bei dieser Verfahrensvariante ebenfalls abge­ trennt. Geeignete Verfahren hierzu sind beispielsweise Dichte­ zentrifugation über einen Gradienten aus Histopaque® oder Dichtezentrifugation über einen Gradienten aus Ficoll und Me­ trizimid (Hypaque) oder Spezialverfahren, beispielsweise bio­ magnetische Separation.

Der erfindungsgemäß isolierten Zellfraktion kann gegebe­ nenfalls ein Aliquot entnommen werden, um die Zellzahl in üb­ licher Weise, wie beispielsweise in einer Thoma-Kammer nach Trypan-Blaufärbung, zu bestimmen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens wird die Erythrozyten-freie mononukle­ äre Zellfraktion vor der Durchführung der Zelllyse in Plasma resuspendiert, das von demselben Säuger (Tier oder Menschen) erhalten wurde, wie die mononukleären Zellen. Insbesondere er­ folgt die Resuspendierung in dem Plasmaüberstand derselben Blutprobe, die auch die mononukleären Zellen enthielt. Dies gewährleistet, daß das erfindungsgemäße in vitro durchgeführ­ te Verfahren eine ex-vivo-Aktivität der IMPDH liefert. Dies ist vor allem dann von Bedeutung, wenn der Proben-Donor mit einem IMPDH-Inhibitor behandelt wurde, der im Blut vorwiegend an Plasmaproteine gebunden vorliegt. Dies ist Untersuchungen der Anmelderin zufolge insbesondere bei Mycophenolat mofetil bzw. dessen freien Wirkstoff Mycophenolsäure (MPA) der Fall. Die Konzentration an freier Mycophenolsäure wird, wie in Fig. 2 dargestellt, sowohl von der Konzentration an Albumin (HSA) als auch von der Konzentration an Mycophenolsäure-Glucuronid (MPAG), dem Hauptmetaboliten von MPA, beeinflußt. Darüber hinaus ist generell anzunehmen, daß die Plasmakonzentration des jeweils verabreichten Wirkstoffs die intrazelluläre IMPDH-In­ hibitorkonzentration und damit die IMPDH-Aktivität signifi­ kant beeinflußt, so daß auch aus diesem Grund die Resuspendie­ rung der Zellen in Plasma von besonderem Vorteil ist.

Die Bestimmung der ex-vivo-Aktivität mit dem in obiger Weise hergestellten Zell-Lysat erfolgt bevorzugt in einem nicht-radioaktiven Reaktionsansatz, wie oben beschrieben. Es ist jedoch ebenfalls denkbar den IMPHD-Test mit den aus dem Stand der Technik bekannten, oben diskutierten radioaktiven Substraten durchzuführen. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der ex-vivo-Aktivität von IMPDH ist also grundsätz­ lich nicht auf die Verwendung nicht-radioaktiver Substrate oder Cosubstrate für IMPDH beschränkt.

Analysen zur Verteilung von MPA in Vollblut zufolge sind im Therapie-relevanten Konzentrationsbereich (etwa 2 bis 20 µg/ml, gemessen etwa 30 bis 40 Minuten nach einer Verabrei­ chung von 1 bis 1,5 g b.i.d. des Wirkstoffs Mycophenolat Mofetil) 99.99% des Wirkstoffs in Plasma enthalten, wobei hiervon 1.25% in Plasmawasser gelöst sind und der verbleiben­ de Anteil an Plasmaproteine, vorwiegend HSA, gebunden ist. Et­ wa 0.01% wurden in der mononukleären Zellfraktion und 0.0005 % in Erythrozyten gefunden.

