JP2579672B2 - 均質なｔ−４取込み分析法 - Google Patents
均質なｔ−４取込み分析法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は診断上の分析、特に甲状腺の取込みについて
の分析に関する。
の分析に関する。
活性な甲状腺ホルモンは、Ｔ−４およびＴ−３と呼称
される。血液中では、Ｔ−４およびＴ−３は、ほとんど
全部血漿タンパク質と結合している。サイロキシン結合
グロブリン（thyroxine binding globulin;TBG）は、常
態ではＴ−４の全結合強度の主要な決定因子である。Ｔ
−４とそれの結合タンパク質との間の相互作用は、可逆
的な結合平衡にある。少量のＴ−４（普通約0.03％）だ
けが血液中で遊離型である。しかし、Ｔ−３は容易に結
合せず、そして結果として、遊離型のＴ−３の正常な割
合はＴ−４のそれより８〜10倍大きい。遊離（未結合）
のホルモンだけが組織にとって有効である。それ故、患
者の代謝状態は、血漿中のホルモンの全濃度よりもむし
ろ遊離のホルモン濃度と密度に関係がある。
される。血液中では、Ｔ−４およびＴ−３は、ほとんど
全部血漿タンパク質と結合している。サイロキシン結合
グロブリン（thyroxine binding globulin;TBG）は、常
態ではＴ−４の全結合強度の主要な決定因子である。Ｔ
−４とそれの結合タンパク質との間の相互作用は、可逆
的な結合平衡にある。少量のＴ−４（普通約0.03％）だ
けが血液中で遊離型である。しかし、Ｔ−３は容易に結
合せず、そして結果として、遊離型のＴ−３の正常な割
合はＴ−４のそれより８〜10倍大きい。遊離（未結合）
のホルモンだけが組織にとって有効である。それ故、患
者の代謝状態は、血漿中のホルモンの全濃度よりもむし
ろ遊離のホルモン濃度と密度に関係がある。
甲状腺ホルモン−血漿タンパク質の相互作用の妨害に
は２つの概括的なタイプがある。妨害の第１のタイプで
は、TBGもしくは他の血清結合タンパク質の量の増加ま
たは異常な血清結合タンパク質の出現が遊離のホルモン
のレベルの低下を引き起こす。遊離のホルモンの濃度が
正常に戻るまで、血清中の全ホルモン濃度が増加するか
もしれない。妨害の第２のタイプでは、サイロキシン結
合グロブリン（TBG）の濃度は正常であるが、甲状腺ホ
ルモンの量が異常である。このタイプの障害において
は、遊離のホルモンの比率がホルモン補給における変化
と同じ方向に変化する。
は２つの概括的なタイプがある。妨害の第１のタイプで
は、TBGもしくは他の血清結合タンパク質の量の増加ま
たは異常な血清結合タンパク質の出現が遊離のホルモン
のレベルの低下を引き起こす。遊離のホルモンの濃度が
正常に戻るまで、血清中の全ホルモン濃度が増加するか
もしれない。妨害の第２のタイプでは、サイロキシン結
合グロブリン（TBG）の濃度は正常であるが、甲状腺ホ
ルモンの量が異常である。このタイプの障害において
は、遊離のホルモンの比率がホルモン補給における変化
と同じ方向に変化する。
遊離のＴ−４の量が低すぎる場合、患者は合成のＴ−
４（レボサイロキシン）で治療され得る。その場合、患
者を治療する上で未結合のホルモンだけが有効であるの
で、Ｔ−４の投与後の全サイロキシン濃度よりもむし
ろ、投与された合成Ｔ−４がTBGによりどれ位結合され
るかを測定することが重要である。
４（レボサイロキシン）で治療され得る。その場合、患
者を治療する上で未結合のホルモンだけが有効であるの
で、Ｔ−４の投与後の全サイロキシン濃度よりもむし
ろ、投与された合成Ｔ−４がTBGによりどれ位結合され
るかを測定することが重要である。
ホルモン濃度および血液中での結合に関する多くの分
析法が開発された。遊離のＴ−４の濃度は、ラベル化し
た少量のＴ−４で富化された血清の平衡透析法により決
定され得る。透析性であり従って遊離型であるＴ−４の
割合が決定される。その数値から結合している割合を計
算することができる。しかしながら、その透析法は厄介
であり、そして一般に臨床目的において有用でない。ラ
ベル化されたＴ−４またはＴ−３と共に血清をインキュ
ベートし、次いで不溶性粒状物質、例えば遊離のホルモ
ンと非特異的に結合する樹脂または活性炭、と共にイン
キュベートすることにおける試験管内の取込み試験は既
に開発されている。その粒状物質と結合したラベル化ホ
ルモンの割合は、血清タンパク質に占有された部位の濃
度およびラベル化ホルモンに対する親和性と反対に変化
する。
析法が開発された。遊離のＴ−４の濃度は、ラベル化し
た少量のＴ−４で富化された血清の平衡透析法により決
定され得る。透析性であり従って遊離型であるＴ−４の
割合が決定される。その数値から結合している割合を計
算することができる。しかしながら、その透析法は厄介
であり、そして一般に臨床目的において有用でない。ラ
ベル化されたＴ−４またはＴ−３と共に血清をインキュ
ベートし、次いで不溶性粒状物質、例えば遊離のホルモ
ンと非特異的に結合する樹脂または活性炭、と共にイン
キュベートすることにおける試験管内の取込み試験は既
に開発されている。その粒状物質と結合したラベル化ホ
ルモンの割合は、血清タンパク質に占有された部位の濃
度およびラベル化ホルモンに対する親和性と反対に変化
する。
TBGの取込み値をより正確に測定する方法は、非−甲
状腺疾病の低いＴ−４状態を甲状腺機能低下症の明白な
サイロキシン欠損から区別することにおいて臨床家を援
助するであろう。そのような方法はまた、甲状腺機能低
下症により生じる症状を緩和するために投与するべき合
成Ｔ−４の量をより正確に決定することを可能にするで
あろう。
状腺疾病の低いＴ−４状態を甲状腺機能低下症の明白な
サイロキシン欠損から区別することにおいて臨床家を援
助するであろう。そのような方法はまた、甲状腺機能低
下症により生じる症状を緩和するために投与するべき合
成Ｔ−４の量をより正確に決定することを可能にするで
あろう。
Kapteinら、J.of Clin.Endrocrinol.and Metab.（198
1）52:1073は、遊離型サイロキシンの評価の８つの方法
の比較を提供する。その文献は、甲状腺機能低下症およ
び視床下部下垂体機能低下症により生じる低いＴ−４レ
ベルを非甲状腺の疾病により生じるものから区別する分
析能力を記載している。評価された分析方法は、平衡透
析法、エンザイムイムノアッセイ（Abbott）、抗体でコ
ートされたチューブ（Clinical Assay）、抗体でコート
された微細シリカ（Corning Immunophase）、マイクロ
カプセル化抗体（Damon）、およびＴ−３取込み率また
はサイロキシン結合グロブリン法を使った遊離のＴ−４
取込みである。
1）52:1073は、遊離型サイロキシンの評価の８つの方法
の比較を提供する。その文献は、甲状腺機能低下症およ
び視床下部下垂体機能低下症により生じる低いＴ−４レ
ベルを非甲状腺の疾病により生じるものから区別する分
析能力を記載している。評価された分析方法は、平衡透
析法、エンザイムイムノアッセイ（Abbott）、抗体でコ
ートされたチューブ（Clinical Assay）、抗体でコート
された微細シリカ（Corning Immunophase）、マイクロ
カプセル化抗体（Damon）、およびＴ−３取込み率また
はサイロキシン結合グロブリン法を使った遊離のＴ−４
取込みである。
本発明は、サイロキシン結合グロブリン（TBG）の活
性を直接測定することにおけるサイロキシン取込み測定
の改良方法を提供する。試料中のTBGによるサイロキシ
ン取込みを測定する方法は、有効な（available）サイ
ロキシン結合グロブリン部位に結合するポリヨードサイ
ロニン類似体と接合した酵素供与体（ED）を水溶液中の
試料と混合することを含んで成る。Ｔ−４に対するTBG
の親和性が有意に変化しないようにEDへのＴ−４の付着
が調節される。試料は、TBG活性量に関連して変化する
酵素活性を提供することにより特徴づけられる、酵素供
与体（ED）および酵素受容体（EA）と一緒にされる。そ
して既知量の有効なTBG結合部位を有する対照溶液と比
較して酵素活性の量が決定される。
性を直接測定することにおけるサイロキシン取込み測定
の改良方法を提供する。試料中のTBGによるサイロキシ
ン取込みを測定する方法は、有効な（available）サイ
ロキシン結合グロブリン部位に結合するポリヨードサイ
ロニン類似体と接合した酵素供与体（ED）を水溶液中の
試料と混合することを含んで成る。Ｔ−４に対するTBG
の親和性が有意に変化しないようにEDへのＴ−４の付着
が調節される。試料は、TBG活性量に関連して変化する
酵素活性を提供することにより特徴づけられる、酵素供
与体（ED）および酵素受容体（EA）と一緒にされる。そ
して既知量の有効なTBG結合部位を有する対照溶液と比
較して酵素活性の量が決定される。
実際的な方法は、実施するのに迅速で、より正確でそ
して簡単であり、加えて抗体を使って結合を測定する間
接測定法よりもより正確でありそして経済的である。
して簡単であり、加えて抗体を使って結合を測定する間
接測定法よりもより正確でありそして経済的である。
サイロキシン結合グロブリン（TBG）活性を直接測定
することにおけるサイロキシン取込み測定の改良方法が
提供される。本発明は、血清における遊離のＴ−３およ
びまたはＴ−４の低レベルが甲状腺機能低下症または非
−甲状腺疾病のどちらに起因するかに関して、確かな情
報を提供する。
することにおけるサイロキシン取込み測定の改良方法が
提供される。本発明は、血清における遊離のＴ−３およ
びまたはＴ−４の低レベルが甲状腺機能低下症または非
