DE3316452C2 - Verfahren zum Eliminieren des glucoseabhängigen Schiff'schen Basen-Effektes aus dem Hämoglobin A↓1↓-Assay - Google Patents

Verfahren zum Eliminieren des glucoseabhängigen Schiff'schen Basen-Effektes aus dem Hämoglobin A↓1↓-Assay

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes Ionenaustauschverfahren zur Abtrennung von Hämoglobin A ↓1 von seinen SchiffΔschen Basen-Vorläufern und von nicht-glycosyliertem Hämoglobin in eine Humanblutprobe. Das bekannte Verfahren, bei dem die Probe zuerst lysiert, dann zum Imprägnieren eines schwachen Kationenaustauscherharzes verwendet wird, danach die glycosylierten Komponenten mit einer Pufferlösung, die etwa 0,6 M bis etwa 0,11 M darin gelöste Alkalimetallionen enthält, daraus eluiert werden und das Eluat gesammelt wird, wird dadurch verbessert, daß entweder dem Hämolysat oder dem Elutionspuffer oder beiden eine Dihydroxyborylverbindung einverleibt wird.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Hämoglobin A&sub1; von nicht-glycosylierten Hämoglobinen und den Schiff'schen Basen-Vorläufern für Hämoglobin A&sub1; in einer Humanblutprobe, das für die Überwachung und für die Reihenuntersuchung der Langzeit-Blutglucosespiegel bei Diabetikern geeignet ist.
  • Seit einiger Zeit ist es bekannt, daß die Menge an Hämoglobin A&sub1; (HbA&sub1;), einer glycosylierten Form des Stamm- Hämoglobins (HbA), im Blut von Diabetikern höher ist als im Blut von gesunden Personen. Hämoglobin A&sub1; selbst besteht aus mehreren Komponenten, von denen die Hauptkomponenten als HbA1a, HbA1b und HbA1c identifiziert worden sind. Diese drei Komponenten werden als "schnelle Hämoglobine" bezeichnet, da sie beim Eluieren relativ schnell durch eine chromatographische Säule laufen. Die Vorläufer dieser Komponenten sind labile Addukte, in denen die Brückenbindung zwischen dem Glucosemolekül und dem Hämoglobinmolekül eine Aldimin-Brückenbindung ist (nachstehend als "Schiff'sche Base" bezeichnet). Wegen der bei ihrer Bildung aus Glucose und Hämoglobin A auftretenden hohen Reaktionsrate sowie ihrer ausgeprägten Neigung, wieder zu den Ausgangsmaterialien zu dissoziieren, spiegelt der Gehalt an Schiff'scher Base eher die Kurzzeit-Schwankungen in den Blutglucosespiegeln wider als die Langzeit- Spiegel, die bei einer aussagekräftigen Diabetes-Analyse bestimmt werden sollen. Aus diesem Grunde sind häufig Analysen ohne Entfernung der Schiff'schen Base schlechte Indikationen für die Fähigkeit eines Patienten, seinen Blutglucosespiegel zu regulieren.
  • Es ist deshalb erwünscht, ein Verfahren zur Bestimmung des Hämoglobin A&sub1;-Gehaltes in Humanblut zu finden, bei dem die Schiff'schen Basen-Vorläufer nicht stören.
  • Eine generelle Diskussion über glycosylierte Hämoglobine und ihre Bedeutung für Diabetes mellitus ist Bunn et al., "Science" 200 S. 21-27 (1978), zu finden. Die Verwendung von Ionenaustauscherharzen wird von Chou et al., in "Clin. Chem." 24 (10), S. 1708-1710 (1978), und in den US-Patentschriften 41 42 855, 41 42 856, 41 42 857 und 41 42 858, 41 68 147 und 42 38 196 beschrieben.
  • Zu den bekannten Verfahren zur Entfernung der Schiff'schen Basen-Addukte gehören die Inkubation von Erythrocyten in einer Salzlösung und die Dialyse des Hämolysats. Erstere wird von Goldstein et al. in "Diabetes", 29 S. 623-628 (1980), von Svendsen et al. in "Diabetologia", 19, S. 130-136 (1980), und von Chou et al. in "Clin. Chem.", 24 (10), S. 1708-1710 (1978), beschrieben. Letztere wird von Goldstein et al. in supra und Widness et al. in "J. Lab. Clin. Med.", 95 (3), S. 386-394 (1980), beschrieben.
  • Die genaue Analyse von HbA1c ohne vorherige Entfernung der Schiff'schen Base wurde erreicht durch Anwendung einer kolorimetrischen Methode, in der eine Säurehydrolyse angewendet wird, woran sich die Behandlung mit Thiobarbitursäure anschließt (vergl. Svendsen et al., supra).
  • Die Verwendung von Borationen in Verbindung mit einem Anionenaustauscher, um die Elution von glycosylierten Verbindungen in einer Probe, in der keine Schiff'schen Base vorhanden ist, zu verzögern, wird von Bunn et al. "Advances in Hemoglobin Analysis" S. 83-94, Alan R. Liss, Inc., N. Y. (1981), beschrieben.
  • Ferner betrifft die DE-OS 29 33 832 ein Verfahren zum Trennen von Glycoproteinen von nicht-glycosylierten Proteinen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man das betreffende Gemisch mit einem Reagens mit an einen Träger gebundener Dihydroxyborylgruppe zur Bildung eines Glycoproteins/Dihydroxyboryl-Komplexes in Berührung bringt und danach den Komplex von dem Gemisch trennt. Mit der Dihydroxyborylverbindung soll jedoch keine Dissoziation der Schiff'schen Basen-Vorläufer für Hämoglobin A&sub1; erzielt werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft nun, ausgehend von der US-PS 42 38 196, ein Verfahren zur Abtrennung von Hämoglobin A&sub1; von nicht-glycosylierten Hämoglobinen und den Schiff'schen Basen-Vorläufern für Hämoglobin A&sub1; in einer Humanblutprobe, wobei man
    • (a) die in der Probe enthaltenen roten Blutkörperchen unter Bildung eines Hämolysats lysiert,
    • (b) ein schwaches Kationenaustauscherharz mit diesem Hämolysat imprägniert,
    • (c) durch das Harz eine Pufferlösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0,06 M bis etwa 0,11 M gelösten Ionen eines Alkalimetalls laufen läßt, um die Dissoziation der Schiff'schen Basen-Vorläufer zu Glucose und Hämoglobin A zu bewirken und die Glucose und das Hämoglobin A&sub1; gegenüber dem Hämoglobin A und den anderen nicht-glycosylierten Hämoglobinen bevorzugt zu eluieren, und
    • (d) das in der Stufe (c) erhaltene Eluat sammelt;

    dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man entweder dem Hämolysat oder der Pufferlösung oder beiden eine wirksame Menge einer Dihydroxyborylverbindung einverleibt.
  • Mit Hilfe der Dihydroxyborylverbindung wird eine verbesserte Dissoziation der Schiff'schen Basen-Vorläufer erzielt.
  • Bevorzugt verwendete Dihydroxyborylverbindungen sind Borsäure, Niedrigalkylboronsäuren (vorzugsweise C&sub1;-C&sub3;- Alkylboronsäuren) und ihre Salze. Beispiele für Alkylboronsäuren sind Methylboronsäure, Ethylboronsäure, Propylboronsäure, 3-Methyl-1-butylboronsäure und dergl. Borsäure und andere Formen des Borations werden besonders bevorzugt. Bevorzugte Salze sind die Alkalimetallsalze.
  • Die Verbindung kann vor oder nach der Hämolyse dem Hämolysat zugegeben werden. Die Hämolyse kann entweder mit der gesamten Blutprobe oder mit irgendeinem abgemessenen Anteil derselben vorgenommen werden. Die roten Blutkörperchen können durch Zentrifugieren von der Gesamtmenge der Probe abgetrennt werden; diese Abtrennung kann aber auch weggelassen werden, ohne daß dadurch die Analyse selbst beeinträchtigt wird. Es ist daher höchst zweckmäßig, die Hämolyse mit der gesamten Probe vorzunehmen. Es eignet sich jede beliebige Methode, bei der die Membranen der roten Blutkörperchen in ausreichendem Maße unter Freisetzung bzw. Abgabe des Zellinhalts an die umgebende Flüssigkeit zerreißen.
  • Sie umfaßt jede konventionelle Hämolysemethode. Beispiele sind das Rühren, die Verwendung von organischen hydrophoben Lösungsmitteln, die Anwendung eines osmotischen Schocks und die Verwendung von wäßrigen Detergentien. Die Verwendung von wäßrigen Detergentien ist bevorzugt. Beipsiele für geeignete Detergentien sind Polyoxyethylenether von höheren aliphatischen Alkoholen, Alkylarylpolyetheralkohole, Sulfonate und Sulfate und Polyoxyethylenderivate von Fettsäureestern von Sorbitanhydriden. Es sind viele derartige Detergentien im Handel erhältlich.
  • Die für die Hämolyse verwendete Detergensmenge ist nicht kritisch und es kann jede beliebige Menge verwendet werden, die ausreicht, um eine Lysis innerhalb einer vernünftigen Zeitspanne zu bewirken, ohne die Retentionseigenschaften des Kationenaustauschers zu beeinflussen, wenn das Detergens als Teil des Hämolysats diesen passiert. Ein geeigneter Bereich beträgt etwa 0,1 bis etwa 0,5 Gew.-% Detergens, bezogen auf Probe plus wäßrige Lösung.
  • Wenn für die Hämolyse ein Detergens verwendet wird, kann die Dihydroxyborylverbindung dem wäßrigen Detergens zugesetzt werden, bevor das Detergens mit der Blutprobe in Kontakt gebracht wird. Die Menge der Dihydroxyborylverbindung ist nicht kritisch und es kann jede beliebige Menge verwendet werden, die eine Dissoziation der Schiff'schen Base bewirkt und keinen wesentlichen Aussalzungseffekt in dem Ionenaustauscher ergibt. Die bevorzugte Konzentration der Dihydroxyborylverbindung in dem Hämolysat beträgt etwa 0,1 M bis etwa 1,0 M, insbesondere etwa 0,4 M bis etwa 0,6 M. Sobald die Dihydroxyborylverbindung zugegeben worden ist, wird der pH-Wert des Hämolysats durch Zugabe einer Base vorzugsweise auf einen Wert von etwa 4,5 bis etwa 6,5, insbesondere von etwa 5,0 bis etwa 6,0, eingestellt. Bei einer typischen Ausführungsform der Erfindung wird die die Dihydroxyborylverbindung enthaltende Detergenslösung mit der Blutprobe vereinigt und die resultierende Mischung wird mindestens etwa 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Wenn eine Dihydroxyborylverbindung in dem Elutionspuffer enthalten ist, ist auch hier die Menge nicht kritisch und es kann jede beliebige Menge verwendet werden, die zu einer Dissoziation der Schiff'schen Base führt, ohne einen wesentlichen Aussalzungseffekt in dem Ionenaustauscher hervorzurufen. Die bevorzugte Konzentration in dem Elutionspuffer beträgt etwa 0,01 M bis etwa 0,15 M, insbesondere etwa 0,07 M bis etwa 0,10 M.
  • Die Dihydroxyborylverbindung ist vorzugsweise in dem Hämolysat enthalten, und es ist besonders bevorzugt, daß die Dihydroxyborylverbindung sowohl in dem Hämolysat als auch in dem Elutionspuffer enthalten ist.
  • Obgleich die übrigen Merkmale der Analyse bekannt sind, dient die nachfolgende Diskussion einer weiteren Klärung.
  • Es kann jedes beliebige konventionelle Kationenaustauscherharz mit einem schwach sauren Charakter verwendet werden. Beispiele für geeignete Harzmatrices sind Acryl-, Methacryl- und Phenolpolymere sowie Polystyrol, Polyvinylverbindungen, Cellulose und Agarose. Beispiele für aktive Gruppen mit einem schwach sauren Charakter sind Carboxyl-, Methyl- carboxyl- und Phosphorsäuregruppen. Ein bevorzugtes Harz ist ein Methacrylsäure/Divinylbenzol-Copolymer. Die Teilchengröße des Harzes ist nicht kritisch und sie variiert je nach Typ der verwendeten Säule. Am zweckmäßigsten ist es, Teilchen mit einer Größe zwischen 0,15 und 0,03 mm, vorzugsweise zwischen 0,08 und 0,03 mm zu verwenden.
  • Wenn ein Methacrylsäure/Divinylbenzol-Copolymer verwendet wird, handelt es sich dabei vorzugsweise um ein solches, bei dem etwa 30% bis etwa 50%, insbesondere etwa 35% bis etwa 45%, der aktiven Zentren an dem Harz durch Ionen eines Alkalimetalls und der Rest durch Wasserstoffionen besetzt sind. Der hier verwendete Ausdruck "Alkalimetall" umfaßt die Metalle der Gruppe IA des Periodischen Systems der Elemente. Bevorzugte Metalle sind solche mit einem Atomgewicht, das gleich demjenigen von Kalium oder größer ist. Unter diesen sind Natrium und Kalium besonders bevorzugt und Natrium ist am meisten bevorzugt. Die Einstellung des Ionenverhältnisses wird zweckmäßig dadurch erzielt, daß man eine saure Pufferlösung, beispielsweise Phosphorsäure, verwendet und sie muß vor der Imprägnierung beendet sein.
  • Obgleich jeder konventionelle Aufbau des Kationenaustauscherharzes angewendet werden kann, ist das Harz vorzugsweise in Form eines Festbettes in ener vertikalen Säule angeordnet. Es kann jede konventionelle Methode der Imprägnierung der Säure mit dem Hämolysat angewendet werden. In einer Säule mit einem unter dem Einfluß der Schwerkraft nach unten fließenden Strom wird die Imprägnierung zweckmäßig dadurch erzielt, daß man das Hämolysat mittels einer Spritze oder Pipette auf die Oberseite des Harzbettes aufgibt und es sich unter dem Einfluß der Schwerkraft in den Teilchenzwischenräumen in der Hauptmasse des Bettes verteilen läßt.
  • Das Volumen des Hämolysats ist nicht kritisch, und es ist in der Regel um mehrere Größenordnungen kleiner als das Volumen des Kationenaustauscherharzbettes. Dadurch wird sichergestellt, daß eine vollständige Wechselwirkung zwischen dem Hämolysat und den Harzteilchen eintritt und reichlich Gelegenheit für den Ionenaustausch und die Komponententrennung während der Elution besteht. In der Regel dringt das Hämolysat nur in den Eingangsbereich des Bettes ein, wobei der Rest für die weitere Wechselwirkung während der Elution verbleibt.
  • Nach der Imprägnierung des Harzes mit dem Hämolysat wird der Elutionspuffer durch das Harz laufen gelassen. Zusätzlich zu den oben genannten Erwägungen (d. h. der Berücksichtigung der Menge an vorhandener Dihydroxyborylverbindung) werden die Zusammensetzung und das Volumen des Puffers so eingestellt, daß das gesamte HbA1a und HbA1b sowie praktisch das gesamte HbA1c gesammelt werden unter Dissoziation der Schiff'schen Basen-Vorläufer zu Glucose und nicht-glycosyliertem Hämoglobin. Höhere Elutionsvolumina ergeben eine vollständigere Dissoziation der Schiff'schen Base.
  • Der Elutionspuffer enthält Alkalimetallionen in einer für die Erzielung der gewünschten Abtrennung geeigneten Konzentration. Die geeignete Konzentration hängt von dem jeweils verwendeten Alkalimetall ab, sie liegt jedoch im allgemeinen im Bereich von etwa 0,06 M bis etwa 0,11 M, vorzugsweise von etwa 0,07 M bis etwa 0,09 M. Wie bei dem Harz selbst sind Alkalimetalle mit einem Atomgewicht, das gleich demjenigen von Kalium oder höher ist, bevorzugt, wobei Natrium und Kalium besonders bevorzugt sind und Natrium am meisten bevorzugt ist.
  • Der pH-Wert des Puffers ist nicht kritisch und es ist lediglich erforderlich, daß eine Hydrolyse der Hämoglobine durch eine übermäßige Acidität vermieden wird und die gewünschte Trennung bewirkt wird. Im allgemeinen liegt der pH-Wert im Bereich von etwa 5,0 bis etwa 7,5, vorzugsweise von etwa 6,5 bis etwa 7,0. Es kann irgendein beliebiges konventionelles Puffersystem mit einem pH-Wert innerhalb dieses Bereiches verwendet werden. Beispiele sind biochemische Puffer, Zwitterionenpuffer und Phosphatpuffer. Bevorzugte Puffer sind Kalium- und Natriumphosphate, sowohl monobasische als auch dibasische. Natriumphosphate sind besonders bevorzugt.
  • Die Temperaturen sind ähnlich wie bei anderen Ionenaustauschverfahren. Die geeignete Temperatur hängt somit von dem Volumen des Harzes in der Säule, der Teilchengröße und dem Alkalimetallgehalt des Harzes, der Oberflächengröße der Teilchen und anderen ähnlichen Variablen ab und kann durch Routineuntersuchungen leicht bestimmt werden. Am zweckmäßigsten ist es, bei einer Temperatur im Bereich von etwa 14°C bis etwa 35°C, vorzugsweise von etwa 19°C bis etwa 30°C, zu arbeiten.
  • Das Volumen des Elutionspuffers und seine Fließgeschwindigkeit durch das Kationenaustauscherharz werden so gewählt, daß eine optimale Trennung erzielt wird. Das optimale Volumen und die optimale Fließgeschwindigkeit können leicht durch Routineuntersuchungen festgelegt werden.
  • Der Elutionspuffer kann konventionelle Stabilisatoren, wie z. B. Natriumazid und/oder Ethylendiamintetraessigsäure, in geeigneten Mengen enthalten.
  • Im allgemeinen kann die Dissoziation der Schiff'schen Basen- Addukte durch Verlängerung der Elutionszeit verbessert werden. Dies wird auf irgendeine konventionelle Weise erzielt, beispielsweise auf eine der nachstehend beschriebenen, entweder allein oder in Kombination : Herabsetzung des prozentualen Anteils der aktiven Zentren an dem Harz, die durch Alkalimetallionen besetzt sind; Herabsetzung der Alkalimetallkonzentration in dem Elutionspuffer; Erhöhung der Volumenmenge des Harzes im Verhältnis zu dem Probenvolumen; Verringerung der Harzteilchengröße, Einführung von Fließbeschränkungen in dem Austauscher und dergleichen.
  • Sobald die Elution beendet ist, enthält das resultierende Eluat praktisch das gesamte, in der ursprünglichen Probe vorhandene Hämoglobin A&sub1; und praktisch kein nichtglycosyliertes Hämoglobin. Das Eluat kann dann unter Anwendung einer konventionellen Methode, beispielsweise unter Anwendung an sich bekannter biochemischer und spektrophotometrischer Methoden, auf seinen Gehalt an HbA&sub1; hin analysiert werden.
  • Besonders bevorzugte Verfahrensvarianten sind in den Ansprüchen 6 bis 8 angegeben.
  • Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung eines Reagens-Set bestehend aus
    • (a) einem schwachen Kationenaustauscher,
    • (b) einem Hämolysereagens mit einer wäßrigen Detergenslösung, die eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,1 M bis etwa 1,0 M enthält, und
    • (c) einer Pufferlösung mit Ionen eines Alkalimetalls, die darin in einer Konzentration von etwa 0,06 M bis etwa 0,11 M gelöst sind, in einem Assay zur Bestimmung des Gehalts an Hämoglobin A&sub1; in einer Humanblutprobe.

  • Bei dieser Verwendung umfaßt auch die Pufferlösung eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,01 M bis etwa 0,15 M.
  • Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel erläutert.
    • Beispiel
  • Dieses Beispiel erläutert die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens beim Analysieren von Schiff'schen Basen enthaltenden Humanblutproben zur Bestimmung ihres Gehaltes an von Schiff'schen Basen freiem glycosyliertem Hämoglobin.
  • Die Gesamtblutproben von vier nicht an Diabetes leidenden Personen wurden in jeweils zwei Portionenpaare aufgeteilt. Eine Portion jedes Paares wurde 5 Stunden lang bei 37°C mit 900 mg/dl Glucose inkubiert für die Verwendung als Proben, die Schiff'sche Base enthielten. Die restlichen Anteile wurden bis zur Durchführung des Assays bei 4°C aufbewahrt, wobei sie dann als Proben ohne Schiff'scher Base verwendet wurden (die tatsächliche Menge an Schiff'scher Base in diesen Proben war vernachlässigbar gering, da sie vor ihrer Verwendung 18 Tage lang aufbewahrt wurden).
  • Aliquote Anteile sowohl der inkubierten als auch der nichtinkubierten Proben wurden dann auf die nachstehend beschriebene Weise lysiert und in Ionenaustauschersäulen aufgetrennt.
    • (A) Hämolyse
  • Ein gut gemischter 100-µl-Anteil jeder Probe wurde mit 500 µl eines Hämolysereagens vereinigt, das aus einer 0,33 vol.-%igen wäßrigen Lösung eines Polyoxyethylenether-Tensids und Borsäure in einer Konzentration von 0,6 M bestand. Die Mischung wurde verwirbelt und 5 Minuten lang stehengelassen. Ein 200 µl-Mengenanteil jedes resultierenden Hämolysats wurde dann zur Seite gestellt zum Vergleich mit den in den folgenden Stufen erhaltenen Elutionsproben.
    • (B) Elutionen
  • Eine Reihe von Ionenaustauscherharzsäulen wurde wie folgt vorbereitet: ein schwach saures Ionenaustauscherharz, das aus einem Methacrylsäure/Divinylbenzol- Copolymeren besteht, wurde mit Phosphorsäure konditioniert, um ein Verhältnis von Wasserstoffionen zu Natriumionen an den aktiven Zentren des Harzes von 55 : 45 zu erzielen. Eine etwa 12 cm lange Kunstharzsäule mit einem Volumen von etwa 12 ml, die in der Nähe des Bodens eine Fritte enthielt, wurde mit 1,0 g (3,0 ml) des vorkonditionierten Harzes beschickt. Die Säule wurde geschüttelt, um eine gleichmäßige Suspension zu erzielen. Unmittelbar nach dem Schütteln wurde die Kappe am Kopf der Säule entfernt und die Spitze am Boden wurde abgebrochen, so daß die Säule in einen Abfallbehälter auslaufen konnte.
  • Nachdem die Säule abgetropft war, wurden 100 µl Hämolysat mittels einer Pipette auf die Mitte der Oberseite des Harzbettes übertragen. Dann wurde das Bett 5 bis 7 Minuten lang stehengelassen.
  • Dann wurde eine Elutionspufferlösung durch die Säule laufen gelassen. Die Lösung enthielt einen 0,05 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,7 und einer Natriumionenkonzentration von 74 mVal/l. Es wurde eine Gesamtmenge von 10,0 ml Lösung verwendet, wobei die ersten ml der Lösung auf die Oberseite der Säule aufgetropft wurden und der Rest in einem Strom gegen die Säulenwand gegossen wurde.
  • Nachdem die Säule vollständig ausgelaufen war, wurde das Eluat durchgemischt und in eine Küvette mit einem Lichtweg von 10 mm überführt und es wurde ihre Extinktion an einem Labor-Spektrophotometer, der mit einer Pufferlösung als Blindprobe auf Null eingestellt worden war, bei 415 nm abgelesen.
  • Um dem Hämoglobingehalt des Eluats als Prozentsatz der in der ursprünglichen Probe enthaltenen Gesamtmenge Hämoglobin ausdrücken zu können, wurde eine ähnliche Extinktionsmessung mit dem zur Seite gestellten Hämolysat-Anteil (vgl. letzter Satz des Abschnitts "Hämolyse"), nachdem sie mit dem zweiten Elutionspuffer verdünnt worden war. Der Gehalt an HbA&sub1; in dem Eluat als Prozentsatz der Gesamtmenge Hämoglobin in der ursprünglichen Probe wurde dann nach der folgenden Formel errechnet: &udf53;vu10&udf54;Prozent H¿moglobin in dem Eluat = @W:Extinktion¤des¤Eluats:5ó¤(Extinktion¤des¤H¿molysats)&udf54; ó 100&udf53;zl10&udf54;
  • Sowohl die inkubierten Hämolysate als auch die nicht-inkubierten Hämolysate wurden nach diesem Verfahren eluiert.
    • (C) Bestimmung der Gesamtmenge an Schiff'scher Base
  • Zur Bestimmung der Gesamtmenge an Schiff'scher Base in den Hämolysaten wurde der bekannte Puffer ohne darin enthaltene Borationen verwendet. Dieser bestand aus 4,0 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers mnit einem pH-Wert von 6,7 und einer Natriumionenkonzentration von 74 mVal/l. Wegen des Natriumionengehaltes dieses Puffers und des Verhältnisses von Natriumionen zu Wasserstoffionen in dem Ionenaustauscher (die gleichen wie oben) wurden alle schnellen Hämoglobine und Schiff'schen Basen-Addukte in dem Eluat gesammelt. Die HbA- Menge in dem Eluat als Prozentsatz der Gesamtmenge Hämoglobin in der ursprünglichen Probe wurde dann wie in Abschnitt (B) angegeben errechnet.
    • (D) Ergebnisse
  • Es wurden vier verschiedene Versuche mit jeder Probe unter Verwendung variierender Mengen an Borationen sowohl in dem Hämolysereagens als auch in der Pufferlösung wie folgt durchgeführt: Tabelle I Borationengehalt der Reagentien °=c:110&udf54;H&udf53;vu10&udf54;&udf53;vz9&udf54; &udf53;vu10&udf54;
  • Vor der Verwendung jeder dieser Reagenskombinationen wurden geringfügige Anpassungen des Verhältnisses von Wasserstoffionen zu Natriumionen in dem Austauscher gegenüber dem ursprünglichen Wert von 55 : 45 durchgeführt, um eine optimale Abtrennung der HbA&sub1;-Fraktion von der HbA&sub0;-Fraktion zu erzielen. Die Anpassungen wurden durchgeführt durch Behandeln mit Phosphorsäure, das Endverhältnis lag in jedem Falle innerhalb des Bereiches von 55 : 45 bis 60 : 40.
  • Die Eluate sowohl aus den inkubierten Proben als auch aus den nicht-inkubierten Proben wurden zur Bestimmung ihres Prozentsatzes an ursprünglichem Hämoglobin wie oben angegeben analysiert. Die Ergebnisse repräsentierten die Gesamtmenge der drei schnellen Hämoglobine in jeder Probe plus der eventuell vorhandenen Schiff'schen Basen-Addukte, die nicht dissoziiert worden waren. Diese Werte wurden in die nachstehend angegebene Formel eingesetzt, um die Menge der durch das erfindungsgemäße Verfahren entfernten Schiff'schen Base, ausgedrückt durch den Prozentsatz der in den inkubierten Proben ursprünglich vorhandenen Gesamtmenge, zu errechnen: °=c:150&udf54;&udf53;vu10&udf54;&udf53;vz7&udf54; &udf53;vu10&udf54;&udf53;sg8&udf54;*)Æ4¤ml-Elution, durchgefÝhrt ohne Borationen (vergl.°eobigen Abschnitt C)&udf50;"inc." = inkubiert&udf50;"uninc." = nicht-inkubiert&udf53;zl10&udf54;&udf53;sg9&udf54;
  • Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengefaßt, aus der ersichtlich ist, daß der Prozentsatz der Entfernung der Schiff'schen Base durch Verwendung des Borats beträchtlich verbessert wurde. Tabelle II Testergebnisse &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz21&udf54; &udf53;vu10&udf54;

Claims (12)

1. Verfahren zur Abtrennung von Hömoglobin A&sub1; von nichtglycosylierten Hämoglobinen und den Schiff'schen Basen- Vorläufern für Hämoglobin A&sub1; in einer Humanblutprobe, wobei man
(a) die in der Probe enthaltenen roten Blutkörperchen unter Bildung eines Hämolysats lysiert,
(b) ein schwaches Kationenaustauscherharz mit diesem Hämolysat imprägniert,
(c) durch das Harz eine Pufferlösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0,06 M bis etwa 0,11 M gelösten Ionen eines Alkalimetalls laufen läßt, um die Dissoziation der Schiff'schen Basen-Vorläufer zu Glucose und Hämoglobin A zu bewirken und die Glucose und das Hämoglobin A&sub1; gegenüber dem Hämoglobin A und den anderen nicht-glycosylierten Hämoglobinen bevorzugt zu eluieren, und
(d) das in der Stufe (c) erhaltene Eluat sammelt,

dadurch gekennzeichnet, daß man entweder dem Hämolysat oder der Pufferlösung oder beiden eine wirksame Menge einer Dihydroxyborylverbindung einverleibt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Dihydroxyborylverbindung sowohl dem Hämolysat in einer Konzentration von etwa 0,1 M bis etwa 1,0 M als auch der Pufferlösung in einer Konzentration von etwa 0,01 M bis etwa 0,15 M einverleibt.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Dihydroxyborylverbindung sowohl dem Hämolysat in einer Konzentration von etwa 0,4 M bis etwa 0,6 M als auch der Pufferlösung in einer Konzentration von etwa 0,07 M bis etwa 0,10 M einverleibt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Dihydroxyborylverbindung aus der Gruppe Borsäure, der Niedrigalkylboronsäuren und ihrer Salze auswählt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hydroxyborylverbindung Borsäure verwendet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (a) durchführt, indem man die Probe einer wäßrigen Detergenslösung zugibt unter Bildung einer Mischung, die etwa 0,1 bis etwa 0,5 Gew.-% Detergens enthält, und die Mischung mindestens etwa 10 Minuten lang bei etwa Raumtemperatur inkubiert, wobei man entweder nur der Detergenslösung oder der Detergenslösung und der Pufferlösung eine Dihydroxyborylverbindung in einer solchen Menge einverleibt, daß die Konzentration des Hämolysats an Dihydroxyborylverbindung etwa 0,1 M bis etwa 1,0 M und die Konzentration der Pufferlösung an Dihydroxyborylverbindung etwa 0,01 M bis etwa 0,15 M betragen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (a) in der Weise durchführt, daß man die Probe einer wäßrigen Detergenslösung zusetzt unter Bildung einer Mischung, die etwa 0,1 bis etwa 0,5 Gew.-% Detergens enthält, und die Mischung mindestens etwa 10 Minutzen lang bei etwa Raumtemperatur inkubiert, wobei man der Detergenslösung Borsäure zusetzt unter Bildung eines Hämolysats, das etwa 0,4 M bis etwa 0,6 M Borationen enthält, und der Pufferlösung Borsäure zusetzt unter Bildung einer Pufferlösung, die etwa 0,07 M bis etwa 0,10 M Borationen enthält.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) die Probe mit einer wäßrigen Detergenslösung vereinigt unter Bildung einer Mischung, die etwa 0,1 bis etwa 0,5 Gew.-% Detergens und 0,1 M bis etwa 1,0 M Borationen enthält, und die Mischung mindestens etwa 10 Minuten lang bei etwa Raumtemperatur inkubiert,
(b) ein im wesentlichen aus einem Methacrylsäure/Divinylbenzol- Copolymeren bestehendes Kationenaustauscherharz mit einer Teilchengröße von etwa 0,15 bis etwa 0,03 mm, bei dem etwa 30% bis etwa 50% der aktiven Zentren durch Natriumionen und der Rest durch Wasserstoffionen besetzt sind, mit dem Hämolysat imprägniert,
(c) durch das Harz eine Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 5,0 bis etwa 7,5, die darin in einer Konzentration von etwa 0,06 M bis etwa 0,11 M gelöste Natriumionen und Borationen in einer Konzentration von etwa 0,01 M bis etwa 0,15 M enthält, bei einer Temperatur von etwa 14°C bis etwa 35°C laufen läßt, um die Schiff'schen Basen- Vorläufer zu Glucose und Hämoglobin A zu dissoziieren und die Glucose und das Hämoglobin A&sub1; gegenüber dem Hämoglobin A und den anderen nicht-glycosylierten Hämoglobinen bevorzugt zu eluieren, und
(d) das Eluat aus der Stufe (c) sammelt.

9. Verwendung eines Reagens-Set bestehend aus
(a) einem schwachen Kationenaustauscher,
(b) einem Hämolysereagens mit einer wäßrigen Detergenslösung, die eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,1 M bis etwa 1,0 M enthält, und
(c) einer Pufferlösung mit Ionen eines Alkalimetalls, die darin in einer Konzentration von etwa 0,06 M bis etwa 0,11 M gelöst sind,

in einem Assay zur Bestimmung des Gehalts an Hämoglobion A&sub1; in einer Humanblutprobe.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß auch die Pufferlösung eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,01 M bis etwa 0,15 M umfaßt.
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