Die Lyse der erfindungsgemäß verwendeten Zellfraktionen wird, gegebenenfalls nach Suspendieren in Plasma, in bekannter Weise durchgeführt. Beispielsweise kann die Zell-Lyse erfolgen durch Schockfrieren in Trockeneis/Isopropanol oder flüssigem Stickstoff und anschließendes Wiederauftauen der Zellen, durch Mischen mit einem Vortex-Mischer, Ultraschallbehandlung, oder eine geeignete Kombination dieser Methoden. Die in der jeweils lysierten Fraktion enthaltene Zellzahl ist nicht kritisch. Ge­ eigneterweise sollte die Zellzahl jedoch im Bereich von etwa 1.10⁶ bis etwa 1.10⁸, wie z. B. 1.10⁷, Zellen liegen.

Vor Durchführung der enzymatischen Reaktion wird das Ly­ sat vorzugsweise mit einem Puffer verdünnt, der EDTA (Ethylendiamintetraacetat) und/oder Allopurinol enthält. Nichtlimitierende Beispiele für geeignete Puffersysteme sind Tris-Puffer und Phosphat-Puffer, wie Tris-HCl und Kaliumphos­ phat mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 7 bis 8,5 und einer Konzentration im Bereich von etwa 0,005 bis 0,2 Mol/l. Insbe­ sondere können genannt werden: 0,1 M Tris-HCl, pH 8; 0,01 M Tris-HCl, pH 8,0; oder 0,02 M Tris-HCl, pH 8,3; oder 0,1 M Ka­ liumphosphat, pH 7,4. Durch Zugabe von EDTA werden viele Oxi­ doreduktasen, nicht jedoch IMPDH gehemmt. EDTA wird in einer Konzentration verwendet, die ausreicht, um die Aktivität von gegebenenfalls vorhandenen, von zweiwertigen Kationen abhängi­ gen Oxidoreduktasen zu inhibieren. Dadurch werden unerwünschte Konkurrenzreaktionen zur IMPDH-Aktivität weitestgehend unter­ bunden, und das gebildete NADH stellt ein verläßliches Maß für die IMPDH-Aktivität dar. Geeignete EDTA-Konzentrationen liegen z. B. im Bereich von etwa 0,1 bis 10 mM, wie z. B. etwa 1 bis 3 mM. Grundsätzlich kann das erfindungsgemäße Verfahren jedoch auch ohne Beimischung von EDTA durchgeführt werden. Der Xanthinoxidase-Hemmer Allopurinol inhibiert die Oxidation von gegebenenfalls vorhandenem endogenem Hypoxanthin zu Xanthin und Harnsäure und vermeidet so eine Verfälschung der Meßergeb­ nisse. Reproduzierbare Ergebnisse werden insbesondere mit Al­ lopurinol-Konzentrationen zwischen 10 und 200 µg/ml erhalten.

Die Umsetzung des Substrats wird vorzugsweise über einen Zeitraum von 10 bis 120 Minuten, insbesondere 30 bis 90 Minu­ ten durchgeführt. Die Reaktionstemperatur liegt bevorzugt bei etwa 37°C.

Die jeweils geeigneten Testbedingungen, wie Versuchsdauer, Substratkonzentration, sind mit Hilfe geeigneter, dem Fachmann geläufiger Vorversuche in einfacher Weise zu bestimmen. In jedem Fall ist darauf zu achten, daß die enzymatische Umsetzung im Sättigungsbereich des Enzyms mit Substrat, d. h. in einem Substratkonzentrationsbereich durchgeführt wird, in dem der Substratverbrauch bzw. die Produktbildung linear verläuft.

Die IMPDH-katalysierte Reaktion kann in herkömmlicher Wei­ se, beispielsweise durch Zugabe von Säure, Base oder eines or­ ganischen Lösungsmittels oder durch Temperaturerhöhung abge­ stoppt werden. Am geeignetsten ist die Zugabe einer Säure. Ins­ besondere bevorzugt ist die Zugabe eines Aliquots konzentrier­ ter Perchlorsäure (HClO₄). Durch weitere Zugabe von Perchlorsäu­ re und Erhitzen des Reaktionsansatzes, beispielsweise auf Tem­ peraturen im Bereich von 80 bis 120°C, wie z. B. 100°, erfolgt die säurekatalysierte Spaltung der N-glycosidischen Bindung von XMP.

