JPS58210024A - ヘモグロビン分離法 - Google Patents
ヘモグロビン分離法Info
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- JPS58210024A JPS58210024A JP57234944A JP23494482A JPS58210024A JP S58210024 A JPS58210024 A JP S58210024A JP 57234944 A JP57234944 A JP 57234944A JP 23494482 A JP23494482 A JP 23494482A JP S58210024 A JPS58210024 A JP S58210024A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は糖尿病患者の長期血中グルコース値のモニター
とスクリーニングに関する。特に、人血中に存在する迅
速ヘモグロビンをそれらのグルコース依存シッフ塩基体
前駆体及び他ヘモグロビン成分から単離する方法に関す
る。
とスクリーニングに関する。特に、人血中に存在する迅
速ヘモグロビンをそれらのグルコース依存シッフ塩基体
前駆体及び他ヘモグロビン成分から単離する方法に関す
る。
唐人ヘモグロビン（ＨｂＡ ）の１種のグルコシル体で
あるヘモグロビンＡｌ（ＨｂＡｌ ）は正常人より糖尿
病患者の血中に多いことはしばらく前より知られている
。ヘモグロビンＡＩ自体は数成分からなり、そのうち主
なものはＨｂＡｌａ、 ＨｂＡ市、ＨｂＡ ｌｃ と
確認されている。これら６成分はクロマトカラムを比較
的早く溶出するので１迅速ヘモグロビン”と総称的に知
られている。これら成分の前駆体は、グルコース分子と
ヘモグロビン分子との間の結合がアルジミン結合である
不安定な付加体（以後１シツフ塩基”と称す）である。
あるヘモグロビンＡｌ（ＨｂＡｌ ）は正常人より糖尿
病患者の血中に多いことはしばらく前より知られている
。ヘモグロビンＡＩ自体は数成分からなり、そのうち主
なものはＨｂＡｌａ、 ＨｂＡ市、ＨｂＡ ｌｃ と
確認されている。これら６成分はクロマトカラムを比較
的早く溶出するので１迅速ヘモグロビン”と総称的に知
られている。これら成分の前駆体は、グルコース分子と
ヘモグロビン分子との間の結合がアルジミン結合である
不安定な付加体（以後１シツフ塩基”と称す）である。
グルコースとヘモグロビンＡとからの形成での反応速度
が速く、かつ、出発物質への解離傾向が高いのでシック
塩基量は青味ある糖尿病分析で決定されるべき血中グル
コース値の長期量ではなく短期変動を反映する。このた
め、シック環基を除かない分析では患者のグルコース規
制能が良く反映されないことが多い。
が速く、かつ、出発物質への解離傾向が高いのでシック
塩基量は青味ある糖尿病分析で決定されるべき血中グル
コース値の長期量ではなく短期変動を反映する。このた
め、シック環基を除かない分析では患者のグルコース規
制能が良く反映されないことが多い。
それゆえ、シッフ塩基体前駆体からの妨害なく人血のへ
セグロビンＡ１含旨を決定する方法の発見が望ましい。
セグロビンＡ１含旨を決定する方法の発見が望ましい。
グリコジル什１ヘモグロビンとそれらの糖尿病との関係
についての一般論はＢｕｎｎ等により５ｃｉｅｎｃｅ
。
についての一般論はＢｕｎｎ等により５ｃｉｅｎｃｅ
。
２００．２Ａ〜２７頁（１９７８）に扶示されている。
イオン９１体の使用はＣｈｏｕ等によるＣ１１ｎ 、Ｃ
ｈｅｍ−。
ｈｅｍ−。
２４（１０）、１７０８〜１７１０頁（１９７８）、Ａ
ｃｕｆｅに付方された一連のアメリカ特許４１４２８５
５：４１４２８５６： ４１４２８５７．４１４２８５
８（以上、１９７８年６月６日公布）、４１．！５８１
４７（１９７９年９月１８日公布）、４２３８１９（Ｓ
（１９８０年１２月９日公布）公報に配賦されている。
ｃｕｆｅに付方された一連のアメリカ特許４１４２８５
５：４１４２８５６： ４１４２８５７．４１４２８５
８（以上、１９７８年６月６日公布）、４１．！５８１
４７（１９７９年９月１８日公布）、４２３８１９（Ｓ
（１９８０年１２月９日公布）公報に配賦されている。
シッフ塩基付加体の既知除去法では赤血球の塩水中培養
、溶血産物の透析を含む。前者はＧｏｌｄａｔｅｉｎ等
によりＤｉａｂｅｔｅｓ、 ２９．６２６〜６２８頁（
１９８０）、５ｖｅｎｄｓｅｎ等によりＤｉａｂｅｔｏ
ｌｏｇｉａ、 １９．１３０〜１６６頁（１９８０）
、Ｃｈｏｕ 等によりＣ１１ｎ。
、溶血産物の透析を含む。前者はＧｏｌｄａｔｅｉｎ等
によりＤｉａｂｅｔｅｓ、 ２９．６２６〜６２８頁（
１９８０）、５ｖｅｎｄｓｅｎ等によりＤｉａｂｅｔｏ
ｌｏｇｉａ、 １９．１３０〜１６６頁（１９８０）
、Ｃｈｏｕ 等によりＣ１１ｎ。
Ｃｈｅｍ、、 ２４ （１０）、１７０８〜１７１０頁
（１９７８）に６己載されている。佐者は前掲のＧｏｌ
ｄａｔｅｉｎ等著、Ｗｉｄｎｅｓｓ等著Ｊ 、Ｌａｈ、
Ｃ１１ｎ 、Ｍｅｄ 、 、 ９５ （３）。
（１９７８）に６己載されている。佐者は前掲のＧｏｌ
ｄａｔｅｉｎ等著、Ｗｉｄｎｅｓｓ等著Ｊ 、Ｌａｈ、
Ｃ１１ｎ 、Ｍｅｄ 、 、 ９５ （３）。
３８６〜３９４（１９８０）に記載されている。
シッフ塩基を事前に除去しなくてのＨｂＡ １ｏの正確
な分析は酸性加水分Ｍ後にチオバルビッール酸で処理す
る比色接衝で達成されている。これは前掲の５ｖｅｎｄ
ｓｅｎ等著に記載されている。
な分析は酸性加水分Ｍ後にチオバルビッール酸で処理す
る比色接衝で達成されている。これは前掲の５ｖｅｎｄ
ｓｅｎ等著に記載されている。
