JPH06265546A - 免疫学的測定用トロポニン安定化組成物および安定化法 - Google Patents

免疫学的測定用トロポニン安定化組成物および安定化法

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JPH06265546A JP6024055A JP2405594A JPH06265546A JP H06265546 A JPH06265546 A JP H06265546A JP 6024055 A JP6024055 A JP 6024055A JP 2405594 A JP2405594 A JP 2405594A JP H06265546 A JPH06265546 A JP H06265546A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は血清または血漿トロポニン免疫学
的測定法の標準物質として用いるトロポニンの安定化組
成物、そのための粉末組成物および安定化方法に関す
る。 【構成】 トロポニンＩまたはトロポニンＴ、トロポニ
ンＩまたはＴの１モル等量当たり、１〜１０モル等量の
トロポニンＣ、およびＭｇ++および／またはＣａ++イオ
ンを含有する水性溶液を含む免疫学的測定用トロポニン
ＩおよびトロポニンＴの安定化組成物。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は血清または血漿トロポニ
ンの免疫学的測定法の標準物質として用いるトロポニン
の安定化組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】トロ
ポニンは３種の蛋白質、トロポニンＣ、ＩおよびＴから
なる筋原繊維蛋白複合物、これはＣａ2+による筋肉収縮
の制御を誘発し、この収縮は筋原繊維のミオシンおよび
アクチンの相互作用をもたらすことが知られている。
【０００３】筋肉が損傷されると、心筋であろうとなか
ろうと、心筋梗塞形成または骨格筋肉中に、長期の生理
的運動中に、ついで、放出された収縮性蛋白質が血流中
の多かれ少なかれ急速に発現する。
【０００４】従って、心筋の梗塞形成の初期診断のため
のトロポニンの測定法が最近提唱されており、サーキュ
レーション（Circulation）８３、８９０２−９１２
（１９９１）記載のトロポニンＴの測定法、またはアメ
リカン・ハート・ジャーナル（Am.Hert J.）１１０、１
３３３−４４（１９８７）およびモレキュラー・イムノ
ロジー、２９（２）２７１−２７８記載のトロポニンＩ
の測定法のいずれかである。
【０００５】病理学的研究に用いられる酵素免疫学的測
定法および放射免疫学的測定法は、一般に市販されてい
るものは、測定のために必要な試薬に加えて、換言する
と、標識または非標識抗体、トレーサー試剤および希釈
溶液を含み、測定物質のための標準物質は、測定試料と
同じ条件下で用いられるとき、結果を換算するための対
照として、および／または絶対的対照として役立つ。
【０００６】蛋白質が溶液中で非常に安定でなく、それ
らを含む試剤が凍結乾燥状態で、適当な組成物の溶媒と
ともにしばしば市販されており、組成物中の上記の試剤
は使用前に使用者が溶解しなければならない；たとえ、
毎日の検量曲線が試剤の濃度に何等かの変化を示して
も、得られた試液を４℃に保つことは数日間試液を使用
することを可能にする；一般に、そしてこれがトロポニ
ンＴを推薦する理由であるが、凍結乾燥物から調製され
る標準溶液は、単位使用量で融解されることが知られて
いる。
【０００７】トロポニンの緩衝化水性溶液は、具体的に
は、トロポニンＩおよびＴのものであるが、−８０℃で
数カ月保存可能であるが、たとえ、プロテアーゼ阻害剤
または抗菌剤を添加しても、＋４℃では２、３時間以上
は安定ではないことが観察されている。そこで、病理学
研究者はしばしば、時には１日に２回も検量曲線のため
の溶液を調製しなければならない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、特定の免疫学
的測定法の対照として用いられるトロポニンＩおよびＴ
の多かれ少なかれ希釈された標準溶液の＋４℃での保存
を可能にするものである。
【０００９】本発明の安定化組成物は、水性媒体中に、
実施される測定法により変化する１種またはそれ以上の
トロポニンＩまたはＴを、トロポニンＣの１〜１０モル
等量、好ましくは２〜５等量、および多量のＭｇ++およ
び／またはＣａ++イオンを含む。Ｍｇ++および／または
Ｃａ++イオンは塩、特に塩化物、臭化物または硝酸塩の
形で存在する。Ｍｇ++および／またはＣａ++塩の量は、
トロポニンＩまたはトロポニンＴの１００〜１００００
重量倍であってもよい。
【００１０】トロポニンＣは、ひとまたは動物由来であ
ってもよい。本発明の溶液中のトロポニンＩまたはＴの
濃度は、一般に免疫学的測定法に用いられる濃度に対応
し、概して、０.０１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、好ま
しくは０.２ｎｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌであるが、Ｍ
ｇ++および／またはＣａ++塩の濃度は、臨界的ではな
く、２０μｍ〜１０ｍＭである；慣例では、この濃度は
２ｍＭに近い。
【００１１】溶液は、常套的方法では、ｐＨ４〜１０、
好ましくは５.５〜７.５に緩衝化されていてもよく、溶
媒は、部分的または全体的に正常ひと血漿からなり、患
者からの血漿または血清を含む測定試料と同じ成分を含
む標準試料を含む。
【００１２】本発明の主題は、また粉末化トロポニンＩ
またはＴ組成物、好ましくは凍結乾燥状態であり、所望
により、ＣａＣｌ2などのＭｇ++および／またはＣａ++
イオンを含み、１〜１０モル等量のトロポニンＣ、ただ
し、トロポニンＣが存在する場合は、使用者によってこ
の組成物が水性媒体中に溶解された時からのみ他のトロ
ポニン類の安定性を保証するのに有効である。もし、凍
結乾燥組成物がＭｇ++および／またはＣａ++イオンを含
まない場合は、溶解時に添加される。
【００１３】本発明の組成物はまた、免疫学的測定法の
ためのトロポニンＩまたはＴの溶液の安定化方法であ
り、トロポニンＩまたはＴの１モル当たり１〜１０モル
等量のトロポニンＣ、および、例えば、ＣａＣｌ2など
のＭｇ++および／またはＣａ++イオンを添加するもので
ある。下記に、本発明の例示的具体例および対応する保
存試験結果を記載する。
【００１４】ひとトロポニンＩ（ＴｎＩ）はＦＥＢＳレ
ター、４０、２５３−２５７（１９７４）に記載の方法
によって心臓から分離した。得られた溶液は、−８０℃
にて数カ月間、０.５％のカゼインを含むリン酸緩衝液
中に１０μｇ／ｍｌより高い濃度で保存可能である。
【００１５】トロポニンＴ（ＴｎＴ）はジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー、７２、７２３−７３５（１９
７２）またはジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、２４９、４７４２−４７４８（１９７４）に
記載と同様にして得た。
【００１６】トロポニンＣ（ＴｎＣ）は、アクタ・ケミ
カ・スカンジナビアカ、Ｂ４２；２１１−２１５（１９
８８）に記載の方法より、雄牛由来の３種のトロポニン
（Ｔ、Ｃ、Ｉ）の複合物から分離した。
【００１７】調製溶液の濃度は、ブラッドフォード試薬
を用いて測定する。Ann. Biochem.７２、２４８（１９
７６）に記載されており、これは市販されている；標準
物質は周知のトロポニンＩ、ＣおよびＴの混合物であ
り、凍結乾燥されて、商品番号Ｔ４８９５でシグマ社か
ら市販されている。
【００１８】
【実施例】
本発明の組成物の製造 −トロポニンＩ １分子につきトロポニンＣ５分子を含
有する組成物 ＣaＣl2・２Ｈ2Ｏを２７６μg、および１０μｇ／ｍｌ
のトロポニンＩ溶液１０μｌおよび１０μｇ／ｍｌのト
ロポニンＣ溶液５０μｌを、１０％正常ひと血漿を含む
ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（０.１Ｍ；ｐＨ６.８）９４０μｌに
注入する。例えば、直径０.２２μｍの細孔のフィルタ
ーを通すことにより、滅菌されたトロポニンＩおよびト
ロポニンＣ溶液を使用して無菌媒体中でこれらの操作を
実施するのがより好ましい。ＴｎＩ濃度約１００ｎｇ／
ｍｌおよびＴｎＣ濃度約５００ng/mlである得られた溶
液を用いて、１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌまで希釈系
列のトロポニンＩを調製した。 −トロポニンＩに対して１、２または１０モル等量のト
ロポニンＣを含有する溶液を同様にして調製する。
【００１９】粉末化組成物はひと血漿を含まないが上記
と同様にして調製した水性組成物から凍結乾燥によって
得ることができる。トロポニンＴに対して１〜１０モル
等量のトロポニンＣを含有する溶液をトロポニンＩをト
ロポニンＴに代えて、同様の方法で調製する。
【００２０】試験方法 ４℃で貯蔵した溶液は、６週間を越える数日を選び、使
用直前に、−８０℃で保存したトロポニンＩ溶液から調
製された標準検量曲線を用いて測定した。測定は、心筋
トロポニンＩに対する２種のモノクローナル抗体を用い
て行った；第１の抗体は、商品番号マキシソルプ、スタ
ーチューブとして市販されているＮＵＮＣ（ＵＳＡ）社
製の免疫学的測定管の壁に吸着させた；第２の抗体はペ
ルオキシダーゼでラベルした；この方法はサンドイッチ
法である。これらの抗体の調製はモルキュラー・イムノ
ロジー、２９（２）、２７１−２７８（１９９２）に記
載されている。この測定法において、他の異性体型であ
るトロポニンＩ、トロポニンＣまたは他の心筋蛋白質に
妨害はなかった。
【００２１】ＴｎＣの不存在下では、貯蔵の初日からＴ
ｎの濃度に実質的減少が、全ての希釈物に観察された；
もし、ＴｎＩに対して５モル等量の比率で、ＴｎＣがア
クトミオシンまたはトロポマイシンで代替されれば、１
２日後に測定されたＴｎＩの濃度は、最初の濃度である
１０ｎｇ／ｍｌの濃度の２／３しかなかったが、ＴｎＣ
およびＣａＣｌ2で安定化された溶液には変化がなかっ
た。４０日後、種々の濃度のＴｎＣおよびＣａＣｌ2で
安定化されたＴｎＩ溶液は変化がなかったが、非安定化
溶液はみかけの濃度が８０％まで下がっていた。

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 トロポニンＩまたはトロポニンＴ、トロ
    ポニンＩまたはＴの１モル等量当たり、１〜１０モル等
    量のトロポニンＣ、およびＭｇ++および／またはＣａ++
    イオンを含有する水性溶液を含む免疫学的測定用トロポ
    ニンＩおよびトロポニンＴの安定化組成物。
  2. 【請求項２】 トロポニンＩまたはトロポニンＴの１０
    ０〜１００００重量倍のＭｇ++および／またはＣａ
    ++塩、特にＣａＣｌ2を含む、請求項１記載の組成物。
  3. 【請求項３】 トロポニンＩおよびトロポニンＩの１モ
    ル等量当たり、２〜５モル等量のトロポニンＣを含む、
    請求項１または２記載の組成物。
  4. 【請求項４】 希釈媒体がｐＨ４〜１０の緩衝化水性溶
    液である、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
  5. 【請求項５】 溶媒が、１００％以下のひと血漿を含む
    ものである、請求項１記載の組成物。
  6. 【請求項６】 トロポニンＩの濃度が、０.０１ｎｇ／
    ｍｌ〜１μｇ／ｍｌであり、Ｃａ++塩の濃度が２０μＭ
    〜１０ｍＭである、請求項３〜５のいずれか１項記載の
    組成物。
  7. 【請求項７】 トロポニンＩまたはトロポニンＴ、トロ
    ポニンＩまたはＴの１モル等量当たり、１〜１０モル等
    量のトロポニンＣ、および所望によりＭｇ++および／ま
    たはＣａ++イオンを含有する、請求項１〜６のいずれか
    １項記載の安定化組成物の調製のための粉末化組成物。
  8. 【請求項８】 ＣａＣｌ2を含む、請求項１〜７のいず
    れか１項記載の組成物。
  9. 【請求項９】 凍結乾燥されており、Ｍｇ++および／ま
    たはＣａ++イオンを含まないものである、請求項７記載
    の組成物。
  10. 【請求項１０】 トロポニンＩまたはＴの１モル等量当
    たり、１〜１０モル等量のトロポニンＣ、およびＭｇ++
    および／またはＣａ++イオンを添加することを含む、免
    疫学的測定用トロポニンＩまたはＴの水性組成物の安定
    化方法。
  11. 【請求項１１】 Ｍｇ++および／またはＣａ++塩、特に
    ＣａＣｌ2、を好ましくはトロポニンＩまたはトロポニ
    ンＴの１００〜１００００重量倍添加するものである、
    請求項１０記載の方法。
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