DE4117619C2

DE4117619C2 -

Info

Publication number: DE4117619C2
Application number: DE19914117619
Authority: DE
Inventors: Regine Dr. 7000 Stuttgart De Schmidt
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 1991-05-29
Filing date: 1991-05-29
Publication date: 1993-04-08
Also published as: CH684486A5; DE4117619A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Alkalischen Phosphatase in Zellen, bei welchem die Zellen mit einer alkalischen Lösung eines aromatischen Phosphor säureesters und eines Diazonium-Salzes inkubiert werden, und bei welchem mittels der Alkalischen Phosphatase aus dem Phosphorsäureester ein aromatischer Alkohol gebildet wird, welcher dann mittels des Diazonium-Salzes über eine Azokupplung in eine Azoverbindung übergeführt wird.

Die Alkalische Phosphatase (AP) ist ein Enzym, welches im alkalischen Bereich die Spaltung von Estern der Orthophosphorsäure mit verschiedenen Alkoholen und Phenolen katalysiert.

Orthophosphorsäuremonoester + H₂O ⇄ Alkohol + o-Phosphat

Die Alkalische Phosphatase kann außerdem auch manche Ver bindungen mit Phosphorylanhydriden hydrolysieren; z. B. Adenosin-, Inosin- oder Uridintriphosphat bzw. Thiaminpyro phosphat. Weiterhin ist das Enzym in der Lage, eine Reihe von transphosphorylierenden Reaktionen zu katalysieren. Sein pH-Optimium liegt zwischen 9.2 und 9.8 und hängt mit von der Art und Konzentration des Substrates sowie vom Puffer ab. Mg²⁺-, Mn²⁺-, Zn²⁺- und Co²⁺-Ionen aktivieren, Phosphat- und Arsenationen, sowie verschiedene Alkohole und L-Cystein inhibieren das Enzym. Die Alkalische Darmphosphatase wird außerdem von einigen L-Aminosäuren, z. B. L-Phenylalanin, gehemmt.

Das Enzym kommt vor allem dort in Zellmembranen vor, wo aktive Transportvorgänge ablaufen, z. B. im Bürstensaum von Enterozyten und proximalen Tubuluszellen der Niere, in der Membran am Gallepol der Leberzellen, im Kapillar- und Arteriolenendothel. Weiterhin läßt sich die Alkalische Phosphatase z. B. im endoplasmatischen Retikulum, im Golgi- Apparat und in Lysosomen von Enterozyten sowie in den Granula neutrophiler Leukozyten nachweisen. Die Alkalische Phosphatase kommt beispielsweise in der Leber, in den Knochen, im Dünndarm, in den Nieren, in der Galle und in geringem Ausmaß in der Placenta vor. Der Anstieg der AP- Aktivität im Plasma hat insbesondere für den Nachweis von Lebererkrankungen und Erkrankungen des Knochenskeletts diagnostische Bedeutung, d. h. die Alkalische Phosphatase kann zur Beurteilung verschiedener Zellarten, wie z. B. von Osteoblasten oder von Knochenmarkszellen, herangezogen werden.

Die meisten Enzyme, die im Serum bestimmt werden, sind Zell-Enzyme, die im Extrazellular-Raum nur erscheinen, weil die Zellen, in denen sie normalerweise ihre Funktion aus üben, vermehrt durchlässig geworden sind. Es ist selbstver ständlich, daß Enzyme, die in hoher Konzentration in einem Organ vorhanden sind, beim Leckwerden der Zellen höhere Spiegel im Plasma erreichen als solche mit geringer Aktivi tät in den geschädigten Zellen. Somit spiegelt sich das Enzymmuster des erkrankten Organs im Serum wider und es werden beispielsweise erhöhte AP-Spiegel bei Morbus Paget, bei Osteosarkomen, Gelbsucht, Hepatitis und ähnlichen Krankheitsbildern beobachtet.

Die klinische Chemie sowie die Diagnostik erfordern somit eine einfach zu handhabende und zugleich gut reproduzierbare Methode zur quantitativen Bestimmung der Alkalischen Phos phatase. Diesem Zweck dient in der Regel die direkte photo metrische oder fluorometrische Bestimmung von Verbindungen, die durch die AP bewirkte hydrolytische Spaltung aus zuge setzten spezifischen Substraten hervorgegangen sind. Bei den durch die Alkalische Phosphatase freigesetzten Verbindungen handelt es sich in der Regel um chromogene bzw. mesomeriestabilierte Alkohole, insbesondere Phenolderivate, und Phosphatreste. In der Regel werden erstere qualitativ bzw. quantitativ bestimmt.