ホウ酸イオンとアニオン交換体との併用はＢｕｎｎ等の
Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａ
ｎａｌ、ｙｓｉｓ、８３〜９４頁〔アメリカニューヨー
クのＡｌａｎ Ｒ，Ｌｉ５ｓ社発行（１９８１）〕に、
シック塩基が存在しないサンプル中のグリコジル化部分
の溶出を遅らせると開示されている。
Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａ
ｎａｌ、ｙｓｉｓ、８３〜９４頁〔アメリカニューヨー
クのＡｌａｎ Ｒ，Ｌｉ５ｓ社発行（１９８１）〕に、
シック塩基が存在しないサンプル中のグリコジル化部分
の溶出を遅らせると開示されている。
本発明により、塩水洗滌、溶血産物透析、複雑な分析技
術の必要のないト面すンプル中のヘモグロビンＡをその
ンツフ均基体前掲体から分ｋＩＦする方法が提供される
。本方法は、サンプルを溶血し、カチオン交換体に溶血
産物を含浸させ、θ〔望成分を緩衝剤溶液で溶出する既
知カチオン交拳法の改良法である。改良漬はジヒドロキ
シボリル化合物な溶血産物か溶出用緩衝剤溶液か両者に
含めることからなる。
術の必要のないト面すンプル中のヘモグロビンＡをその
ンツフ均基体前掲体から分ｋＩＦする方法が提供される
。本方法は、サンプルを溶血し、カチオン交換体に溶血
産物を含浸させ、θ〔望成分を緩衝剤溶液で溶出する既
知カチオン交拳法の改良法である。改良漬はジヒドロキ
シボリル化合物な溶血産物か溶出用緩衝剤溶液か両者に
含めることからなる。
本発明は、ヘモグロビンＡ１分析のための既知カチオン
交換法でのシッフ塩基体前駆体の解離の強化にある。こ
の解離の強化はジヒドロキシボリル化合物な溶血産物か
溶出用緩衝剤溶液か両者に含めることで達成される。
交換法でのシッフ塩基体前駆体の解離の強化にある。こ
の解離の強化はジヒドロキシボリル化合物な溶血産物か
溶出用緩衝剤溶液か両者に含めることで達成される。
好ましいジヒト９０キシボリル化合物はホウ酸、低級ア
ルキルボロン酸、好ましくは０１〜３アルキルボロンｍ
Ｄびそれらの塩である。アルキルボロン酸の例はメチル
ボロン酸、エチルボロン酸、プロビルボロン〆・″、３
−メチル−１−ブチルポロン酸等である。ホウ酸と他の
形のホウ酸イオンが特に好ましい。好ましい塩はアルカ
リ金属塩である。
ルキルボロン酸、好ましくは０１〜３アルキルボロンｍ
Ｄびそれらの塩である。アルキルボロン酸の例はメチル
ボロン酸、エチルボロン酸、プロビルボロン〆・″、３
−メチル−１−ブチルポロン酸等である。ホウ酸と他の
形のホウ酸イオンが特に好ましい。好ましい塩はアルカ
リ金属塩である。
溶血産物に含めるには、該化合物は使用清白技術により
溶血の前でも後でも添加できる。溶血は全面サンプルで
もその一部にでも適用できる。赤血球はサンプルから遠
心分離できるが、かかる分離を省い−（も４＋折自体に
、凸影響はない。従って全サンプルに溶血技術を適用す
るのが最も便利である。赤血球膜を破壊してその内容物
を周囲液に放出できるいづれの技術も充分役立つ。これ
にはいづれの従来の溶血技術も含まれる。その例は攪拌
、有機疎水溶媒の使用、浸透ショック、洗滌剤水溶液の
使用である。洗滌剤水溶液の使用が好ましい。
溶血の前でも後でも添加できる。溶血は全面サンプルで
もその一部にでも適用できる。赤血球はサンプルから遠
心分離できるが、かかる分離を省い−（も４＋折自体に
、凸影響はない。従って全サンプルに溶血技術を適用す
るのが最も便利である。赤血球膜を破壊してその内容物
を周囲液に放出できるいづれの技術も充分役立つ。これ
にはいづれの従来の溶血技術も含まれる。その例は攪拌
、有機疎水溶媒の使用、浸透ショック、洗滌剤水溶液の
使用である。洗滌剤水溶液の使用が好ましい。
適当な洗滌剤の例は高級脂肪族アルコール、アルキルア
リールポリエーテルアルコール、スルホネート、サルフ
ェートのポリオキシエチレンエーテル、無水ソルビット
の脂肪酸エステルのポリオキシエチレン誘導体である。
リールポリエーテルアルコール、スルホネート、サルフ
ェートのポリオキシエチレンエーテル、無水ソルビット
の脂肪酸エステルのポリオキシエチレン誘導体である。
かかる洗滌剤は多く市販されており、” Ｂｒ１ｊ”■
（アメリカ国プラウエア州つィ屑、トンのＩｃＩアハヵ
社）、“Ｔｒｉｔｏｎ”■（アメリカ国はニシルバニア
州フィラデルフィアのローム及・・−ス社）、”Ｔｗｅ
ｅｎ”■（アハカ国プラウエア州つイルミントンのアト
ラス化学工業会社）等である。溶血に使う洗滌剤の量は
Ｎ要ではなく、洗驕削が溶血産物の一部としてカチオン
交換体を通過する時にその保持特性に影響することなく
溶血を相補の時間後に起こすに充分な童である。便利な
のはサンプル＋水溶液のＦｌ ０．１〜約０．５Ｗ％で
ある。
（アメリカ国プラウエア州つィ屑、トンのＩｃＩアハヵ
社）、“Ｔｒｉｔｏｎ”■（アメリカ国はニシルバニア
州フィラデルフィアのローム及・・−ス社）、”Ｔｗｅ
ｅｎ”■（アハカ国プラウエア州つイルミントンのアト
ラス化学工業会社）等である。溶血に使う洗滌剤の量は
Ｎ要ではなく、洗驕削が溶血産物の一部としてカチオン
交換体を通過する時にその保持特性に影響することなく
溶血を相補の時間後に起こすに充分な童である。便利な
のはサンプル＋水溶液のＦｌ ０．１〜約０．５Ｗ％で
ある。
洗凝剤を溶血に便５時には洗滌剤と血液サンプルとの接
触前にジヒドロキシボリル化合物を洗滌側水溶液に添加
できる。ジヒドロキシボリル化合物量は重要ではなく、
有効量即ち、シップ塩基の解離は招くがイオン交換体に
実質的な塩析効県を牛することのない量のいづれも使用
できる。溶血産物中のジヒドロキシボリル化合物の好ま
しい濃度はｉｏ、１Ｍ−約１．０Ｍ、１−も好マシくハ
約０．４Ｍに約０．６Ｍである。ジヒドロキシボリル化
合物添加後に塩基添加により溶血産物のｐＨを約４．５
〜絹６．５、より好ましくは約５．０〜約６．０に調整
することも好ましい。典型的には、ジヒドロキシボリル
化合物を含む洗滌側溶液を血液サンプルとあわせ、生成
混合物を室温で少くとも約１０分間培養する。
触前にジヒドロキシボリル化合物を洗滌側水溶液に添加
できる。ジヒドロキシボリル化合物量は重要ではなく、
有効量即ち、シップ塩基の解離は招くがイオン交換体に
実質的な塩析効県を牛することのない量のいづれも使用
できる。溶血産物中のジヒドロキシボリル化合物の好ま
しい濃度はｉｏ、１Ｍ−約１．０Ｍ、１−も好マシくハ
約０．４Ｍに約０．６Ｍである。ジヒドロキシボリル化
合物添加後に塩基添加により溶血産物のｐＨを約４．５
〜絹６．５、より好ましくは約５．０〜約６．０に調整
することも好ましい。典型的には、ジヒドロキシボリル
化合物を含む洗滌側溶液を血液サンプルとあわせ、生成
混合物を室温で少くとも約１０分間培養する。
ジヒト９０キシボリル化合物を溶出用緩衝剤溶液に含め
る時にも量は重要ではなく、有効量即ち、イオン交換体
で相当の塩析効果を生ずることなくシップ塩基を解離さ
せる旬のいづれも使用できる。
る時にも量は重要ではなく、有効量即ち、イオン交換体
で相当の塩析効果を生ずることなくシップ塩基を解離さ
せる旬のいづれも使用できる。
俗用用緩衝剤浴液の好適濃度は約０．０１Ｍ−約０．１
５Ｍ、最も好まＬ＜ハ約０．０７Ｍ 〜約０．１０Ｍで
ある。
５Ｍ、最も好まＬ＜ハ約０．０７Ｍ 〜約０．１０Ｍで
ある。
ジヒト９０キシボリル化合物を溶血産物に含めることが
好ましく、溶血産物と溶出緩衝剤溶液の両者にジヒト９
０キシボリル化合物を含めることが特に好ましい。
好ましく、溶血産物と溶出緩衝剤溶液の両者にジヒト９
０キシボリル化合物を含めることが特に好ましい。
本分析法の残りの特徴も知られているが、以下の記載は
それらを更に明らかにするために提供する。
それらを更に明らかにするために提供する。
弱酸性の従来のカチオン交換樹脂のいづれも使用できる
。適当な樹脂マトリックスの例はアクリル、メタクリル
、フェノールのポリマー、及び。
。適当な樹脂マトリックスの例はアクリル、メタクリル
、フェノールのポリマー、及び。
ポリスチレン、ポリビニル化合物、セルロース、アガロ
ースである。弱１腋性の活性基の例はカルボン酸、メチ
ルカルボン酸、リン酸の基である。好ましい樹脂はメタ
クリル酸とジビニルはンゼンのコポリマーである。樹脂
の粒径は重要ではなく、使用カラムのタイプにより変わ
る。アメリカ篩規格で１００〜４００メツシユ、好まし
くは２００〜４００メツシユの粒径の使用が最も便利で
ある。
ースである。弱１腋性の活性基の例はカルボン酸、メチ
ルカルボン酸、リン酸の基である。好ましい樹脂はメタ
クリル酸とジビニルはンゼンのコポリマーである。樹脂
の粒径は重要ではなく、使用カラムのタイプにより変わ
る。アメリカ篩規格で１００〜４００メツシユ、好まし
くは２００〜４００メツシユの粒径の使用が最も便利で
ある。
メタクリル酸とジビニルベンゼンのコポリマーを使う時
には樹脂の活性部位の約３０〜約５０％、より好ましく
は約３５〜約４５％がアルカリ金属イオンで占められ、
残りがＨイオンで占められていることが好ましい。用語
１アルカリ金属”は周期表１人族の金属をさす。好まし
い金属は原子１″がＫに等しいかそれ未満のものであ々
。これらのうちではＮαとＫが傷に好ましく、Ｎαか解
も好ましい。イオン比の調整は酸性緩衝剤浴液、例えば
リン酸の使用で達成するのが便利であり、含浸前に完了
せねばならない。
には樹脂の活性部位の約３０〜約５０％、より好ましく
は約３５〜約４５％がアルカリ金属イオンで占められ、
残りがＨイオンで占められていることが好ましい。用語
１アルカリ金属”は周期表１人族の金属をさす。好まし
い金属は原子１″がＫに等しいかそれ未満のものであ々
。これらのうちではＮαとＫが傷に好ましく、Ｎαか解
も好ましい。イオン比の調整は酸性緩衝剤浴液、例えば
リン酸の使用で達成するのが便利であり、含浸前に完了
せねばならない。
カチオン交換樹脂にはいづれの従来の配置も使用できる
が、固定床として垂直カラムに配列するのが好ましい。
が、固定床として垂直カラムに配列するのが好ましい。
カラムに溶血産物を含浸させるにはいづれの常法も使用
できる。軍刀流力ラムでは含浸は溶血産物をシリンジか
ピペットで樹脂床頭部へ適用し、粒子界面を通って床本
体中へ重力分散させることで達成すると便利である。
できる。軍刀流力ラムでは含浸は溶血産物をシリンジか
ピペットで樹脂床頭部へ適用し、粒子界面を通って床本
体中へ重力分散させることで達成すると便利である。
溶血産物答継は重要ではないが、典型的にはカチオン交
換樹脂床の谷阻より数倍小である。これにより溶血産物
と初詣粒子との十分な相互作用が確実になり、溶出中の
イオン交換と成分分離の十分な機会が寿えられる。典型
的には、溶血産物は床の入口＠域のみに浸透し、残りは
溶出中央に相互作用する。
換樹脂床の谷阻より数倍小である。これにより溶血産物
と初詣粒子との十分な相互作用が確実になり、溶出中の
イオン交換と成分分離の十分な機会が寿えられる。典型
的には、溶血産物は床の入口＠域のみに浸透し、残りは
溶出中央に相互作用する。
樹脂に溶面産物な含浸稜に溶出用緩衝剤溶液を樹脂を通
す。上記観点（即ちジヒドロキシボリル化合物存在旬に
関する）に加え、緩ｒｉｆＩ剤の組成と容量を調整して
ＨｂＡｌ、、ＨｂＡｌｂの全て、ＨｂＡｌｏの実質上全
てを集める。シッフ塩基体前駆体はグルコースと非グリ
コジル化ヘモグロビンに解離する。
す。上記観点（即ちジヒドロキシボリル化合物存在旬に
関する）に加え、緩ｒｉｆＩ剤の組成と容量を調整して
ＨｂＡｌ、、ＨｂＡｌｂの全て、ＨｂＡｌｏの実質上全
てを集める。シッフ塩基体前駆体はグルコースと非グリ
コジル化ヘモグロビンに解離する。
溶出量が多ければシッフ塩基解離はより完全になる。
溶出用緩衝剤溶液は所望分離を鐘成するに適当な濃度の
アルカリ金属イオンを含む。適邑濃度は各使用アルカリ
金属に依存するが、一般に約０．０６Ｍ〜約０．１１Ｍ
、好ましくは約０．０７Ｍ〜約００９Ｍである。樹脂自
体上に関してはＫに等しいかそれ未満の原子量を持つア
ルカリ金属が好ましく、ＮαとＫが特に好ましく、Ｎα
が最も好ましい。
アルカリ金属イオンを含む。適邑濃度は各使用アルカリ
金属に依存するが、一般に約０．０６Ｍ〜約０．１１Ｍ
、好ましくは約０．０７Ｍ〜約００９Ｍである。樹脂自
体上に関してはＫに等しいかそれ未満の原子量を持つア
ルカリ金属が好ましく、ＮαとＫが特に好ましく、Ｎα
が最も好ましい。
緩衛液のｐＨは重要ではなく、過剰酸性によるへモグロ
ビンの加水分解を避け、所望分離の達成に必要なもので
あればよい。一般に、そのｐＨけ約５．０〜約７５、好
ましくは約６．５〜約７０．である。ｐＨがこの範囲内
の従来緩衝系のいづれも使用できる。例は生化学的緩衝
剤、双イオン、ボスフェート緩衝剤である。好ましい緩
衝剤はリン酸カリウム、リン酸ナトリウムであり、−塩
基性と二環基性とを含む。リン酸ナトリウム類が特に好
ましい。
ビンの加水分解を避け、所望分離の達成に必要なもので
あればよい。一般に、そのｐＨけ約５．０〜約７５、好
ましくは約６．５〜約７０．である。ｐＨがこの範囲内
の従来緩衝系のいづれも使用できる。例は生化学的緩衝
剤、双イオン、ボスフェート緩衝剤である。好ましい緩
衝剤はリン酸カリウム、リン酸ナトリウムであり、−塩
基性と二環基性とを含む。リン酸ナトリウム類が特に好
ましい。
本方法の？／ｉＸ度上０？観点はいづれのイオン交（φ
法のものともωている。従って適当な温度はカラム中の
樹脂容瞼、樹脂の粒径、アルカリ金属食潰。
法のものともωている。従って適当な温度はカラム中の
樹脂容瞼、樹脂の粒径、アルカリ金属食潰。
粒子表面積その他の類似変数に左右され、ルーチンな実
験で容易に決定できる。約１４〜ね３５℃、好ましくは
約１９〜絹６０℃の温度で実施するのが最も便利である
。
験で容易に決定できる。約１４〜ね３５℃、好ましくは
約１９〜絹６０℃の温度で実施するのが最も便利である
。
溶出用緩衝剤溶液の容量、カチオン交換樹脂を通っての
その流速を選択して最適分離を提供する。
その流速を選択して最適分離を提供する。
最適の容量と流速はルーチンの実駐で容易に決定される
。
。
従来安定剤、例えばナトリウムア：）ト及び／又はエチ
レンジアミン四酢酸、を従来量で溶出用緩衝剤溶液に含
有できる。
レンジアミン四酢酸、を従来量で溶出用緩衝剤溶液に含
有できる。
一般に、シップ塩基付加体の解離は溶出時間の延長によ
り強化できる。これは、樹脂の活性部位のアルカリ金属
イオン占有率の低下：溶出用緩衝剤溶液のアルカリ金属
濃度の低下：サンプル容重に比例しての樹脂の容量の増
加：樹脂粒径の減少：交倹体上への流れの制限：等を単
独か緬み合せて進行する等の従来法のいづれでも達成さ
れる。
り強化できる。これは、樹脂の活性部位のアルカリ金属
イオン占有率の低下：溶出用緩衝剤溶液のアルカリ金属
濃度の低下：サンプル容重に比例しての樹脂の容量の増
加：樹脂粒径の減少：交倹体上への流れの制限：等を単
独か緬み合せて進行する等の従来法のいづれでも達成さ
れる。
溶出が完了したら、溶出液は原サンプル中に存在したヘ
モグロビンＡ０の実質上全てを含み、非グリコジル化ヘ
モグロビンは実質上全く含まない。
モグロビンＡ０の実質上全てを含み、非グリコジル化ヘ
モグロビンは実質上全く含まない。
ついで浴出液のＡ１含量を当業界で良く知られている生
化学的技術１分光学的技術等の従来技術のいづれにても
分析できる。
化学的技術１分光学的技術等の従来技術のいづれにても
分析できる。
次実施例は本発明の例示であり、限定ではない。
実施例 １゜
本実施例は、人血のシッフ塩基含有サンプルの非シッフ
塩基体グリコジル化ヘモグロビン含量の分析での本発明
の方法の利用の実証である。
塩基体グリコジル化ヘモグロビン含量の分析での本発明
の方法の利用の実証である。
４人の非糖尿病恵者からの全面サンプルを各々２分した
。各対からの１部を９００■／ｄ１のグルコースと共に
５時間、３７℃で培養してシッフ塩基含有サンプルとし
て使った。残部は分析特進４℃で貯蔵し１分析時にシッ
フ塩基を含まないサンプルとして使った（使用前１８日
間貯蔵したのでこれらサンプル中のシック塩基の実際量
は無視できるものだった）。
。各対からの１部を９００■／ｄ１のグルコースと共に
５時間、３７℃で培養してシッフ塩基含有サンプルとし
て使った。残部は分析特進４℃で貯蔵し１分析時にシッ
フ塩基を含まないサンプルとして使った（使用前１８日
間貯蔵したのでこれらサンプル中のシック塩基の実際量
は無視できるものだった）。
培養したサンプルと培養しないサンプルとの両者のアリ
コートを前記方法で溶血し、イオン交換カラムで分鳥１
Ｆシた。
コートを前記方法で溶血し、イオン交換カラムで分鳥１
Ｆシた。
Ａ、溶血
各サンプルの良く混合した１００μｔアリコートを、商
品名“Ｔｒｉｔｏｎ ｘ −１００”■（アメリカの４
ニシルバニア州のフィラデルフィアのローム及）〜−ス
社）の界面活性剤ポリオキシエチレンエーテルの０．３
３ Ｖ／Ｖ％水浴でルと０．６ Ｍ濃度のホウ酸からな
る５００μｔの溶血剤とあわせた。渭合物を渦巻攪拌し
、５分間放置した。各生成溶血組物の２００μｔアリコ
ートを次工程で得られる溶出サンプルとの比較のため保
存した。
品名“Ｔｒｉｔｏｎ ｘ −１００”■（アメリカの４
ニシルバニア州のフィラデルフィアのローム及）〜−ス
社）の界面活性剤ポリオキシエチレンエーテルの０．３
３ Ｖ／Ｖ％水浴でルと０．６ Ｍ濃度のホウ酸からな
る５００μｔの溶血剤とあわせた。渭合物を渦巻攪拌し
、５分間放置した。各生成溶血組物の２００μｔアリコ
ートを次工程で得られる溶出サンプルとの比較のため保
存した。
Ｂ、溶出
一連のイオン交換樹脂カラムを次の如くして調製した。
アメリカのカリフォルニア州のリツチモンＶのＢｉｏ
−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から得られるメ
タクリル酸とジビニルインゼ、ンとのコポリマーからな
る弱酸性樹脂であるＢｉｏ −Ｒｅｘ ７０イオン交換
樹脂をリン酸で２１．１整して樹脂の活性部位でのＨイ
オンとＮαイオンとの比を５５：４５とした。
−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から得られるメ
タクリル酸とジビニルインゼ、ンとのコポリマーからな
る弱酸性樹脂であるＢｉｏ −Ｒｅｘ ７０イオン交換
樹脂をリン酸で２１．１整して樹脂の活性部位でのＨイ
オンとＮαイオンとの比を５５：４５とした。
長さ約１２−１容量約１２ｍ１で、底近くにフリットを
含むプラスチック拉寸１旨カラムに１．０ ？ （ろ０
ＩＩＩｔ）の予調整樹脂を装入した。カラムを振とうし
て均一サスはンションを提供した。振と５直後にカラム
頭部のキャップをはずし、底の先端を破り取ってカラム
内容物を廃物容器に吐出した。
含むプラスチック拉寸１旨カラムに１．０ ？ （ろ０
ＩＩＩｔ）の予調整樹脂を装入した。カラムを振とうし
て均一サスはンションを提供した。振と５直後にカラム
頭部のキャップをはずし、底の先端を破り取ってカラム
内容物を廃物容器に吐出した。
カラムから吐出後に浴面産物の１００μｔアリコートを
樹脂床の幀部の中心にピはットで移した。
樹脂床の幀部の中心にピはットで移した。
ついで床を５〜７分放置した。
ついで溶出用緩衝液をカラムを通過させた。この液はｐ
Ｈが６．７、Ｎαイオン繕濃度７４ミリ尚缶／ｌの０．
０５Ｍホスフェート緩衝剤を含んでいた。
Ｈが６．７、Ｎαイオン繕濃度７４ミリ尚缶／ｌの０．
０５Ｍホスフェート緩衝剤を含んでいた。
合計で１０．ＱｍＩのこの液を使い、そのうち初めの１
ｒｎｌはカラム頭部に滴下し、残りは流わとしてカラム
壁に向けた。
ｒｎｌはカラム頭部に滴下し、残りは流わとしてカラム
壁に向けた。
カラムから完全に吐出後に溶出液を完全に混合し、１０
朋光路のキュベツトに移し、その吸光度を実験室用公党
光度計で、Ａ１５ルｍで緩（財）剤鹸液をブランクとし
て使った零位調整して読み取った。
朋光路のキュベツトに移し、その吸光度を実験室用公党
光度計で、Ａ１５ルｍで緩（財）剤鹸液をブランクとし
て使った零位調整して読み取った。
溶出液のヘモグロビン含量を原サンプル中に存在する全
ヘモグロビンの％として表現するために同様な吸光測定
値を第２の溶出緩衝剤溶液で希釈後に保存溶血産物アリ
コート（前項″′浴溶血の最結文を見よ）で％ｐみ取っ
た。ついで溶出液での％、 を次式で決定した。
ヘモグロビンの％として表現するために同様な吸光測定
値を第２の溶出緩衝剤溶液で希釈後に保存溶血産物アリ
コート（前項″′浴溶血の最結文を見よ）で％ｐみ取っ
た。ついで溶出液での％、 を次式で決定した。
この式は原サンプル中の全ヘモグロビンの％とじてのＨ
ｂＡｌを示す。培養した浴面産物と培養しなかった溶血
産物の両者をこの方法で溶出した。
ｂＡｌを示す。培養した浴面産物と培養しなかった溶血
産物の両者をこの方法で溶出した。
Ｃ１全シッフ塩基量
溶面産物中の全シック塩基量を決定するために、ホウ酸
イオンを存在させることな〈従来の緩衛剤を使った。こ
れはｐＨが６．７でＮαイオン濃度が７４ミリ轟量／ｌ
の４． Ｑ ｍｌの０．．０５ Ｍホスフェート緩前削
から組成されていた。この緩衛剤のＮαイオン含量、イ
オン交換体表面でのＮα：Ｈイオン比（前記使用と同じ
）のために迅速ヘモグロビン＋シップ塩基付加体の全て
が溶出液中に集められた。ついで、１ｇサンプル中の全
ヘモグロビンの％とじての溶出液中のＨｂＡ Ｈ−を前
ｎｅＢ項と同様に４算した。
イオンを存在させることな〈従来の緩衛剤を使った。こ
れはｐＨが６．７でＮαイオン濃度が７４ミリ轟量／ｌ
の４． Ｑ ｍｌの０．．０５ Ｍホスフェート緩前削
から組成されていた。この緩衛剤のＮαイオン含量、イ
オン交換体表面でのＮα：Ｈイオン比（前記使用と同じ
）のために迅速ヘモグロビン＋シップ塩基付加体の全て
が溶出液中に集められた。ついで、１ｇサンプル中の全
ヘモグロビンの％とじての溶出液中のＨｂＡ Ｈ−を前
ｎｅＢ項と同様に４算した。
Ｄ、結果
次の如く溶血剤と溶出用緩衝との両者でのホウ酸イオン
室をかえて４つの別の実験を各サンプルで行なった。
室をかえて４つの別の実験を各サンプルで行なった。
表 Ｉ
Ａ ４ｍ／
Ｂ ’Ｉ、０ｍ１
Ｃ０６Ｍ（ＰＨ５，００）１０ｍ／
Ｄ ０．６Ｍ（、ｐＨ５，ｏＯ）０．０９Ｍ １０ｍ
１これら剤の組合せの各々を使う前に交換体のＨ対Ｎα
イオン比をｖ１期値５５：４５かられずかに調整してＨ
ｂＡＯフラクションからのＨｂＡ、フラクションのｇ、
＋ｊ（１分離を達成した。このｉａ、’ｔ ＊はリン酸
での処理で行ない、各ケースの最終比は５５：４５〜６
０ ： ４０の範囲内であった。
１これら剤の組合せの各々を使う前に交換体のＨ対Ｎα
イオン比をｖ１期値５５：４５かられずかに調整してＨ
ｂＡＯフラクションからのＨｂＡ、フラクションのｇ、
＋ｊ（１分離を達成した。このｉａ、’ｔ ＊はリン酸
での処理で行ない、各ケースの最終比は５５：４５〜６
０ ： ４０の範囲内であった。
培養したサンプルと培養しないサンプルとの両者からの
浴出液の原ヘモグロビン含匍″（％）を前述の如く分析
した。結果は、各サンプル中の６種の迅速ヘモグロビン
の全齢と解１１ｉ１ｆ Ｌなかったシック塩基へ付加体
との和を表していた。ついでこれら値を次式に挿入して
本発明の方法で除去されたシッフ塩基の量を計算して、
培養サンプル中に元来存在した全量の％に換算して表示
した。
浴出液の原ヘモグロビン含匍″（％）を前述の如く分析
した。結果は、各サンプル中の６種の迅速ヘモグロビン
の全齢と解１１ｉ１ｆ Ｌなかったシック塩基へ付加体
との和を表していた。ついでこれら値を次式に挿入して
本発明の方法で除去されたシッフ塩基の量を計算して、
培養サンプル中に元来存在した全量の％に換算して表示
した。
Ａ
８印はホウ酸イオンなしで行った４ｍｌの溶出での
Ｂ結果を示す（前項Ｃを見よ）。
Ｂ結果を示す（前項Ｃを見よ）。
”ｉｎｃ、” ＝培養サンプル： ”ｕｎｉｎｃ、”＝
未培養サンプル。
未培養サンプル。
結果を表■に示す。シッフ環基除去率Ｃ％）は
０ボレートの使用により相当に高まっている。
０ボレートの使用により相当に高まっている。
１２３−
表■
テスト結果
９００■／ｄ１の 培養に起因シッフ塩基１ ７．０
５ １１．０３ ５６．５％ ０％２
６．９７ １０．４９ ３ ７．６９ １１．７（Ｓ ４６．３２ １０．４９ １ ６．５５ ９．３０ ４２．０％
２５．７％２ ６．６４ ９．０４ ３ ７．１５ ９．９０ ４ ５．７９ ８．７７ １ ６．８４ ７．２３ ６．５％
８８％２ ６．２０ ６．９９ ３ Ｚ６３ ７５１ ４ ５．８２ ６．３８ １ ６．６９ ６，９１ ３．５％
９３８％２ ６．２６ ６６６ ３ ７．５１ ７．３８ ４ ５．７９ ６．１３
５ １１．０３ ５６．５％ ０％２
６．９７ １０．４９ ３ ７．６９ １１．７（Ｓ ４６．３２ １０．４９ １ ６．５５ ９．３０ ４２．０％
２５．７％２ ６．６４ ９．０４ ３ ７．１５ ９．９０ ４ ５．７９ ８．７７ １ ６．８４ ７．２３ ６．５％
８８％２ ６．２０ ６．９９ ３ Ｚ６３ ７５１ ４ ５．８２ ６．３８ １ ６．６９ ６，９１ ３．５％
９３８％２ ６．２６ ６６６ ３ ７．５１ ７．３８ ４ ５．７９ ６．１３
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 第１ ：ｌｊｉ 入面サンプル中の非グリコジル化ヘモグロビンＡ□のシ
ッフ塩基体前駆体とからヘモブロイ。 リンＡ１を分離する方法において、 （α）該サンプル中の赤血球を溶面して溶血産物を形成
し。 （ｈ’）該溶面産物を弱カチオン交換樹脂に含浸させ、 （ｃ）約０．０６ Ｍ〜約０．１１Ｍの濃度のアルカリ
金属イオンを溶解している緩衝剤溶液を該樹脂を通過さ
せて該シッフ塩基体前駆体をグルコースとヘモグロビン
Ａ１に解離し、かつ、該ヘモグロビンＡ１と該似非グリ
コジル化ヘモグロビンより優先的に該グルコースと該ヘ
モグロビンＡＩとを溶出させ、 （ｄ）王稈（Ｃ）の溶出液を回収する、ことからなり、 該溶血産物か核緩衝剤溶液か両者に有効層のジヒト９０
キシボリル化合物を含めることを重機とする方法。 ｗ、２項 有効量のジヒト９０キシボリル化合物を該溶血産物又は
、該溶血産物と該緩衝剤溶液との両者に含める、特許請
求の範囲第１項記載の方法。 Ｉ！１′６項 ジヒドロキシボリル化合物を該溶血産物中に、ｉ＋ ０
．１ Ｍ〜約１．０Ｍの濃度で、該緩衝剤溶液中に約［
３，０１Ｍ〜約［１，１５Ｍの濃度で含める、特許請求
の範四譲１項記載の方法。 第４項 ジヒドロキシボリル化合物を該溶面産物中に約０．４Ｍ
〜約０．６Ｍの濃度で、該緩衝剤溶液に約０．０７Ｍ〜
約０．１０ Ｍの濃度で含める、特「（−請求の範囲第
１項記載の方法。 第５項 該ジヒドロキシボリル化合物ｌがホウ酸、但級アルキル
ボロン酸及びそれらの塩からなる群から選択される１％
許請求の範囲第１．２，３、又は４項記載の方法。 笛６項 該ヒビロキシボリル化合物がホウ酸である、特許請求の
ｆｌ＋ｆｌ囲枦１．２，３又は４項記載の方法。 第７項 工程（α）を、該サンプルを洗滌側水溶ｉ’ｆＬに加え
、生成混合物をほぼ室温で少くとも約１０分間培養する
ことにより達成する、特許請求の範囲第１項言ｅ載の方
法。 Ｗ８項 工程（α）を、該サンプルを洗滌剤水溶液に加えて約０
．１〜約０．５ Ｗ％の洗滌剤を含む混合物を牛廠し、
該混合物をほぼ室温で少くとも約１００〜約元、するこ
とにより達成し、 ジヒドロキシボリル化合物を該洗滌側溶液又は、該洗滌
側溶液と該緩ｔｈ削溶液との両者に含めてジヒドロキシ
ボリル化合物濃度を該溶血産物で約０．１ Ｍ〜約１．
０Ｍ、該緩衝剤溶液で約０．０１Ｍ〜約０．１５Ｍとす
る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 第９項 工程（α）を、該サンプルを洗滌剤水溶液に加えて約０
．１〜約０．５ Ｗ％の洗滌剤を含む混合物を生成し、
該混合物をほぼ室温で少くとも約１０分間培養すること
により達成し、 ホウ酸を該洗滌側溶液と該緩衝剤溶液との両者に含めて
約０．４ Ｍ〜約１１．６ Ｍホウ酸イオンを含む溶血
産物を生成し、又、該緩衝剤溶液のホウ酸イオン濃度を
約０．０７Ｍ〜約０．１０Ｍとする、特許ハ、（１求の
範囲第１項記載の方法。 第：１０項 該弱カチオン交換樹脂がメタクリル酸とジビニルベンゼ
ンとのコポリマーであり、該樹脂上の活性部位の８ｒＪ
３０〜約５０％がアルカリ金属イオンで占られ、残りが
Ｈイオンで占られ、該樹脂上の該アルカリ金属イオンと
該緩衝剤溶液中の該アルカリ金属イオンとが同一であり
、 ＮＩＺとＫからなる群から選択される、特許請求の
範囲第１項記載の方法。 第１１項 該弱カチオン交換樹脂がメタクリル酸とジビニルばンゼ
ンとのコポリマーであり、該樹脂上の活性部位の約６５
〜約４５％がＮαイオンで占められ、残りがＨイオンで
占められ、該緩衝剤溶液のアルカリ金属イオン濃度が約
０、０７ Ｍ〜約０．０９ Ｍであり、該アルカリ金属
イオンがＮαイオンである。特許請求の却囲第１項記載
の方法。 Ｗ：１２項 該緩衝剤溶液がｐＨが約５．０〜約７５のホスフェート
緩衝剤溶液であり、工程（ｃ）が約４〜約３５℃の温度
で達成される、特許請求の範囲第１頌記載の方法。 第１６項 該弱カチオン交換樹脂がメタクリル 酸とジビニルはンゼンとのコポリマ ーであり、該樹脂上の活性部位の約３５〜約４５％がＮ
αイオンで占められ、工程（Ｃ）の該アルカリ金属イオ
ンがＮａイオンであり、該緩衝剤溶液の診Ｎαイオン濃
度が約０．０７Ｍ〜約０．０９Ｍであり、該緩衝剤溶液
がｐＨが約６．５〜約ＺＯのホスフェート緩衝剤溶液で
あり、工程（Ｃ）を約１９〜約３０℃の湿度で達成する
１％許請求の範囲第１項記載の方法。 紀１４項 人血サンプル中の非グリコジル化ヘモグロビントヘモグ
ロビンＡ１のシッフ塩基体前駆体とからヘモグロビンＡ
１を分離する方法において、（α）該サンプルを洗滌剤
水溶液とあわせて約０１〜約０．５Ｗ％の洗滌剤を含む
混合物を形成し、該混合物をほぼ室温で少くとも１０分
間培養し、 （ｈ） カチオン交換樹脂に該溶血産物を含Ｉりさせ
。 ここで該樹脂は粒子サイズが約１００〜約４００であり
、その表面の活性部位の約６０〜約５０％がＮαイオン
で、ｉりがＨイオンで占められているメタクリルｌとジ
ビニルベンゼンとのコポリマーから本質的になり、 （Ｃ）該樹脂に、ＰＨが約５０〜約７５、温度が約１４
〜約３５℃で、約０．０６ Ｍ〜約０．１１Ｍの濃度で
Ｎαイオンを溶解して含むホスフェート緩衝剤溶液を通
過させて該シック塩基体前駆体をグルコースとヘモグロ
ビンＡに解離し、かつ、該ヘモグロビンＡや該似非グリ
コジル化ヘモグロビンヨ？）該１ルコースや該ヘモグロ
ビンＡ０を優先的に溶出し、 （均 工程（Ｃ）の俗出液を回収する、ことからなり、 工程（α）の混合物が約０．１Ｍ〜約１．０Ｍのホウ酸
イオンを含む様にホウ酸イオンを該洗滌剤溶液に含め、
該緩衝剤溶液に絶０．０１Ｍ〜約０．１５Ｍの濃度でホ
ウ酸イオンを含めることを特徴とする方法。 第１５項 ヘモグロビンＡ□のグルコース依存シッフ塩基体前駆体
による妨害なく人血サンプルのヘモグロビンＡ０含量を
決定するための分析に使うキットにおいて。 （ａｌ 弱カチオン交榊体： （Ａ＋ 約０．１ Ｍ〜約１．０Ｍの濃度でジヒＰロ
キシボリル化合物を含む洗滌剤水溶液からなる溶血剤： （Ｃ） 約０．０６ Ｍ〜約０．１１Ｍの濃度のアル
カリ金属イオンを溶解している緩衝剤溶液：からなるキ
ット。 第１１６項 約０．０１Ｍ〜約０．１５Ｍの濃度でジヒＰロキシポリ
ル化合物を含む緩衝剤溶液を更に含む。 特許請求の範囲第１６項記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/382,899 US4409335A (en) | 1982-05-28 | 1982-05-28 | Method for eliminating glucose dependent Schiff base effect from hemoglobin A1 assay |
| US382899 | 1989-07-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58210024A true JPS58210024A (ja) | 1983-12-07 |
| JPH0135302B2 JPH0135302B2 (ja) | 1989-07-25 |
Family
ID=23510886
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57234944A Granted JPS58210024A (ja) | 1982-05-28 | 1982-12-24 | ヘモグロビン分離法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4409335A (ja) |
| JP (1) | JPS58210024A (ja) |
| DE (1) | DE3316452C2 (ja) |
| GB (1) | GB2121170B (ja) |
Families Citing this family (21)
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| FR2570615B1 (fr) * | 1984-09-26 | 1986-12-26 | Centre Nat Rech Scient | Nouveau complexe d'elution notamment pour chromatographie d'affinite |
| IT1177354B (it) * | 1984-11-28 | 1987-08-26 | Giorgio Torelli | Procedimento per l'analisi dell'emoglobina hba2 |
| GB8504521D0 (en) * | 1985-02-21 | 1985-03-27 | Genetics Int Inc | Electrochemical assay |
| JPS6336143A (ja) * | 1986-07-30 | 1988-02-16 | Tosoh Corp | 安定型糖化ヘモグロビン測定方法および装置 |
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| CA1338348C (en) * | 1987-11-30 | 1996-05-28 | Kazutoshi Yamazaki | Eliminating agent for glycosylated hemoglobin |
| GB2220369B (en) * | 1988-06-10 | 1993-01-27 | Inst Of Child Health | Method for testing body fluids by low pressure liquid chromatography |
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| US7851229B2 (en) * | 2006-05-12 | 2010-12-14 | Primus Corporation | Two-phase optical assay with unitized container and double or single sensor systems |
| KR102656644B1 (ko) | 2015-02-09 | 2024-04-09 | 슬링샷 바이오사이언시즈 인코포레이티드 | 튜닝가능한 광 특성을 갖는 하이드로겔 입자 및 이를 사용하기 위한 방법 |
| JP2023511132A (ja) | 2020-01-24 | 2023-03-16 | スリングショット バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド | 細胞様較正粒子のための組成物および方法 |
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| US4142856A (en) * | 1977-12-02 | 1979-03-06 | Isolab, Incorporated | Method to determine a diagnostic indicator of blood sugar condition, and, a liquid chromatographic microcolumn therefor |
| US4142855A (en) * | 1977-12-02 | 1979-03-06 | Isolab, Incorporated | Method to determine a diagnostic indicator of blood sugar condition, and, a liquid chromatographic microcolumn therefor |
| US4168147A (en) * | 1977-12-02 | 1979-09-18 | Isolab, Inc. | Method to determine a diagnostic indicator of blood sugar condition, and, a liquid chromatographic microcolumn therefor |
| US4142857A (en) * | 1977-12-02 | 1979-03-06 | Isolab, Incorporated | Method to determine a diagnostic indicator of blood sugar condition, and, a liquid chromatographic microcolumn therefor |
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- 1982-12-24 JP JP57234944A patent/JPS58210024A/ja active Granted
-
1983
- 1983-05-05 DE DE3316452A patent/DE3316452C2/de not_active Expired
- 1983-05-20 GB GB08313981A patent/GB2121170B/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4409335A (en) | 1983-10-11 |
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| GB8313981D0 (en) | 1983-06-29 |
| DE3316452C2 (de) | 1987-02-26 |
| JPH0135302B2 (ja) | 1989-07-25 |
| DE3316452A1 (de) | 1983-12-01 |
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