DE2701415A1

DE2701415A1 - Diagnostischer reagenziensatz zur bestimmung von harnsaeure

Info

Publication number: DE2701415A1
Application number: DE19772701415
Authority: DE
Inventors: Karl Artur Kovac; Hildegard Metzger
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1976-01-15
Filing date: 1977-01-14
Publication date: 1977-07-21
Also published as: GB1524731A; FR2338494A1; FR2338494B1

Description

DR. BERG DIPl.-ING. STAPF DIPL-ING. SCHWABE DR. DR. SANDMAIR

8 MÜNCHEN 86, POSTFACH 8602 45

Anwaltsakte 27 667 1Ί. Januar 1977

THE WELLCOME FOUNDATION LIMITED LONDON, NWl / GROSSBRITANNIEN

Diagnostischer Reagenziensatz zur Bestimmung von Harnsäure

Die Erfindung betrifft ein Bestimmungsverfahren zur Feststellung von Harnsäure in Flüssigkeiten; insbesondere betrifft sie einen diagnostischen Reagenziensatz für eine Farbreaktion, die mit einem Standardkolorimeter gemessen werden kann.

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9133IO TELEX: 0524 560 BERG d Postscheck München 65343-808

Der Körper eines gesunden Erwachsenen enthält etwa 1,1 g Harnsäure. Nur etwa ein Sechstel davon ist im Blutplasma enthalten, der Rest befindet sich in anderen Geweben. Der normale Blutharnsäurespiegel gesunder Männer liegt daher unter 6,5 mg/100 ml, der gesunder Frauen unter 6,0 mg/100 ml. Höhere als diese Harnsäurespiegel können ein Anzeichen dafür sein, daß der Patient an Gicht oder zumindest einer verringerten Nierenfunktion leidet und Behandlung benötigt.

Eine genaue Messung des Harnsäurespiegels ist äußerst schwierig, da in Flüssigkeiten wie Serum oder Urin viele Stoffe enthalten sind, die in den Bestimmungsverfahren irrtümlich für Harnsäure gehalten werden können. Diese Stoffe führen in den Tests dann fälschlicherweise zu hohen Harnsäurewerten. Genaue Harnsäurebestimmungen sind jedoch wesentlich, um die Grenzfälle mit beeinträchtigter Nierenfunktion feststellen zu können.

Einer der heute allgemein angewandten Tests zur Bestimmung von Harnsäurespiegeln in Körperflüssigkeiten wie Serum oder Urin basiert auf der Reaktion von Harnsäure in alkalischer Lösung mit Phosphorwolframsäure, wobei eine blaue Farbe oder ein Chromophor erzeugt wird. Die Tiefe der so erzeugten Farbe ist proportional zur Harnsäurekonzentration in der Flüssigkeit. Die meisten Formen dieser Testart haben jedoch den wesentlichen Nachteil, daß alle im Serum enthaltenen Proteine ausge-

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fällt und mittels langwieriger Filtration oder Zentrifugierung vor dem Zusatz des Reagenzmittels entfernt werden müssen, um Chromophorbildung aus den Proteinen selbst zu verhindern und um zu vermeiden, daß durch die Reaktion dieser Proteine mit den verwendeten Reagenzien eine Trübung entsteht. Diese Vorarbeiten sind sehr zeitraubend, ferner sind die Tests nicht spezifisch, da andere reduzierende Stoffe mit einigen der für diesen Zweck vorgeschlagenen Reagenzien störend reagieren.

Von Bulger & Johns (J. Biol. Chem. (1941), ItO, M-27) wurde vorgeschlagen, daß durch die Verwendung des Enzyms Uricase zur spezifischen Zerstörung der Harnsäure in einer Testflüssigkeit die Genauigkeit und Spezifität der Messung verbessert werden kann. Der Test sieht noch immer die Ausfällung des Proteins aus der Flüssigkeit und die anschließende Phosphorwolframsäurereaktion mit der Probe vor, nachdem diese halbiert wurde. Eine Hälfte war zur Zerstörung der vorhandenen Harnsäure mit Uricase vorbehandelt worden. Die erzeugte Differenz im Grad der Färbung wurde der Menge der vorhandenen Harnsäure gleichgesetzt. _%

Die Verwendung von uricase in Tests mit einer Farbreaktion, die beispielsweise durch Reaktion mit Arsenphosphorwolframat hervorgerufen wird, wurde von Henry in "Clinical Chemistry Principles & Techniques" (Harper & Row 1967) scharf kristisiert. Die Zuversässigkeit des

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Tests wurde auf Grund der Anwesenheit von Glucose und Gentisinsäure angezweifelt, die beide in den mit Enzym beziehungsweise nicht mit Enzym behandelten Proben ungleich reagieren.

Die Systeme, die Phosphor wolf ramat verwenden, sind zwar im Handel, ihre Spezifität und Genauigkeit sind aber begrenzt. Fearon publizierte in Biochem. J. (1944), ^JJ, 399, daß, wenn man eine verdünnte Harnsäurelösung durch Zusatz eines geeigneten Puffers leicht alkalisch macht und sie mit zwei oder drei Tropfen einer sehr verdünnten Lösung von 2,6-Dichlorchinonchlorimid behandelt, das Gemisch rasch eine leuchtend gelbe Farbe entwickelt. Fearon verwendet diese Reaktion zur Feststellung von Harnsäure im Urin; es gibt jedoch einige im Urin gelöste Stoffe, die die Reaktion stören können, zum Beispiel Aminoverbindungen wie Kreatin, Thiole wie Cystein und reduziertes Glutathion, und freie Phenole. Es wird zwar vorgeschlagen, die Wirkung dieser Störstoffe durch Verdünnung des Urins 1:50 auszuschalten, die Urinzusammensetzung variiert jedoch im Laufe des Tages und man kann sich nicht darauf verlassen, daß die Wirkung der Störstoffe durch die Verdünnung vollständig beseitigt wird. Aus diesem Grund wurde das Verfahren nie unter die in vielen Ländern handelsüblichen Testsysteme aufgenommen, obwohl während der letzten Jahrzehnte eine beträchtliche Nachfrage danach bestand.

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Nunmehr wurde ein Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure gefun den, bei dem eine Probe der Testflüssigkeit in zwei gleiche Teile geteilt, ein Teil mit dem Enzym Uricase zur Herstellung einer "Kontrolle" behandelt, und dann beiden Teilen eine kleine Menge 2,6-Dichlorchinonchlorimid zugegeben wird. Dieses Ver fahren ergibt außerordentlich gute Resultate, wenn die Farbreaktion kolorimetrisch bestimmt wird. Da die Störstoffe sowohl in der "Testhälfte" wie in der "Kontrollhälfte" mit dem Indikator eine Farbe bilden, entfällt eine Wirkung dieser Stoffe und der Harnsäurespiegel kann mit einem überraschenden Grad an Genauigkeit und Zuverlässigkeit ermittelt werden, indem man den Wert der "Kontrolle" von dem Wert der "Testhälfte" abzieht.

Die Erfindung betrifft deshalb ein Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure in Flüssigkeiten unter alkalischen Bedingungen, bei dem eine Testprobe halbiert, einem Teil eine ausreichende Menge Uricase, und beiden Teilen ein Überschuß an 2,6-Dichlorchinonchlorimid zugemischt wird. Die Harnsäurekonzentration wird bestimmt, indem man die Extinktion der erhaltenen Farbe mißt und die Harnsäurekonzentration in der Probe mit Hilfe der Differenz zwischen der erhaltenen Extinktion und der Extinktion einer bekannten Harnsäurekonzentration berechnet.

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Harnsäure ist im Blutplasma gesunder Personen in Konzentrationen von 6-7 mg/100 ml vorhanden. Das Ablesen des Endwertes in dem Test wird durch das Vorhandensein von roten Blutkörperchen behindert und es ist deshalb wesentlich, daß diese entfernt und Serum oder Plasma verwendet werden. Im allgemeinen werden 0,05 bis 0,2 ml Plasma benötigt, wenn ein Kolorimeter mit 2 ml-Küvetten zur Verfügung steht. Wahlweise kann auch Urin zum Testen hoher Harnsäurespiegel verwendet werden. Es ist wichtig, einen genauen Harnsäuretest zu besitzen, so daß die aus dem Urin verfügbare Harnsäure leicht bestimmt werden kann.

Die zu testende Flüssigkeitsprobe wird vorzugsweise in zwei gleiche Teile geteilt und durch Zusatz eines Puffers auf einen alkalischen pH eingestellt. Der ph des Puffers liegt vorzugsweise bei 8 bis 10, besser bei 9 bis 10. Der Puffer enthält vorzugsweise Borsäure, da in ihrer Gegenwart die Enzymreaktion schneller abläuft. Chloridionen, beispielsweise Natriumoder Kaliumchlorid, können in den Puffer aufgenommen werden, um die Dechlorierung des Indikators 2,6-Dichlorchinonchlorimid durch Hydrolyse zu verhindern.

Nachdem jeder Hälfte der Testflüssigkeit geeignete Puffermengen zugesetzt worden sind, wird einem Teil, nachfolgend als "Kontrolle" bezeichnet, Uricase zugesetzt, um so die Menge

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aller Störstoffe in der Flüssigkeit festzustellen und die Ergebnisse entsprechend zu berichtigen. Die Aktivität des verwendeten Enzyms Uricase kann bei 1 bis 20 Einheiten/100 ml, vorzugsweise bei 2 Einheiten/100 ml liegen.

Um das Volumen des der "Kontrolle" zugegebenen Enzyms Uricase auszugleichen« kann dem anderen Teil, der nachfolgend als "Testhälfte" bezeichnet wird, eine gleiche Menge eines Ausgleichsstoffes zugesetzt werden, zum Beispiel 50%iges Glyzerin, 1/15 mol/1 Glycinpuffer oder konzentrierte Ammoniumsulfatlösung.

Der Inhalt jedes Reagenzglases wird gründlich gemischt und 10 bis 30 Minuten bei Zimmertemperatur gehalten. Danach werden einige Tropfen, etwa 20 μΐ, einer 0,3 bis 0,5%igen Lösung, vorzugsweise einer 0,4%igen Lösung, von 2,6-Dichlorchinonchlorimid in einem geeigneten Lösungsmittel wie Alkohol, Isopropanol oder Aceton, zugegeben und gründlich gemischt.

Um die Extinktion der Probe bei einer Wellenlänge von 4 30 bis 440 nm, vorzugsweise bei 4 36 nm, festzustellen, wird zunächst die "Kontrolle" in das Kolorimeter gebracht und das Gerät für die"Kontrolle" auf Null eingestellt. Anschließend wird die "Testhälfte" in das Gerät gebracht und die Extinktion abgelesen, was die Extinktion der Probe ergibt.

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Für die Routineanalyse können Standardseren, die bekannte Harnsäuremengen enthalten, zur Berechnung der Harnsäurekonzentration verwendet werden. Das Standardserum muß genau wie die Probe behandelt werden. Die Extinktion des Standards wird auf gleiche Weise wie die der Probe erhalten, d.h. indem man für die Standard-"Kontrolle" das Gerät auf Null einstellt.

Sind keine Standardseren verfügbar, dann können Harnsäurestandards hergestellt werden, indem man Albumin bis zu einer Konzentration zufügt, die der des normalen menschlichen Serums entspricht, nämlich 4,2 g/100 ml. Normale physiologische Abweichungen in den Albuminkonzentrationen im Bereich von - 0,3 g/100 ml beeinflussen die Ergebnisse nicht. Wahlweise kann die Konzentration des Harnsäurestandards für die Testzwekke angepaßt werden, um die Wirkung des Serums zu kompensieren.

Zur Berechnung der Harnsäurekonzentration in der Probe wird die folgende Gleichung verwendet:

Harnsäurekonzentration = Extinktion Probe χ Konzentration in der Probe Extinktion Standard Standard

Zur Verwendung in dem Test kann eine Pufferzubereitung, vorzugsweise in konzentrierter Form, zum Beispiel in einem Glasoder Plastikbehälter bereitgestellt werden, ebenso das Ausgleichsmaterial und das Enzym Uricase. Ferner kann eine Zubereitung von 2,e-Dichlorchinonchlorimid in einem Behälter, sowie ein Harnsäurestandard und Anweisungen zur Durchführung

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der Bestimmung bereitgestellt werden. Alle wesentlichen Bestandteile für die Bestimmung von Harnsäure in Flüssigkeiten können in einem Kasten oder Behälter angeboten und verpackt werden. Eine derartige Zusammenstellung von Puffer, Uricase, Glycerin, Indikator, Harnsäurestandard und Anweisungen, sowie weiteren wahlweisen Komponenten und Hilfsmitteln fällt in den Bereich der Erfindung und stellt einen Reagenziensatz dar.

Da der Indikator 2,6-Dichlorchinonchlorimid nur verhältnismässig kurze Zeit stabil ist, kann die Aufnahme eines Stabilisators in die Lösung notwendig sein.

Die Erfindung betrifft ferner einen Reagenziensatz zur Feststellung von Harnsäure in Flüssigkeiten, der aus drei Behältern besteht. Der erste enthält einen Puffer, der zweite eine Uricasezubereitung, der dritte eine 2,6-Dichlorchinonchlorimid-Zubereitung; dazu kommt noch eine Gebrauchsanweisung.

Vorzugsweise enthält der Satz außerdem einen Harnsäure-Standard Alle oder einige Bestandteile des Satzes können in Tablettenform oder gefriergetrocknet vorliegen.

Der Vorteil dieser Bestimmungsmethode liegt darin, daß sie im Vergleich zu anderen enzymatischen Methoden schnell und einfach und sehr spezifisch ist. Für den Test wird nur ein billiges Gerät, nämlich ein Kolorimeter zur Bestimmung der Farbe

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im sichtbaren Licht benötigt, und im Gegensatz zu anderen kolorimetrischen Verfahren entfällt das Ausfällen von Proteinen. Aus diesem Grund wird auch keine Zentrifuge benötigt. Durch die parallele Bestimmung der Störstoffe und die Verwendung des Indikators 2,6-Dichlorchinonchlorimid wurde ein unerwartet genauer Harnsäuretest gefunden, der auch leicht einer automatischen Durchführung, z.B. in einem Autoanalyser, angepaßt werden könnte. Die Harnsäure kann auch aus anderen als Körperflüs sigkeiten stammen.

Beispiel 1

Herstellung von Reagenzien

a) Pufferkonzentrat

3,0915 g Borsäure, 3,72 8 g Kaliumchlorid und 50,0 g Natriumchlorid wurden in 219,5 ml 0,1 N Natronlauge gelöst und mit destilliertem Wasser auf 500 ml aufgefüllt, was ein Pufferkonzentrat mit pH 9,3 ergab.

b) Endgültiger Puffer

1. Puffer 1 (für Kontrollen)

0,5 ml Uricase 10 Einheiten/ml (von Böhringer Mannheim GmbH) wurden zu 20,0 ml Pufferkonzentrat gegeben und grundlich gemischt. Das Gemisch wurde mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

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2. Puffer 2 (für Proben)

0,5 ml 50%iges Glycerin wurden zu 20,0 ml Pufferkonzentrat gegeben und gründlich gemischt. Das Gemisch wurde mit destil liertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

c) Harnsäurelösung 1 (100 mg/100 ml)

100 mg Harnsäure und 80 mg Lithiumcarbonat wurden bei 60 ⁰C in 15 ml destilliertem Wasser gelöst und nach Abkühlen auf Zimmertemperatur mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt. Diese Zubereitung ist eine Woche stabil.

d) Harnsäurestandard (6 mg/100 ml)

6,0 ml Harnsäurelösung 1, siehe oben, werden mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt. 210 mg Rinderserumalbumin wurden in 5 ml dieser Lösung aufgelöst.

e) Farbreagenz

UO mg 2,6-Dichlorchinonchlorimid (Merck, Art.Nr. 3037) wurden in 10,0 ml absolutem Äthanol gelöst, was eine 0,4%ige Lösung ergab. Die Lösung ist in einer braunen Flasche im Kühlschrank eine Woche stabil.

Beispiel 2 Bestimmungsverfahren Einem gichtverdächtigen Patienten wurde ein Aliquot Blut ent-

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nommen, das bis zur Gerinnung stehen blieb. Das Serum wurde abpipettiert.

Jeweils 0,1 ml Serum wurden in zwei Reagenzgläser pipettiert. In eines der Gläser wurden 2,0 ml des Puffers 1 (Uricase) gegeben und so die "Kontrolle" hergestellt, in das andere wurden 2,0 ml des Puffers 2 gegeben und die "Testhälfte" hergestellt. Der Inhalt jedes Glases wurde gründlich gemischt und 15 Minuten bei Zimmertemperatur gehalten.

In gleicher Weise wurden jeweils 0,1 ml Harnsäurestandard in zwei Reagenzgläser pipettiert. Aus dem Standard wurden eine "Kontrolle" und eine "Testhälfte" hergestellt, wie oben für die Serumprobe beschrieben, und 15 Minuten stehen gelassen.

Nach dieser Zeit wurden jedem der Gläser 0,02 ml einer 0,4%igen Lösung von 2,e-Dichlorchinonchlorimid zugegeben und gründlich gemischt. Genau 2 Minuten nach dem Zusetzen des Indiaktors wurde die "Kontrolle" in das Kolorimeter gegeben und das Gerät bei einer Wellenlänge von 436 nm auf Null eingestellt. Die "Kontrolle" wurde dann durch die "Testhälfte" ersetzt und die Extinktion abgelesen, was E_p , ergab. Dieses Verfahren wurde mit dem Harnsäurestandard wiederholt und ergab

E_CJ- λ λ' Die Harnsäurekonzentration im Blut des Patienten standard

wurde wie folgt berechnet:

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Harnsäure-	Probe
konzentration	Γ Standard
Beispiel 3

χ Konzentration des Standard

Ein Reagenziensatz zur Bestimmung von Harnsäure in Flüssigkeiten, insbesondere in Körperflüssigkeiten, wird aus drei Flaschen zusammengestellt, von denen die erste Pufferkonzentrat gemäß Beispiel 1 a), eine zweite Uricase und eine dritte Harnsäurelösung 1 gemäß Beispiel Ic) enthält. Dazu kommen eine braune Glaswasserflasche mit einer Lösung von 2,6-Dichlorchinonchlorimid gemäß Beispiel 1 e) und Gebrauchsanweisungen gemäß Beispiel 2.

Der Satz kann wahlweise noch eine fünfte Flasche mit 50%iger Glycerinlösung enthalten.

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Claims

Patentansprüche :

1.)Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure in Flüssigkeiten unter alkalischen Bedingungen, dadurch gekennzeichnet , daß eine Probe der Testflüssigkeit in zwei Hälften, d.h. eine "Kontrolle" und eine
"Testhälfte" geteilt wird, der "Testhälfte" eine ausreichende Uricasemenge zur Umwandlung der darin enthaltenen Harnsäure zu Allantoin zugemischt, und beiden Teilen ein Überschuß an 2,6-Dichlorchinonchlorimid zugegeben wird,
ferner die Harnsäurekenzentration durch Messen der Extinktion der erhaltenen Färbung bei einer für Harnsäure charakteristischen Wellenlänge bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Testflüssigkeit Serum, Plasma oder Urin ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge kennzeichnet , daß der Testflüssigkeit ein
Puffer mit einem pH von 8 bis 10 zugegeben wird.

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ORIGINAL INSPECTED

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4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß der Puffer Borsäure enthält.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität der Uricase 1 bis 20 Einheiten/100 ml beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekenn zeichnet, daß die Aktivität der Uricase 2 Einheiten/100 ml beträgt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das 2,6-Dichlorchinonchlorimid in einem geeigneten Lösungsmittel zu einer 0,3 bis 0,5%igen Lösung gelöst wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, d a durch gekennzeichnet, daß die erhaltene Färbung durch Messen der Extinktion bei einer Wellenlänge zwischen 430 und 440 nm berechnet wird.

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9. Reagenziensatz zur Bestimmung von Harnsäure in Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß er aus drei Behältern besteht, von denen der erste eine Pufferzubereitung, der zweite Uricase und der dritte eine 2,6-Dichlorchinonchlorimidzubereitung enthält, dazu die oben beschriebenen Gebrauchsanweisungen.

10. Reagenziensatz nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß der Puffer einen pH von 8 bis 10 hat.

11. Reagenziensatz nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet , daß der Puffer Borsäure enthält.

12. Reagenziensatz nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität der Uricase 1 bis 20 Einheiten/100 ml beträgt.

13. Reagenziensatz nach Anspruch 12, dadurch ge kennzeichnet , daß die Aktivität der Uricase 2 Einheiten/100 ml beträgt.

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-Tf-

14. Reagenziensatz nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das 2,6-Dichlorchinonchlorimid in einem geeigneten Lösungsmittel zu einer 0,3 bis 0,5%igen Lösung gelöst wird.

15. Reagenziensatz nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß er
einen vierten Behälter mit Harnsäurestandard enthält.

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