Es sind eine Reihe von Verfahren bekannt, bei denen die AP-Aktivitäten in verschiedensten Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise in Blut, Plasma, Serum, Urin oder Speichel bestimmt werden. Z.B. ist aus der DE 37 39 284 A1 ein Verfah ren bekannt, bei welchem als zugesetzte spezifische Sub strate 1-Naphtholphthaleinmonophosphate verwendet werden. Neben p-Nitrophenylphosphat, Naphthylphosphaten oder Phe nolphthaleindiphosphaten sind aber auch Phenolphthaleinmono phosphorsäureester bzw. deren Salze als AP-Substrate bekannt (US-Patente 33 31 857 und 33 31 862). Diese Verfahren sind jedoch für die Bestimmung der Alkalischen Phosphatase in Körperflüssigkeiten nicht geeignet, da der Nachweis der freigesetzten Phenolphthaleinmenge durch andere in der Probenflüssigkeit vorhandene Verbindungen verfälscht wird. Zahlreiche Serumbestandteile, wie beispielsweise Bilirubin haben wie die erwähnten, aus den AP-Substraten freigesetzten Phenolate ein Absorptionsmaximum bei ca. 400-450 nm.

Wie schon erwähnt, kommt die Alkalische Phosphatase in den verschiedensten Geweben vor, d. h. es existieren gewebespezifische Formen dieses Enzyms (Isoenzyme). Die Isoenzyme werden von den Organen an das Blutplasma abgege ben, wobei die charakteristischen Eigenschaften der jeweiligen Isoenzyme beim Übergang vom erzeugenden Organ in das Blutplasma erhalten bleiben. Das Blutplasma gesunder Menschen enthält hauptsächlich das Leber- und Knochen- Isoenzym. Bei ungefähr einem Viertel aller Personen wird im Plasma auch Alkalische Phosphatase gefunden, die im Dünndarm entstanden ist. Der Anteil dieses Dünndarm-Isoenzyms liegt in diesen Fällen bei einem Mittelwert von 10% des gesamten AP-Gehaltes im Plasma. Während der Schwangerschaft, insbe sondere während der letzten drei Monate wird auch in der Placenta entstehende, Alkalische Phosphatase in das Blut plasma abgegeben. Die gesamte AP-Aktivität des Plasmas ergibt sich aus der Summe der Aktivitäten aller gewebsspezifischen Einzelkomponenten.

Die Bestimmung der Aktivität z. B. des Leber- bzw. des Knochenisoenzyms ist von besonderer diagnostischer Bedeutung bei der Untersuchung von Erkrankungen der Leber bzw. des Knochenenzyms. Die Erkrankungen bewirken einen Anstieg der AP-Aktivität im Plasma, da unter diesen Voraussetzungen von der Leber bzw. den Knochen in verstärktem Maße Alkalische Phosphatase an das Plasma abgegeben wird. Der Anstieg der AP-Aktivität des Leber- oder des Knochen-Isoenzyms im Plasma kann demnach dazu dienen, eine Erkrankung dieser Gewebe zu erkennen.

Eine Differenzierung zwischen den AP-Isoenzymen ist deshalb unbedingt erforderlich, um gezielt Erkrankungen bestimmter Organe ermitteln zu können. Eine Differenzierung zwischen dem Leber- und dem Knochen-Isoenzym gestaltet sich aber äußerst schwierig, da diese beiden Isoenzyme sich nur wenig in ihren chemischen, physikalischen oder immunologischen Eigenschaften, z. B. hinsichtlich ihrer elektrischen Ladung, ihrer Hitzestabilität und in ihrer Antwort auf Inhibitoren (z. B. gegenüber Harnstoff) unterscheiden. Diese geringen Unterschiede reichen nicht aus, um eine brauchbare Diffe renzierung zwischen diesen beiden Enzymformen und eine hinreichende Quantifizierung jeder Form in einem Gemisch beider Formen zu erreichen. Vor einer quantitativen Bestim mung der einzelnen AP-Isoenzyme in einer Probenflüssigkeit ist es deshalb zwingend erforderlich, das Gemisch der Isoenzyme aufzutrennen.

