CN114235522B - 一种检测植物中酰脲含量和尿囊酸含量的试剂盒及其方法 - Google Patents

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Abstract

一种检测植物中酰脲含量和尿囊酸含量试剂盒及其应用，解决了现有检测植物中酰脲和尿囊酸的方法步骤繁杂、检测结果误差大的问题。检测植物中酰脲含量的试剂盒由提取液、水解液A、水解液B、反应试剂A、反应试剂B、反应试剂C、标准品和反应板组成。方法：利用所述的酰脲含量的试剂盒进行检测。检测植物中尿囊酸含量试剂盒由提取液、水解液C、反应试剂A、反应试剂B、反应试剂C、标准品和反应板组成；方法：利用所述的尿囊酸含量的试剂盒进行检测。本发明使用反应板使得本发明的检测更加便捷，时间上能达成一致，重复性好，准确度高，从而高效地测定植物体内酰脲、尿囊酸含量，解决了现有方法中存在的步骤繁杂、检测结果误差大的问题。

Description

一种检测植物中酰脲含量和尿囊酸含量的试剂盒及其方法
技术领域
本发明涉及一种检测酰脲、尿囊酸含量的试剂盒及其应用。
背景技术
酰脲主要是由尿囊素(Allantoin)分子式为C4H6N4O3和尿囊酸(Allantoic acid)分子式为C4H8N4O4两种物质组成，是豆科作物根瘤菌固氮的最初产物。依赖于共生固氮的植株，所固定的氮素主要转化为酰脲，并以此作为氮素的运输形式。根瘤是产生酰脲的主要器官，在根瘤中首先合成嘌呤，然后这些新合成的物质发生降解，最后产生酰脲。大豆籽粒中的酰脲也是在大豆根瘤中合成，通过大豆茎运输到大豆荚皮，在荚皮中酰脲降解为乙醛酸和氨基酸，将氮输送到大豆籽粒中。酰脲在共生固氮的大豆植株生长发育、氮素代谢及蛋白质合成中起着非常重要的作用，在一定程度上也反映了豆科植物共生固氮的能力。
目前有很多检测植物中酰脲和尿囊酸的方法，传统检测的方法普遍存在着配置试剂步骤繁杂，测试结果不准确等问题；而现有的试剂盒在操作过程中难以在时间上控制一致，从而产生较多误差。
发明内容
本发明为了解决现有检测植物中酰脲和尿囊酸的方法步骤繁杂、检测结果误差大的问题，而提供了一种检测植物中酰脲含量和尿囊酸含量的试剂盒及其方法。
本发明检测植物中酰脲含量的试剂盒由提取液、水解液A、水解液B、反应试剂A、反应试剂B、反应试剂C、标准品和反应板组成，其中所述提取液是pH＝7、0.1mol/L的磷酸缓冲液、水解液A是浓度为0.75mol/L的盐酸溶液，水解液B是浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液，反应试剂A是盐酸苯肼粉剂，反应试剂B是浓度为20g/L铁氰化钾溶液，反应试剂C是质量分数为36％浓盐酸，标准品是1mmol/L尿囊素标准液，反应板是连排管带盖的反应板。
上述试剂盒检测酰脲含量的方法：将待测样品按重量份数比为1:10-20的比例与所述检测酰脲含量的试剂盒中的提取液混合，于100℃水浴中萃取5min，以4000rpm/min离心15min，去沉淀留上清液，获得含有酰脲提取液；取含有酰脲提取液置于反应板中，加入水解液A，于100℃水浴萃取7min，冷却室温后，再加入水解液B，于100℃水浴萃取7min，然后加入由反应试剂A配置的浓度为5g/L的反应试剂A溶液，沸水浴2min，冷却室温后于冰水浴上反应30min，再加入反应试剂B，摇匀后加入反应试剂C，于冰水浴上反应30min，获得酰脲测定液；对照组不加热，且水解液A与水解液B用蒸馏水代替；
将所述测定液在波长535nm处，读取吸光度值OD，根据以下公式计算样品中酰脲的含量：
Figure BDA0003398475980000021