Das dabei gebildete Xanthin kann in geeigneter Weise quan­ titativ bestimmt werden. Besonders bevorzugt führt man die Xanthinbestimmung mittels HPLC (High Performance Liquid Chro­ matography)-Analyse durch. Grundsätzlich können zur quantita­ tiven Bestimmung jedoch auch andere übliche Meßverfahren ein­ gesetzt werden.

Die Auswertung des erfindungsgemäß bevorzugten, auf die HPLC-Analyse von XMP basierenden Verfahrens wird im folgenden Abschnitt näher erläutert. Ausgehend davon bereitete es dem Fachmann keinerlei Schwierigkeiten abgewandelte Verfahren in analoger Weise auszuwerten.

Bei der Auswertung ist zu unterscheiden, ob die IMPDH-Ak­ tivität in einer mononukleäre Zellen enthaltenden Fraktion bestimmt werden soll, die auch andere zelluläre Bestandteile der Blutprobe enthält (Gesamt-Zellfraktion) oder ob, bei­ spielsweise bei einem mit IMPDH-Inhibitoren behandelten Pati­ enten, die zu untersuchende Fraktion frei von Erythrozyten, Granulozyten und Thrombozyten, insbesondere frei von Erythro­ zyten ist.

Bestimmung der IMPDH-Aktivität in einem definierten Volu­ men einer Gesamt-Zellfraktion (WBC-Aktivität):

wobei f für einen Verdünnungsfaktor steht, der beispielsweise 5 beträgt, wenn 1 Vol. WBC mit 4 Vol. Tris-EDTA-Allopurinol-Puf­ fer verdünnt wird. ΔXMP errechnet sich aus den nach 60 bzw. 30 Minuten Reaktionszeit gebildeten XMP-Mengen:

Aus der WBC-Aktivität läßt sich wiederum die IMPDH-Ak­ tivität in einem definierten Volumen Vollblut bestimmen:

wobei HC für Hämatokrit [%] steht.

In Vollblut von gesunden Personen ist die IMPDH-Aktivität überwiegend in Leukozyten lokalisiert. Der Vollblut-Assay er­ möglicht daher auch die Berechnung einer "apparenten" spezifi­ schen Aktivität in Leukozyten:

Eine Differenzierung in weitere Subtypen (Lymphozyten, Monozyten etc.) ist grundsätzlich ebenfalls möglich, erfordert jedoch noch weitere Kenntnisse über möglicherweise vorhandene zell-spezifische Unterschiede.

Bestimmung der IMPDH-Aktivität in einem definierten Volu­ men einer mononukleären Zellfraktion (MNF):
Zur Charakterisierung der IMPDH-Aktivität in Lymphozyten von Patienten, die mit einem IMPDH-Inhibitor über einen länge­ ren Zeitraum therapiert werden, wird die Bestimmung vorzugs­ weise mit mononukleären Zellfraktionen (MNF) durchgeführt wer­ den. Die Aktivität in dem gemessenen Volumen MNF berechnet sich dann wie folgt:

wobei f wie oben definiert ist. Hieraus läßt sich dann die spezifische MNF-Aktivität errechnen:

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum therapeutischen Monitoring von IMPDH-Inhibitor­ behandelten Patienten, wobei man in einer Blutprobe des Patien­ ten die IMPDH-Aktivität in der oben beschriebenen Weise be­ stimmt. Dieses Verfahren ist insbesondere einsetzbar zur indi­ viduellen Dosisoptimierung eines IMPDH-Inhibitors. Dabei be­ stimmt man die IMPDH-Aktivität im Blut eines Patienten bei un­ terschiedlich hohen Dosierungen des IMPDH-Inhibitors und er­ mittelt so die im Hinblick auf das Dosis-Wirkungs-Verhältnis optimale Dosierung des IMPDH-Inhibitors ermittelt. Außerdem kann man für jede dem Patienten verabreichte Dosierung die Konzentration des IMPDH-Inhibitors im Blut, insbesondere im Plasma des Patienten, bestimmen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Monitoring des immunsuppressiven Status von IMPDH-Inhibitor-behandelten Patienten, wobei man in einer Blutprobe des Patienten die IMPDH-Aktivität wie oben beschrieben bestimmt. Insbesondere anwendbar ist dieses Verfahren bei Krebspatienten und Organtransplantationspatienten. Vorzugsweise wird das Verfahren eingesetzt bei Patienten, die mit wenigstens einem IMPDH-In­ hibitor behandelt werden oder wurden, der ausgewählt ist unter Mycophenolat mofetil, Mycophenolsäure, Tiazofurin, Ribavirin, Mizoribin oder VX-497, insbesondere unter Mycophenolat mofetil und Mycophenolsäure oder Derivaten der Mycophenolsäure, wie z. B. Mycophenolsäureestern, die unter physiologischen Bedingungen hydrolysierbar sind. Beispiele für mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ermittelten IMPDH-Ak­ tivitäten von CellCept®-behandelten Patienten sind in den folgenden Tabellen 2, 3 und 4 zusammengefaßt.

Tabelle 2

Assay in Vollblut

Tabelle 3

Assay in mononukleärer Zellfraktion

Tabelle 4

Assay in Erythrozyten

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen Ana­ lysenkit zur Durchführung der erfindungsgemäßen Bestimmungsme­ thoden, umfassend die für das Bestimmungsverfahren erforderli­ chen Substrate und gegebenenfalls Cosubstrate sowie gegebenen­ falls weitere Reagenzien zum Nachweis der aus den Substraten bzw. Cosubstraten gebildeten Reaktionsprodukte.

Kurze Beschreibung der Figuren:

Fig. 1 Biosynthese von Guanin-Nucleotiden. Ribose-5-phos­ phat wird über 12 Schritte in IMP umgewandelt. HGPRT steht für Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribo­ syl-Transferase.

Fig. 2 Schematische Darstellung der Verteilung von Mycophe­ nolsäure zwischen Lymphozyt (L) und Plasma (P).

Fig. 3 Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs zur Be­ stimmung der IMPDH-Aktivität in mononukleären Zel­ len.

Fig. 4 Chromatogramm aus der Bestimmung von Xanthin nach chemischer Hydrolyse von Xanthosin 5'-monophosphat; Bestimmung der IMPDH-Aktivität in mononukleären Zel­ len, die in Plasma resuspendiert wurden. Reaktions­ stop nach 30 min.

Fig. 5 Wie Fig. 4, aber Reaktionsstop nach 90 min.

Fig. 6 Wie Fig. 4 (Doppelbestimmung).

Fig. 7 Wie Fig. 5 (Doppelbestimmung).

Fig. 8 Chromatogramm aus der Bestimmung von Xanthin nach chemischer Hydrolyse von Xanthosin 5'-monophosphat; Bestimmung der IMPDH-Aktivität in mononukleären Zel­ len, die in Plasma resuspendiert wurden, das den IMPDH-Inhibitor Mycophenolsäure in einer Konzentra­ tion von 1 µg/ml enthält. Reaktionsstop nach 30 min.

Fig. 9 Wie Fig. 8, aber Reaktionsstop nach 90 min.

Fig. 10 Wie Fig. 8, aber mit Proben, die von regelmäßig mit Mycophenolat mofetil behandelten Nierentransplanta­ tionspatienten stammen. Reaktionsstop nach 30 min.

Fig. 11 Wie 10, aber Reaktionsstop nach 90 min.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:

Beispiel 1 Vorbereitung zur Bestimmung der IMPDH-Aktivität in einer Gesamt-Zellfraktion aus Vollblut

In ein Antikoagulans enthaltendes Röhrchen werden 7,5 ml Vollblut aufgefangen und bei Raumtemperatur oder unter leich­ ter Kühlung bei ca. 2000.g für 10 min zentrifugiert. Das über­ stehende Plasma wird abdekantiert und die die sedimentierte Zellfraktion überschichtende Restplasmamenge mit einer Pa­ steur- oder Eppendorf-Pipette vorsichtig abgenommen. Von der Zellfraktion werden 2.1-1,5 ml Aliquote in Kunststoff-Test­ röhrchen überführt und durch Eintauchen des Teströhrchens in eine Trockeneis/i-Propanol-Mischung oder flüssigen Stick­ stoff schockgefroren.

