JPS61217763A - 免疫学的検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗原の免疫学的検定法、およびかかる方法を実
施するだめのキットに関する。特に。

本発明は検定すべき抗原を定電するために酵素標識され
た抗体上使用することからなる免疫学的検定における改
良に関する（以下酵素免疫検定と称する）。

酵素免疫計量的検定は用いられる技法により種々の型１
例えば１一部位および２一部位検定に分類される。慣用
の１一部位酵素免疫検定では、検定すべき抗原（以下「
リガンド」と称する）は酵素標識された抗体に対しリガ
ンド類似体（すなわち、リガンドと同じ複合体形成特性
を有する試薬、「リガンド類似体」なる用語は検定すべ
きリガンドの知られたＩｌｉをその範囲内に包含する）
と競合し、ａ合体形成反応が完結したのち、結合された
標識された抗体を有するリガンド類似体が検定混合物か
ら分離される。

標識された抗体を結合するりガント畑似体の量は試料中
に存在するリガンド量に反比例するであろう。普通、リ
ガンド類似体は分離工程を促進するために固形支持体上
に固定される。複合体形成反応が起ったのち検定混合物
からの固形支持体の分離（リガンド類似体およびある割
合の標識された構成分と共に）に続き、リガンド類似体
と複合体形成した標識された構成分の割合を測定しそし
てそれによりリガント量を計算する。

ヨーロッパ特許出願第８５５０６２７２．７号に開示さ
れた型の改良された１一部位酵素免疫検定においては、
リガンド類似体は固形支持体上に直接結合されない。代
りに、リガンド類似体は試薬Ｘ例、ｔばフルオレセイン
イソチオシアネート（以下ＦＩＴＯと略記する）のよう
なハプテンと接合され、そして固相は試薬Ｘに対する特
異的な結合相手を接合して有する。かかる１一部位検定
は以下間接結合型の１一部位酵素免疫検定と称する。

１一部位法は１個またはそれ以上のエビ）−プ（すなわ
ち免疫学的結合部位）を有するすがンドの検定に使用さ
れうる。しかしながら、リガンドが１個以上のエピトー
プを有する場合は。

かかる部位の１種類のみが検定に用いられる。

普通サンドイッチ免疫検定と称される慣用の２一部位酵
素免疫検定においては、２種またはそれ以上のエピトー
プを有していなければならないリガンドは固相に接合さ
れた標識されていない抗体との反応によりネ溶化されそ
してリガンドの（好ましくは空間的に間隔をおいた）異
なるエピトープに対する酵素標識された抗体と反応する
。複合体形成反応ゆえに固定化される標識された抗体の
量が試料中に存在するリガンドの量に直接比例する。

間接結合型の２一部位酵素免疫検定は、ヨーロツ／ぞ特
許出願公告第１０５７１４号に記載の放射線免疫計量的
検定法と同様に、リガンドの異なるエピトープに対する
２種類の溶性抗体試薬を用いており、１種類の溶性抗体
試薬は酵素標識された抗体分子からなる。用いられる固
相は標識されてない抗体を特異的に非共有的に結合しう
るもう一つの試薬に接合される。これらの抗体は、例え
ば好都合には試薬Ｘに接合されうる。

次に分離工程は試薬Ｘに対する特異的な結合相手に接合
された固相を用いることにより達成される。

ここで使用される「抗原」なる用語は永久的に抗原性で
ある種類（例えばタン・ぞり質、ペプチドホルモン、細
菌、細菌断片、細胞、細胞断片およびウィルス）および
適当な条件下に抗原性となされうるハプテン（例えば麻
酔剤、催眠剤、鎮痛剤、心臓血管用薬物、ビタミン、非
ズプチドホルモンおよびその代部産物、抗生物質、農薬
および砂糖を含む）の両方を包含することが理解されよ
う。

ここで使用される「抗体」なる用語はその範囲内に下記
のものを包含する、すなわちａ）種々のクラスまたはサ
ブクラスの免疫グロブリンのいずれか、例えば慣用に用
いられる任意の動物５例えば羊、兎、ヤギまたはマウス
に由来するＩｇＣ）、Ｉ蜘、 ｂ）モノクローナル抗体、および Ｃ）抗体の結合領域を含有するモノクローナルまたはポ
リクローナル性抗体の断片、すなわちＦｃ部分のない断
片（例えばＦａｂ、　Ｆａｂ’　、　Ｆ’（ａ’ｂ’）
２）または完全なる抗体中のＨ鎖成分を連結しているジ
スルフイツド結合の還元的開裂により得られるいわゆる
「半分子」断片。

抗体の抗原結合断片の製法は画業上よく知られておりそ
してここには記載しない。モノクローナル抗体を製造す
るための技法もよく知られている（例えばＧａ１ｆｒｅ
　Ｇ、民地の「Ｍｓｔｈｏｄｓ　ｉｎｚｎｚｙｍｏ１ｏ
ｇｙＪ７３　、１〜４６（ｂ９８１）参照）。