−甲状腺疾病のどちらに起因するかに関して、確かな情
報を提供する。
本法は、有効なサイロキシン結合グロブリン部位と結
合するポリヨードサイロニンの類似体と接合した酵素供
与体と水溶液中の試料を一緒にすることを含んで成る。
酵素受容体、酵素供与体および酵素基質を試料と一緒に
して分析媒体を形成せしめる。試料を酵素供与体接合体
または酵素受容体のどちらかとプレインキュベートして
もよい。また、試料の不在下で酵素供与体と酵素受容体
とを混合しない限りは、分析媒体の全ての成分を一緒に
してもよい。酵素受容体は、部分的には、該接合体と結
合する時にTBG活性の量に関連して変化する酵素活性を
提供することにより特徴づけられる。即ち、試料のTBG
活性が増加すると酵素活性の量は減少する。酵素活性の
量は、TBGによる既知のサイロキシン取込み量を有する
対照溶液と比較される。
合するポリヨードサイロニンの類似体と接合した酵素供
与体と水溶液中の試料を一緒にすることを含んで成る。
酵素受容体、酵素供与体および酵素基質を試料と一緒に
して分析媒体を形成せしめる。試料を酵素供与体接合体
または酵素受容体のどちらかとプレインキュベートして
もよい。また、試料の不在下で酵素供与体と酵素受容体
とを混合しない限りは、分析媒体の全ての成分を一緒に
してもよい。酵素受容体は、部分的には、該接合体と結
合する時にTBG活性の量に関連して変化する酵素活性を
提供することにより特徴づけられる。即ち、試料のTBG
活性が増加すると酵素活性の量は減少する。酵素活性の
量は、TBGによる既知のサイロキシン取込み量を有する
対照溶液と比較される。
この分析方法は、サイロキシン結合グロブリンを含有
する試料に関して使用され得る。通常、試料は患者の血
清または血漿であろう。微粒子物の除去以外には、通
常、即時の分析法のために試料の他の前処理は全く行わ
れないだろう。
する試料に関して使用され得る。通常、試料は患者の血
清または血漿であろう。微粒子物の除去以外には、通
常、即時の分析法のために試料の他の前処理は全く行わ
れないだろう。
酵素供与体および酵素受容体は、β−ガラクトシダー
ゼの部分配列であり、酵素供与体の方がより小さい。酵
素供与体および酵素受容体は変異していてもよい。β−
ガラクトシダーゼ酵素供与体フラグメントは、実質的に
β−ガラクトシダーゼ単量体のＮ端部分と同じアミノ酸
配列を有し、酵素受容体は、実質的にβ−ガラクトシダ
ーゼ単量体分子の50％より多いＣ端部分と同じアミノ酸
配列を有する。β−ガラクトシダーゼ活性は、β−ガラ
クトシダーゼ酵素受容体単量体フラグメントと酵素供与
体接合体との相補性に由来する。
ゼの部分配列であり、酵素供与体の方がより小さい。酵
素供与体および酵素受容体は変異していてもよい。β−
ガラクトシダーゼ酵素供与体フラグメントは、実質的に
β−ガラクトシダーゼ単量体のＮ端部分と同じアミノ酸
配列を有し、酵素受容体は、実質的にβ−ガラクトシダ
ーゼ単量体分子の50％より多いＣ端部分と同じアミノ酸
配列を有する。β−ガラクトシダーゼ活性は、β−ガラ
クトシダーゼ酵素受容体単量体フラグメントと酵素供与
体接合体との相補性に由来する。
該酵素受容体は、酵素供与体接合体と結合して複合体
を提供することにより特徴づけられ、複合体の酵素活性
は、分析条件下でサイロキシン結合グロブリン活性の量
に関係して変化する。即ち、酵素供与体接合体がTBGと
結合すると、測定時間の間、酵素活性は、酵素供与体接
合体が未結合の時の酵素活性に比べて実質的に減少す
る。
を提供することにより特徴づけられ、複合体の酵素活性
は、分析条件下でサイロキシン結合グロブリン活性の量
に関係して変化する。即ち、酵素供与体接合体がTBGと
結合すると、測定時間の間、酵素活性は、酵素供与体接
合体が未結合の時の酵素活性に比べて実質的に減少す
る。
酵素供与体フラグメントは、サイロキシン結合グロブ
リン結合部位に結合するポリヨードサイロニンの類似体
と接合される。その類似体は、一般にＴ−４であるかま
たはＴ−４に関連するものである。Ｔ−３もまた利用さ
れるが、TBGはＴ−３に対して非常に低い親和性を有し
ており、使用されるEDに依存して、あまり正確でない測
定値を導く。ほとんどの場合、該類似体は４−（３′,
5′−ジヨード−４′−ヒドロキシフェノ−１′−オキ
シ）−3,5−ジヨードフェニル基を有するであろう。
リン結合部位に結合するポリヨードサイロニンの類似体
と接合される。その類似体は、一般にＴ−４であるかま
たはＴ−４に関連するものである。Ｔ−３もまた利用さ
れるが、TBGはＴ−３に対して非常に低い親和性を有し
ており、使用されるEDに依存して、あまり正確でない測
定値を導く。ほとんどの場合、該類似体は４−（３′,
5′−ジヨード−４′−ヒドロキシフェノ−１′−オキ
シ）−3,5−ジヨードフェニル基を有するであろう。
β−ガラクトシダーゼ酵素供与体および受容体は、米
国特許第4,708,929号（1985年４月８日に出願された出
願番号第721,267号）において記載されており、その開
示は引用により、本明細書に組み入れられる。前記出願
明細書中に記載された分析条件は、本発明に適用でき
る。
国特許第4,708,929号（1985年４月８日に出願された出
願番号第721,267号）において記載されており、その開
示は引用により、本明細書に組み入れられる。前記出願
明細書中に記載された分析条件は、本発明に適用でき
る。
水溶液および分析条件は、酵素供与体と酵素受容体と
の相補体形成に備える。一般に、リン酸ナトリウム緩衝
液のような生理的緩衝液が有用である。好ましい緩衝液
は、10〜30mM NaPO4,5〜10mM EGTA、および10〜20mM Na
N3から成り、６〜８のpHを有する。温度は普通少なくと
も25℃であり、好ましくはより高められた温度である
が、60℃以下、普通70℃以下であろう。エンザイムアッ
セイは、一般に室温（25℃）から40℃未満、普通約37℃
で行われる。その分析は大気圧にて実施される。
の相補体形成に備える。一般に、リン酸ナトリウム緩衝
液のような生理的緩衝液が有用である。好ましい緩衝液
は、10〜30mM NaPO4,5〜10mM EGTA、および10〜20mM Na
N3から成り、６〜８のpHを有する。温度は普通少なくと
も25℃であり、好ましくはより高められた温度である
が、60℃以下、普通70℃以下であろう。エンザイムアッ
セイは、一般に室温（25℃）から40℃未満、普通約37℃
で行われる。その分析は大気圧にて実施される。
分析媒体中の酵素供与体接合体の濃度は、普通約１〜
60nM、より普通には５〜25nMの範囲であり、一方酵素受
容体濃度は４〜200単位/ml、普通80〜120単位/mlの範囲
であろう。酵素供与体接合体対酵素受容体のモル比は、
普通1:30〜1:80、より普通には1:50〜1:60であろう。TB
G結合部位の定量のために重要の有用な範囲は、20〜50
％取込みであろう。
60nM、より普通には５〜25nMの範囲であり、一方酵素受
容体濃度は４〜200単位/ml、普通80〜120単位/mlの範囲
であろう。酵素供与体接合体対酵素受容体のモル比は、
普通1:30〜1:80、より普通には1:50〜1:60であろう。TB
G結合部位の定量のために重要の有用な範囲は、20〜50
％取込みであろう。
分析媒体中の酵素活性量は、β−ガラクトシダーゼ活
性を測定するための標準的な技術に従って測定されるで
あろう。酵素基質は、該酵素により分解された時に分析
媒体の吸光または発光の量に変化を生じるものが使用さ
れる。即ち、基質の分解が着色生成物または蛍光生成物
の出現または消失をもたらす。好ましい酵素基質は、オ
ルト−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（ONPG）であ
り、これは酵素で分解されてオルト−ニトロフェノール
（ONP）を形成する。ONPの吸光度は420nmで測定され
る。他の同等の酵素基質も商業的に入手可能である。
性を測定するための標準的な技術に従って測定されるで
あろう。酵素基質は、該酵素により分解された時に分析
媒体の吸光または発光の量に変化を生じるものが使用さ
れる。即ち、基質の分解が着色生成物または蛍光生成物
の出現または消失をもたらす。好ましい酵素基質は、オ
ルト−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（ONPG）であ
り、これは酵素で分解されてオルト−ニトロフェノール
（ONP）を形成する。ONPの吸光度は420nmで測定され
る。他の同等の酵素基質も商業的に入手可能である。
既知量のTBG活性を有する試料と比較してTBG活性量を
決定することは、多数のやり方で行われ得る。１つまた
は複数の未知試料、および対照試料（標準試料）、普通
２つまたは３つの標準試料を分析する。次のようにし
て、試料および対照を平行して処理する。試料を混合し
た後約３分〜約４分で最初の読みを行う。該試料をさら
に１〜２分間インキュベートし、そして第２の吸光度を
読む。標準試料における吸光度または発光度の値の変化
は、標準曲線を作成するのに使用され得る。このように
して、試料中のＴ−４取込み率がその曲線から決定され
得る。
決定することは、多数のやり方で行われ得る。１つまた
は複数の未知試料、および対照試料（標準試料）、普通
２つまたは３つの標準試料を分析する。次のようにし
て、試料および対照を平行して処理する。試料を混合し
た後約３分〜約４分で最初の読みを行う。該試料をさら
に１〜２分間インキュベートし、そして第２の吸光度を
読む。標準試料における吸光度または発光度の値の変化
は、標準曲線を作成するのに使用され得る。このように
して、試料中のＴ−４取込み率がその曲線から決定され
得る。
本発明を容易にする試薬を含有するキットもまた期待
される。そのキットは、少なくとも１つの容器、普通別
々の容器の中に、前述したようなβ−ガラクトシダーゼ
酵素供与体接合体および酵素受容体を含んで成る。別々
の容器に詰める時、酵素供与体または酵素受容体がさら
に酵素基質を含んでもよい。酵素供与体接合体および酵
素受容体並びに基質は凍結乾燥された形であってもよ
い。該キットは普通、試薬類を復元するのに適する緩衝
液を含み、その緩衝液を酵素成分と共にまたは別々に詰
めてもよい。該キットはまた、サイロキシン結合グロブ
リンによる既知のサイロキシン取込み量を有する血清を
含んで成る、１つまたは複数の対照試料を含有してもよ
い。該キットは、自動分析での使用のために特に考案さ
れ得る。
される。そのキットは、少なくとも１つの容器、普通別
々の容器の中に、前述したようなβ−ガラクトシダーゼ
酵素供与体接合体および酵素受容体を含んで成る。別々
の容器に詰める時、酵素供与体または酵素受容体がさら
に酵素基質を含んでもよい。酵素供与体接合体および酵
素受容体並びに基質は凍結乾燥された形であってもよ
い。該キットは普通、試薬類を復元するのに適する緩衝
液を含み、その緩衝液を酵素成分と共にまたは別々に詰
めてもよい。該キットはまた、サイロキシン結合グロブ
リンによる既知のサイロキシン取込み量を有する血清を
含んで成る、１つまたは複数の対照試料を含有してもよ
い。該キットは、自動分析での使用のために特に考案さ
れ得る。
下記の例は、明晰の目的で例示のために提供されるも
のであり、そして限定のためのものではない。
のであり、そして限定のためのものではない。
実施例 ED緩衝液〔20mM NaPO4;10mM EGTA（エチレン−ビス−
オキシエチレンニトリロ四酢酸）;20mM NaN3;0.05％ Tw
een20;6.25mg/ml ONPG;0.9％Ｎ−ラウロイルサルコシン
ナトリウム塩;pH7.0〕中の11nM酵素供与体接合体（ED4
−T4、出願番号第721,267号、上記、を参照のこと）の
緩衝化された溶液およびEA緩衝液〔20mM NaPO4;10mM EG
TA;20mM NaN3;5mMショ糖;2mM Mg(OAc)2・４H2O;0.2％
β−シクロデキストリン;3.6％グリセロール;pH7.0〕中
の22単位の酵素受容体（EA−22）の緩衝化された溶液を
調製した。両溶液を使用まで氷上に保存した。また、対
照の血清試料を検量線作成用として使った。その検量線
作成用の数値は20,35および50％のＴ−取込みであっ
た。未知のTBG活性を有する２人の患者の試料を同様に
分析した。
オキシエチレンニトリロ四酢酸）;20mM NaN3;0.05％ Tw
een20;6.25mg/ml ONPG;0.9％Ｎ−ラウロイルサルコシン
ナトリウム塩;pH7.0〕中の11nM酵素供与体接合体（ED4
−T4、出願番号第721,267号、上記、を参照のこと）の
緩衝化された溶液およびEA緩衝液〔20mM NaPO4;10mM EG
TA;20mM NaN3;5mMショ糖;2mM Mg(OAc)2・４H2O;0.2％
β−シクロデキストリン;3.6％グリセロール;pH7.0〕中
の22単位の酵素受容体（EA−22）の緩衝化された溶液を
調製した。両溶液を使用まで氷上に保存した。また、対
照の血清試料を検量線作成用として使った。その検量線
作成用の数値は20,35および50％のＴ−取込みであっ
た。未知のTBG活性を有する２人の患者の試料を同様に
分析した。
既知の血清標準試料各14μｌを、96ウエルのミクロタ
イタープレートのラベルを付したウエルにピペットで加
えた。蒸留水14μｌを１つのウエルに入れてブランクと
した。蒸留水36μｌを各ミクロタイターウエルに加え
た。ブランクを除く各ウエルに酵素受容体溶液160μｌ
を加え、ブランクには蒸留水160μｌを加えた。該プレ
ートを軽くたたくことによりまたは回転することによ
り、溶液を混合した。その後、各ウエルに酵素供与体溶
液40μｌを入れた。プレートを軽くたたくことによりま
たは回転することにより、その溶液を混合した。そのプ
レートを37℃のインキュベーター中に４分間置いた。イ
ンキュベーターからミクロタイタープレートを取り出
し、そして適当なフィルターを有するミクロタイタープ
レートリーダーを使って、各試料について420nmの吸光
度を読みとった。該プレートを読みとった後すぐに、そ
れをインキュベーターに戻した。２回目の読取りは、１
回目の読取りの１分後に行い、全体で５分間かかった。
そして数値間の差異を決定した。Ｘ軸として既知の取込
み量およびＹ軸として１分の速度を使って、既知の標準
試料についての検量線を作成した。未知の試料の速度を
その曲線から読みとってＴ−取込みの割合を決定した。
イタープレートのラベルを付したウエルにピペットで加
えた。蒸留水14μｌを１つのウエルに入れてブランクと
した。蒸留水36μｌを各ミクロタイターウエルに加え
た。ブランクを除く各ウエルに酵素受容体溶液160μｌ
を加え、ブランクには蒸留水160μｌを加えた。該プレ
ートを軽くたたくことによりまたは回転することによ
り、溶液を混合した。その後、各ウエルに酵素供与体溶
液40μｌを入れた。プレートを軽くたたくことによりま
たは回転することにより、その溶液を混合した。そのプ
レートを37℃のインキュベーター中に４分間置いた。イ
ンキュベーターからミクロタイタープレートを取り出
し、そして適当なフィルターを有するミクロタイタープ
レートリーダーを使って、各試料について420nmの吸光
度を読みとった。該プレートを読みとった後すぐに、そ
れをインキュベーターに戻した。２回目の読取りは、１
回目の読取りの１分後に行い、全体で５分間かかった。
そして数値間の差異を決定した。Ｘ軸として既知の取込
み量およびＹ軸として１分の速度を使って、既知の標準
試料についての検量線を作成した。未知の試料の速度を
その曲線から読みとってＴ−取込みの割合を決定した。
上記の結果は、TBGの有効な結合部位の容易な、正確
なそして迅速な直接測定を証明する。この方法は、検体
を平均化させるための過剰のサイロキシンを含む間接測
定および全結合部位の測定加えて全サイロキシンの測定
を必要とせず、放射性同位体も使用しない。TBGは酵素
供与体接合体と結合することができ、そのため有効なTB
G部位の直接測定を可能にする。
なそして迅速な直接測定を証明する。この方法は、検体
を平均化させるための過剰のサイロキシンを含む間接測
定および全結合部位の測定加えて全サイロキシンの測定
を必要とせず、放射性同位体も使用しない。TBGは酵素
供与体接合体と結合することができ、そのため有効なTB
G部位の直接測定を可能にする。
本発明を今まで十分に記載したので、当業者には、上
記の特許請求の範囲の精神または範囲からはずれること
なく、多くの変更および改良を行うことができることは
明らかであろう。
記の特許請求の範囲の精神または範囲からはずれること
なく、多くの変更および改良を行うことができることは
明らかであろう。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−186855（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−163566（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−225655（ＪＰ，Ａ) 特開 昭51−106724（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−757（ＪＰ，Ａ) 米国特許4341865（ＵＳ，Ａ) 米国特許4171244（ＵＳ，Ａ) 国際公開86／2666（ＷＯ，Ａ)
Claims (9)
- 【請求項１】試料中の有効なサイロキシン結合性部位の
量を直接測定するための方法であって、 （ａ）分析媒体中で、（１）β−ガラクトシダーゼの基
質、（２）前記試料、（３）β−ガラクトシダーゼのＣ
末端領域と実質的に同じアミノ酸配列を有するβ−ガラ
クトシダーゼ受容体フラグメント、及び（４）β−ガラ
クトシダーゼ酵素供与体フラグメントを含んで成るβ−
ガラクトシダーゼ酵素供与体接合体を一緒にする、ここ
で前記供与体フラグメントは、活性甲状腺ホルモンＴ−
３もしくはＴ−４又は遊離のサイロキシン結合性部位に
対してサイロキシンと競合するその類似体に結合されて
いる前記Ｃ末端領域に対して相補性なβ−ガラクトシダ
ーゼのＮ末端領域と実質的に同じアミノ酸配列を有して
おり、ここで前記β−ガラクトシダーゼ供与体接合体と
前記β−ガラクトシダーゼ受容体フラグメントとは前記
試料の非存在下では一緒にしないことを条件とし、そし
てここで前記供与体と前記受容体フラグメントは複合体
化して活性のβ−ガラクトシダーゼ酵素を形成するもの
であり、そしてこの複合体化率は前記酵素供与体接合体
がサイロキシン結合性部位を有するタンパク質に結合す
ると変化してしまうものである；そして （ｂ）前記分析媒体におけるβ−ガラクトシダーゼ活性
量を、既知量の有効なサイロキシン結合性部位を含む分
析媒体と比較して決定する； ことを含んで成る方法。 - 【請求項２】前記酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、
そして前記酵素供与体フラグメントが小さい方のフラグ
メントであり、且つβ−ガラクトシダーゼのＮ末端配列
と実質的に同じ配列を含んで成る、請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】前記試料が血清又は血漿である、請求項２
記載の方法。 - 【請求項４】前記β−ガラクトシダーゼ供与体フラグメ
ントが小さい方のフラグメントであり、且つβ−ガラク
トシダーゼのＮ末端と実質的に同じ配列を含んで成り、
そして前記β−ガラクトシダーゼ受容体フラグメントが
大きい方のフラグメントである前記方法であって、 （ａ）水性溶液中で、 （ｉ）前記試料； （ii）前記受容体フラグメント； （iii）活性甲状腺ホルモンＴ−３もしくはＴ−４又は
前記部位に対してサイロキシンと競合するその類似体と
結合した前記供与体フラグメントを含んで成る供与体接
合体； （iv）β−ガラクトシダーゼ触媒反応を受けて吸光生成
物または発光生成物を生成するβ−ガラクトシダーゼの
基質； を混合して分析媒体を形成せしめ； （ｂ）複合体化が起こるのに十分な時間にわたって前記
分析媒体をインキュベートし； （ｃ）２つの異なる時点において吸光または発光を測定
しそしてその差異を決定して前記比較を実施する； ことを含んで成る請求項１記載の方法。 - 【請求項５】前記２つの異なる時点が１分間隔以上であ
る、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】前記基質がｏ−ニトロフェニル−β−ガラ
クトシドである、請求項４に記載の方法。 - 【請求項７】前記競合する活性甲状腺成分又は類似体
が、４−（３′、５′−ジヨード−４′−ヒドロキシフ
ェノ−１′−オキシ）−3,5−ジヨードフェニル基を含
んで成る、請求項４に記載の方法。 - 【請求項８】（１）前記供与体接合体；（２）前記酵素
受容体；（３）既知量のサイロキシン結合性部位を含む
対照物；及び（４）前記基質；を含んで成る、請求項１
記載の方法を実施するためのキット。 - 【請求項９】前記（１）および（２）が凍結乾燥されて
いる、請求項８に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10434287A | 1987-10-02 | 1987-10-02 | |
| US104342 | 1987-10-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01257262A JPH01257262A (ja) | 1989-10-13 |
| JP2579672B2 true JP2579672B2 (ja) | 1997-02-05 |
Family
ID=22299991
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63244687A Expired - Fee Related JP2579672B2 (ja) | 1987-10-02 | 1988-09-30 | 均質なｔ−４取込み分析法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0310430B1 (ja) |
| JP (1) | JP2579672B2 (ja) |
| AT (1) | ATE105414T1 (ja) |
| AU (1) | AU618022B2 (ja) |
| CA (1) | CA1317861C (ja) |
| DE (1) | DE3889407T2 (ja) |
| ES (1) | ES2055740T3 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1335707C (en) * | 1989-08-15 | 1995-05-30 | Pyare Khanna | Drug screening assay |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4171244A (en) | 1975-02-20 | 1979-10-16 | Syva Company | Enzyme-bound-polyidothyronine |
| US4341865A (en) | 1980-07-21 | 1982-07-27 | Abbott Laboratories | Determination of thyroxine binding globulin |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1028643A (en) * | 1975-02-20 | 1978-03-28 | Judith I. Blakemore | Polylodothyronine immunoassay |
| US4378428A (en) * | 1981-03-30 | 1983-03-29 | Baker Instruments Corporation | Method for carrying out non-isotopic immunoassays, labeled analytes and kits for use in such assays |
| US4614712A (en) * | 1983-02-25 | 1986-09-30 | The Upjohn Company | Immunoassays with luciferase labeled ligands or receptors |
| US4708929A (en) * | 1984-10-29 | 1987-11-24 | Microgenics Corporation | Methods for protein binding enzyme complementation assays |
| EP0199801B1 (en) * | 1984-10-29 | 1993-08-25 | MICROGENICS CORPORATION (a Delaware corporation) | Methods for protein binding enzyme complementation assays |
| DE3504406A1 (de) * | 1985-02-08 | 1986-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur bestimmung der bindungskapazitaet des thyroxin bindenden globulins |
| JPS61225655A (ja) * | 1985-03-29 | 1986-10-07 | Eiken Kagaku Kk | 血中遊離型サイロキシンの測定法 |
-
1988
- 1988-09-30 ES ES88309122T patent/ES2055740T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-30 EP EP88309122A patent/EP0310430B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-30 AU AU22993/88A patent/AU618022B2/en not_active Ceased
- 1988-09-30 CA CA000579043A patent/CA1317861C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-09-30 DE DE3889407T patent/DE3889407T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-09-30 JP JP63244687A patent/JP2579672B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1988-09-30 AT AT8888309122T patent/ATE105414T1/de not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4171244A (en) | 1975-02-20 | 1979-10-16 | Syva Company | Enzyme-bound-polyidothyronine |
| US4341865A (en) | 1980-07-21 | 1982-07-27 | Abbott Laboratories | Determination of thyroxine binding globulin |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0310430A3 (en) | 1990-01-17 |
| EP0310430B1 (en) | 1994-05-04 |
| ATE105414T1 (de) | 1994-05-15 |
| DE3889407T2 (de) | 1994-11-03 |
| JPH01257262A (ja) | 1989-10-13 |
| ES2055740T3 (es) | 1994-09-01 |
| AU2299388A (en) | 1989-04-06 |
| EP0310430A2 (en) | 1989-04-05 |
| CA1317861C (en) | 1993-05-18 |
| DE3889407D1 (de) | 1994-06-09 |
| AU618022B2 (en) | 1991-12-12 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |