JP3357163B2 - 免疫学的測定用トロポニン安定化組成物および安定化法 - Google Patents

免疫学的測定用トロポニン安定化組成物および安定化法

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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は血清または血漿トロポニ
ンの免疫学的測定法の標準物質として用いるトロポニン
の安定化組成物に関する。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】トロ
ポニンは3種の蛋白質、トロポニンC、IおよびTから
なる筋原繊維蛋白複合物、これはCa2+による筋肉収縮
の制御を誘発し、この収縮は筋原繊維のミオシンおよび
アクチンの相互作用をもたらすことが知られている。
【0003】筋肉が損傷されると、心筋であろうとなか
ろうと、心筋梗塞形成または骨格筋肉中に、長期の生理
的運動中に、ついで、放出された収縮性蛋白質が血流中
の多かれ少なかれ急速に発現する。
【0004】従って、心筋の梗塞形成の初期診断のため
のトロポニンの測定法が最近提唱されており、サーキュ
レーション(Circulation)83、8902−912
(1991)記載のトロポニンTの測定法、またはアメ
リカン・ハート・ジャーナル(Am.Hert J.)110、1
333−44(1987)およびモレキュラー・イムノ
ロジー、29(2)271−278記載のトロポニンI
の測定法のいずれかである。
【0005】病理学的研究に用いられる酵素免疫学的測
定法および放射免疫学的測定法は、一般に市販されてい
るものは、測定のために必要な試薬に加えて、換言する
と、標識または非標識抗体、トレーサー試剤および希釈
溶液を含み、測定物質のための標準物質は、測定試料と
同じ条件下で用いられるとき、結果を換算するための対
照として、および/または絶対的対照として役立つ。
【0006】蛋白質が溶液中で非常に安定でなく、それ
らを含む試剤が凍結乾燥状態で、適当な組成物の溶媒と
ともにしばしば市販されており、組成物中の上記の試剤
は使用前に使用者が溶解しなければならない;たとえ、
毎日の検量曲線が試剤の濃度に何等かの変化を示して
も、得られた試液を4℃に保つことは数日間試液を使用
することを可能にする;一般に、そしてこれがトロポニ
ンTを推薦する理由であるが、凍結乾燥物から調製され
る標準溶液は、単位使用量で融解されることが知られて
いる。
【0007】トロポニンの緩衝化水性溶液は、具体的に
は、トロポニンIおよびTのものであるが、−80℃で
数カ月保存可能であるが、たとえ、プロテアーゼ阻害剤
または抗菌剤を添加しても、+4℃では2、3時間以上
は安定ではないことが観察されている。そこで、病理学
研究者はしばしば、時には1日に2回も検量曲線のため
の溶液を調製しなければならない。
【0008】
【課題を解決するための手段】本発明は、特定の免疫学
的測定法の対照として用いられるトロポニンIおよびT
の多かれ少なかれ希釈された標準溶液の+4℃での保存
を可能にするものである。
【0009】本発明の安定化組成物は、水性媒体中に、
実施される測定法により変化する1種またはそれ以上の
トロポニンIまたはTを、トロポニンCの1〜10モル
等量、好ましくは2〜5等量、および多量のMg++およ
び/またはCa++イオンを含む。Mg++および/または
Ca++イオンは塩、特に塩化物、臭化物または硝酸塩の
形で存在する。Mg++および/またはCa++塩の量は、
トロポニンIまたはトロポニンTの100〜10000
重量倍であってもよい。
【0010】トロポニンCは、ひとまたは動物由来であ
ってもよい。本発明の溶液中のトロポニンIまたはTの
濃度は、一般に免疫学的測定法に用いられる濃度に対応
し、概して、0.01ng/ml〜1μg/ml、好ま
しくは0.2ng/ml〜25ng/mlであるが、M
++および/またはCa++塩の濃度は、臨界的ではな
く、20μm〜10mMである;慣例では、この濃度は
2mMに近い。
【0011】溶液は、常套的方法では、pH4〜10、
好ましくは5.5〜7.5に緩衝化されていてもよく、溶
媒は、部分的または全体的に正常ひと血漿からなり、患
者からの血漿または血清を含む測定試料と同じ成分を含
む標準試料を含む。
【0012】本発明の主題は、また粉末化トロポニンI
またはT組成物、好ましくは凍結乾燥状態であり、所望
により、CaCl2などのMg++および/またはCa++
イオンを含み、1〜10モル等量のトロポニンC、ただ
し、トロポニンCが存在する場合は、使用者によってこ
の組成物が水性媒体中に溶解された時からのみ他のトロ
ポニン類の安定性を保証するのに有効である。もし、凍
結乾燥組成物がMg++および/またはCa++イオンを含
まない場合は、溶解時に添加される。
【0013】本発明の組成物はまた、免疫学的測定法の
ためのトロポニンIまたはTの溶液の安定化方法であ
り、トロポニンIまたはTの1モル当たり1〜10モル
等量のトロポニンC、および、例えば、CaCl2など
のMg++および/またはCa++イオンを添加するもので
ある。下記に、本発明の例示的具体例および対応する保
存試験結果を記載する。
【0014】ひとトロポニンI(TnI)はFEBSレ
ター、40、253−257(1974)に記載の方法
によって心臓から分離した。得られた溶液は、−80℃
にて数カ月間、0.5%のカゼインを含むリン酸緩衝液
中に10μg/mlより高い濃度で保存可能である。
【0015】トロポニンT(TnT)はジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー、72、723−735(19
72)またはジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、249、4742−4748(1974)に
記載と同様にして得た。
【0016】トロポニンC(TnC)は、アクタ・ケミ
カ・スカンジナビアカ、B42;211−215(19
88)に記載の方法より、雄牛由来の3種のトロポニン
(T、C、I)の複合物から分離した。
【0017】調製溶液の濃度は、ブラッドフォード試薬
を用いて測定する。Ann. Biochem.72、248(19
76)に記載されており、これは市販されている;標準
物質は周知のトロポニンI、CおよびTの混合物であ
り、凍結乾燥されて、商品番号T4895でシグマ社か
ら市販されている。
【0018】
【実施例】
本発明の組成物の製造 −トロポニンI 1分子につきトロポニンC5分子を含
有する組成物 CaCl2・2H2Oを276μg、および10μg/ml
のトロポニンI溶液10μlおよび10μg/mlのト
ロポニンC溶液50μlを、10%正常ひと血漿を含む
KH2PO4緩衝液(0.1M;pH6.8)940μlに
注入する。例えば、直径0.22μmの細孔のフィルタ
ーを通すことにより、滅菌されたトロポニンIおよびト
ロポニンC溶液を使用して無菌媒体中でこれらの操作を
実施するのがより好ましい。TnI濃度約100ng/
mlおよびTnC濃度約500ng/mlである得られた溶
液を用いて、1ng/ml〜10ng/mlまで希釈系
列のトロポニンIを調製した。 −トロポニンIに対して1、2または10モル等量のト
ロポニンCを含有する溶液を同様にして調製する。
【0019】粉末化組成物はひと血漿を含まないが上記
と同様にして調製した水性組成物から凍結乾燥によって
得ることができる。トロポニンTに対して1〜10モル
等量のトロポニンCを含有する溶液をトロポニンIをト
ロポニンTに代えて、同様の方法で調製する。
【0020】試験方法 4℃で貯蔵した溶液は、6週間を越える数日を選び、使
用直前に、−80℃で保存したトロポニンI溶液から調
製された標準検量曲線を用いて測定した。測定は、心筋
トロポニンIに対する2種のモノクローナル抗体を用い
て行った;第1の抗体は、商品番号マキシソルプ、スタ
ーチューブとして市販されているNUNC(USA)社
製の免疫学的測定管の壁に吸着させた;第2の抗体はペ
ルオキシダーゼでラベルした;この方法はサンドイッチ
法である。これらの抗体の調製はモルキュラー・イムノ
ロジー、29(2)、271−278(1992)に記
載されている。この測定法において、他の異性体型であ
るトロポニンI、トロポニンCまたは他の心筋蛋白質に
妨害はなかった。
【0021】TnCの不存在下では、貯蔵の初日からT
nIの濃度に実質的減少が、全ての希釈物に観察され
た;もし、TnIに対して5モル等量の比率で、TnC
がアクトミオシンまたはトロポマイシンで代替されれ
ば、12日後に測定されたTnIの濃度は、最初の濃度
である10ng/mlの濃度の2/3しかなかったが、
TnCおよびCaCl2で安定化された溶液には変化が
なかった。40日後、種々の濃度のTnCおよびCaC
2で安定化されたTnI溶液は変化がなかったが、非
安定化溶液はみかけの濃度が80%まで下がっていた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平7−191024(JP,A) 特開 平3−7597(JP,A) 特表 平8−501628(JP,A) American Heart Jo urnal,1987年6月,113(6), 1333−1344 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) G01N 33/53 C07K 4/00

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 トロポニンIまたはトロポニンT、トロ
    ポニンIまたはTの1モル等量当たり、1〜10モル等
    量のトロポニンC、およびMg++および/またはCa++
    イオンを含有する水性溶液を含む免疫学的測定用トロポ
    ニンIおよびトロポニンTの安定化組成物。
  2. 【請求項2】 トロポニンIまたはトロポニンTの10
    0〜10000重量倍のMg++および/またはCa
    ++塩、特にCaCl2を含む、請求項1記載の組成物。
  3. 【請求項3】 トロポニンIおよびトロポニンIの1モ
    ル等量当たり、2〜5モル等量のトロポニンCを含む、
    請求項1または2記載の組成物。
  4. 【請求項4】 希釈媒体がpH4〜10の緩衝化水性溶
    液である、請求項1〜3のいずれか1項記載の組成物。
  5. 【請求項5】 溶媒が、100%以下のひと血漿を含む
    ものである、請求項1記載の組成物。
  6. 【請求項6】 トロポニンIの濃度が、0.01ng/
    ml〜1μg/mlであり、Ca++塩の濃度が20μM
    〜10mMである、請求項3〜5のいずれか1項記載の
    組成物。
  7. 【請求項7】 トロポニンIまたはトロポニンT、およ
    びトロポニンIまたはTの1モル等量当たり、1〜10
    モル等量のトロポニンCを含有する、請求項1〜6のい
    ずれか1項に記載の安定化組成物の調製のための粉末化
    組成物。
  8. 【請求項8】 さらに、Mg++および/またはCa++
    オンを含む、請求項7記載の粉末化組成物。
  9. 【請求項9】 CaCl2を含む、請求項1〜8のいず
    れか1項記載の組成物。
  10. 【請求項10】 凍結乾燥されている、請求項7または
    8記載の粉末化組成物。
  11. 【請求項11】 トロポニンIまたはTの1モル等量当
    たり、1〜10モル等量のトロポニンC、およびMg++
    および/またはCa++イオンを添加することを含む、免
    疫学的測定用トロポニンIまたはTの水性組成物の安定
    化方法。
  12. 【請求項12】 Mg++および/またはCa++塩、特に
    CaCl2、を好ましくはトロポニンIまたはトロポニ
    ンTの100〜10000重量倍添加するものである、
    請求項11記載の方法。
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