Nach dem Wiederauftauen werden dem Zell-Lysat 4 Volumina Tris-EDTA-Allopurinol-Puffer (24 ml 0,1 M Tris, pH 8,0, 0,1 M KCl, 3 mM EDTA in 1 ml Allopurinol-Lösung (200 µg/ml)) zugege­ ben. Zur vollständigen Zell-Lyse wird diese Mischung eine Mi­ nute am Vortexmixer und anschließend zwei Minuten mit Ultra­ schall behandelt. Mit je 1 ml des auf diese Weise gewonnenen Zell-Lysats wird die IMPDH-Aktivität in Doppelbestimmung durchgeführt.

Beispiel 2 Vorbereitung zur Bestimmung der IMPDH-Aktivität in isolierten mononukleären Zellfraktionen (MNF)

In Anti-Koagulanz enthaltende Röhrchen werden 20 ml Voll­ blut aufgefangen und mit 2 Volumina 0.9%iger NaCl-Lösung verdünnt (Ges.-vol.: 60 ml). In sieben 15 ml Zentrifugen­ röhrchen, in die je 3 ml Histopaque®-Lösung vorgelegt wurden, werden 8-9 ml des verdünnten Blutes vorsichtig aufgeschichtet. Die Röhrchen werden bei Raumtemperatur (ca. 20°C) und 400.g 30 Minuten zentrifugiert. Von jedem Röhrchen wird anschließend die überstehende Plasmaschicht bis auf 0.5 cm oberhalb der MNF abgenommen und verworfen. Mit einer Pasteurpipette wird die MNF abgenommen. Die vereinigten MNF werden auf vier neue Zen­ trifugenröhrchen verteilt und der Inhalt der Röhrchen mit DPBS-Puffer (4,0 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,1 g KH₂PO₄, 0,575 g Na₂HPO₄, 0,5 g D-Glucose, bidest H₂O ad 500 ml) auf 13 ml auf­ gefüllt. Die in dieser Lösung vorsichtig suspendierten Zellen werden bei 250.g (10 min, 20°C) sedimentiert, in 10 ml DPBS-Puf­ fer resuspendiert und abermals zentrifugiert (250.g, 10 min, 20°C). Die sedimentierten Zellen werden in je l ml DPBS-Puf­ fer resuspendiert und vereinigt. Aus dieser Suspension wer­ den 50 µl zur Zellzahlbestimmung (Thoma-Kammer nach Trypan­ blau-Färbung) entnommen. Die Zellsuspension wird nochmals zen­ trifugiert, der Überstand vorsichtig abgenommen und das Zell­ pellet in 1 ml Plasma, das vom gleichen Spender durch Zentri­ fugation von Vollblut gewonnen wurde, resuspendiert und bei 37°C 5 min inkubiert. Anschließend wird der Inhalt des Teströhrchens schockgefroren (Trockeneis/Isopropanol oder flüssiger Stickstoff). Nach dem Wiederauftauen wird das Zell-Ly­ sat mit 4 Vol Tris-EDTA-Allopurinol-Puffer verdünnt und 1 min am Vortexmixer sowie 2 min mit Ultraschall behandelt. Mit je 1 ml des auf diese Weise gewonnenen Zell-Lysats wird die IMPDH-Aktivität in Doppelbestimmung durchgeführt.

Beispiel 3 Enzym-Assay

Je 1 ml Zell-Lysat (aus 1. oder 2.) werden in vier Teströhrchen überführt und jeweils mit 10 µl NAD-Lösung (16,59 mg/ml H₂O; Endkonz. = 0,25 mM) sowie 10 µl IMP-Lösung (8,7 mg/ml H₂O; Endkonz. = 0,25 mM) versetzt. Der Inhalt wird kurz durchmischt; anschließend werden die Röhrchen in ein auf 37°C temperiertes Wasserbad gestellt. Unter wiederholtem Umschüt­ teln werden je zwei Röhrchen nach 30 min aus dem Wasserbad ge­ nommen und zur Beendigung der Reaktion mit 0,15 ml 4 M HClO₄ versetzt. Die beiden anderen Röhrchen werden weitere 30 min (Gesamt-Zellfraktion) oder 60 min (MNF) bei 37°C stehengelas­ sen und anschließend ebenfalls mit 0,15 ml 4 M HClO₄ versetzt.

Die Röhrchen werden zentrifugiert (3000 Upm, 10 min, ca. 2000.g), 700 µl des Überstands werden in ein 10 ml Braunglas überführt und 1 h auf 100°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wird der Inhalt kurz homogenisiert und mit 4 M KOH (93 µl für An­ satz mit Lymphozyten, 83 µl für Gesamtblutzellfraktion) ver­ setzt (pH ∼2-3). Nach kurzem Homogenisieren und Zentrifugie­ ren (3000 Upm, 10 min, ca. 1400.g) wird der klare Überstand in ein Braunglasvial überführt und 200 µl hieraus werden zur HPLC-Analyse eingesetzt.

Das Fließdiagramm in Fig. 3 faßt den gesamten Arbeitsab­ lauf des Enzymassays mit MNF zusammen.

Beispiel 4 HPLC-Bestimmung von Xanthin 5'-Monophosphat (XMP) 4.1. Chromatographische Bedingungen

Säule: 2 Nucleosil C18 (125 × 4.6 mm i.D, dp = 5 µm), in Reihe angeordnet;
Eluent: 4% Methanol, 96% H₂

O (pH 1.8, eingestellt mit conc. H₃

PO₄

);
Fließrate: 0.5 ml/min
Säulentemperatur: Raumtemperatur
Detektion: UV (λ = 260 nm)
Retentionszeit: 18-20 min.

4.2. Validierung der chromatographischen Methode

Die quantitative Bestimmung von XMP über Xanthin wird nach international anerkannten Empfehlungen validiert. Das Konzentrations/Signal-Verhältnis ist im Bereich von 25 ng/ml-5000 ng/ml linear (Korrelationskoeffizient < 0.999). Die zur Eichung zu verwendenden Standards werden aus Vollblutzell-Ly­ sat hergestellt. Die nach Vermessung der Eichstandards er­ haltenen Konzentration/Signal-Datenpaare werden zunächst zur Bestimmung des endogenen Xanthin-Gehalts verwendet. Anschlie­ ßend erfolgt die Berechnung der Kalibrierfunktion unter Be­ rücksichtigung des endogenen Spiegels. Bei Vermessung der Pro­ ben aus den Enzym-Assays werden zusätzlich Eichstandards und Qualitätskontrollproben analysiert. Selektivitätsuntersuchun­ gen ergeben, daß keine Interferenz mit anderen organischen Ba­ sen (Adenin (z. B. aus NAD), Hypoxanthin), Allopurinol oder Harnsäure besteht.

Beispiel 5 HPLC-Chromatogramme aus der Bestimmung von XMP

Die Fig. 4 bis 11 zeigen Chromatogramme, die die Trennung von Xanthin darstellen und zur Quantifizierung von Xanthosin 5'-monophosphat verwendet werden.

Fig. 4 und 5 zeigen die Chromatogramme zur Bestimmung der Enzymaktivität in mononukleären Zellen, die in Plasma resus­ pendiert werden. Fig. 6 und 7 zeigen die Chromatogramme des gleichen Versuchs, der als Doppelbestimmung durchgeführt wird. In einem parallel durchgeführten Versuchsansatz werden die Zellen in Plasma resuspendiert, das den IMPDH-Inhibitor Myco­ phenolsäure in einer Konzentration von 1 µg/ml enthält. Das Ergebnis zeigen die Abb. 8 und 9. Das Verfahren wurde außerdem mit Proben durchgeführt, die von regelmäßig mit Mycophenolat mofetil behandelten Transplantationspatienten mit stabiler Nierenfunktion stammen, die das Medikament in einer Dosis von 1 g b.i.d. über einen Zeitraum von 3 Monaten erhalten haben. Für diese Proben repräsentative Chromatogramme sind in den Abb. 10 und 11 dargestellt.

Die Berechnung der Enzymaktivität erfolgte wie oben be­ schrieben.

Claims (17)

1. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Inosin 5'-mo­ nophosphat dehydrogenase (IMPDH) im Blut eines Säugers, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einem Lysat einer mononukleäre Zellen enthaltenden Zellfraktion aus dem Blut des Säugers eine IMPDH-katalysierte enzymatische Reaktion in einem radioaktivitätsfreien Reaktionsansatz durchführt und aus der pro Zeiteinheit gebildeten Menge eines dabei entstehenden nicht-radioaktiven Reaktionsprodukts die IMPDH-Aktivität im Blut des Säugers ermittelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionsansatz wenigstens ein nicht-radioaktives Substrat der IMPDH und gegebenenfalls ein nicht­ radioaktives Cosubstrat der IMPDH umfaßt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man die Menge eines bei der enzymati­ schen Reaktion gebildeten nicht-radioaktiven Produkts und/oder eines nicht-radioaktiven Coprodukts direkt oder nach weiterer chemischer oder enzymatischer Umsetzung be­ stimmt.

4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als enzymatische Reaktion die Umsetzung von Inosin 5'-monophosphat (IMP) zu Xanthosin 5'-monophosphat (XMP) in Gegenwart von NAD durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Umsetzung in Gegenwart von Allopuri­ nol und/oder EDTA durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) das gebildete XMP zu Xanthin chemisch deglycosidiert und die Xanthinmenge bestimmt; oder
• b) die gebildete NADH-Menge bestimmt.

7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Mengenbestimmung chromatogra­ phisch, photometrisch, fluorimetrisch oder luminometrisch erfolgt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß man die mononukleäre Zellen enthaltende Fraktion durch Abtrennung von Plasma erhält.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem alle nicht-mononukleären Zellen im wesentli­ chen abtrennt, wobei man eine mononukleäre Zellfraktion (MNF) erhält.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die MNF so isoliert, daß sie frei von Erythrozyten, Granulozyten und Thrombozyten, insbesondere frei von Ery­ throzyten, ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die MNF vor oder nach Zell-Lyse durch Zugabe von Plasma rekonstituiert.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß Plasma und MNF von demselben Säuger abgeleitet sind.

13. Verfahren zum therapeutischen Monitoring von IMPDH-Inhi­ bitor-behandelten Patienten, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Blutprobe des Patienten die IMPDH-Aktivität mit Hilfe eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 bestimmt.

14. Verfahren zum Monitoring des immunsuppressiven Status von IMPDH-Inhibitor-behandelten Patienten, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man in einer Blutprobe des Patienten die IMPDH-Aktivität mit Hilfe eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 9 bis 12 bestimmt.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeich­ net, daß die behandelten Patienten ausgewählt sind unter Krebspatienten und Organtransplantationspatienten.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Patienten mit wenigstens einem IMPDH-Inhibitor behandelt wurden, der ausgewählt ist un­ ter Mycophenolat mofetil, Mycophenolsäure, Tiazofurin, Ribavirin, Mizoribin oder VX-497, insbesondere unter My­ cophenolat mofetil und Mycophenolsäure oder Derivaten der Mycophenolsäure.

17. Analysenkit, umfassend die für die Durchführung eines Bestimmungsverfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 erforderlichen nichtradioaktiven Substrate und Cosubstra­ te und gegebenenfalls weitere Reagenzien zum Nachweis der aus den Substraten oder Cosubstrat gebildeten Reaktions­ produkte.