Aus der EP 01 31 606 B1 ist ein Verfahren zur differenzierten Bestimmung von Isoenzymen der Alkalischen Phosphatase bekannt. Dabei wird die Probe mit einem Lektin, das N- Acetylglucosamin-Reste zu binden vermag, versetzt, die so erhaltene Mischung wird inkubiert, danach der Lektingebundene von dem freien Isoenzym-Anteil getrennt und die AP-Aktivität in einem oder in beiden der getrennten Medien bestimmt. Aus der EP 00 32 204 B1 ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Isoenzymen der Alkalischen Phosphatase in Flüssigkeiten bekannt, bei welchem man an einen wasserunlöslichen Träger adsorbierte Antikörper gegen das zu bestimmende Isoenzym mit der dieses Enzym enthalten den Probenflüssigkeit inkubiert, wobei das Isoenzym im Komplex mit dem Antikörper einen reproduzierbaren Anteil seiner Aktivität behält. Die Probenlösung wird entfernt, der mit dem Enzym beladene Antikörper-Träger wird gewaschen und die Aktivität des an den Antikörper gebundenen Enzyms wird bestimmt. Aus der DE 34 20 926 A1 ist ein Verfahren zur differenzierten Bestimmung von Isoenzymen der Alkalischen Phosphatase bekannt. Dabei wird die Differenzierung mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers durchgeführt, der gegen das zu bestimmende Isoenzym gerichtet ist und der nur eine geringe Kreuzreaktivität mit den anderen Isoenzymen auf weist. All diese Verfahren, die an flüssigen Proben durch geführt werden, haben jedoch den Nachteil, daß vor einer quantitativen Bestimmung der AP-Isoenzymaktivität die einzelnen Isoenzyme erst umständlich auf- bzw. abgetrennt werden müssen.

Aus "Enzyme Histochemistry" von Lodja Z., Gossrau R., Schiebler T.H. Springer Verlag Berlin (1979), S. 56-64, sind Verfahren bekannt, bei welchen die Alkalische Phos phatase in Zellen von Gewebeproben qualitativ bestimmt wird. Dabei werden die enzymaktiven Stellen der Gewebeprobe selektiv eingefärbt und somit sichtbar gemacht. Diese Einfärbung kann z. B. über eine Azokupplung erfolgen, indem man die Zellen beispielsweise mit Naphthol-AS-phosphat als Substrat inkubiert und den resultierenden aromatischen Alkohol über eine Azokupplung mit einem Diazonium-Salz, beispielsweise mit Fast Blue BB (Echtblausalz BB) in einen Azofarbstoff überführt. Dieser Azofarbstoff fällt membranständig aus und färbt die enzymaktiven Stellen blauviolett. Dieses Verfahren bietet zwar den Vorteil, daß nur das zu bestimmende Isoenzym in der Gewebeprobe enthalten ist und somit eine Abtrennung des zu bestimmenden Isoenzyms aus einem Gemisch von Isoenzymen nicht erforderlich ist, aber leider ist mit diesem Verfahren nur eine qualitative Bestimmung der Alkalischen Phosphatase möglich. Für viele Anwendungsfälle, z. B. in der medizinischen Diagnostik, ist es aber unbedingt erforderlich, die Alkalische Phosphatase quantitativ zu bestimmen, um verläßliche Aussagen über mögliche Erkrankungen machen zu können.

Quantitative Bestimmungen der AP-Aktivität von Zellen werden bislang durch Messungen der Enzymkinetik (z. B. nach Bergmeyer H.U., Methods in Enzymatic Analysis Vol. 4, Verlag Chemie, Weinheim (1984)) durchgeführt. Dabei werden die zu untersuchenden Zellen aufgebrochen, das Enzym geht in die wäßrige Phase über, in welcher dann die Enzymaktivität über die Messung der Enzymkinetik ermittelt wird. Dafür sind aber sehr hohe Zellzahlen (10⁶-10⁷) erforderlich, da es sich hierbei um ein relativ unempfindliches Verfahren handelt. Die erforderlichen hohen Zellzahlen steigern aber auch gleichzeitig die Kosten der Bestimmung. Außerdem sind hierfür zusätzliche Arbeitsschritte erforderlich, um die Alkalische Phosphatase in eine wäßrige Phase überzuführen, so daß es sich hier um ein sehr arbeits- und kostenintensives Verfahren handelt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein empfindliches Verfahren bereit zu stellen, mit welchem schnell, einfach und zuverlässig die quantitative Bestimmung der AP-Aktivität durchgeführt werden kann. Ferner soll mit Hilfe des Verfahrens selektiv die AP-Aktivität einzelner Isoenzyme bestimmt werden können, ohne daß vorher eine umständliche, zeitaufwendige und kostspielige Ab- bzw. Auftrennung der Isoenzyme erforderlich ist.

Gelöst wird diese Aufgabe, dadurch, daß man die AP-Aktivität nicht in Körperflüssigkeiten oder in anderen flüssigen bzw. wäßrigen Proben quantitativ bestimmt, sondern direkt in den jeweiligen Zellen, indem man die Zellen mit einer alka lischen Lösung eines aromatischen Phosphorsäureesters und eines Diazonium-Salzes inkubiert, und den durch die Alka lische Phosphatase aus dem Phosphorsäureester gebildeten aromatischen Alkohol über eine Azokupplung mittels des Diazonium-Salzes in eine Azoverbindung, einen Azofarbstoff überführt, welcher membranständig ausfällt. Dieser Azofarbstoff wird mittels eines geeigneten organischen Lösungsmittels selektiv aus der Zellmembran herausgelöst und quantitativ durch Messen der Extinktion der resultierenden organischen Lösung bei einer geeigneten Wellenlänge gegen einen entsprechenden Leerwert bestimmt. Aus der Konzentra tion bzw. aus der Menge des gebildeten Azofarbstoffes und aus der Zahl der untersuchten Zellen wird dann die Menge bzw. die Aktivität der Alkalischen Phosphatase quantitativ ermittelt.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die gemessenen Extinktionswerte und die daraus ermittelten AP-Aktivitäten hervorragend mit der Zahl der untersuchten Zellen korrelieren, und es wurde überraschenderweise festgestellt, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ermittelten AP-Aktivitäten ausgezeichnet mit den AP-Aktivitäten über einstimmen, die nach der Methode von Bergmeyer (Bergmeyer H.U., Methods in Enzymatic Analysis Vol. 4, Verlag Chemie, Weinheim (1984)) bestimmt wurden, sodaß damit ein einfach zu handhabendes und zuverlässiges Verfahren zur quantitativen Bestimmung der AP-Aktivitäten zur Verfügung steht.

Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, daß durch die erfindungsgemäße Modifizierung der qualitativen histochemischen Färbung zu einem quantitativen, photome trischen Test die Empfindlichkeit der quantitativen Bestim mung der AP-Aktivität von Zellen gegenüber bekannten Ver fahren nach dem Stand der Technik um das 100fache gestei gert werden konnte, d. h. es konnte die für die Bestimmung erforderliche Zellzahl auf 1/100 reduziert werden. Die für die quantitative Bestimmung der AP-Aktivität erforderliche Zellzahl konnte auf 10⁴ gesenkt werden. Damit ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich geworden, die quantita tive Bestimmung der AP-Aktivitäten von Zellen in Mikroti terplatten durchzuführen und nicht mehr in Küvetten. Somit steht mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht nur ein einfach zu handhabendes und zuverlässiges Verfahren zur quantitativen Bestimmung der AP-Aktivitäten zur Verfügung, sondern auch ein sehr empfindliches und zugleich kostengün stiges Verfahren.

Ferner wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die AP- Aktivität der intakten Zelle bestimmt, so daß eine arbeits- und kostenintensive Ab- bzw. Auftrennung der Isoenzyme nicht erforderlich wird. Dies bedeutet, daß das erfindungsgemäße Verfahren auch von relativ ungeübten Personen durchgeführt werden kann, und daß es geignet ist, auch in großangelegten Reihenuntersuchungen eingesetzt zu werden.

Da bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Zellen nicht zerstört werden müssen, bietet diese Methode den weiteren Vorteil, daß an ein und derselben Zellprobe neben der quantitativen Bestimmung der AP-Aktivität auch weitere morphologische Untersuchungen durchgeführt werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann an einer Vielzahl von Zellproben durchgeführt werden. Besonders gute Resultate er hält man bei der Untersuchung von Gewebeschnitten, z. B. in der Histologie, von Zellausstrichen und von Zellkulturen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit beispielsweise in der medizinischen Diagnostik angewendet werden, und die Zellgewinnung kann z. B. über eine Biopsie erfolgen. Da das erfindungsgemäße Verfahren aber auch an in Kultur gezüchte ten Zellen durchgeführt werden kann, kann es ebenso in der Toxikologie bzw. in der Pharmakologie zum Substanz-Screening eingesetzt werden. Werden Zellausstriche nach dem erfin dungsgemäßen Verfahren untersucht, so werden diese vor dem Inkubieren getrocknet, bei der Untersuchung von Zellkulturen werden diese z. B. mit Ethanol auf einem Träger fixiert.

Für die Untersuchung eignen sich all die Zellarten, in denen Alkalische Phosphatase vorkommt. Dies sind z. B. Zellen der Leber, der Knochen, des Dünndarms, der Nieren, der Galle oder der Placenta. Besonders gute Resultate erhält man bei der Untersuchung von Knochenmarkszellen oder von Osteobla sten. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich geworden, Osteoporose auf einfache Art und Weise detektieren zu können, da eine hohe AP-Aktivität der unter suchten Osteoblasten ein Beweisanzeichen für Osteoporose ist. Diese Krankheit kann bis jetzt nur durch eine aufwendi ge und kostspielige Computer-Tomographie diagnostiziert wer den. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens hat es sich als zweckmäßig erwiesen, wenn die zu untersu chenden Zellen adhärent an der Oberfläche eines Trägers immobiliert sind.

Bei der quantitativen Bestimmung der AP-Aktivität nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die ermittelte AP-Menge auf die Zahl der untersuchten Zellen bezogen. Dabei gibt es verschiedene Möglichkeiten, die Zahl der untersuchten Zellen zu ermitteln. Z. B. können die Zellkerne der zu untersuchen den bzw. der untersuchten Zellprobe selektiv angefärbt und anschließend ausgezählt werden. Ein geeigneter Farbstoff zum Anfärben der Zellkerne ist z. B. das Hämatoxylin. Bei der Verwendung von Hämatoxylin als Farbstoff ist es möglich, die Zellkerne anzufärben, bevor der membranständig ausfallende Azofarbstoff gebildet wird, da bei der Verwendung von DMSO als Lösungsmittel für den Azofarbstoff nur dieser selektiv gelöst wird, und die Färbung der Zellkerne erhalten bleibt. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es also möglich geworden, an nur einer Zellprobe die Zahl der Zellen und die AP-Aktivität zu ermitteln, und noch weitere morpho logische Untersuchungen durchzuführen. Es ist aber auch möglich, über einen Parallelansatz nach üblichen Methoden die Zellzahl zu ermitteln.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens hat es sich als zweckmäßig erwiesen, wenn nach dem Inkubieren der Zellen mit den Lösungen des Phosphorsäureesters und des Di azoniumsalzes und nach dem Entfernen der überschüssigen Lö sungen die Zellen getrocknet werden, z. B. an der Luft. An schließend werden die Zellen mit dem organischen Lösungsmit tel innig kontaktiert, um den membranständig ausgefallenen Azofarbstoff zu lösen. Dies kann z. B. dadurch erfolgen, daß man die Zellen kräftig mit dem Lösungsmittel schüttelt, bei spielsweise 5 Minuten lang.

Die Konzentration bzw. die Menge des membranständig ausge fallenen Azofarbstoffes in der resultierenden Lösung wird über die Messung der Extinktion dieser Lösung bei einer ge eigneten Wellenlänge und gegen einen geeigneten Leerwert be stimmt. Diesen Leerwert bildet z. B. das reine Lösungsmittel, und geeignet ist eine Wellenlänge dann, wenn der resultie rende Azofarbstoff dort eine ausgeprägte Absorption zeigt. Die für den jeweiligen Einzelfall geeignete Wellenlänge hängt vom Absorptionsverhalten des gebildeten Azofarbstoffes ab und kann vom Fachmann aus dem Absorptionsspektrum des jeweiligen Azofarbstoffes, aufgenommen in dem entsprechenden Lösungsmittel, oder aus Tabellen entnommen werden.

Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist prin zipiell mit all den Phosphorsäureestern möglich, die durch die Alkalische Phosphatase gespalten werden. Bevorzugt sind dabei p-Nitrophenolphosphat, 1-Naphtholphthaleinmonophosphate, oder Phosphorsäureester von Derivaten (allgemeine Formel I) des 3-Hydroxy-2-naphthoesäureanilid (Naphthol AS). Geeignete Derivate des Naphthol AS sind Ullmanns Encyklopädie der technischen Chemie, 4. Auflage, Band 8, Seite 288, Tabelle 15 zu entnehmen. Besonders bevorzugte Derivate sind das 2′,4′-Dimethyl-3-hydroxy-2-naphthoesäureanilid (Naphthol AS-MX), das 7-Brom-3-hydroxy-2-naphthoesäureanisidid (Naphthol AS-BI) oder das 4′-Chlor-2′-methyl-3-hydroxy-2-naphthoesäureanilid (Naphthol AS-TR).

Diese Phosphorsäureester sind kommerziell erwerbbar.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind all diejenigen Diazonium-Salze geeignet, die mit dem resultier enden, aromatischen Alkohol über eine Azokupplung Azoverbin dungen zu bilden vermögen, wobei zweckmäßigerweise darauf zu achten ist, daß die dabei hervorgehenden Azoverbindungen in den gängigen, organischen Lösungsmitteln eine hinreichende Löslichkeit besitzen. Bevorzugte Diazonium-Salze sind Diazo echt-Salze. Besonders bevorzugt sind Va riaminblau-Salze, Echtblau-Salze (Fast Blue) oder Echtrot- Salze (Fast Red). Ganz besonders bevorzugt sind das Echtrot- Salz TR (Fast Red TR, Formel II), das Echtrotviolett-Salz LB (Fast Red Violet LB, Formel III), das Echtblau-Salz BB (Fast Blue BB, Formel IV) oder das Echtblau-Salz RR (Fast Blue RR, Formel V). Diese Diazonium-Salze sind kommerziell erwerbbar.

Ferner werden Diagnostik- bzw. Reagentien-Kits für die Be stimmung der Alkalischen Phosphatase nach dem Stand der Technik kommerziell angeboten, die ebenso für die Durchfüh rung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind, und die aus einer alkalischen Lösung eines Phosphorsäureesters und eines Diazonium-Salzes bestehen. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht also darin, daß man zu sei ner Durchführung auf kommerziell verfügbare Reagentien-Kits zurückgreifen kann.

Geeignete, organische Lösungsmittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind all diejenigen Lösungs mittel, die die membranständig ausgefallenen Azoverbindungen zu lösen vermögen, und deren Absorption nicht mit derjenigen dieser Azoverbindung zusammenfallen. Bevorzugte Lösungsmit tel sind dipolar aprotisch, besonders bevorzugt sind Dime thylsulfoxid (DMSO), N-Methylpyrrolidon (NMP), Acetonitril, N,N-Dimethylacetamid, oder Dimethylformamid (DMF). Die Wahl des entsprechenden Lösungsmittels für den jeweiligen Einzel fall hängt dabei von dessen Erfordernissen ab, wie z. B. von der Löslichkeit und von der Absorption der gebildeten Azo verbindung. Die richtige Wahl des Lösungsmittels gehört zum handwerklichen Können des Fachmanns und bereitet diesem kei ne Schwierigkeiten.

Beschreibung der Abbildungen

Abbildung 1 zeigt die Abhängigkeit der AP-Aktivität von der Zahl der untersuchten Zellen am Beispiel von Osteoblasten aus dem Fußbereich einer osteoporotischen Person, sowie die Korrelation der gemessenen Extinktionswerte mit der Zahl der eingesetzten Osteoblasten. Die Ergebnisse wurden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß Beispiel 2 ermittelt.

Abbildung 2 zeigt die AP-Aktivität/10⁵ Zellen aus Proben A bis I unterschiedlicher Herkunft. Die Werte wurden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß Beispiel 1 ermittelt.

Herkunft der Proben:

A: Osteoblasten aus dem Fußbereich einer weiblichen, gesunden Person
B: Osteoblasten aus dem Fußbereich einer weiblichen, osteoporotischen Patientin
C: Osteoblasten aus der Hüfte einer männlichen, gesunden Person
D: Osteoblasten aus dem Knie einer weiblichen, gesunden Person
E: Osteoblasten aus dem Knie einer weiblichen, osteoporotischen Patientin
F: Schädeldachzellen eines fetalen Kalbes
G: Menschliche Tumorzellen vom Knochen U-2 OS
H: Menschliche Fibroblasten aus der Lunge Flow 2002
I: Muskelzellen eines fetalen Kalbes

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1 (Bestimmung der AP-Aktivität in verschiedenen Osteoblasten kulturen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren)

In 2 Gewebekulturplatten mit jeweils 6 Vertiefungen (wells) (Durchmesser je well : 3.5 cm) werden pro well 10⁵ Osteobla sten ausgesäht. Dabei handelt es sich bei einer Platte um Osteoblasten einer osteoporotischen, weiblichen Patientin, bei der anderen Platte um Osteoblasten einer gesunden, weib lichen Person. Die Osteoblasten stammen jeweils aus dem Fuß bereich der Frauen.

Nachdem die Osteoblasten angewachsen sind (1 Tag) und sich ausgespreitet haben, werden sie bis zu ihrer Sättigungsdich te 1-2 Tage in Kultivierungsmedien kultiviert. Anschlie ßend wird das Medium der Platten abgenommen, in phosphatge pufferter Saline gespült, und es wird je Platte von 2 wells die Zellzahl bestimmt. Die übrigen 4 wells pro Platte werden mit 2 ml/well Fixierlösung (= 10 ml 37%iger Formaldehyd in 90 ml Methanol) 30 Sekunden lang fixiert. Danach wird mit Wasser gespült und je well mit 2 ml einer Lösung beschich tet, die wie folgt hergestellt wurde:
0.5 ml alkalische FRV-Lösung (= 5 mg/ml Fast Red Violet LB Base in 0.4 m HCl) werden mit 0.5 ml 0.1 M NaNO₂-Lösung 30 Sekunden kräftig geschüttelt, dann mit 22.5 ml Wasser und 1 ml alkalischer Naphthol AS-BI-Lösung (= 2 mg/ml Naphthol AS-BI Phosphat in 1 M AMPD-Puffer, pH 9.5) versetzt.

Mit dieser Lösung werden die Proben 15 Minuten lang im Dun keln inkubiert. Anschließend wird die Farblösung abgesaugt, die Zellen werden gründlich mit Wasser gespült und 2 Minuten lang mit je 2 ml Hämatoxilin-Lösung (= 6 g/l Hämatoxilin, 0.6 g/l NaJO₃, 52.8 g/l Al₂(SO₄)₃) je well gegengefärbt. Die Farblösung wird abgenommen, die Zellen werden mit Leitungs wasser gespült, getrocknet und mit 1 ml DMSO pro well 5 Minuten lang geschüttelt. Dabei geht der gebildete Azofarbstoff in Lösung. Die gefärbte DMSO-Lösung wird in Küvetten übergeführt, und es wird die Extinktion dieser Lösung bei 550 nm gegen DMSO gemessen. Die nachfolgende Tabelle enthält die Extinktionen/10⁵ Zellen.

Beispiel 2 (Ermittelung des Zusammenhanges zwischen der Zellzahl und der AP-Aktivität)

Osteoblasten aus dem Fußbereich einer osteoporotischen Pati entin wurden jeweils in ihrer Sättigungsdichte in verschie denen Gefäßen ausgesäht.

Flexipermkammern: pro well 1 cm Durchmesser ⇒ 10 000 Zellen
24er well-Schale: pro well 1.5 cm Durchmesser ⇒ 25 000 Zellen
6er well-Schale: pro well 3.5 cm Durchmesser ⇒ 100 000 Zellen

Von diesen Zellen wurde gemäß Beispiel 1 die AP-Aktivität bei 550 nm bestimmt. Die nachfolgende Tabelle enthält die Zellzahlen und die zugehörigen AP-Aktivitäten.

Beispiel 3 (Bestimmung der AP-Aktivität über eine Enzym-Kinetik gemäß dem Stand der Technik)

In einer 80-cm²-Kultivierungsflasche wurden Osteoblasten aus dem Fußbereich einer osteoporotischen Patientin bis zu ihrer Sättigungsdichte (500 000 Zellen) angezüchtet. Der Zellrasen wurde gespült, und die Zellen wurden mit einem Schaber me chanisch von der Oberfläche entfernt und in Suspension ge bracht. Sie wurden in 1.5 ml phosphatgepufferter Saline, die 0.1% Tween 20 enthält, aufgenommen und 2·10 Minuten im Ultraschall beschallt. Anschließend wurde der Zellaufschluß 15 Minuten lang bei 3000 rpm und 4°C zentrifugiert, und die Zellüberstände wurden zur Enzym- und Proteinbestimmung ein gesetzt. Die Proteinbestimmung erfolgte mit dem Färbereagenz der Fa. BioRAD nach der Methode von Bradford, die Bestimmung der Alkalischen Phosphatase wurde nach der Methode von Berg meyer durchgeführt.

Enzymbestimmung:
Puffer/Substratlösung: 1 M Diethanolamin-Puffer, pH 9.8,
15 mM 4-Nitrophenylphosphat (4-NPP)
(10.5 g Diethanolamin, 0.56 g 4-NPP und 9 ml 1 N HCl werden in 80 ml H₂O gelöst, mit HCl auf pH 9.8 eingestellt und auf 100 ml aufgefüllt)

In einer Küvette werden 2 ml Puffer/Substratlösung vorgelegt und mit 0.02 ml Zellüberstand versetzt. Dann wurde 10 Minuten lang die Extinktionsänderung bei 405 nm gemessen und die Volumenaktivität [U/l] und die spezifische Aktivität [U/mg Protein] nach folgenden Formeln ermittelt:

Volumenaktivität = 1000 V / εdv · ΔE/Δt = 16.38 [U/l]

spezifische Aktivität = V / εdvc = 81 [U/mg Protein]

mit
V = 2.02 ml (Probenvolumen),
v = 0.02 ml (Testvolumen),
ε = 18.5 cm²/mol,
d = 1 cm,
ΔE/Δt = 0.003 und
c = Proteinkonzentration des Zellüberstandes = 0.07 mg/ml.

Somit läßt sich die spezifische Aktivität aus der Enzymkine tik mit der photometrischen Bestimmung nach dem erfindungs gemäßen Verfahren vergleichen.

Die nachfolgende Tabelle enthält die vergleichenden AP-Akti vitäten, ermittelt nach dem Stand der Technik und ermittelt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Alkalischen Phosphatase in Zellen durch Inkubieren der Zellen mit einer alkalischen Lö sung eines aromatischen Phosphorsäureesters und eines Diazo nium-Salzes und Überführen des durch die Alkalische Phospha tase aus dem Phosphorsäureester gebildeten aromatischen Al kohols über eine Azokupplung mittels des Diazonium-Salzes in eine Azoverbindung, dadurch gekennzeichnet, daß man die mem branständig ausgefallene Azoverbindung mittels eines organi schen Lösungsmittels selektiv aus der Zellmembran herauslöst und quantitativ durch Messen der Extinktion der resultieren den organischen Lösung bei einer geeigneten Wellenlänge ge gen einen entsprechenden Leerwert bestimmt, und daß man aus der Konzentration bzw. aus der Menge der gebildeten Azover bindung und aus der Zahl der untersuchten Zellen die Menge bzw. die Aktivität der Alkalischen Phosphatase quantitativ ermittelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phosphorsäureester p-Nitrophenolphosphat, 1-Naphtholphthaleinmonophosphate, oder Phosphorsäureester von Derivaten des 3-Hydroxy-2-naphthoesäureanilid (Naphthol AS), bevorzugt des 2′,4′-Dimethyl-3-hydroxy-2-naphthoesäureanilid (Naphthol AS-MX), des 7-Brom-3-hydroxy-2-naphthoesäureanisidid (Naphthol AS-BI) oder des 4′-Chlor-2′-methyl-3- hydroxy-2-naphthoesäureanilid (Naphthol AS-TR), einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß man als Diazonium-Salz Diazoecht-Salze verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Variaminblau-Salze, Echtblau-Salze oder Echtrot-Salze, bevorzugt Echtrot-Salz TR, Echtrotviolett-Salz LB, Echt blau-Salz BB oder Echtblau-Salz RR verwendet.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmit tel aprotisch dipolare Lösungsmittel, bevorzugt Dimethyl sulfoxid (DMSO), N-Methylpyrrolidon (NMP), Acetonitril, N,N-Dimethylacetamid, oder Dimethylformamid (DMF) verwendet.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Alkalische Phosphatase in Gewebeschnitten, in Zellausstrichen oder in Zellkulturen bestimmt.

7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Alkalische Phosphatase in Osteoblasten oder in Knochenmarkszellen bestimmt.

8. Verwendung des Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 zum Substanz-Screening in der Toxikologie bzw. in der Pharmakologie, oder in der klinischen Chemie zur medizinischen Diagnostik.