DE19628484A1 - Blutersatzmittel-Entstörung durch Peroxide - Google Patents

Blutersatzmittel-Entstörung durch Peroxide

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DE19628484A1
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer freies Hämoglobin enthaltenden Probe durch optische Messung unter Zusatz eines Aufhellmittels zum Analy­ senreagenz. Insbesondere ist dieses Verfahren zur Bestimmung von Bestandteilen einer medizinischen Probe wie etwa der Para­ meter α-Amylase, Alkalische Phosphatase und γ-Glutamyl-Trans­ ferase in einer Blut-, Serum- oder Plasmaprobe geeignet.
Gerade bei der Bestimmung klinisch-diagnostisch relevanter Bestandteile in Blut-, Serum- bzw. Plasmaproben kommt es häu­ fig vor, daß diese Probenmaterialien freies Hämoglobin enthal­ ten, d. h. hämolytisch sind. Dabei kann die Hämolyse entweder die Folge von aus Erythrozyten freigesetztem nativem Hämoglo­ bin oder der therapeutischen Anwendung von Blutersatzmitteln auf Basis nichtzellulärer Hämoglobinderivate sein.
Speziell bei Verwendung von photometrischer Bestimmungsmetho­ den ist in vielen Fällen die Analyse solcher Hämoglobin ent­ haltender Proben im wesentlichen aufgrund der spektralen Ei­ genschaften von Hämoglobin bzw. Hämoglobinderivaten gestört oder gänzlich unmöglich. Dies gilt insbesondere dann, wenn die photometrische Messung mit einer Wellenlänge durchgeführt wird, bei der eine starke Absorption von Hämoglobin stattfin­ det, beispielsweise bei Wellenlängen zwischen ca. 400-420 nm und wenn gleichzeitig ein hoher Hämoglobingehalt in der Probe, d. h. üblicherweise < 500 mg/dl vorliegt.
Die Frage nach der Beseitigung solcher durch Hämolyse verur­ sachten Analysenstörungen stellt sich mit der Verfügbarkeit von Blutersatzmitteln auf Basis von Hämoglobinderivaten in weitaus stärkerem Maße als bisher. Nach ihrer therapeutischen Verabreichung können im Blut-Serum oder -Plasma Hämoglobin- Spiegel von bis zu ca. 2000 mg/dl auftreten, wobei erschwerend hinzukommt, daß sich in diesem Fall das Vorhandensein von freiem Hämoglobin in der Probe auch nicht durch geeignete Vorsichtsmaßnahmen bei der Serum- bzw. Plasma-Gewinnung aus der Blutprobe vermeiden läßt.
Es besteht daher ein Bedarf an einem Verfahren, welches es ermöglicht, auch in stark hämolytischen, beispielsweise Blut­ ersatzmittel bis zu Konzentrationen von mindestens 2000 mg/dl enthaltenden Serum- bzw. Plasmaproben störungsfrei photome­ trische Bestimmungen diagnostisch wichtiger Analyten durchführen zu können.
Gelöst wurde die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe durch ein Verfahren zur Beseitigung oder/und Verminderung von Stö­ rungen, die durch Anwesenheit von freiem Hämoglobin hervor­ gerufen werden, bei der Bestimmung eines Analyten in einer Probe durch optische Messung, wobei man dem für die Bestimmung des Analyten verwendeten Reagenz oder einem Teil davon eine oder mehrere peroxidische Verbindungen zusetzt.
Durch den erfindungsgemäßen Zusatz von peroxidischen Verbin­ dungen zum Analysereagenz oder einem oder mehreren Teilreagen­ zien können einerseits spektrale Störungen durch das in der Probe vorhandene Hämoglobin beseitigt werden. Andererseits können auch Störungen beseitigt werden, die durch Wechselwir­ kungen von Hämoglobin mit in der Probe vorhandenen weiteren Substanzen auftreten.
Das Reagenz, welches der Probe zugesetzt wird, kann in flüssi­ ger oder fester Form vorliegen. Für Analytbestimmungen, die in flüssiger Phase durchgeführt werden, wird man vorzugsweise der Probe auch ein flüssiges Reagenz zusetzen. Bei Trockentests kann das Reagenz aber auch in fester Form, z. B. in Form von imprägnierten Fasern oder Vliesen vorliegen.