特に、下記の抗原が前記した１一部位または２一部位法
により検定されうるすなわち、はプチドホルモンを含む
ホルモン（例えば甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）　、黄
体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）
　、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＯＣ））　、インシ
ュリンおよびプロラクチン）。

および非はプチドホルモン（例えばステロイドおよび甲
状腺ホルモン）、タンパク質（例えば癌胚抗原（（ＪＡ
）　）　、およびアルファフェトプロティン（ＡＦＰ）
　）　、薬物、砂糖、毒素およびビタミン。

しかしながらかかる検定法はそれらが実施される物理的
条件における変動、特に定められた検定操作からの逸脱
から生ずる変動に対して非常に影響を受は易い。免疫検
定における不正確さの主原因は誤った試薬容量の添加を
来すまずいピぼット操作、いくつかの検定管が試薬との
反応時間が異なシうることを意味するまずい時間選定お
よび分離段階が必要とされるところでのまずい管取扱い
（例えば遠心分＠または磁気分離、続くデカンテーショ
ンまたはアスピレーション）のような因子と関連してい
る。検定操作上の過誤は手動操作者においてよυ起りそ
うであるが、免疫検定実施用の自動化された器具は絶対
確実ではなく、そして例えば時として不正確な試薬容量
を交付するかまたは反応時間の変動を生じうる。

今、無作為的なまたは系統的な操作者による過誤と関連
した変動が補償されうる、すなわち第２の酵素標識を用
いる結果として内部標準化が達成されうる改良された酵
素免疫検定が発明された。

一方が検定すべき抗原を定量するだめそしてもう一方が
精度を高めるために２種類の標識（例えば２種類の螢光
標識）を用いる免疫検定は先に公告されたＰＯＴ出願Ｗ
Ｏ３０１０２０７６号に開示されている。しかしながら
無作為的または系統的な操作者の過誤以外の免疫検定特
に螢光免疫検定における不正確さく例えば固相を用いる
２一部位または競合的検定において、検出される標識の
量の結果としての変動ではなく標識の表示の性質におけ
る物理的変動の結果としてのシグナル変動）の原因を克
服することに関するこの公告された出願には２種類の酵
素標識の使用は開示されていない。事実、試料リガンド
に免疫学的に結合する受容体リガンドが品質管理のため
または保温培養に先立つ器具目盛定めのために接合され
た標識により検出されるべき場合は、受容体リガンドに
酵素を貼付するのは実際的でなかろうと記述されている
。

しかしながら、事実免疫検定システムに２種類の酵素標
識を用いることが可能であることおよびこれがいずれも
欠点のある放射性８Ａ識および／または螢光標識の使用
を回避するという長所を有することを見出した。放射性
標識は特殊な取扱い技術を必要としそして未熟練操作者
により使用されるには不適当であシうる。螢光標識は通
常紫外線照射を用いて作業しうる螢光計の便用を必要と
し、これらは定常的に使用するには比較的高価である。

一方酵素は比色計で検定されうる着色した溶液を生成す
る基質を用いて使用でき、これらははるかにより簡単で
一般に螢光計よシ高価でない。さらに、非常に低レベル
の螢光標識は評価困難であるのに、低しばルの酵素標識
は酵素１モルが多くのモル数の生成物を生成して高い畳
量を生じそして発色反応を増巾しうるので単に検定の時
間を増大させることにより評価されうる。酵素システム
は螢光システムよシも背景の妨害に対してより影響を受
けに＜＜、螢光標識の使用は螢光化合物が光線中で不安
定である傾向があるという付加的な欠点を有する。

本発明はその局面の一つにおいて、液体試料中のリガン
ドの免疫学的検定を行うにあたり。

２種類の独立して測定しうる酵素標識を検定系の２種類
またはそれ以上の構成分または構成分の楽団に別々に接
合させ、複合体形成反応が完結したのち第１の酵素標識
の実質上すべておよび第２の酵素標識のある割合を検定
混合物からとり出し、とり出された第２の標識の割合が
前記リガンドの量に関連しておりそして前記した８ｇ２
の標識の割合の測定により得られた検定がとり出された
総第一標識の測定と比較することにより標準化されるこ
とからなる検定法を提供するものである。

分離工程は、例えば、第１の標識に接合された構成分（
燐が固形支持体に直接にまたは間接的に結合されること
により達成されうる。固形支持体は例えば微細に分割さ
れた不活性粒子またはビード（例えばラテックス粒子）
の形態であることができそしてかかる粒子またはビード
は所望の場合は分離工程を促進するために磁気性である
かまたは磁化されうる。適当な磁気性または磁化されう
る固形支持体は［Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓｆｏｒ　