DE2703668A1 - Verfahren zur ermittlung des gehalts an schilddruesenhormon in koerperfluessigkeiten - Google Patents

Description

DR. J.-D. FRHR. von UEXKÜLL

DR. ULRICH GRAF STOLBERQ DIPL-ING. JÜRGEN SUCHANTKE

Nuclear-Medical Laboratories, Inc. (Prio: 2. Februar 1976

US 654 541 - 13728) P.O. Box 47864

8700 North Stemmons Freeway

Dallas, Texas/V.St.A. Hamburg, 26. Januar 1977

Verfahren zur Ermittlung des Gehalts an Schilddrüsenhormon in Körperflüssigkeiten

Die Erfindung betrifft diagnostische Tests zur Feststellung des Gehalts an Schilddrüsenhormon in Körperflüssigkeiten, insbesondere einen verbesserten Test zur Bestimmung des Gesamtgehalts an Schilddrüsenhormon in einer Serumprobe mittels einer neuen radioimmunologischen Untersuehungsmethode.

Es sind verschiedene diagnostische Tests zur Prüfung der Schilddrüsenfunktion bekannt. Diese Tests umfassen die Bestimmung des Grundumsatzes, den Schilddrüsenhormon-Aufnahmetest, verschiedene kolorimetrische und chemische Verfahren zur Bestimmung des Thyroxinjodgehalts im Blut sowie einen Test, der gewöhnlich als T-3-Aufnahmetest bezeichnet wird und das Vermögen von Globulin und anderen Proteinen, Schilddrüsenhormon in einer Serumprobe zu binden, mißt. Der wahrscheinlich am häufigsten angewandte diagnostische Test wendet mit Radioisotopen markiertes Hormon an, um den Gehalt des Schilddrüsenhormons Thyroxin

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(C-CH₁₁I-NO.) im Serum zu messen. Dieser Test, der gewöhnlich als T-4-Test bezeichnet wird, ermittelt die Gesamtmenge an Hormon in einer Probe von Blutserum. Der am häufigsten angewandte T-4-Test, der den Thyroxinspiegel in einer Probe von Blutserum feststellt, wendet die Technik der konkurrierenden Proteinbindung an. Zur Durchführung des T-4-Tests ist es notwendig, zuerst das Schilddrüsenhormon Thyroxin aus den das endogene Thyroxin bindenden Proteinen in einer Serumprobe freizusetzen. Danach werden eine bekannte Menge Thyroxin-bindendes Protein (im allgemeinen Schilddrüsenhormon-bindendes Globulin) und radioaktiv markiertes Schilddrüsenhormon zu dem aus der Probe erhaltenen Thyroxin gegeben. Das endogene Thyroxin aus der Probe und das radioaktiv markierte Thyroxin gehen mit der bekannten Menge an zugesetztem Protein eine Bindung ein. Nach dieser Bindung wird das freie oder nicht gebundene Thyroxin vom gebundenen Thyroxin abgetrennt und die relative Menge des Thyroxins in der ursprünglichen Probe wird durch Feststellung der Radioaktivität des freien oder des gebundenen Thyroxins in einer Scintillationszählvorrichtung ermittelt.

Vor kurzem wurden für die Bindung des Schilddrüsenhormons an Proteine anstelle der das Thyroxin bindenden Globuline spezifische Antikörper eingesetzt. Diese Verfahren werden als radioimmunologische Untersuchungen auf Schilddrüsenhormon bezeichnet.

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Die Methodik im Τ-4-Proteinbindungsversuch und im radioimmunologischen Versuch ist im allgemeinen ziemlich ähnlich. Bei beiden Verfahren muß zuerst das Thyroxin aus den das endogene Thyroxin bindenden Proteinen im Serum freigesetzt und die das Thyroxin bindenden Proteine müssen in solcher Weise verändert werden, daß ihre weitere Teilnahme an der Umsetzung verhindert wird. Bei der herkömmlichen Τ-4-Proteinbindung wird dies dadurch erreicht, daß man zu Beginn die Serumprobe mit organischen Lösungsmitteln, wie Äthylalkohol behandelt, um die das Schilddrüsenhormon bindenden Proteine zu denaturieren, vergleiche die US-Patentschrift 3 666 854. Andere chemische Verfahren wenden die Behandlung der Probe mit anorganischen Chemikalien, wie alkalischen Lösungen an. Die Verwendung von alkalischen Extraktionslösungen in handelsgängigen Testsystemen ist jedoch nicht erwünscht, da diese Lösungen bei der Lagerung und Anwendung unbeständig sind. Insbesondere absorbieren diese Lösungen rasch CO_, was zu einer Verringerung des pH-Wertes führt. Ein anderes Verfahren besteht in der Behandlung der Probe mit einer sauren Lösung, um eine Trennung des Schilddrüsenhormons von den das Hormon bindenden Proteinen zu bewirken und der nachfolgenden Behandlung der Lösung mit einem anorganischen kristallinen Adsorptionsmittel, wie Magnesiumsilikat, das lediglich das freie Hormon adsorbiert. Ein solches Verfahren ist in der US-Patentschrift 3 776 698 beschrieben. Wenn saure Extraktionen in Testmethoden durchgeführt werden, die die

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Proteinbindung anwenden, werden die ausgefällten endogenen Proteine physikalisch vom freigesetzten endogenen Schilddrüsenhormon entfernt, bevor bei höheren pH-Werten die nachfolgenden Stufen des Testverfahrens erfolgen. Dies beruht hauptsächlich auf der Tatsache, daß sauer ausgefällte oder denaturierte Proteine bekanntlich in Lösungen von höherem pH-Wert erneut gelöst oder renaturiert werden. Man nimmt daher an, daß die saure Denaturierung "reversibel" ist. In der Tat wendet ein im Handel erhältliches, sogenanntes normalisiertes T-4-Testsystem, das von der Abbott Laboratories unter dem Warenzeichen "Quantisorb-125" vertrieben wird, dieses Phänomen der Renaturierung sauer denaturierter Proteine als wesentliche Stufe an.

Eine andere Methode zur Freisetzung des Thyroxins aus den endogenen, das Thyroxin bindenden Proteinen besteht in der Denaturierung durch Anwendung von Wärme. Diese Art der Denaturierung ermöglicht eine Extraktionseffizienz des Schilddrüsenhormons von etwa 100 %. Sie ist jedoch zeitraubend, denn sie erfordert mindestens 15 Minuten in einem siedenden Wasserbad, um einen vollständigen Abbau der bindenden Proteine zu erreichen.

Auch bei Anwendung des radioimmunologischen Tests muß das Thyroxin zuerst aus den endogenen, das Thyroxin bindenden Proteinen in der Serumprobe freigesetzt und die bindenden

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Proteine müssen in solcher Weise verändert werden, daß ihre weitere Teilnahme an der Umsetzung verhindert wird. Beim radioimmunologischen Test wird dies gewöhnlich bis zu einem Grad durch Blockierung der das Thyroxin bindenden Stellen in den endogenen Proteinen mit chemischen Substanzen, wie 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure, Diphenylhydantoin, Salicylaten oder Thimerosal bewirkt. Die Anwendung dieser Blockierungsmittel birgt jedoch Probleme in sich. Zum Beispiel wurde nachgewiesen, daß die zur Besetzung aller Stellen notwendige Menge der blockierenden Mittel in Beziehung zur Menge der endogenen, das Schilddrüsenhormon bindenden Proteine stehen kann, die in den einzelnen Serumproben beträchtlich schwanken kann.

Das heißt, sowohl bei der herkömmlichen Τ-4-Proteinbindung wie auch im radioimmunologischen Test muß das Thyroxin zuerst aus den nativen Proteinen extrahiert und dann an spezifische Proteine gebunden werden, worauf das freie Hormon von dem an Protein gebundenen Hormon getrennt wird. Die endgültige Trennung wurde durch Adsorption des freien Hormons, zum Beispiel an Harze, Aktivkohle oder anorganische kristalline Adsorptionsmittel bewirkt. Die üblichen Harze umfassen Ionenaustauscherharze, wie Ionenaustauscher mit stark basischen Amino- oder quarternären Ammoniumgruppen, wie sie in der US-Patentschrift 3 414 383 beschrieben sind. Diese organischen Ionenaustauscherharze können entweder in loser Form vorliegen

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oder in Polyurethanschwämme eingebaut sein, siehe hierzu die US-Patentschrift 3 206 602. Sie können auch in porösen Beuteln und dergleichen enthalten sein. Andere herkömmliche Verfahren umfassen die selektive Adsorption des freien Hormons durch Aktivkohle, die mit geeigneten Proteinen oder anderen Polymeren überzogen ist, oder die Verwendung von Molekularsieben, wie Sephadex. Die Verwendung anorganischer kristalliner Adsorptionsmittel ist in den US-Patentschriften 3 666 854 und 3 776 698 beschrieben. Im allgemeinen hängen die Adsorptionsverfahren zur Trennung des freien Hormons von dem an das Protein gebundenen Hormon von der Proteinkonzentration im Untersuchungssystem ab, und einige Systeme können zur Erzielung gültiger Ergebnisse eine Einstellung des Proteingehalts erfordern. Außerdem sind einige Adsorptionsmittel, wie die Harze temperaturempfindlich und erfordern die Korrektur von unter den Testbedingungen erhaltenen Werten, wenn die Temperaturen variabel sind. Hinzu kommt, daß die Adsorptionsmittel im allgemeinen zeitabhängig reagieren, so daß um repoduzierbare Werte zu erhalten, die Zeit des Adsorptionsprozesses sorgfältig überwacht werden muß.

An Antikörper gebundenes Hormon kann von der freien Fraktion durch Fällung des spezifischen Proteins getrennt werden. Eine herkömmliche Methode zur Fällung der gebundenen Fraktion besteht in der doppelten Antikörper-Technik, die jedoch aufgrund

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einer zweiten Einwirkungszeit zeitraubend ist. Ein anderes Trennverfahren besteht in der chemischen Fällung der gebundenen Fraktion durch Polymere mit hohem Molekulargewicht oder Salze. Um die sehr geringen Mengen an vorhandenem ^-Globulin zu fällen, wird gewöhnlich exogenes ^"-Globulin vor der Trennung der gebundenen, von der freien Fraktion zu dem Untersuchungssystem gegeben.

Ein weiteres aufgetretenes Problem besteht in der nicht-spezifischen Bindung während des Versuchs. Unter der nicht-spezifischen Verbindung ist die Bindung von freiem Hormon, einschließlich des freien radioaktiv markierten Hormons,an andere Materialien als an das das Schilddrüsenhormon bindende Protein im T-4-Test oder an den Antikörper im radioimmunologischen Test zu verstehen. Die Tatsache, daß man nicht in der Lage ist, den Grad der nicht-spezifischen Bindung in Abwesenheit des bindenden Proteins abzuschätzen, stellt einen Nachteil solcher Untersuchungssysteme dar, in denen das bindende Protein und das radioaktiv markierte Hormon die einzigen Reaktionsteilnehmer sind.

Zusammenfassend ist daher ein Schilddrüsenhormon-Test erforderlich, bei dem zu Anfang das gesamte oder im wesentlichen das gesamte Schilddrüsenhormon in reproduzierbarer Weise aus dem endogenen Serum extrahiert wird, der nach der konkurrierenden

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Bindung keine Blockierungsmittel oder feste Adsorptionsmittel zur Trennung des gebundenen Hormons vom freien Hormon erfordert, die Trennung aber rasch und wirksam in reproduzierbarer Weise ermöglicht, bei dem eine geringe, aber reproduzierbare nichtspezifische Bindung auftritt, und der in einem einzigen Teströhrchen ohne zwischenzeitliches Abdekantieren der Testlösung(en) durchführbar ist.

Nach einer Ausführungsform der Erfindung besteht der radioimmunologische Test auf Schilddrüsenhormon darin, daß zuerst das endogene Schilddrüsenhormon mit einem sauren Reagenz unter wirksamer Inaktivierung der endogenen, das Schilddrüsenhormon bindenden Proteine aus der Serumprobe extrahiert wird, nachfolgend (ohne Entfernung der endogenen, das Schilddrüsenhormon bindenden Proteine) der pH-Wert auf einen für eine konkurrierende Bindungsreaktion geeigneten Wert erhöht und radioaktiv markiertes Schilddrüsenhormon und eine bekannte Menge Schilddrüsenhormon-Antikörper zugefügt wird. Anschließend ermöglicht man in der gebildeten Lösung die Einstellung eines Gleichgewichts und das Eintreten einer Bindungsreaktion. Dann wird der gebundene Anteil durch Zugabe einer wässrigen Sulfatsalzlösung, die zur Ausfällung des gebundenen Anteils führt, vom freien Anteil getrennt. Anschließend wird die Radioaktivität des ausgefällten, gebundenen Anteils oder die der überstehenden, den freien Anteil enthaltenden Flüssigkeit in einem Scintilla-

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tionszähler ermittelt. Dieses Verfahren läßt sich in einem einzigen Teströhrchen ohne zwischenzeitliches Abdekantieren durchführen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde festgestellt, daß die Trennung der freien Schilddrüsenhormonfraktion von der gebundenen wirksam in repoduzierbarer Weise so bewirkt werden kann, daß die nicht-spezifische Bindung im System auf einem niedrigen konstanten Wert gehalten wird, wenn man die gebundene Fraktion mit einer wässrigen Sulfatsalzlösung ausfällt, der zuvor eine geringe, aber wirksame Menge tierisches Serum zugegeben wurde.

Bei der Suche nach einem "Einröhrchentest" zur Feststellung von Schilddrüsenhormon ohne Verwendung von Blockierungsmitteln oder festen Adsorptionsmitteln bei geringstem manuellen Aufwand durch das Laborpersonal stellte man fest, daß die endogenen, das Schilddrüsenhormon bindenden Proteine durch Behandlung mit einem sauren Reagenz inaktiviert und dadurch vom endogenen Schilddrüsenhormon getrennt werden können. Dann kann der pH-Wert der entstandenen Mischung erhöht, und es können die Schilddrüsenhormon-Antikörper für die konkurrierende Bindungsreaktion mit dem endogenen Schilddrüsenhormon zugegeben werden, ohne daß eine Beeinträchtigung durch das endogene Protein eintritt. Dies ist absolut überraschend, nachdem bekannt ist,

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daß durch Säure inaktiviertes, Schilddrüsenhormon bindendes Protein bei höheren pH-Werten renaturiert wird und die Bindungsreaktion zwischen dem Schilddrüsenhormon und von außen eingeführtem, Schilddrüsenhormon bindendem Protein durch Teilnahme an der Bindungsreaktion beeinflußt. Demgegenüber wurde nun gefunden, daß ein radioimmunologischer Test auf Schilddrüsenhormon unmittelbar nach der sauren Abtrennung des endogenen Schilddrüsenhormons von dem das Hormon bindenden endogenen Protein durch einfache Erhöhung des pH-Wertes der Mischung und ohne zuvor das endogene Protein von der Mischung abgetrennt zu haben, durchgeführt werden kann.

Hinzu kommt, daß wie oben angegeben, die meisten Adsorptionsmittel von der Gesamtproteinkonzentration in der Mischung abhängig sind, so daß geringfügige Variationen in der Proteinkonzentration der Proben die prozentuale Aufnahme durch das Adsorptionsmittel beeinträchtigen können. Außerdem muß ein wirksamer radioimmunologischer Test auf Thyroxin eine geringe reproduzierbare nicht-spezifische Bindung des Schilddrüsenhormons besitzen, die im Wesen auf einem niedrigen, aber gleichmäßigen Bindungsgrad des Schilddrüsenhormons an andere Bestandteile als den Antikörper besteht.

Im erfindungsgemäßen radioimmunologischen Test auf Schilddrüsenhormon wird eine Salzfällung angewandt, um das gebundene

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Hormon in der Lösung vom freien Hormon zu trennen. In herkömmlicher Weise werden Träger oder Hilfsproteine zu diesen Mischungen gegeben, bevor man das Sulfat zufügt, um die Fällung zu bewirken und zu beschleunigen. Es wurde jedoch gefunden, daß das Hilfsprotein mit dem Sulfat vermischt werden kann, bevor man dieses der zu untersuchenden Mischung zugibt. Man hat festgestellt, daß die Zugabe dieses kombinierten Fällungsmittels zu einer konstanten, reproduzierbaren nicht-spezifischen Bindung sowie zu einer annehmbaren Verteilung zwischen den hypothyroiden und den hyperthyroiden Proben führt. Außerdem ermöglicht die Verwendung dieses Kombinationsfällungsmittels die Anwendung eines breiten Volumenbereiches der Serumproben sowie von Serumproben mit einem breiten Proteinkonzentrationsbereich.

Die Erfindung ist nachfolgend an der radioimmunologischen Untersuchung von Thyroxin beschrieben, kann vom Fachman jedoch leicht auf die Untersuchung von Trijodthyronin und anderen Thyroninen abgewandelt werden.

Bevor das endogene Thyroxin des Serums unter Anwendung der verbesserten Salzfällung gemäß der Erfindung untersucht werden kann, muß das Hormon wirksam und reproduzierbar aus einer Serumprobe extrahiert werden. Außerdem muß das gesamte endogene Protein, das während der verschiedenen Stufen des Tests Thyroxin

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binden könnte, vollständig inaktiviert werden. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird das endogene Thyroxin mit einer sauren Lösung aus der Serumprobe extrahiert. Die saure Lösung wird im allgemeinen auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 1,0 bis 2,2 gehalten. Der bevorzugte pH-Bereich beträgt etwa 1,0 bis 2,0. Jede beständige Säurelösung, die das Schilddrüsenhormon nicht beeinträchtigt, kann im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel können wässrige Lösungen von HCl, H-SO., H₃PO₄ und dergleichen angewandt werden, wobei HCl als Säure bevorzugt wird. Diese Materialien können mit geeigneten Puffersubstanzen gepuffert sein, zum Beispiel Salzen schwacher Säuren in einer Konzentration von etwa 0,02 bis 0,07 M.

Auch die Ionenstärke der sauren Lösung kann durch die Gegenwart geeigneter Materialien, wie neutraler Salze, zum Beispiel von NaCl, KCl und dergleichen auf einer Konzentration von O,O2 bis 0,07 Il gehalten werden.

Im allgemeinen werden mindestens etwa 1O und vorzugsweise etwa 20 Volumenteile des Säureextraktionsmittels je Volumenteil mit der Serumprobe vereinigt. Der pH-Wert der entstehenden Mischung sollte im Bereich von etwa 1,3 bis etwa 3,0 liegen. Es tritt sofort eine vollständige Inaktivierung der endogenen, das Thyroxin bindenden Proteine ein, obwohl die inaktiven Proteine in Lösung bleiben. Zum Beispiel kann man das Serum zu der in einem Fläschchen befindlichen sauren Extraktionslösung geben

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und das Fläschchen einige Sekunden, im allgemeinen 10 bis 15
Sekunden schütteln, um das Serum und die saure Lösung sorgfältig zu vermischen. Dies ermöglicht der sauren Lösung die Bindungen zwischen dem Thyroxin und dem das Thyroxin bindenden Protein
zu lösen und das das Thyroxin bindende Protein vollständig zu inaktivieren.

Nachdem die gebildete Lösung das gesamte endogene Thyroxin enthält und im wesentlichen das gesamte, das Thyroxin bindende
Protein inaktiviert ist, muß der pH-Wert der Lösung auf einen geeigneten pH-Wert erhöht werden, bei dem die Bindungsreaktion zwischen dem Schilddrüsenhormon und seinem Antikörper eintreten kann, worauf man zu der Lösung das radioaktiv markierte Schilddrüsenhormon (T-4) und eine bekannte Menge des die Antikörper enthaltenden Antiserums zugibt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das radioaktive Schilddrüsenhormon und dann das Antiserum zu der sauren Lösung gegeben, welche die unbekannte Menge des endogenen Schilddrüsenhormons enthält. Insbesondere kann die das radioaktive Thyroxin enthaltende Lösung einen pH-Wert von etwa 7,6 bis 9,0 und vorzugsweise von etwa 8,3 aufweisen und vorzugsweise eine Puffersubstanz zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes der Lösung enthalten. Eine geeignete Lösung ist ein O,O4 M Natriumbarbital-

träger, der durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf den pH-

125 Wert 8,3 eingestellt ist und das Markierungsmaterial T-4 I enthält.

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Es kann jedes radioaktive Isotop von Jod, Tritium oder Kohlenstoff verwendet werden. Vorzugsweise wird ein Hormon verwendet,

das I markiert ist. Die gepufferte Lösung mit dem radioaktiv markierten Schilddrüsenhormon Thyroxin, die mindestens das 2O- und vorzugsweise etwa das 40-volumenfache der Serumprobe ausmacht, wird zu der Säurelösung gegeben, worauf durch Schütteln sorgfältig vermischt wird. Anschließend wird zu der gebildeten Lösung eine, das Antithyroxin-Serum enthaltende Lösung gegeben. Das Antiserum kann eine geeignete Puffersubstanz, zum Beispiel Natriumbarbital enthalten und im allgemeinen einen pH-Wert im Bereich von etwa 7,6 bis 9,0 aufweisen. Das der Testmischung zugefügte Volumen der Antiserumlösung kann das gleiche sein, wie das der Testmischung zugefügte Volumen der das radioaktive Isotope enthaltenden Lösung. Nach der Zugabe der Lösung des Thyroxin-Antiserums wird wiederum sorgfältig gemischt. Die gebildete Lösung hat einen pH-Wert von etwa 7,0 bis 8,5 und vorzugsweise von etwa 7,4 bis 8,4 und wird etwa 30 bis etwa 60 Minuten bei Raumtemperatur gehalten, um die Bildung des Thyroxin-Antikörper Komplexes zu ermöglichen. Da der Antikörper sowohl das radioaktive Thyroxin als auch das Thyroxin des Serums bindet, ermöglicht die Menge des gewonnenen radioaktiven Thyroxins einen Rückschluß auf die Konzentration des Thyroxins in der ursprünglichen Probe. Das in dieser Stufe verwendete Antiserum sollte eine hohe Spezifität gegenüber Thyroxin besitzen. Wie schon ausgeführt, beein-

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trächtigt das inaktivierte, das Schilddrüsenhormon bindende Protein in der Mischung überraschenderweise nicht die Bindungsreaktion zwischen dem Schilddrüsenhormon und dem Antikörper.

Nachdem in der Lösung ein Gleichgewicht eingestellt und die Bindungsreaktion zwischen den Thyroxin-Antikörpern und dem Thyroxin vollständig ist, werden die Antikörper mit dem an sie gebundenen Hormon unter Anwendung der verbesserten erfindungsgemäßen Salz-Fällungsmethode ausgefällt. Die Fällungslösung besteht aus einer wässrigen Lösung eines wasserlöslichen Sulfatsalzes, das proteinhaltige Materialien wirksam ausfällt, ohne zu einer Ausfällung von freiem Hormon aus der Lösung zu führen. Beispiele für geeignete verwendbare Sulfatsalze sind die Alkalimetallsulfate, wie Natrium- und Kaliumsulfat, Ammoniumsulfat und Zinksulfat. Wegen seines Löslichkeitsbereiches und seiner leichten Zugänglichkeit wird Axnmoniumsulfat am meisten bevorzugt. Die Konzentration des Ammoniumsulfats kann gemäß der Menge des gewünschten zu verwendenden wässrigen Fällungsmittels variieren. Im allgemeinen sollte die Konzentration in der Fällungslösung so beschaffen sein, daß beim Vermischen mit der Thyroxin-Antikörper enthaltenden Lösung die entstehende Sulfatkonzentration im Bereich von etwa 20 bis 30 Gew.%, vorzugsweise im Bereich von etwa 23 bis 27 Gew.% und insbesondere bei etwa 23 bis 24 Gew.% liegt. Die Konzentration des Sulfats in der Fällungslösung kann zweckmäßig etwa 30 bis etwa 40 Gew.%

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vorzugsweise etwa 33 bis 39 Gew.% betragen.

Außer dem Sulfat muß zum Zeitpunkt der Fällung eine kleinere aber wirksame Menge tierisches Serum als Hilfsmittel zu der Antikörper-Thyroxin enthaltenden Lösung gegeben werden, um eine geringfügige, aber reproduzierbare nicht-spezifische Bindung und einen deutlichen Unterschied in den Thyroxinspiegeln von hypothyroiden und hyperthyroiden Serumproben zu erzielen. Außerdem ermöglicht die obige Kombination die Anwendung eines breiten Volumenbereiches der Proben, das heißt von etwa 2 bis etwa 50 Mikroliter, und die Untersuchung von Serumproben mit einem breiten Proteinkonzentrationsbereich. Im allgemeinen ist die Menge des zugefügten Serums, das zur Erzielung dieses Ergebnisses notwendig ist, um ein Volumen größer als das ursprüngliche Volumen der untersuchten Serumprobe. Gewöhnlich kann jedes tierische Serum als Hilfsmittel verwendet werden, obwohl gefunden wurde, daß eine gewisse Variation in der Menge des Serums erforderlich ist, die in direktem Zusammenhang zu der Art des Tieres steht, von der das Serum erhalten wurde. Bei Verwendung einer Serumprobe von 10 Mikrolitern oder weniger und Verwendung von Rinderserum, Schafserum oder menschlichem Serum als Hilfsprotein muß das Volumen des zugefügten Trägerproteins im allgemeinen größer als etwa das vierfache des ursprünglichen Volumens der untersuchten Serumprobe und vorzugsweise größer als das etwa 6-fache des Volumens der untersuchten

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Probe sein. Es kann auch wesentlich größer sein und zum Beispiel das 12- bis 20-fache des Volumens der ursprünglichen Probe betragen. Wenn das Gesamtprotein in der Lösung etwa 60 Mikroliter erreicht, wird eine konstante nicht-spezifische Bindung und eine annehmbare prozentuale Verteilung erreicht, und weitere Mengen zugefügten Proteins, entweder aus der Probe oder anderweitig, beeinträchtigen die Analyse nicht. Von Kaninchenserum ist etwa das 2-fache des oben genannten Rinder-, Schaf- oder menschlichen Serums erforderlich, und von Pferdeserum etwa die Hälfte des Rinder-, Schaf- oder menschlichen Serums. Das Serum ist vorteilhaft in der konzentrierten Sulfatfällungslösung enthalten, deren Konzentration, wie oben angegeben, im allgemeinen etwa 30 bis 4O und vorzugsweise etwa 33 bis 39 Gew.% beträgt.

Zur Trennung der freien von den gebundenen Fraktionen in der Testlösung wird eine ausreichende Menge der Fällungslösung zu der das Thyroxin und den Antikörper enthaltenden Probenlösung gegeben, so daß eine Endkonzentration an Sulfat zwischen etwa 20 und 30 Gew.% erreicht wird, wie oben dargelegt, und die Konzentration des Hilfsproteins innerhalb der vorstehend genannten Bereiche liegt. Die Mischung wird sorgfältig vermischt, zum Beispiel durch Verschließen des Röhrchens in der sie enthalten ist, und 5- bis 20-faches Umkehren. Die Fällung aus Antikörper und an ihm gebundenen Hormon zusammen mit den

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Hilfsproteinen erfolgt unmittelbar an der unteren Grenze der Sulfatkonzentration. Das gebildete Gemisch sollte zentrifugiert werden, bis das ausgefällte proteinhaltige Material am Boden des Gefäßes ein kleines knopfförmiges Gebilde bildet.

Darauf wird entweder das freie Hormon in der überstehenden Flüssigkeit oder das gebundene in der Fällung in einem Scintillationszähler untersucht. Vorzugsweise wird das gebundene Hormon ausgezählt. Der im Scintillationszähler festgestellte Wert wird dann mit der Gesamtanzahl der Signale verglichen, die von dem zu Anfang zugefügten radioaktiv markierten Schilddrüsenhormon ausgesandt werden. Auf diese Weise erhält man den Prozentsatz an gebundenem Hormon. Dieser Prozentsatz wird dann zu Standardwerten in Beziehung gebracht, die man durch Messen des Prozentsatzes an gebundenem Hormon von Standardproben mit bekannten Mengen an Schilddrüsenhormon erhalten hatte, um auf diesem Weg in bekannter Weise die Menge des Schilddrüsenhormons in der Probe zu ermitteln.

Die kleine aber wirksame Menge an Hilfsprotein ist notwendig, um einen Test zur Verfügung zu stellen, in dem bei konstanter nicht-spezifischer Bindung verschieden große Volumen an Serum eingesetzt werden können und sowohl bei hohen als auch bei niedrigen Thyroxinwerten ein annehmbarer Rückgewinnungsbereich erzielt wird. Man nimmt an, daß das wirksame Prinzip im Serum,

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das zu den gewünschten und unerwarteten Ergebnissen führt, {("-Globulin ist. Das meiste tierische Serum enthält im allgemeinen zwischen etwa 0,5 und 2 g ^-Globulin je 100 ml Serum, während der Gesamtproteingehalt im Serum etwa 5 bis 8 g je 100 ml Serum ausmacht. Auf diese Tatsache wird deshalb hingewiesen, weil man, wie vorstehend angegeben, annimmt, daß K'-Globulin der wirksame Bestandteil des Serums für diesen Zweck ist, aus Zweckmäßigkeitsgründen aber vorteilhaft die gesamte Serumprobe verwendet wird. Bei Verwendung von Rinder-, menschlichem oder Schafserum in Mengen vom vierfachen des Volumens der eingesetzten Serumprobe oder weniger wurden schwankende, nicht-reproduzierbare Werte der nicht-spezifischen Bindung sowie eine unannehmbare prozentuale Verteilung zwischen den Serumproben mit hohem und niedrigem Thyroxingehalt fest-, gestellt. Bei Verwendung dieses Serums in Volummengen von mehr als etwa dem vierfachen des Volumens des eingesetzten Serums wird jedoch eine Ebene erreicht, auf der die nicht-spezifische Bindung im wesentlichen konstant ist und auch die Rückgewinnungswerte ausgezeichnet sind. Diese Ebene liegt beim etwa 6-fachen des Volumens der eingesetzten Probe und erfährt keine Änderung bei Zugabe von Proteinmengen von bis dem 12-fachen oder mehr, bezogen auf das ursprüngliche Volumen der Serumprobe.

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- 2tr -

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Dieses Beispiel erläutert die Reproduzierbarkeit des neuen erfindungsgemäßen Thyroxin-Tests. Hierbei wurden die folgenden Reaktionslösungen verwendet:

(a) Die Extraktionslösung bestand aus einer Lösung mit 0,025 ι

HCl und 0,05 η KCl.

125

(b) Die T-4 I Reaktionslösung enthielt eine Markierungen

125
menge des Radioisotopen T-4 I in einer O,O4 molaren Natriumbarbitallösung mit ausreichend HCl, um den pH-Wert auf 8,3 einzustellen.

(c) Das T-4 Antiserum enthielt Thyroxin-Antikörper (aus Kaninchen) ir. einer 0,04 m Natriumbarbitallösung, die mit HCl auf den End-pH-Wert von 8,3 eingestellt worden war.

(d) Die Fällungslösung bestand aus einer wässrigen Lösung mit 37 Gew.% Ammoniumsulfat und Rinderserum in einer Konzentration von 4 Vol.%.

(e) Als Standardlösungen wurden verwendet:

1 Mikrogramm Thyroxin je Deziliter

6 Mikrogramm Thyroxin je Deziliter

12 MikrograiTim Thyroxin je Deziliter

18 Mikrogramm Thyroxin je Deziliter

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Die obigen Lösungen wurden zur Untersuchung von gefrorenem hypothyroiden Serum, normalem Serum und hyperthyroidemSerum durch 11 verschiedene Fachleute verwendet.

Das Testverfahren bestand darin, daß man zunächst 10 Mikroliter einer Serumprobe (oder eines Standards) zu 200 Mikroliter der Extraktionslösung gab. Die gebildete Lösung wurde sorgfältig gemischt. Dann wurden 400 Mikroliter der T-4 I-Reaktionslösung zugefügt, worauf man rührte. Anschließend wurden 400 Mikroliter der T-4-Antiserumlösung zugegeben, und die gebildete Lösung wurde sorgfältig gemischt. Dann wurde die Lösung 4 5 oder 60 Minuten bei Raumtemperatur bebrütet und nach Ablauf dieser Inkubationszeit wurde die Fällung in der Sulfatlösung resuspendiert, und 2 ml dieser Suspension wurden zu jedem Röhrchen mit der Testlösung gegeben. Dies bedeutet, daß 80 Mikroliter des Hilfsserums zu jeweils 10 Mikroliter der ursprünglichen Probe gegeben wurden und die endgültige Sulfatkonzentration in jeder Testlösung 23,7 Gew.% betrug. Die Röhrchen wurden verschlossen und sanft etwa zehnmal umg&- dreht.

20 Minuten nach der Zugabe des Fällungsmittels wurden die Röhrchen 10 Minuten bei 1000- bis 15OO-facher Gravitation oder 2000 bis 2500 U/Min, zentrifugiert, und nach drei Stunden

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wurde die überstehende Flüssigkeit verworfen und die zentrifugierte Fällung in einem Scintillationszähler untersucht.

Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengestellt:

Tabelle 1 Serumprobe

Anzahl der Untersuchungen Anzahl der Tage

Anzahl der Proben

Anzahl der untersuchenden Fachleute

Mittel,

Standard-Abweichung, ,u/dl Abweichungskoeffizient, %

hypothyroid	normal	hyperthyroid
212	317	210
16	15	16
2	2	2
12	11	12
3,2	7,9	14,1
0,28	0,30	0,47
8,8	3,8	3,3

Die Tabelle zeigt die ausgezeichnete Reproduzierbarkeit des erfindungsgemäßen Tests.

Beispiel 2

Dieses Beispiel veranschaulicht den linearen Verlauf des erfindungsgemäßen radioimmunologischen Tests, wobei die in Beispiel 1 beschriebenen Lösungen verwendet wurden. Das endogene Thyroxin von 3 Serumproben wurde zu Anfang nach dem in Beispiel 1

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beschriebenen Verfahren untersucht. Darauf wurden Mengen von 5, 10, 15 bzw. 20 Mikrogramm je Deziliter kristallines Thyroxin zu jeweils vier Proben der 3 Seren gegeben und die erhaltenen Proben wurden nach dem Verfahren des Beispiels 1 untersucht, um die übereinstimmende prozentuale Rückgewinnung in diesem Test zu veranschaulichen. Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengestellt.

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Tabelle 2

	Serum	endogen, gemessen T4, ,ug/dl	exogen, zugefügt T4, ,ug/dl	erwartete Gesamtmenge T4, ,ug/dl	gemessene Gesamtmenge T4, ,ug/dl	exogen, zurück gewonnen T4, ,ug/dl	exogen, zurück gewonnen
	1	3,3	5	8,3	8,3	5,0	100
709			10 15	13,3 18,3	13,4 18,4	10,1 15,1	101 101
831			20	23,3	23,6	20,3	102
**te ο	2	3,6	5	8,6	8,7	5,1	102
			10	13,6	13,5	9,9	99
an			15	18,6	18,8	15,2	101
			20	23,6	24,0	20,4	102
	3	3,0	5	8,0	7,9	4,9	98
			10	13,0	12,9	9,9	99
			15	18,0	18,1	15,1	101
			20	23,0	23,0	20,0	100

Die obigen Ergebnisse veranschaulichen die ausgezeichnete Rückgewinnung des zugefügten T-4 und die Linearität des Testsystems.

Beispiel 3

Dieses Beispiel veranschaulicht die konstante reproduzierbare nicht-spezifische Bindung des Hormons an den Antikörper, die erreicht wird, wenn die Fällungslösung Rinderserum in einem Überschuß von 4 Volumteilen je Volumteil der ursprünglichen Serumprobe enthält. In jedem Fall wurde eine Lösung mit einer bekannten Menge Schilddrüsenhormon (eine 10 Mikroliter Probe), einer Markierungsmenge radioaktiv gekennzeichneten Schilddrüsenhormons und einer bekannten Menge Antiserum mit verschiedenen Fällungslösungen in Berührung gebracht. Die nichtspezifische Bindung jeder Fällungslösung wurde durch Durchführung jedes Tests, aber unter Weglassung des Antiserums aus der gepufferten Antiserumlösung festgestellt. Die Fällungslösung wurde sowohl hinsichtlich der Konzentration an Ammoniumsulfat als auch hinsichtlich des Trägerproteins variiert, wie aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich ist, und die nichtspezifische Bindung der drei verschiedenen Standardseren wurde durch Weglassen des Antiserums aus der Antiserum-Pufferlösung wie in diesem Beispiel beschrieben, untersucht. Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengestellt.

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Tabelle 4

%

Trägerprotein, nicht-spezifi- Volumen

Bindung 40yl 80yl lZQyl

5,2 4,6 4,5 5,2 4,5 4,5

Serumstandard

<*> 0,5 /ig

_/ug

normales menschliches Serum 4,9 4,5 4,6

Durchschnitt

4,5 4,5 (NH₄)-SO.-Konzentration in der Fällungslösung
% 36 % 37 %

38 %

Trägerprotein, Volumen

5,9 5,5 5,3

5,7 5,6 5,4

5.6 5,4 5,4

5.7 5,5 5,4

Trägerprotein,
Volumen

60ul 80yl lOüyl 6OyI 6,1 5,7 5,6

5,6 5,6

5_r8 5,5 5,5
6,0 5,6 5,6

Trägerprotein,
Volumen

Trägerprotein. Volumen

lOüyl 6DyI 80yl lOOyl 40yi 80yl 12Üyl

6,7 6,6 6,8

6,9 6,8 6,8

6,9 6,8 6,7

6,9 6,7 6,8

8.0 7,6 7,5 Φ 8,6 7,7 7,4 *

8.1 7,4 7,2

8.2 7,4 7,4

N)

O CO

CJ) CX)

Beispiel 4

Dieses Beispiel veranschaulicht die konstante nicht-spezifische Bindung und die ausgezeichnete Verteilung der Rückgewinnungswerte zwischen hypothyroiden und hyperthyroiden Serumproben im erfindungsgemäßen Test, in dem die Fällungsflüssigkeit eine kleine aber wirksame Menge zugefügtes Serum als Hilfsmittel enthält. Es wurde das Verfahren des Beispiels 3 zur Untersuchung verschiedener Standardseren mit der Abweichung angewandt, daß die Konzentration des Serums in der Fällungslösung variiert wurde, so daß die entstehende Testlösung 60, 70, 80, 90, 100 bzw. 110 Mikroliter zugefügtes Serum enthielt, das mit der Fällungslösung zu der Testlösung gegeben wurde, die die ursprünglichen 10 Mikroliter Serumprobe enthielt. Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß, wenn das Trägerprotein in der Fällungslösung in der 6-fachen Menge des Volumens der ursprünglichen Probe oder mehr vorhanden ist, der Wert der nichtspezifischen Bindung stabil ist. Wenn jedoch die Menge des Trägerproteins nur das 4-fache des ursprünglichen Probenvolumens beträgt, weicht die nicht-spezifische Bindung in unvorhersehbarer Weise ab. Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 5 zusammengestellt.

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Tabelle 5

Probe
Konzentration

Fällung mit
,ul Serum

nicht-

spez. %, ge-

Fällung mit 7OyUl Serum

nichtspez. %, ge-

(.ug/dl) Bind, bunden Δ Bind, bunden

0,4 6,6

3,2

6,0 6,8

12,0

18,0 6,7

insgesamt

61,8
61,2
61,2

(61,4)

48,2
48,0
48,8

(48,3) 13,1

40,2
40,2
39,8

(40,1) 8,2

28,8
29,3
29,0

(29,0) 11,1

24,0
23,7
23,6

(23,8) 5,2 37,6

6,6

6,7

6,6

(61,1)

(48,6)

(39,9)

(29,0)

(23,7) Fällung mit ,ul Serum

nichtspez. %, ge-Δ Bind. bunden

6,6 61,6 61,6 60,8

(61,5)

48,6 48,8 48,5

(48.6) 12,7

6,6 40,2 40,2 40,5

(40,5) 8,3

28,9 29,0 28,9

(28,9) 11,4

6,6 23,7 23,8 23,6

(25.7) 5,2 37,6

O
(D
QO

Fällung mit

Probe ⁹⁰/^{ul Serum} Konzen- nichttration spez. %, ge-( ,ug/dl)Bind. bunden

Fällung mit
100,ul Serum

nicht-

spez. %, ge-

Bind. bunden ι

Fällung mit 110,ul Serum

nicht-

spez. %, ge-

Bind. bunden

0,4 6,6

3,2

6,0

12,0

18,0

6,6

6,3

insgesamt

59,1 59,8 59,7

(59,5)

47,6 47,0 47,0

C47,2) 12,3

39,0 33,3 38,8

(38,9) 8,3

23,0 27,9 28,1

(28,0) 10,9

22,8 23,2 22,8

(22,9) 5,1 36,6

60,2 6,4

60,3

59,6

(60,0)

46,6

47,1
47,2

(47,0) 13,0

39.0 6,5
39,2

38,8

(39,0) 8,0

28,5'

28,3

2S,3

(28,5) 10,5

23.1 6,4
23,3

25,1

(23,2) 5,3
36,8

60,3 61,0 60,6

(60,7)

47,4 47,3 47,7

(47,5) 13,2

59,1 39,2 38,8

(59,0) 8,5

28, 5 28,3

28,7

(2β,5) 10,5

23,3

23,4 23,4

(23,4) 5,1 37,3

* Unterschied in der prozentualen Bindung zwischen den Proben.
** Zahlen in Klammern stellen Durchschnittswerte dar.

27Π3668

Beispiel 5

Dieses Beispiel erläutert die Spezifität und die Unabhängigkeit vom Serumprotein in der Probe des erfindungsgemäßen radioimmunologischen Tests; Das endogene Thyroxin verschiedener Probenvolumen verschiedener Seren mit erhöhten und verringerten Proteinmengen wurde unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensund der dort angegebenen Reaktionslösungen gemessen. Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 6 zusammengestellt.

Art der Serumprobe

Hyperthyroid
Gesamtprotein, 7,3 g/dl

Hyperthyroid,
Gesamtprotein, 7,5 g/dl

cxi-Globuline, 2,1 g/dl (erhöht)

Albumin, 5,4 g/dl (erhöht)

Tabelle	6	gemessen	korrigiert*
Serum	. T4	auf 10,Ul (,ug/dl)
Volumen	( ,ug/dl)	/ 17,9
(,ul)	/ 17,9	18,3
I 10	13,7	18,8
7,5	9,4	18,8
5,0	4,7	17,4
2,5	2,9	13,7
1 ,67	13,7	14,1
10	10,6	14,8
7,5	7,4	14,0
5,0	3,5	13,2
2,5	2,2	15,4
1,67	15,4	15,3
10	11,5	15,8
7,5	7,9	16,4
5,0	4,1	7,7
2,5	7,7	8,0
10	4,0	7,5
5,0	2,5	7,2
3,3	1,8
2,5

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Art der Serumprobe

'if'-Globuline, 4,6 g/dl
(erhöht)

Hypothyroid
Gesamtprotein, 8,2 g/dl

Gesamtprotein, 4,5 g/dl
(verringert)

Albumin, 0,9 g/dl
(verringert)

Katzen (10 Tiere jeweils drei Bestimmungen)

Hunde (10 Tiere -

jeweils drei Bestimmungen)

Pferde (10 Tiere jeweils drei Bestimmungen)

Serum

Volumen

UuI)

gemessen

T4 (_{/ U}g/dl)

korrigiert auf 10,ul (,ug/άΐ)

10 5,0 3,3 2,5

10 20 30

10 20 30

10 20 3O

10 20 30

10 2O 30

10 20 30 7,3 3,6 2,5 1,7

2,5 5,3 8,2

3,1 6,7

10,4

3,5 7,2

10,4

1,3 3,6 5,4

1,4 3,0 4,8

0,8 2,2 3,8

7,3 7,2 7,5 6,8

2,5 2,7 2,7

3,1 3,4 3,5

3,5 3,6 3,5

1,3 1,6 1,8

1,4 1,5 1,6

0,8

1,1 1,3

Diese Werte sind nur auf das Volumen 10,ul korrigiert und stellen keine Korrektur für die nicht-spezifische Bindung dar. Alle Werte für jedes Serum wurden gleich sein, wenn sie hinsichtlich der nicht-spezifischen Bindung korrigiert werden.

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Claims (20)

Patentansprüche

1. ) Verfahren zur Messung der Menge an Schilddrüsenhormon in einer Serumprobe, die endogenes Schilddrüsenhormon und endogenes Schilddrüsenhormon bindendes Protein enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) die Serumprobe zur Trennung des Schilddrüsenhormons von dem das Schilddrüsenhormon bindenden Protein mit einer wässrigen sauren Lösung vermischt,

(b) den pH-Wert der gebildeten Mischung in Abwesenheit von Blockierungsmitteln auf etwa 7,0 bis etwa 8,5 einstellt und eine bekannte Menge radioaktiv markierten Schilddrüsenhormons sowie eine bekannte Menge Schilddrüsenhormon bindender Antikörper zufügt und in der entstandenen Lösung ein Gleichgewicht einstellen läßt,

(c) die Mischung aus der Stufe (b) sorgfältig mit einer wässrigen Lösung eines wasserlöslichen Sulfats in solcher Menge vermischt, daß die Sulfatkonzentration in der entstehenden Mischung etwa 20 bis 30 Gew.% beträgt und dadurch zu einer Ausfällung von Proteinmaterial mit an ihm gebundenen Schilddrüsenhormon führt, während freies Schilddrüsenhormon in der Lösung bleibt,

(d) das gefällte Material von der Lösung trennt und

(e) in einem Scintillationszähler (1) das freie radioaktiv markierte Schilddrüsenhormon in der Lösung oder (2) das in der Fällung an die Antikörper gebundene radioaktiv markierte Schilddrüsenhormon ermittelt.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige saure Lösung aus einer wässrigen HCl-Lösung mit einem pH-Wert von etwa 1,0 bis etwa 3,0 besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Lösung des wasserlöslichen Sulfats eine wirksame Menge tierisches Serum enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das tierische Serum aus Rinder-, menschlichem oder Schafserum besteht.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen des der Mischung zugefügten tierischen Serums mindestens das 6-fache des Volumens der Serumprobe und das Volumen der Serumprobe bis zu etwa 10 Mikroliter beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das volumetrische Verhältnis der Serumprobe zum zugefügten tierischen Serum etwa 1:6 bis etwa 1:20 beträgt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß

das volumetrische Verhältnis etwa 1:6 bis etwa 1:12 beträgt,

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8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das tierische Serum aus Rinderserum besteht.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das tierische Serum aus Pferdeserum besteht.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen des der Serumprobe zugefügten Pferdeserums mindestens das zweifache der Serumprobe beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das tierische Serum aus Kaninchenserum besteht.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen des der Serumprobe zugefügten Kaninchenserums das 8-fache der Serumprobe beträgt.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sulfatlösung aus einer wässrigen Alkalimetallsulfatoder Ammoniumsulfatlösung besteht.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Sulfatlösung aus einer wässrigen Ammoniumsulfatlösung mit etwa 30 bis etwa 40 Gew.% Ammoniumsulfat besteht.

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15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die entstehende Mischung eine Sulfatkonzentration von
etwa 23 bis 27 Gew.% aufweist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Schilddrüsenhormin Thyroxin ist.

17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Schilddrüsenhormon Trijodthyronin ist.

18. Radioimmunologischer Test auf Schilddrüsenhormon in einer Serumprobe bekannten Volumens mit unbekanntem Gehalt an Schilddrüsenhormon und Schilddrüsenhormon bindendem Protein, in dem das Schilddrüsenhormon von dem das Schilddrüsenhormon bindenden Protein getrennt und darauf eine bekannte Menge radioaktiv markiertes Schilddrüsenhormon sowie eine bekannte Menge Schilddrüsenhormon-Antikörper zugefügt werden, anschließend das freie, nicht an Schilddrüsenhormon-Antikörper gebundene Schilddrüsenhormon von dem an Schilddrüsenhormon-Antikörper gebundenen Hormon getrennt und die unbekannte Menge des Hormons durch Auszählung des (a) radioaktiv markierten, an die Schilddrüsenhormon-Antikörper gebundenen Hormons oder (b) des radioaktiv markierten nicht gebundenen Hormons in einem

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Scintillationszähler festgestellt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man das Schilddrüsenhormon von dem das Schilddrüsenhormon bindenden Protein in der Serumprobe durch Behandlung mit einer sauren Lösung trennt, anschließend den pH-Wert der Mischung in Abwesenheit eines Blockierungsmittels auf einen höheren Wert einstellt und die bekannte Menge des radioaktiv markierten Schilddrüsen hormons sowie die bekannte Menge der Schilddrüsenhormon-Antikörper zugibt, ohne zuvor das das Schilddrüsenhormon bindende Protein aus der Mischung zu entfernen.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die saure Lösung aus einer wässrigen HCl-Lösung vom pH-Wert etwa 1 bis etwa 3 besteht.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Lösung einen pH-Wert von etwa 1 bis 2,0 hat.

sch:kö

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