Als peroxidische Substanzen kommen sowohl anorganische als auch organische Peroxide in Frage. Bevorzugt sind anorganische peroxidische Verbindungen wie etwa H₂O₂, Peroxide, Perborate, Persulfate, Peroxodisulfate, Percarbonate etc. Besonders be­ vorzugt werden die peroxidischen Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H₂O₂ und Perboraten wie etwa NaBO₂ × H₂O₂ × 3 H₂O bzw. Na₂B₄O₇ × H₂O₂ × 9 H₂O.
Die Endkonzentration der peroxidischen Verbindungen im Test­ ansatz kann über einen breiten Bereich variiert werden. Sie beträgt vorzugsweise 1-500 mmol/l und besonders bevorzugt 5-200 mmol/l bezogen auf den Gehalt an O₂2- im Testansatz.
Durch den Zusatz peroxidischer Verbindungen kommt es nach dem Vermischen der Probe mit dem Analysenreagenz zu einer raschen Ausbleichung der vom Hämoglobin bzw. Hämoglobinderivat hervor­ gerufenen Färbung, ohne daß gleichzeitig eine sich im selben Reaktionsansatz anschließende Bestimmung des Analyten wie z. B. eines Enzyms mittels chromogener Substrate signifikant beein­ trächtigt wird. Dieser Befund ist sehr überraschend, da kei­ nesfalls vorhergesehen werden konnte, daß peroxidische Ver­ bindungen auch in höheren Konzentrationen sowie innerhalb des für photometrische Serum- bzw. Plasmaanalysen üblicherweise verwendeten Temperaturbereichs, d. h. im allgemeinen von 25-37°C, auch über eine längere Einwirkungszeit, d. h. vorzugs­ weise über mindestens 1 min und besonders bevorzugt über min­ destens 2-10 min hinweg keine Beeinflussung von enzymati­ schen Aktivitäten und/oder eine Störung der jeweiligen Indika­ torreaktion verursachen.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere für optische Messungen, die bei mindestens einer Meßwellenlänge durchgeführt werden, bei der natives Hämoglobin bzw. synthe­ tische Hämoglobinderivate eine Absorption aufweisen. Besonders bevorzugt wird das Verfahren bei optischen Messungen in den Meßwellenlängenbereichen von etwa 380-450 nm und insbesondere von 400-420 nm oder/und 520-590 nm durchgeführt, wo Hämoglo­ bin seine Haupt- bzw. Nebenabsorptionen aufweist.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Bestimmung beliebiger Proben, in denen freies Hämoglobin vorliegt. Bei­ spiele für solche Proben sind nativ hämolytische Blut-, Serum- oder Plasmaproben oder Proben, die ein Blutersatzmittel auf Basis von Hämoglobinderivaten enthalten. Beispiele für Blut­ ersatzmittel, die im Sinne der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff "freies Hämoglobin" fallen, sind modifizierte oder intramolekular oder intermolekular vernetzte bzw. polymeri­ sierte Derivate von Hämoglobinen, insbesondere von Humanhämo­ globin oder Rinderhämoglobin, z. B. DCL-Hämoglobin (Diaspirin- Crosslinked-Hämoglobin), sowie rekombinant z. B. aus Mikroorga­ nismen gewonnene Hämoglobin-Muteine (vgl. z. B. "Blood Substi­ tutes", R.M. Winslow, K.D. Vandegriff, M. Intaglietta (Hrsg.), Birkhäuser, Boston 1995 und EP-A-0700 997).
In einer bestimmten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei dem zu bestimmenden Analyten um ein Enzym. Bevorzugte Enzyme sind ausgewählt aus der Gruppe der Hydrolasen wie z. B. α-Amylase, Alkalische Phosphatase und γ-Glutamyl-Transferase (γ-GT). Darüberhinaus ist das erfin­ dungsgemäße Verfahren auch zur Bestimmung anderer Analyten geeignet.
Als Probe beim erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise eine medizinische Probe, z. B. eine Blut-, Serum- oder Plasma­ probe eingesetzt, insbesondere eine humane Serum- oder Plasma­ probe.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens be­ steht darin, daß es in einem Analyseautomaten durchgeführt werden kann, z. B. an einem Boehringer Mannheim/Hitachi 704- oder 717-Analysegerät.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bestimmung des Analyten im erfindungsgemäßen Verfahren als Mehr-Schritt-Test, z. B. als Zwei-Schritt-Test durchgeführt, wobei der Probe nach­ einander mindestens zwei Teilreagenzien zu unterschiedlichen Zeitpunkten zugesetzt werden. Bei einer solchen Mehr-Schritt- Testführung werden die peroxidischen Verbindungen vorzugsweise dem Teilreagenz zugefügt, das als erstes der Probe zugesetzt wird. Die eigentliche Analytbestimmung erfolgt dann vorzugs­ weise frühestens nach Zugabe des zweiten Teilreagenzes, das z. B. im Falle einer Enzymbestimmung ein chromogenes Farbsub­ strat enthalten kann.
Wenn bei einer Mehr-Schritt-Testführung die peroxidischen Verbindungen zusammen mit einem ersten Teilreagenz zugesetzt werden, können das zweite oder mindestens eines der weiteren Teilreagenzien dann gegebenenfalls noch ein Mittel enthalten, mit dem die aus dem ersten Teilreagenz stammenden überschüssi­ gen peroxidischen Verbindungen wieder entfernt werden, um die etwaigen Störungen von anderen, im gleichen Reaktionsgefäß anschließend durchgeführten Analysen aufgrund von sogenannten Verschleppungseffekten zu vermeiden.
Werden als Peroxide H₂O₂ oder/und Perborate eingesetzt, so umfaßt das Mittel zur Entfernung der peroxidischen Verbindun­ gen vorzugsweise ein Peroxid-umsetzendes Enzym wie etwa Kata­ lase oder/und Peroxidase gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren geeigneten Substraten des Peroxid-umsetzenden Enzyms.
Weiterhin kann dem Analysenreagenz oder einem Teilreagenz davon zur Vermeidung der Bildung von Superoxidradikalen O₂⁻ noch Superoxiddismutase zugesetzt werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann ohne weitere Maßnah­ men eine Wiederfindung des nachzuweisenden Analyten auch in hämolytischen Proben von 100 ± 10% und vorzugsweise 100 ± 5% erreicht werden, wenn zum ersten Meßzeitpunkt die Ausbleichung von Hämoglobin oder Hämoglobinderivat durch die peroxidischen Verbindungen im wesentlichen vollständig abgeschlossen oder zum Stillstand gekommen ist. Ist dagegen die Ausbleichreaktion zu Beginn der Messung noch nicht zum Stillstand gekommen, was gegebenenfalls bei einer sehr hohen Hämoglobin-Konzentration in der Probe und/oder einem verhältnismäßig hohen Probe- zu Reagenz-Volumenverhältnis der Fall sein kann, so kann zum Erreichen der gewünschten Analysengenauigkeit bevorzugt noch eine Leewertkorrektur durchgeführt werden. Diese Leerwertkor­ rektur kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß man von dem Meßsignal, welches mit dem peroxid- und chromogenhaltigen Reagenz erhalten wird, das Leerwertsignal abzieht, welches im gleichen Meßzeitraum in einem parallelen Testansatz mit dem ebenfalls peroxidhaltigen, jedoch chromogenfreien Reagenz erhalten wird. Besonders bevorzugt erfolgt die Leerwertkorrek­ tur durch Abziehen eines kinetischen Leerwerts.
Bei einem Zwei-Schritt-Test erfolgt die Bestimmung des Leer­ werts vorzugsweise derart, daß ein peroxidhaltiges erstes Teilreagenz (R1), vorzugsweise ein Reagenz mit gleicher Per­ oxidkonzentration wie im Testansatz, und nachfolgend ein chro­ mogenfreies zweites Teilreagenz (R2) zur Probe gegeben wird und aus diesem Testansatz dann der vom Meßsignal abzuziehende Leerwert ermittelt wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Reagenzienkit zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe durch optische Messung, der neben den zur Analytbestimmung erforderlichen Komponenten mindestens eine peroxidische Ver­ bindung zur Beseitigung oder/und Verminderung von Störungen, die durch freies Hämoglobin hervorgerufen werden, enthält. Vorzugsweise besteht der Reagenzienkit aus mindestens zwei räumlich voneinander getrennten Teilreagenzien. Ein Teilrea­ genz enthält vorzugsweise die peroxidische Verbindung getrennt von allen anderen Komponenten. In diesem Teilreagenz kann die peroxidische Verbindung in fester oder flüssiger Form, z. B. als Pulver oder Tablette oder auch als stabilisierte Lösung vorliegen. Das die peroxidische Verbindung enthaltende Teil­ reagenz wird vor der Durchführung des Tests vorzugsweise mit einem weiteren Teilreagenz vermischt.
Ein erfindungsgemäßer Reagenzienkit zur Bestimmung von Enzymen enthält vorzugsweise ein erstes die peroxidische Verbindung enthaltendes Teilreagenz, ein weiteres mit der peroxidischen Verbindung mischbares Teilreagenz und ein separates Reagenz, welches ein chromogenes Farbsubstrat enthält.
Ein erfindungsgemäßer Reagenzienkit zur Bestimmung von α-Amy­ lase umfaßt vorzugsweise ein erstes Teilreagenz, welches die peroxidische Verbindung enthält, ein weiteres mit der peroxi­ dischen Verbindung kompatibles Teilreagenz, welches gegebenen­ falls ein α-Amylase-Hilfsenzym wie etwa α-Glucosidase oder/und einen Antikörper enthält, sowie ein weiteres Teilreagenz, das ein chromogenes α-Amylasesubstrat, beispielsweise ein oligome­ res Glucosid enthält.
Ein erfindungsgemäßer Reagenzienkit zur Bestimmung von alkali­ scher Phosphatase umfaßt vorzugsweise ein erstes, die peroxi­ dische Verbindung enthaltendes Teilreagenz. Ein weiteres Teil­ reagenz, welches mit dem ersten Teilreagenz kompatibel ist, enthält vorzugsweise einen geeigneten alkalischen Puffer, und ein weiteres Teilreagenz, enthält ein chromogenes Substrat der Alkalischen Phosphatase, z. B. einen Phosphatester wie etwa 4-Nitro­ phenylphosphat.
Ein erfindungsgemäßer Reagenzienkit zur Bestimmung von γ-Glu­ tamyltransferase umfaßt vorzugsweise ein erstes, die peroxi­ dische Verbindung enthaltendes Teilreagenz, ein zweites Teil­ reagenz, welches einen geeigneten Puffer enthält, und ein weiteres Teilreagenz, das ein chromogenes Substrat der γ-GT, z. B. L-γ-Glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilid enthält.
Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die beigefügten Abbildungen sowie die nachfolgenden Beispiele erläutert wer­ den.
Es zeigen:
Abb. 1 den zeitlichen Verlauf des Meßsignals bei einer Be­ stimmung von Alkalischer Phosphatase in Proben mit unterschiedlichen Gehalten an Hämoglobinderivat ohne Zusatz einer peroxidischen Verbindung;
Abb. 2 den zeitlichen Verlauf des Meßsignals bei einer Be­ stimmung von Alkalischer Phosphatase in Proben mit unterschiedlichen Gehalten an Hämoglobinderivat un­ ter Zusatz einer peroxidischen Verbindung (1-4) bzw. den zeitlichen Verlauf des Meßsignals für eine Leer­ wertkorrektur (1′-4′);
Abb. 3 den zeitlichen Verlauf des Meßsignals bei einer α-Amy­ lasebestimmung in Proben mit unterschiedlichen Gehalten an Hämoglobinderivat ohne Zusatz einer per­ oxidischen Verbindung;
Abb. 4 die zeitlichen Verlauf des Meßsignals bei einer α-Amy­ lase Bestimmung in Proben mit unterschiedlichen Gehalten an Hämoglobinderivat unter Zusatz einer peroxidischen Verbindung (1-4) bzw. den zeitlichen Verlauf des Signals für eine Leerwertkorrektur (1′-4′);
Abb. 5 den zeitlichen Verlauf des Meßsignals bei einer Be­ stimmung von γ-GT in Proben mit unterschiedlichen Gehalten an Hämoglobinderivat ohne Zusatz einer per­ oxidischen Verbindung;
Abb. 6 den zeitlichen Verlauf des Meßsignals bei einer γ-GT Bestimmung in Proben mit unterschiedlichen Gehalten an HB-Derivat unter Zusatz einer peroxidischen Ver­ bindung (1-7) und
Abb. 7 den zeitlichen Verlauf des Signals für eine parallel zu den Versuchen in Abb. 6 durchgeführten Leerwert­ korrektur (1′-7′).
Beispiele Beispiel 1 Bestimmung der Alkalischen Phosphatase (AP) in Hämoglobin­ derivat-haltigem Serum 1.1. Probenmaterial
Je 0,40 ml eines Humanserumpools werden mit 0,01-0,10 ml Hämoglobin-Derivat (di-aspirin crosslinked hemoglobin, ′DClHb′, 10 g/dl; Fa. Baxter) in Stufen von 0,01 ml aufge­ stockt und zum Volumenausgleich mit 0,9% NaCl-Lösung auf jeweils 0,50 ml aufgefüllt (DClHb-Konzentration 200-2000 mg/dl).
Als Kontrolle wird eine Mischung von 0,40 ml des selben Serum­ pools mit 0,10 ml 0,9%iger wäßriger NaCl-Lösung mitgeführt.
1.2. Reagenzien 1.2.1. Alkalische Phosphatase-Grundreagenz (entsprechend Emp­ fehlung der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie)
AP DGKCh (Sys 2-Packung, Boehringer Mannheim GmbH, Best.-Nr. 1 662 902); Zusammensetzung:
1.2.2. Alkalische Phosphatase-Reagenz mit Peroxid-Zusatz
Wie 1.2.1., nur daß zu R1 noch H₂O₂ zu einer Konzentration von 147 mmol/l zugesetzt wird (0,5 ml Perhydrol 30%ig pro 30 ml R1) (H₂O₂-Endkonzentration im Test = 120 mmol/l).
1.3. Durchführung der Bestimmung
Die Bestimmung der Alkalischen Phosphatase wurde am Boehringer Mannheim/Hitachi 717-Analysenautomat bei 37°C mit Geräteein­ stellungen gemäß der Arbeitsvorschrift der Packungsbeilage durchgeführt (5 µl Probe, 250 µl R1, 50 µl R2; Wellenlängen 700/405 nm; Meßintervall 30.-38. Meßpunkt).
1.4. Ergebnisse 1.4.1. Reaktionskinetik (zeitlicher Extinktionsverlauf)
Abb. 1 zeigt den zeitlichen Extinktionsverlauf im Alkalische Phosphatase-Test bei Verwendung des Grundreagenzes (1.2.1) und folgender Proben:
  • - Kurve 1: 0,9% NaCl (= Reagenzleerwert)
  • - Kurve 2: Serum ohne DClHb
  • - Kurve 3: Serum mit 1000 mg/dl DClHb
  • - Kurve 4: Serum mit 2000 mg/dl DClHb.
Zumindest mit dem Serum mit einem DCLHb-Gehalt von 2000 mg/dl wird mit ca. 2.3 eine Ausgangsextinktion erreicht, die an der photometrischen Erfassungsgrenze liegt und keine zuverlässige Bestimmung der Enzymaktivität mehr erlaubt.
Dagegen führt, wie aus Abb. 2 ersichtlich (Zuordnung der Ex­ tinktionsverläufe zu den verschiedenen Proben wie bei Abb. 1), die Anwesenheit von Peroxid in R1 des Alkalische Phosphatase- Reagenzes zu einer raschen Absenkung der vom Hämoglobin-Deri­ vat verursachten Ausgangsextinktion, so daß zu Beginn des Meß­ intervalls (Meßpunkt 30) auch bei dem auf 2000 mg/dl mit DClHb aufgestockten Serum eine Anfangsextinktion von weniger als 0,2 erreicht wird. Eine der Farbbildung aus dem chromoge­ nen Substrat im Meßintervall evtl. noch unterlagerte weitere Hämoglobin-Ausbleichung läßt sich durch Mitführen eines sepa­ raten Reaktionsansatzes mit chromogenfreiem R2 (= R1 aus dem Grundreagenz) ermitteln und bei der Berechnung der AP-Aktivi­ tät in Korrektur bringen (Kurven 1′-4′ der Abb. 2).
1.4.2. Alkalische Phosphatase-Wiederfindung
In nachfolgender Tabelle sind die Daten zur Wiederfindung der Alkalischen Phosphatase in dem mit unterschiedlichen DClHb- Mengen aufgestockten Serum-Pool bei Verwendung (a) des her­ kömmlichen AP-Reagenzes und (b) des mit H₂O₂ in R1 versetzten AP-Reagenzes aufgelistet:
Aus der Tabelle ist zu ersehen, daß die Wiederfindung der alkalischen Phosphatase mit dem herkömmlichen Analysenreagenz mit steigender Probenkonzentration an Hämoglobin-Derivat erheb­ lich abnimmt, während sie mit dem erfindungsgemäßen Peroxid- Zusatz auch bei 2000 mg DClHb/dl noch bei über 90% (Berech­ nung ohne Leerwertkorrektur) bzw. 95% (Berechnung mit Leer­ wertkorrektur) liegt.
Identische Ergebnisse werden auch erhalten, wenn der Serumpool anstelle von DClHb mit dem Hämoglobin-Derivat der Fa. Somato­ gen (rekombinantes Human-Hämoglobin aus E. coli mit intramole­ kularer di-α-Fusion) aufgestockt wird.
Das Resultat ändert sich auch nicht, wenn R1 anstelle von H₂O als Peroxid Natrium-Perborat (NaBO₂·H₂O₂·3 H₂O) zugesetzt wird; z. B. wurden bei Perborat-Konzentrationen von 14,4 bzw. 28,8 mmol/l R1 (Endkonzentration im Test = 11,8 bzw. 23,6 mmol/l) folgende AP-Wiederfindungen gemessen:
Schließlich werden auch keine davon abweichenden Ergebnisse erhalten, wenn R2 zum Peroxidabbau z. B. noch Katalase zuge­ setzt wird.
Beispiel 2 Bestimmung der α-Amylase in Hämoglobinderivat-haltigem Serum 2.1. Probenmaterial
Art und Herstellung s. Beispiel 1, Punkt 1.1.
2.2. Reagenzien 2.2.1. Amylase-Grundreagenz
α-Amylase EPS liquid (Sys 2-Packung, Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 1555 693); Zusammensetzung:
2.2.2. Amylase-Reagenz mit Peroxid-Zusatz
Wie 2.2.1, nur daß R1 noch H₂O₂ auf eine Konzentration von 147 mmol/l zugesetzt wird (0,5 ml Perhydrol 30%ig pro 30 ml R1) H₂O₂-Endkonzentration im Test = 118 mmol/l).
2.3. Durchführung der Bestimmung
Die Amylase-Bestimmung wurde am Boehringer Mannheim/Hitachi 717-Analysenautomat bei 37°C mit Geräteeinstellungen gemäß der Arbeitsvorschrift der Packungsbeilage durchgeführt (10 µl Probe, 250 µl R1, 50 µl R2; Wellenlängen 700/405 nm; Meßinter­ vall 40.-50. Meßpunkt).
2.4. Ergebnisse 2.4.1. Reaktionskinetik (zeitlicher Extinktionsverlauf)
Abb. 3 zeigt den zeitlichen Extinktionsverlauf im Amylase-Test bei Verwendung des Grundreagenzes (2.2.1) und folgenden Pro­ ben:
  • - Kurve 1: 0,9% NaCl (= Reagenzleerwert)
  • - Kurve 2: Serum ohne DClHb
  • - Kurve 3: Serum mit 1000 mg/dl DClHb
  • - Kurve 4: Serum mit 2000 mg/dl DClHb.
Aus Abb. 3 ist zu ersehen, daß schon bei einer DClHb-Konzen­ tration von 1000 mg/dl im herkömmlichen Amylase-Test eine Grundextinktion von mehr als 2 erreicht wird, während bei der mit DClHb zu 2000 mg/dl aufgestockten Probe der Meßbereich des Photometers überschritten wird und somit eine Bestimmung der Amylase völlig unmöglich ist.
Dagegen führt, wie aus Abb. 4 ersichtlich (Zuordnung der ver­ schiedenen Extinktionsverläufe zum Probenmaterial wie bei Abb. 3), der Zusatz von Peroxid zu R1 des Amylase-Reagenzes zu einer raschen Absenkung der vom Hämoglobin-Derivat verursach­ ten Ausgangsextinktion, so daß zu Beginn des Meßintervalls (Meßpunkt 40) auch bei dem auf 2000 mg/dl mit DClHb aufge­ stockten Serum eine Anfangsextinktion von nur ca. 0,3 erreicht wird. Analog der AP-Bestimmung empfiehlt es sich auch hier, zur Erfassung einer weiteren Hämoglobin-Ausbleichung im Meß­ fenster einen separaten Reaktionsansatz mit chromogenfreiem R2 (= R1 aus dem Grundreagenz) mitzuführen und bei der Berechnung der Amylase-Aktivität in Korrektur zu bringen (Kurven 1′-4′ der Abb. 4).
2.4.2. Amylase-Wiederfindung
In nachfolgender Tabelle sind die Daten zur Amylase-Wieder­ findung in dem mit unterschiedlichen DClHb-Mengen aufgestock­ ten Serum-Pool bei Verwendung (a) des herkömmlichen Amylase- Reagenzes und (b) des gleichen, jedoch mit H₂O₂ in R1 versetz­ ten Amylase-Reagenzes aufgelistet:
Aus der Tabelle ist zu ersehen, daß die Amylase-Wiederfindung mit dem herkömmlichen Reagenz bei steigender DClHb-Konzentra­ tion abnimmt und bei 2000 mg/dl sogar negative Werte er­ reicht, während sie durch den erfindungsgemäßen Peroxid-Zusatz immer über 90% beträgt.
Im übrigen gelten die für die AP-Bestimmung gemachten Aussagen analog.
Beispiel 3 Bestimmung der γ-Glutamyl-Transferase (γ-GT) in Hämoglobin­ derivat-haltigem Serum 3.1. Probenmaterial
Art und Herstellung s. Beispiel 1, Punkt 1.1.
3.2. Reagenzien 3.2.1. γ-GT-Grundreagenz
Gamma-GT (Sys 2-Packung, Boehringer Mannheim GmbH, Best.-Nr. 1 489 496); Zusammensetzung:
3.2.2. γ-GT-Reagenz mit Peroxid-Zusatz
Wie 3.2.1, nur daß zu R1 noch H₂O₂ auf eine Konzentration von 147 mmol/l gegeben wird (0,5 ml Perhydrol 30%ig pro 30 ml R1) ( H₂O₂-Endkonzentration im Test = 116 mmol/l).
3.3. Durchführung der γ-GT-Bestimmung
Die γ-GT-Bestimmung wurde am Boehringer Mannheim/Hitachi 717-Ana­ lysenautomat bei 37°C mit Geräteeinstellungen gemäß der Arbeitsvorschrift der Packungsbeilage durchgeführt (15 µl Probe, 250 µl R1 50 µl R2; Wellenlängen 660/405 nm; Meßinter­ vall 30.-50. Meßpunkt).
3.4. Ergebnisse 3.4.1. Reaktionskinetik (zeitlicher Extinktionsverlauf)
Abb. 5 zeigt den zeitlichen Extinktionsverlauf im γ-GT-Test bei Verwendung des Grundreagenzes (3.2.1) und folgenden Proben:
  • - Kurve 1: 0,9% NaCl (= Reagenzleerwert)
  • - Kurve 2: Serum ohne DClHb
  • - Kurve 3: Serum mit 400 mg DClHb/dl
  • - Kurve 4: Serum mit 800 mg DClHb/dl
  • - Kurve 5: Serum mit 1200 mg DClHb/dl
  • - Kurve 6: Serum mit 1600 mg DClHb/dl
  • - Kurve 7: Serum mit 2000 mg DClHb/dl.
Aus Abb. 5 ist zu ersehen, daß schon bei einer DClHb-Konzen­ tration von 800 mg/dl im herkömmlichen γ-GT-Test eine Grund­ extinktion von mehr als 2 erreicht wird, während bei den mit DClHb auf mehr als 1600 mg/dl aufgestockten Proben der Meßbe­ reich des Photometers überschritten wird und somit von vor­ neherein keine Bestimmung der γ-GT mehr möglich ist.
Dagegen führt, wie aus Abb. 6 ersichtlich (Zuordnung der Ex­ tinktionsverläufe zu den verschiedenen Proben wie bei Abb. 5), die Anwesenheit von Peroxid in R1 des γ-GT-Reagenzes zu einer raschen Absenkung der vom Hämoglobin-Derivat verursachten Aus­ gangsextinktion, so daß zu Beginn des Meßintervalls (Meßpunkt 30) auch bei dem auf 2000 mg/dl mit DClHb aufgestockten Serum eine Anfangsextinktion von nur knapp mehr als 1 erreicht wird.
Der dem von der Umsetzung des chromogenen Substrats herrühren­ den Farbsignal noch unterlagerte weitere Hämoglobin-Ausblei­ cheffekt läßt sich auch hier, analog Beispielen 1 und 2, in einem parallelen Testansatz mit H₂O₂-haltigem R1 und mit R1 des Grundreagenzes als chromogenfreiem R2 ermitteln (Kurven 1′-7′ der Abb. 7) und bei der Berechnung für die γ-GT-Wiederfin­ dung berücksichtigen.
2.4.2. γ-GT-Wiederfindung
In nachfolgender Tabelle sind die Daten zur γ-GT-Wiederfindung in dem mit unterschiedlichen DClHb-Mengen aufgestockten Serum- Pool bei Verwendung (a) des herkömmlichen γ-GT-Reagenzes und (b) des mit H₂O₂ in R1 versetzten γ-GT-Reagenzes aufgelistet:
Aus der Tabelle ist zu ersehen) daß die γ-GT-Wiederfindung mit dem herkömmlichen Reagenz mit steigender DClHb-Konzentration sehr schnell absinkt und bereits ab 600 mg/dl sogar negative Werte annimmt, während sie beim Reagenz mit dem erfindungs­ gemäßen Peroxid-Zusatz immer 90% beträgt.
Bezüglich der Ergebnisse mit dem Hämoglobinderivat der Fa. Somatogen, dem Einsatz von Natrium-Perborat anstelle von H₂O₂ sowie dem fakultativen Zusatz von Katalase zu R2 gelten im übrigen die für die AP-Bestimmung gemachten Angaben analog.

Claims (22)

1. Verfahren zur Beseitigung oder/und Verminderung von Stö­ rungen, die durch Anwesenheit von freiem Hämoglobin her­ vorgerufen werden, bei der Bestimmung eines Analyten in einer Probe durch optische Messung, dadurch gekennzeichnet, daß man dem zur Bestimmung des Analyten verwendeten Rea­ genz oder einem Teil davon eine oder mehrere peroxidische Verbindungen zusetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man anorganische peroxidische Verbindungen verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die peroxidischen Verbindungen ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus H₂O₂ und Perboraten.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß man die optische Messung bei mindestens einer Meßwel­ lenlänge durchführt, bei der Hämoglobin eine Absorption aufweist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die optische Messung bei Meßwellenlängen von 380-450 nm oder/und 520-590 nm durchführt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Analyten bestimmt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus α-Amylase, Alkalischer Phosphatase und γ-Glutamyl-Transferase.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Endkonzentration der peroxidischen Verbindungen im Testansatz 1-500 mmol/l bezogen auf den Gehalt an O₂2- beträgt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Endkonzentration 5-200 mmol/l beträgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Einwirkungszeit der peroxidischen Verbindungen auf die Probe vor der Messung mindestens 1 Minute be­ trägt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung als Mehr-Schritt-Test durchgeführt wird, wobei der Probe mindestens zwei Teilreagenzien zu unterschiedlichen Zeitpunkten zugesetzt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die peroxidischen Verbindungen mit dem ersten Teil­ reagenz zugesetzt werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe bestimmt, die ein Blutersatzmittel enthält.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung an einer Serum- oder Plasmaprobe durchgeführt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung in einem Analyseautomaten durch­ führt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß man das bei der Analytenbestimmung erhaltene Meßsi­ gnal einer Leerwertkorrektur unterzieht.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man vom Meßsignal den kinetischen Leerwert abzieht.
17. Reagenzienkit zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe durch optische Messung, dadurch gekennzeichnet, daß er neben den zur Analytbestimmung erforderlichen Komponenten mindestens eine peroxidische Verbindung zur Beseitigung oder/und Verminderung von Störungen, die durch freies Hämoglobin hervorgerufen werden, enthält.
18. Reagenzienkit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß er aus mindestens zwei räumlich voneinander getrenn­ ten Teilreagenzien besteht, wobei ein Teilreagenz die peroxidische Verbindung und das oder die anderen Teilrea­ genzien weitere Testkomponenten enthalten.
19. Reagenzienkit nach Anspruch 17 oder 18, zur Bestimmung von α-Amylase, umfassend ein erstes Teilreagenz, das eine peroxidische Verbindung enthält, ein zweites Teilreagenz, das einen geeigneten Puffer und gegebenenfalls ein α-Amy­ lase-Hilfsenzym oder/und einen Antikörper enthält, und ein weiteres Teilreagenz, das ein chromogenes α-Amyla­ sesubstrat enthält.
20. Reagenzienkit nach Anspruch 17 oder 18, zur Bestimmung von Alkalischer Phosphatase, umfassend ein erstes Teil­ reagenz, das eine peroxidische Verbindung enthält, ein zweites Teilreagenz, das einen geeigneten Puffer enthält und ein weiteres Teilreagenz, das ein chromogenes Sub­ strat der Alkalischen Phosphatase enthält.
21. Reagenzienkit nach Anspruch 17 oder 18 zur Bestimmung von γ-Glutamyl-Transferase, umfassend ein erstes Teilreagenz, das eine peroxidische Verbindung enthält, ein zweites Teilreagenz, das einen geeigneten Puffer enthält und ein weiteres Teilreagenz, das ein chromogenes Substrat der γ-Glut­ amyl-Transferase enthält.
22. Verwendung von peroxidischen Verbindungen zur Beseitigung oder/und Verminderung von Störungen, die durch freies Hämoglobin hervorgerufen werden, bei der Bestimmung eines Analyten in einer Probe.
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