JP5782712B2 - 心疾患マーカー標品およびその製造法 - Google Patents

Description

本発明は、心筋トロポニン（Ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ、以下ｃＴｎと記載する）及び脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｂｒａｉｎ Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ、以下ＢＮＰと記載する）含有標品及びその製造方法に関するものである。本発明の標品は、例えば免疫測定において心疾患マーカーとしてｃＴｎ及び／又はＢＮＰを測定する場合の、測定用管理物質として有用である。

ミオグロビン、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）、ｃＴｎ（心臓に由来するｃＴｎＩ、ｃＴｎＴ及びｃＴｎＣの３つのサブユニットが存在する）又はＢＮＰといった種々の心疾患マーカーが知られるようになり、臨床検査の分野において広く測定されている（非特許文献１）。

種々の心筋マーカーの中でも、ｃＴｎは、最新のガイドライン（日本循環器学会の急性心筋梗塞（ＳＴ上昇型）の診療ガイドライン、急性および慢性心筋炎の診断・治療に関するガイドライン、欧州心臓学会／米国心臓病学会の心筋梗塞診断基準のガイドライン等）において急性冠症候群（Ａｃｕｔｅ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＡＣＳ）における心筋障害の指標とされている。またＢＮＰは、心不全の鋭敏なバイオマーカーであり、心不全の診断のみならず、その予後評価や治療判定に広く利用されている。このため、心疾患マーカーの中でもｃＴｎとＢＮＰの測定は心疾患の診断において特に重要である。

ｃＴｎやＢＮＰの測定方法としては、免疫測定が広く普及している。免疫測定でｃＴｎやＢＮＰを測定する場合、測定を実施する者や測定を実施する装置、更には測定を実施した日時等が異なっても同一濃度のｃＴｎ等が存在する場合には同一の結果が得られるような精度管理が重要である。このため、従来から既知濃度のｃＴｎや既知濃度のＢＮＰを含有する標品である測定用管理物質が使用されているが、測定管理用物質にはその中に含有されるｃＴｎ又はＢＮＰが安定であること（測定管理用物質についてｃＴｎ又はＢＮＰの免疫測定を行った場合、経時的な測定値の変化が少ないこと）、そして免疫測定における抗原や抗体との反応を妨害しないこと、が求められる。

種々の心疾マーカーの中でも特にｃＴｎとＢＮＰの重要性が高まっていることから、利便性を向上するためにもｃＴｎとＢＮＰの両者を含む測定管理用物質を提供すべきであるが、従来報告されているｃＴｎを安定的に存在させることができる条件と従来報告されているＢＮＰを安定的に存在させることができる条件（特許文献１）には相違があり、ｃＴｎとＢＮＰの両者を含む測定管理用物質は未だ報告されていない。特にＢＮＰは、ガラス吸着し易く、ガラス製容器で保存等した場合、ポリスチレンやポリプロピレン製容器で保存等した場合と比較して前記した経時的な測定値の変化が大きくなるという課題もある。

特開２０１０−０９１３９８

ＴＨＲＯＭＢＯＳＩＳ ａｎｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｖｏｌ．１３ Ｎｏ．２ ２００５ ８１（１８９−１９３）

そこで本発明の目的は、心筋マーカーとして特に重要なｃＴｎ及びＢＮＰを同時に、かつ、安定的に含有し、免疫測定における測定用管理物質としても使用可能な標品を提供することにある。

前記目的を達成するために本発明者らは鋭意検討をおこなった結果、本発明を完成するに至った。前記目的を達成する本発明は、カゼイン系タンパク質及びベンズアミジン誘導体を共存させたことを特徴とするｃＴｎ及びＢＮＰ含有標品である。また前記目的を達成する本発明は、カゼイン系タンパク質及びベンズアミジン誘導体を添加することを特徴とする、ｃＴｎ及びＢＮＰ含有標品の製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、ｃＴｎ及びＢＮＰの両者を含む標品である。本発明でいう標品とは、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）又は発光免疫測定法（ＬＩＡ）等で使用される測定用管理物質や検量線作成用の標準品としても使用される、厳密に管理された濃度のｃＴｎやＢＮＰを含有するもの以外に、単にｃＴｎやＢＮＰを含有するものであっても良い。測定用管理物質として使用されるものについては、ｃＴｎが０．２から５０ｎｇ／ｍＬの範囲に、ＢＮＰが２０から２０００ｐｇ／ｍＬの範囲に管理されたものを例示することができる。また標品の形態については、溶液状のもの、凍結されたもの更には凍結後に乾燥されたもののいずれであっても良い。中でも本発明は、凍結乾燥状態で供され、使用にあたって溶解される凍結乾燥状態の測定用管理物質に対して特に好ましく適用される。

標品に含有されるｃＴｎとしては、ｃＴｎＩ、ｃＴｎＴ、ｃＴｎＣ、ｃＴｎＩとＴのダイマー、ｃＴｎＩとＣのダイマー、ｃＴｎＴとＣのダイマー又はｃＴｃＩとＴとＣのトリマーから選ばれる１種以上のものであれば、上記いかなる形態であってもカゼイン系タンパク質及びベンズアミジン誘導体の共存による安定化の効果を得ることができる。標品に含有されるｃＴｎ及びＢＮＰともに、ヒトに由来するものに限定されるものではなく、例えばラット、ブタ、イヌ又はウナギ来のｃＴｎやＢＮＰであっても良く、またかかる生体由来の抽出精製物等のほか、化学合成物や遺伝子組換え技術による製造物等であってもカゼイン系タンパク質及びベンズアミジン誘導体の共存による安定化の効果を得ることができる。また更に、例えばＢＮＰにおいては、例えば−Ｓ−Ｓ−結合により形成されるリング部位を有する誘導体等であっても良い。本発明におけるＢＮＰ誘導体の一例として、いわゆるＰｒｏ ＢＮＰやＮＴ−Ｐｒｏ ＢＮＰを例示できる。また更には、例えば一次構造における各アミノ酸残基の含有比率が類似しているＡＮＰやＣＮＰ等もまた、本発明におけるＢＮＰ誘導体として例示できる。

カゼイン系タンパク質としては、植物由来カゼインや牛乳カゼイン等の種々のカゼインやカゼインナトリウムを使用することができる。市販されているものでは、例えば免疫測定用固相のブロッキング剤として流通しているもの（商品名ブロックエース、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）等を使用しても良い。カゼイン系タンパク質は、標品中のｃＴｎ及びＢＮＰ濃度を勘案して共存量を決定すれば良いが、例えば本発明の標品を測定用管理物質として使用する場合、一般にｃＴｎが０．２から５０ｎｇ／ｍＬ、ＢＮＰが２０から２０００ｐｇ／ｍＬの範囲であることから、溶液状態では好ましくは終濃度が１から１０％、特に好ましくは１から３％となるように共存させることが例示できる。

ベンズアミジン誘導体としては、ベンザミジン（塩酸塩）、アミノベンザミジン、４−メトキシベンザミジン等を例示することができる。ベンズアミジン誘導体は、標品中のｃＴｎ及びＢＮＰ濃度を勘案して共存量を決定すれば良いが、例えば本発明の標品を測定用管理物質として使用する場合、一般にｃＴｎが０．２から５０ｎｇ／ｍＬ、ＢＮＰが２０から２０００ｐｇ／ｍＬの範囲であることから、溶液状態では好ましくは終濃度が１から１００ｍＭ、特に好ましくは５から２０ｍＭとなるように共存させることが例示できる。

本発明の標品は、カゼイン系タンパク質とベンズアミジン誘導体に加えて、目的に応じて例えばウシ血清アルブミン等の保剤、例えばアスコルビン酸やビタミンＥ等の抗酸化剤、例えばカルボキシメチルセルロース等の結合剤、例えばセルロース又はポリエチレングリコール等の湿潤剤、例えば合成食用色素等の着色剤、例えばポリビニルピロリドン等の懸濁化剤、例えばアルキルスルホン酸等の乳化剤、例えばグリセリン等の溶解補助剤、例えばリン酸塩又はトリスヒドキシルアミン塩酸塩等緩衝剤、例えばＤ−ソルビトール又は塩化ナトリウム等の等張化、例えばトライトンＸ−１００又はツィーン２０等の界面活性剤を含有していても良い。上記例示したような剤の一種又は二種以上を更に共存させる場合には、例えば標品を測定管理用物質として使用するのであれば抗原抗体反応を阻害しないことを確認するなど、本発明の標品の用途を勘案することが好ましい。更に本発明では、それらの安定性を確保できる限り、ｃＴｎ又はＢＮＰ以外の心筋マーカーであるミオグロビンやＣＫＭＢを含有することができる。

本発明では、例えばｃＴｎとＢＮＰを含有する溶液とカゼイン系タンパク質及びベンズアミジン誘導体を含有する溶液を混合すること等により、前記標品を製造する。この操作に際しては、ＢＮＰのガラスへの吸着を防ぐ目的で、ポリスチレンやポリプロピレン製容器を使用するか、又は、ガラス製容器を使用するのであればまずカゼイン系タンパク質及びベンズアミジン誘導体を含有する溶液をガラス製容器に投入し、その後にｃＴｎとＢＮＰを含有する溶液を添加することが好ましい。なお、カゼイン系タンパク質及びベンズアミジン誘導体を共存させることにより、ＢＮＰのガラスへの吸着をも低減することが可能である。

以上のようにして製造した本発明の標品については、その後、凍結し、また必要に応じて更に乾燥しても、その安定性が失われることはない。

本発明によれば、カゼイン系タンパク質とベンズアミジン誘導体を共存させるという極めて簡便な操作によって、診断の分野等で重要性を増しつつあるｃＴｎ及びＢＮＰの両者を含有する標品を長期間に渡って安定的に維持することが可能になる。しかも、液状はもとより、凍結した状態や凍結乾燥した状態であってもカゼイン系タンパク質とベンズアミジン誘導体を共存させることによる効果は失われないため、種々の形態の標品を提供することが可能になる。また更に、ＢＮＰのガラスへの吸着を抑制し、従来ＢＮＰの保存のためには使用し難かったガラス容器を使用することも可能になる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、各例中、カゼイン系タンパク質としては免疫測定用固相のブロッキング剤として一般に流通しているもの（商品名ブロックエース、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を使用した。

実施例１
２ｗｔ％のカゼイン系タンパク質を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、最終濃度がそれぞれ４０ｐｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ又は１０ｎｇ／ｍＬとなるようにＢＮＰ、ｃＴｎＩ、ミオグロビン及びＣＫＭＢを添加して、溶液Ａを調整した。この溶液Ａに対して、最終濃度がそれぞれ５ｍＭ又は１０ｍＭになるようにベンズアミジン塩酸塩を添加して溶液Ｂ及び溶液Ｃを調整した。

溶液ＡからＣのそれぞれ２ｍＬをガラス製容器に分注して凍結乾燥した後、４０℃で７日間保存した。その後、凍結乾燥物に蒸留水２ｍＬを加えて溶解しＢＮＰ、トロポニンＩ、ミオグロビン、ＣＫＭＢ濃度を測定した。結果を表１に示す。なお表１中、「濃度百分率」は、以下の式１に基づいて計算したものである。

表１からは、溶液Ｂ及び溶液Ｃ（カゼイン系タンパク質とベンズアミジン塩酸塩を共存させた標品）では溶解後４℃７日間保存してもＢＮＰ、ｃＴｎＩ、ミオグロビン、ＣＫＭＢともに濃度百分率は９０％以上を示しており、これらの心筋マーカーが安定であることが分かる。

比較例 １
５ｗｔ％の牛血清アルブミンを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、最終濃度がそれぞれ１００ｐｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ又は１００ｎｇ／ｍＬとなるようにＢＮＰ、ｃＴｎＩ、ミオグロビン及びＣＫＭＢを添加して、溶液Ｄを調製した。ゲリセートペプトンを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対し同様にして溶液Ｅを、カゼイン系タンパク質を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対し同様にして溶液Ｆを、それぞれ調製した。

溶液ＤからＦのそれぞれ２ｍＬをガラス製容器に分注して凍結乾燥した後、４
℃で７日間保存した。その後、凍結乾燥物に蒸留水２ｍＬを加えて溶解しＢＮＰ、トロポニンＩ、ミオグロビン、ＣＫＭＢ濃度を測定した。結果を表２に示す。表２中、「濃度百分率」は、以下の式２に基づいて計算したものである。

表２からは、溶液Ｆ（カゼイン系タンパク質を共存させた標品）ではＢＮＰ、トロポニンＩ、ミオグロビン、ＣＫＭＢが４０℃で７日目保存しても濃度百分率は９０％以上と比較的良好であるが、特にＢＮＰに関しては、実施例１における結果を下回ることが分かる。

以上の結果から、カゼイン系タンパク質又はベンズアミジン誘導体のいずれも共存していない標品では、ＢＮＰ、トロポニンＩ、ミオグロビン、ＣＫＭＢを安定に保存できないことが分かる。またカゼイン系タンパク質単独でも一定の効果が得られるものの、その安定性の向上効果は、カゼイン系タンパク質とベンズアミジン誘導体を共存させた効果には及ばないことが分かる。

Claims (2)

1. カゼイン系タンパク質及びベンズアミジン誘導体を共存させたことを特徴とする心筋トロポニン及び脳性ナトリウム利尿ペプチド含有標品。
2. カゼイン系タンパク質及びベンズアミジン誘導体を添加することを特徴とする、心筋トロポニン及び脳性ナトリウム利尿ペプチド含有標品の製造方法。