△A1为酰脲测定管吸光值与对照管吸光值差值再带入标准曲线中计算出酰脲的含量，V1为总水解体积，Vt1为分取倍数，W为植物干重；其中，检测方法中，标准曲线的绘制如下：取尿囊素标准样品1mmol/L母液，依次稀释成0umol/L、0.025umol/L、0.05umol/L、0.1umol/L、0.25umol/L的溶液，测定方法与酰脲测定方法一致，上机测定，读取吸光值，并绘制标准曲线。
本发明检测植物中尿囊酸含量试剂盒由提取液、水解液C、反应试剂A、反应试剂B、反应试剂C、标准品和反应板组成；所述提取液是pH＝7、0.1mol/L的磷酸缓冲液，水解液C是浓度为0.25mol/L的盐酸溶液，反应试剂A是盐酸苯肼粉剂，反应试剂B是浓度为20g/L铁氰化钾溶液，反应试剂C是质量分数为36％的浓盐酸，标准品是1mmol/L尿囊素标准液，反应板是连排管带盖的反应板。
所述试剂盒检测尿囊酸含量的方法：将待测样品按照重量份数比为1:10～20的比例与所述检测的尿囊酸试剂盒中的提取液混合，于100℃水浴中萃取5min，以4000rpm/min离心15min，去沉淀留上清液，获得含有尿囊酸提取液；取含有尿囊酸提取液置于反应板中，加入水解液C，于100℃水浴萃取7min，冷却室温后，再加入由反应试剂A配置的浓度为5g/L的反应试剂A溶液，于冰水浴上反应30min，然后再加入反应试剂B，摇匀后加入反应试剂C，于冰水浴上反应30min，获得尿囊酸测定液；对照组不加热，且水解液C用蒸馏水代替。
将所述测定液在波长535nm处，读取吸光度值OD，根据以下公式计算样品中尿囊酸的含量：
Figure BDA0003398475980000022
△A2为尿囊酸测定管吸光值与对照管吸光值差值再带入标准曲线中计算出尿囊酸的含量，V2为总水解体积，Vt2为分取倍数，W为植物干重；其中，检测方法中，标准曲线的绘制如下：取尿囊素标准样品1mmol/L母液，依次稀释成0umol/L、0.025umol/L、0.05umol/L、0.1umol/L、0.25umol/L的溶液，测定方法与酰脲测定方法一致，上机测定，读取吸光值，并绘制标准曲线。
本发明的试剂盒在检测酰脲含量和尿囊酸含量时采用的是微量法，试剂盒中的水解液A、水解液B、水解液C分别将植物中酰脲、尿囊酸水解成乙醛酸，水解后与反应试剂A结合转化成苯胺，再与反应试剂B、反应试剂C生成红色的络合物，该络合物在535nm处有最高吸收峰，确定酰脲、尿囊酸的含量。本发明的试剂盒豆科植物酰脲含量以及尿囊酸含量是检测中对反应时间要求较为严格，在对各组样品进行加热时，水浴时间要保证能达到一致，反应板中加完反应试剂后，待水温升到100℃时，样品放进去和取出时都存在一个先后顺序，利用本发明反应板，可以在同一时间点将样品放进水中加热以及能在同一时间点将样品从沸水浴中取出。本发明使用反应板使得本发明的检测更加便捷，时间上能达成一致，重复性好，准确度高，从而高效地测定植物体内酰脲、尿囊酸含量。
附图说明
图1是实施例1的标准曲线图；
图2是实施例2的标准曲线图；
图3是实施例3的标准曲线图；
图4是实施例4的标准曲线图；
图5是本发明反应板的示意图；
图6是反应板中单管的示意图；
图7是反应板的实物图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式检测植物中酰脲含量的试剂盒由提取液、水解液A、水解液B、反应试剂A、反应试剂B、反应试剂C、标准品和反应板组成，其中所述提取液是pH＝7、0.1mol/L的磷酸缓冲液、水解液A是浓度为0.75mol/L的盐酸溶液，水解液B是浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液，反应试剂A是盐酸苯肼粉剂，反应试剂B是浓度为20g/L铁氰化钾溶液，反应试剂C是质量分数为36％浓盐酸，标准品是1mmol/L尿囊素标准液，反应板是连排管带盖的反应板。
本实施例中的反应试剂A在检测前提前3小时进行配制成液体使用，即配制成浓度为5g/L的盐酸苯肼溶液进行使用。
本实施例中反应试剂C在检测前至少提前在冰水浴上预冷30min以上。
本实施方式中的反应板的示意图如图5所示，图中1表示单管，2表示卡带，3表示卡扣，图6是反应板中单管的示意图，其中1-1表示管盖，1-2表示空管(容积2mL)，图7是反应板是实物图。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：反应板是8*12*2ml连排管带盖的反应板。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式一所述的试剂盒检测酰脲含量的具体方法：将待测样品按照重量份数比为1:10～20的比例与具体实施方式一中所述酰脲试剂盒中的提取液(V提)混合，于100℃水浴中萃取5min，以4000rpm/min离心15min，去沉淀留上清液，获得含有酰脲提取液；取上清液置于反应板中，加入水解液A，于100℃水浴萃取7min，冷却室温后，再加入水解液B，于100℃水浴萃取7min，然后加入由反应试剂A配置的浓度为5g/L的反应试剂A溶液，沸水浴2min，冷却室温后于冰水浴上反应30min，再加入反应试剂B，摇匀后加入反应试剂C，于冰水浴上反应30min，获得酰脲测定液；对照组不加热，且水解液A与水解液B用蒸馏水代替。
将所述测定液在波长535nm处，读取吸光度值OD，根据以下公式计算样品中酰脲的含量：
Figure BDA0003398475980000041
△A1为酰脲测定管吸光值与对照管吸光值差值再带入标准曲线中计算出酰脲浓度，V1为总水解体积(加入到反应板中的提取液与水解液A和水解液B的总体积是V1)，Vt1为分取倍数(反应用的提取液体积/总提取液体积V提为分取倍数Vt1)，W为植物干重；其中，检测方法中，标准曲线的绘制如下：取尿囊素标准样品1mmol/L母液，依次稀释成0umol/L、0.025umol/L、0.05umol/L、0.1umol/L、0.25umol/L的溶液，测定方法与酰脲测定方法一致，上机测定，读取吸光值，并绘制标准曲线。
本实施方式中所述的反应试剂A溶液在检测前3小时配置完成，反应试剂C先置于冰水浴上，预冷后使用。
具体实施方式四：本实施方式检测植物中尿囊酸含量试剂盒由提取液、水解液C、反应试剂A、反应试剂B、反应试剂C、标准品和反应板组成；所述提取液是pH＝7、0.1mol/L的磷酸缓冲液，水解液C是浓度为0.25mol/L的盐酸溶液，反应试剂A是盐酸苯肼粉剂，反应试剂B是浓度为20g/L铁氰化钾溶液，反应试剂C是质量分数为36％的浓盐酸，标准品是1mmol/L尿囊素标准液，反应板是连排管带盖的反应板。
本实施例中的反应试剂A在检测前至少提前3小时进行配制成液体使用，即配制成浓度为5g/L的盐酸苯肼溶液进行使用。
本实施例中反应试剂C在检测前至少提前冰水浴上预冷30min以上。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：反应板是8*12*2ml连排管带盖的反应板。
具体实施方式六：具体实施方式四的试剂盒进行尿囊酸含量测定的具体方法：将待测样品按照重量份数比为1:10～20的比例与具体实施方式四中所述尿囊酸试剂盒中的提取液(V提)混合，将样品与具体实施方式四的试剂盒中的提取液混合后，于100℃水浴中萃取5min，以4000rpm/min离心15min，获得含有尿囊酸提取液，离心取上清液；取含有尿囊酸提取液置于反应板中(反应用的提取液体积/总提取液体积V提为分取倍数)，加入水解液C(加入到反应板中的提取液体积与水解液C体积为总水解体积V2)，于100℃水浴萃取7min，冷却室温后，再加入由反应试剂A配置的浓度为5g/L的反应试剂A溶液，于冰水浴上反应30min，然后再加入反应试剂B，摇匀后加入反应试剂C，于冰水浴上反应30min，获得尿囊酸测定液；对照组不加热，且水解液C用蒸馏水代替。
将所述测定液在波长535nm处，读取吸光度值OD，根据以下公式计算样品中尿囊酸的含量：
Figure BDA0003398475980000051
△A2为尿囊酸测定管吸光值与对照管吸光值差值再带入标准曲线中计算出尿囊酸的含量，V2为总水解体积，Vt2为分取倍数，W为植物干重。
上述检测方法中，标准曲线的绘制如下：取尿囊素标准样品1mmol/L母液，依次稀释成0umol/L、0.025umol/L、0.05umol/L、0.1umol/L、0.25umol/L的溶液，测定方法与酰脲测定方法一致，上机测定，读取吸光值，并绘制标准曲线。
本实施方式中所述的反应试剂A溶液在检测前3小时配置完成，反应试剂C先置于冰水浴上，预冷后使用。
实施例1取大豆植物作为待测样品，并对大豆中的酰脲的进行检测，具体的方法按照以下步骤进行：
一、酰脲提取
将供试样本在65℃的鼓风烘箱中烘干，研磨成粉状，过20-40目筛；按质量(g)：体积(mL)1:10～20的比例将过筛样品与提取液(V提)混合，置于100℃水浴中萃取5min，以4000rpm/min离心15min，取上清液，获得含有酰脲提取液，置于冰上待测。
二、酰脲水解
准备具体实施方式一所述的试剂盒(试剂盒由提取液、水解液A、水解液B、反应试剂A、反应试剂B、反应试剂C、标准品和反应板组成，其中所述提取液是pH＝7、0.1mol/L的磷酸缓冲液、水解液A是浓度为0.75mol/L的盐酸溶液；水解液B是浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液；反应试剂A是盐酸苯肼粉剂，反应试剂A在检测前提前3小时进行配制成液体使用，即配制成浓度为5g/L的盐酸苯肼溶液进行使用，反应试剂B是浓度为20g/L铁氰化钾溶液，反应试剂C是质量分数为36％的浓盐酸(反应试剂C先置于冰水浴上，预冷后使用)，标准品是1mmol/L尿囊素标准液和反应板组成，其中，反应板为8*12*2ml连排管带盖的反应板，取150ul含有酰脲提取液到反应板中，加入50ul水解液A，于100℃水浴萃取7min，冷却室温后，加入50ul水解液B，于100℃水浴萃取7min，冷却至室温得到水解液；
三、水解液反应
将步骤二的水解液加入50ul反应试剂A，沸水浴2min，冷却室温后于冰水浴上反应30min，再加入250ul反应试剂B，摇匀后加入50ul反应试剂C，于冰水浴上反应30min，获得酰脲测定液，对照组不加热，且水解液A与水解液B用同体积蒸馏水代替。
四、测定
酶标仪预热30min以上，调节波长至535nm，蒸馏水调零，使用排枪从反应板中吸取200ul最终反应液于96孔板中待测，将所述测定液在波长535nm处，读取吸光度值OD，根据以下公式计算样品中酰脲的含量：
Figure BDA0003398475980000061
△A1为酰脲测定管吸光值与对照管吸光值差值再带入标准曲线中计算出酰脲浓度，V1为总水解体积(加入到反应板中的提取液与水解液A和水解液B的总体积)，Vt1为分取倍数(反应用的提取液体积/总提取液体积V提)，W为植物干重；本实施例的检测方法中，标准曲线的绘制如下：取尿囊素标准样品1mmol/L母液，依次稀释成0umol/L、0.025umol/L、0.05umol/L、0.1umol/L、0.25umol/L的溶液，测定方法与酰脲测定方法一致，上机测定，读取吸光值，并绘制酰脲标准曲线，如图1所示。本实施例检测得到大豆酰脲含量为36.5umol/g组织干重。
利用本实施例方法完成两组大豆植物的酰脲测定(酰脲吸光值、酰脲对照吸光值)，每组样品测定三次，即1-1、1-2、1-3、2-1、2-2、2-3结果如表1所示。从表1可以看出，1-1、1-2、1-3的三次的△A1以及2-1、2-2、2-3的三次△A1数值比较接近，本发明的方法误差小，准确度高。
本实施例的方法在对各组样品进行加热时，水浴时间能保证达到一致，往反应板中加完反应试剂后，待水温升到100℃时，利用反应板，可以在同一时间点将样品放进水中加热以及能在同一时间点将样品从沸水浴中取出，从而避免反应时间不一致带来的误差，准确度高。
实施例2
取大豆植物作为待测样品，并对植物中的尿囊酸的检测具体的应用方法按照以下步骤进行：
一、尿囊酸提取
将供试样本在65℃的鼓风烘箱中烘干，研磨成粉状，过20-40目筛。按质量(g)：体积(mL)1:10-20的比例将过筛样品与提取液(V提)混合，置于100℃水浴中萃取5min，以4000rpm/min离心15min，取上清液，获得含有尿囊酸提取液，置于冰上待测；
二、尿囊酸水解
准备具体实施方式三所述的试剂盒(试剂盒由提取液、水解液C、反应试剂A、反应试剂B、反应试剂C、标准品和反应板；所述提取液是pH＝7、0.1mol/L的磷酸缓冲液；水解液C是0.25mol/L的盐酸溶液；反应试剂A是盐酸苯肼粉剂，反应试剂A在检测前提前3小时进行配制成液体使用，即配制成浓度为5g/L的盐酸苯肼溶液进行使用，反应试剂B是浓度为20g/L铁氰化钾溶液，反应试剂C是质量分数为36％的浓盐酸(反应试剂C先置于冰水浴上，预冷后使用)，标准品是1mmol/L尿囊素标准液和反应板组成，其中反应板为8*12*2ml连排管带盖的反应板)，取200ul含有尿囊酸提取液到反应板中，加入50ul水解液C，于100℃水浴萃取7min，冷却至室温得到水解液；
三、水解液反应
将步骤三的水解液加入50ul反应试剂A，沸水浴2min，冷却室温后于冰水浴上反应30min，再加入250ul反应试剂B，摇匀后加入50ul的反应试剂C，于冰水浴上反应30min，获得尿囊酸测定液，对照组不加热，且水解液C用同体积蒸馏水代替。
四、测定
酶标仪预热30min以上，调节波长至535nm，蒸馏水调零，使用排枪从反应板中吸取200ul最终反应液于96孔板中待测，其中，将所述测定液在波长535nm处，读取吸光度值OD，根据以下公式计算样品中尿囊酸的含量：
Figure BDA0003398475980000071
△A2为尿囊酸测定管吸光值与对照管吸光值差值再带入标准曲线中计算出尿囊酸的含量，V2为总水解体积，Vt2为分取倍数，W为植物干重，尿囊酸标准曲线如图2所示，本实施例检测得到大豆尿囊酸含量为8.5umol/g组织干重；同时，本实施例中取六组(1-1、1-2、1-3、2-1、2-2、2-3)尿囊酸定管吸光值、尿囊酸对照管吸光值，进行对比，结果如表1所示。本发明的方法在对各组样品进行加热时，水浴时间能保证达到一致，往反应板中加完反应试剂后，待水温升到100℃时，利用反应板，可以在同一时间点将样品放进水中加热以及能在同一时间点将样品从沸水浴中取出，从而避免反应时间不一致带来的误差，准确度高。
利用本实施例方法完成两组大豆植物的尿囊酸测定(尿囊酸吸光值、尿囊酸对照吸光值)，每组样品测定三次，即1-1、1-2、1-3、2-1、2-2、2-3结果如表1所示。从表1可以看出，1-1、1-2、1-3的三次△A2以及2-1、2-2、2-3的三次△A2数值比较接近，本发明的方法误差小，准确度高。
表1实施例1和实施例2的测定结果
Figure BDA0003398475980000081
实施例3现有的检测酰脲含量的方法
取大豆植物作为待测样品，并对植物中的酰脲的检测具体的应用方法按照以下步骤进行：
一、试剂的配置
配置浓度为20g/L的铁氰化钾、体积百分比为50％的乙醇、浓度为1.1mol/L的NaOH、浓度为1.3mol/L的HCL、浓度为5g/L的盐酸苯肼，PH＝7.0 0.1mol/L磷酸缓冲液，PH＝7.00.4mol/L磷酸缓冲液；
二、提取
取烘干后的大豆植物样品0.5g，加入10ml 50％乙醇的0.1mol/L磷酸缓冲液，置于80℃水浴萃取5min，以2000g离心15min，取上清液置于具塞试管中待测。
三、水解
取2.0mL上述提取液与0.25mL 1.1mol/L NaOH溶液混合，于沸水浴中加热7min，冷却后加入0.25mL 1.3mol/L HCl溶液，此混合液再于沸水浴中加热6min，冷却后测定酰脲含量。均使用刻度试管，水解后用蒸馏水补足到2.5mL。
四、测定
向上述2.5mL水解液中加入0.5mL0.4mol/L磷酸缓冲液和0.5mL 5g/L盐酸苯肼溶液，混匀后于室温下放置6min，再转移到冰水浴中冷却至0℃，加入预先冷却的浓盐酸和0.5mL 20g/L铁氰化钾，充分混合后于室温下放置15min，然后用分光光度计测定535nm处的吸光值。
五、标准曲线的绘制
取不同浓度(25、50、75、100、125、150、175nmol/L)的尿囊素溶液2mL，加入0.25mL1.1mol/LNaOH溶液混合，于沸水浴中加热7min，冷却后加入0.25mL1.3mol/L HCl溶液，此混合液再于沸水浴中加热6min，冷却后测定尿囊酸含量。均使用刻度试管，水解后用蒸馏水补足到2.5mL，并按上述方法测535nm处的吸光值。以尿囊素浓度nmol/L为纵坐标，OD535为横坐标，绘制标准曲线(酰脲标准曲线图3)。
六、计算样品酰脲含量(nmol/g组织干重)＝A*10mL/1000m，本实施例大豆检测得到的酰脲含量，其中A(nmol/L)表示标准曲线中的样品提取液的酰脲浓度，m(g)为样品干重。
本实施例标准曲线R2小于实施例1，实施例1的R2值更接近于1，测量数据更为精确，其中R2指的是相关系数，一般R2>0.99，才具有可行度和线性关系。
测定酰脲及尿囊酸含量在配置试剂过程中精确度较高，以及在反应中对反应过程和反应后测定对时间以及温度要求较高，而传统方法在配置试剂中存在操作繁琐，效率低等问题，且在反应过程样品的反应时间上很难控制一致，本发明的实例1节省了配置试剂的步骤，精确度较高，在操作过程中反应板能够取代试管架，减少EP管放进试管架和取出的时间，在加热和取出过程中反应板可以控制在在同一时间点，从而减少实验结果误差，重复性好。
实施例4现有的检测尿囊酸含量的方法
取大豆植物作为待测样品，并对植物中的尿囊酸的检测具体的应用方法按照以下步骤进行：
一、试剂的配置
配置浓度为20g/L的铁氰化钾、体积百分比为50％的乙醇、浓度为0.15mol/L的HCL、浓度为5g/L的盐酸苯肼，PH＝7.0 0.1mol/L磷酸缓冲液，PH＝7.0 0.4mol/L磷酸缓冲液；
二、提取
取烘干后的大豆植物样品0.5g，加入10ml 50％乙醇的0.1mol/L磷酸缓冲液，置于80℃水浴萃取5min，以2000g离心15min，取上清液置于具塞试管中待测。
三、水解
取2mL上述提取液与0.5mL 0.15mol/L HCl溶液混合后放到沸水浴中加热6min，冷却后测定尿囊酸含量。使用刻度试管，水解后用蒸馏水补足到2.5mL。
四、测定
向上述2.5mL水解液中加入0.5mL0.4mol/L磷酸缓冲液和0.5mL 5g/L盐酸苯肼溶液，混匀后于室温下放置6min，再转移到冰水浴中冷却至0℃，加入预先冷却的浓盐酸和0.5mL20g/L铁氰化钾，充分混合后于室温下放置15min，然后用分光光度计测定535nm处的吸光值。
五、标准曲线的绘制(图2)
取不同浓度(25、50、75、100、125、150、175nmol/L)的尿囊素溶液2mL，加入0.25mL1.1mol/LNaOH溶液混合，于沸水浴中加热7min，冷却后加入0.25mL1.3mol/L HCl溶液，此混合液再于沸水浴中加热6min，冷却后测定尿囊酸含量。均使用刻度试管，水解后用蒸馏水补足到2.5mL，并按上述方法测535nm处的吸光值。以尿囊素浓度nmol/L为纵坐标，OD535为横坐标，绘制尿囊素标准曲线，如图4所示。
六、计算样品尿囊酸含量(nmol/g组织干重)＝A*10mL/1000m，本实施例检测得到的大豆尿囊酸含量，其中A(nmol/L)表示标准曲线中的样品提取液的尿囊酸浓度，m(g)为样品干重。
本实施例标准曲线R2小于实施例2，实施例2的R2值更接近于1，测量数据更为精确，其中R2指的是相关系数，一般R2>0.99，才具有可行度和线性关系。
实施例5现有试剂盒对酰脲含量和尿囊酸含量进行检测
现有试剂盒：
提取液A液：无水乙醇60ml，自备；
提取液B液：液体60ml*1瓶，4℃保存；
试剂一：液体2ml*1支，4℃保存；
试剂二：液体2ml*1支，4℃保存；
试剂三：液体2ml*1支，4℃保存；
试剂四：液体2ml*1支，4℃保存；
试剂五：粉剂一瓶，-20℃避光保存；
试剂六：15ml浓HCL自备；
试剂七：液体4ml*1瓶，4℃避光保存；
标准品：粉剂*1支，10mg尿囊素，4℃避光保存；临用前加入632.5uL蒸馏水配制成100umol/mL酰脲标准液。
操作步骤：
一、酰脲提取：
取烘干后的大豆植物样品按质量(g)：提取液体积(mL)1:10-20比例，依次加入1ml提取液A液与1ml提取液B，禁止将提取液A与提取液B混匀待用，于80℃水浴中萃取5min，以3500rpm/min离心15min，弃沉淀取上清液置于冰上待测。
二、测定步骤：
1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至535nm，蒸馏水调零。
2、将试剂六与试剂七置于冰水浴中预冷30min以上，并置于冰上待用。
3、标准液的处理：将标准品配制成100umol/mL的标准液后，用蒸馏水稀释至25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125nmol/mL的标准溶液备用。
4、操作步骤：
酰脲测定管中加入80ul样品，10ul试剂一，沸水浴7min，冷却至室温，再加入10ul试剂二，沸水浴加热6min，冷却至室温后依次加入试剂四20ul和试剂五20ul，室温下静置6min，然后转移至冰水浴中，冷却至4℃，加入试剂六100ul和试剂七20ul，充分混匀，室温下静置15min，尿囊酸测定管加入80ul样品，20ul试剂三，沸水浴加热6min，冷却至室温后依次加入试剂四20ul和试剂五20ul，室温下静置6min，然后转移至冰水浴中，冷却至4℃，加入试剂六100ul和试剂七20ul，充分混匀，室温下静置15min，对照管不进行水浴加热处理；取200ul反应液，于微量玻璃比色皿/96孔板中测定535nm处吸光值A，分别记为A酰脲对照管、A酰脲测定管、A尿囊酸对照管、A尿囊酸测定管。标准样品测定方法同酰脲测定方法。
三、计算
酰脲含量(nmol/g)＝△A1*V提取/W
尿囊酸含量(nmol/g)＝△A2*V提取/W
△A1为酰脲测定管吸光值与对照管吸光值差值再带入标准曲线中计算出酰脲浓度；△A2为尿囊酸测定管吸光值与对照管吸光值差值再带入标准曲线中计算出尿囊酸浓度；V提取：加入提取液体积；W：样品质量。本实施例的结果如表1所示。
利用本实施例的方法分别取两组大豆进行酰脲吸光值、酰脲对照吸光值以及尿囊酸吸光值、尿囊酸对照吸光值，每组分别进行三次吸光值的测定，即1-1、1-2、1-3、2-1、2-2、2-3，结果如2所示，从表2可以看出，利用实施例5的试剂盒进行测定，同一组样品，三次测定后的△A差异较大，由此可见实施例5的误差较大，测定结果不够准确。
表2：实施例5试剂盒的测定结果
Figure BDA0003398475980000121
实施例1和2中，将试剂和样品放在反应板中充分反应后可以将多个样品在同一时间一起放进水浴锅或者是冰浴中，能够减少因反应时间不同带来的误差，目前现有的解决时间上的差距的方法是将所有样品管放置在漂浮转子或者泡沫板上，使用反应板可以减少将反应试管放进漂浮转子或者从漂浮转子中拿出来的时间；实施例1和2所使用的反应板规格是8*12*2ml连排管带盖组成，包括重复一个反应板能够一次性检测16个样品，并且反应板带盖(具有卡扣的盖)能够防止反应过程中加热产生气体将盖子弹开从而产生一些气体挥发而带来实验数据结果的误差；其反应板款式与96孔板差不多，方便样品加热完后用排枪吸取反应液到96孔板中，减少单枪吸取的时间，从而有效的减少误差。
实施例3、4和5与本发明实施例1和2进行比较，其反应时间很难控制一致，影响最后的检测结果，另外在配置标准样品过程中，误差较大，稀释的梯度不合理，准确性不高，并且样品在1.5mlEP管中发生反应，加热过程中即使用封口膜密封EP管盖，管盖依然会被管中产生的气体给弹开，本发明的标准样品配制成溶液并且稀释梯度也易操作，提高效率，反应板配有螺旋拧盖避免在发生反应过程中管盖被弹开，避免液体蒸发影响试验数据，并且能够在反应时间上控制一致，从而减少实验结果误差，重复性好。

Claims (2)

1.一种利用试剂盒检测酰脲含量的方法，特征在于：将待测样品按重量份数比为1:10~20的比例与试剂盒中的提取液混合，于100℃水浴中萃取5min，以4000rpm/min离心15min，去沉淀留上清液，获得含有酰脲提取液；取含有酰脲提取液置于反应板中，加入水解液A，于100℃水浴萃取7min，冷却室温后，再加入水解液B，于100℃水浴萃取7min，然后加入由反应试剂A配置的浓度为5g/L的反应试剂A溶液，沸水浴2min，冷却室温后于冰水浴上反应30min，再加入反应试剂B，摇匀后加入反应试剂C，于冰水浴上反应30min，获得酰脲测定液；对照组不加热，且水解液A与水解液B用蒸馏水代替；其中试剂盒中所述提取液是pH=7、0.1mol/L的磷酸缓冲液、水解液A是浓度为0.75mol/L的盐酸溶液，水解液B是浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液，反应试剂A是盐酸苯肼粉剂，反应试剂B是浓度为20g/L铁氰化钾溶液，反应试剂C是质量分数为36%浓盐酸，标准品是1mmol/L尿囊素标准液，反应板是连排管带盖的反应板；
将所述测定液在波长535nm处，读取吸光度值OD，根据以下公式计算样品中酰脲的含量：，△A1为酰脲测定管吸光值与对照管吸光值差值再带入标准曲线中计算出酰脲的含量，V1为总水解体积，Vt1为分取倍数，W为植物干重；其中，检测方法中，标准曲线的绘制如下：取尿囊素标准样品1mmol/L母液，依次稀释成0umol/L、0.025umol/L、0.05umol/L、0.1umol/L、0.25umol/L的溶液，测定方法与酰脲测定方法一致，上机测定，读取吸光值，并绘制标准曲线。
2.根据权利要求1所述的一种利用试剂盒检测酰脲含量的方法，其特征在于反应板是8*12*2 ml连排管带盖的反应板。
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