CH688194A5 - Composition stabilisée de troponine pour immunoessais et procédé de stabilisation de troponine pour immunoessais. - Google Patents
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Description
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Description
La présente invention concerne une composition stabilisée de troponine pouvant servir d'échantillon de référence dans les immunoessais visant à doser la troponine dans le sérum ou le plasma sanguin.
On sait que la troponine est un complexe protéi-que myofibrillaire, constitué de 3 protéines, les tro-ponines C, I, T, qui permet la régulation de la contraction du muscle par le Ca2*, contraction qui résulte de l'interaction de la myosine et de l'actine des fibrilles musculaires.
Lorsque le muscle est endommagé, que ce soit le muscle cardiaque, lors d'un infarctus du myocarde, ou le muscle squelettique, lors d'efforts physiques prolongés, les protéines contractiles alors libérées apparaissent plus ou moins rapidement dans la circulation sanguine.
Ainsi on a récemment préconisé le dosage des troponines pour le diagnostic précoce de l'infarctus du myocarde, que ce soit celui de la troponine T dans Circulation 22 902-912 (1991) ou de la troponine I dans Am. Heart J JJÛ 1333-44 (1987) et Mo-lecular Immunology 22 (2) 271-278 (1992).
Tout immunoessai enzymatique ou tout radioim-muoessai pratiqué dans les laboratoires d'analyses biologiques implique, en général, la fourniture par le fabriquant à côté des réactifs nécessaires au dosage, c'est-à-dire des anticorps marqués ou non, des agents de révélation et des solutions de dilution, d'un étalon du composé à déterminer qui, mis en œuvre dans des conditions analogues à celles de l'échantillon à étudier, servira de référence pour le calcul des résultats et/ou de témoin positif.
On sait que les protéines sont peu stables en solution, et les réactifs qui en contiennent sont fréquemment commercialisés sous forme lyophilisée, accompagnés d'un solvant, de composition convenable, dans lequel ils devront être dissous par l'utilisateur avant l'emploi; le maintient à 4°C des solutions obtenues permet de les utiliser pendant plusieurs jours, même si l'étalonnage journalier montre une certaine évolution des concentrations du réactif; en général, et c'est ce qui est préconisé pour la troponine T, les solutions de référence préparées à partir du lyophilisât sont congelées, en dose unitaire.
Les solutions aqueuses tamponnées de troponine, notamment celles de troponine I et T, peuvent être conservées plusieurs mois à -80°C, mais on a constaté qu'elles n'étaient pas stables plus de quelques heures à +4°C, même si des inhibiteurs de protéases ou des agents antibactériens, y étaient ajoutés, ce qui oblige les laboratoires d'analyses biologiques à préparer fréquemment, quelquefois deux fois par jour, leurs solutions d'étalonnage.
La présente invention permet la conservation durant plusieurs jours à +4°C, des solutions étalons plus ou moins diluées de troponine I ou de troponine T qui servent de référence dans des immunoessais spécifiques.
La composition stabilisée de l'invention comprend en milieu aqueux l'une des deux troponines I ou T selon le dosage à effectuer et de 1 à 10 équivalents molaires de troponine C et de préférence de 2
à 5 équivalents, ainsi qu'une grande quantité d'ions Mg++ et/ou Ca++, notamment sous forme de MgCl2. Les ions Mg++ et/ou Ca++ sont présents sous forme de sels, notamment de chlorure, bromure ou nitrate. La quantité de sels de Mg++ et/ou Ca++, notamment de MgCfe, peut être de 100 à 10 000 fois en poids celle de la troponine I ou de la troponine T.
La troponine C peut être d'origine humaine ou animale.
La concentration de troponine I ou T dans les solutions selon l'invention correspond à celles généralement utilisées dans les immunoessais, c'est-à-dire qu'elle peut être comprise entre 0,01 ng/ml et 1 ng/ml et de préférence entre 0,2 ng/ml et 25 ng/ml, tandis que la concentration de sels de Mg++ et/ou Ca++ qui n'est pas critique pourra être comprise entre 20 ^m et 10 mM; de façon classique, cette concentration sera voisine de 2 mM.
La solution peut être tamponnée, de façon classique, à un pH compris entre 4 et 10, de préférence 5,5 et 7,5, et le solvant peut être constitué partiellement ou dans sa totalité de plasma humain normal, ce qui permet d'avoir un échantillon de référence de composition équivalente à celle de l'échantillon à étudier qui contient le plasma ou le sérum du malade.
L'invention a également pour objet une composition de troponine I ou T en poudre, de préférence sous forme lyophilisée, comprenant éventuellement des ions Mg++ et/ou Ca++, notamment sous forme de MgCfe, et de 1 à 10 équivalents molaires de troponine C, bien que dans ce cas la présence de troponine C ne sera utile pour assurer la stabilité des autres troponines qu'à partir du moment où la composition aura été mise en solution aqueuse par l'utilisateur.
La composition lyophilisée peut ne pas contenir d'ions Mg++ et/ou Ca++, qui seront alors ajoutés lors de la mise en solution.
L'invention a également pour objet un procédé de stabilisation d'une solution de troponine I ou T pour immunoessais, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter de 1 à 10 équivalents molaires de troponine C par équivalent molaire de troponine I ou T, et des ions Mg++ et/ou Ca+\ par exemple CaCI?.
Dans ce qui suit, on décrit des exemples de réalisation de l'invention et les résultats des essais de conservation correspondants.
La troponine I (Tnl) humaine a été isolée d'un cœur par la méthode décrite dans FEBS Lett. 40 253-257 (1974). La solution obtenue peut etre conservée plusieurs mois à -80°C, à une concentration supérieure à 10 ng/ml dans un tampon phosphate salin contenant 0,5% de caséine.
La troponine T (TnT) peut être obtenue comme décrit dans J. Biochem. 72, 723-735 (1972) ou dans J. Biol. Chem. 242 4742-4748 (1974).
La troponine C (TnC) peut être isolée par la méthode décrite dans Acta Chem. Scand. B 42; 211-215 (1988) à partir du complexe des 3 troponines (T, C, I), d'origine bovine, qui est commercialisé.
Les concentrations des solutions préparées sont déterminées à l'aide du réactif de Bradford, décrit dans Ann. Biochem 72, 248 (1976) et commerciali-
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sé; le produit de référence est un mélange de troponine I, C et T, connu, commercialisé par la société Sigma sous forme lyophilisée avec la réf. T 4895.
Préparation de la composition selon l'invention
- Composition contenant 5 molécules de troponine C par molécule de troponine I.
On introduit dans 940 n' de tampon KH2PO4 (0,1 M; pH 6,8) contenant 10% de plasma humain normal, 276 n9 de CaCl2, 2H2O, 10 pi de solution de troponine I à 10 ng/ml et 50 ni de solution troponine C à 10 ng/ml.
Il est préférable d'effectuer ces opérations en milieu stérile en utilisant des solutions de troponine I et de troponine C stérilisées, par exemple en leur faisant traverser un filtre de diamètre de pores 0,22 nm.
La solution obtenue de concentration en Tnl voisine de 100 ng/ml et TnC de 500 ng/ml est utilisée ensuite pour préparer une gamme de dilutions de 1 ng/ml à 10 ng/ml en troponine I.
- On prépare de la meme façon des solutions contenant 1 ou 2 ou 10 équivalents molaires de troponine C par rapport à la troponine I.
La composition en poudre pourra être obtenue par lyophilisation d'une composition aqueuse préparée comme précédemment en l'absence de plasma humain.
On prépare de façon analogue des solutions contenant de 1 à 10 équivalents molaires de troponine C par rapport à la troponine T, en remplaçant la troponine I par la troponine T.
Réalisation des essais
Les solutions conservées à 4°C sont dosées aux jours choisis, pendant 6 semaines, en utilisant comme référence une gamme étalon, préparée extem-poranément, à partir de la solution de troponine I conservée à -80°C.
Le dosage est effectué avec deux anticorps mo-noclonaux dirigés contre la troponine I myocardi-que; le premier anticorps est adsorbé sur les parois de tubes pour immunoessais commercialisés par NUNC (USA) sous la référence Maxisorp, Startube; le second anticorps est marqué à la Peroxydase; la méthode est dite méthode sandwich.
L'obtention de ces anticorps est décrite dans Mo-lecular Immunology 22 (2) 271-278 (1992). On a constaté qu'il n'y a pas d'interférence dans ce dosage avec les autres isoformes de troponine I, la troponine C ou les autres protéines myocardiques.
En l'absence de TnC, dès le premier jour de conservation, on observe une diminution sensible de la concentration en Tnl pour les différentes dilutions; si la TnC est remplacée par de l'actomyosine ou par de la tropomyosine, à raison de 5 équivalents molaires par rapport à la Tnl, la concentration de Tnl mesurée au bout de 12 jours n'est plus que les 2/3 de celle du départ à 10 ng/ml alors que les solutions stabilisées par la TnC et CaCl2 n'ont pas évolué.
Au bout de 40 jours, les solutions de Tnl, stabilisées par différentes concentrations de TnC et CaCl2 n'ont pas évolué, tandis que les solutions non stabilisées ont une concentration apparente qui peut chuter jusqu'à 80%.
Claims (12)
1. Composition stabilisée de troponine I ou T pour immunoessais, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une solution aqueuse contenant de la troponine I ou de la troponine T, 1 à 10 équivalents molaires de troponine C par équivalent molaire de troponine I ou T, et des ions Mg++ et/ou Ca++.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité de sels de Mg++ et/ou Ca++, notamment de MgCl2, égale à 100 à 10 000 fois, en poids celle de la troponine I ou de la troponine T.
3. Composition selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle comprend de la troponine I et 2 à 5 équivalents molaires de troponine C par équivalent molaire de troponine I.
4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est en solution aqueuse tamponnée à pH compris entre 4 et 10.
5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que le milieu de dilution est constitué jusqu'à 100% de plasma humain.
6. Composition selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que la concentration en troponine I est comprise entre 0,01 ng/ml et 1 ng/ml et ce que la concentration de sels de Mg++ et/ou Ca++, notamment de MgCl2, est comprise entre 20 nM et 10 mM.
7. Composition en poudre pour la préparation d'une composition stabilisée selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle contient de la troponine I ou de la troponine T, 1 à 10 équivalents molaires de troponine C par équivalent molaire de troponine I ou T.
8. Composition en poudre selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle contient des ions Mg++ et/ou Ca++.
9. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle contient du CaCI2.
10. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle est sous forme lyophilisée et exempte d'ions Mg++ et/ou Ca++.
11. Procédé de stabilisation d'une composition aqueuse de troponine I ou T pour immunoessais, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter de 1 à 10 équivalents molaires de troponine C par équivalent molaire de troponine I ou T, et des ions Mg++ et/ou Ca++.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter une quantité de sels de Mg++ et/ou Ca++, notamment sous forme MgCl2, de préférence égale à 100 à 10 000 fois en poids celle de la troponine I ou de la troponine T.
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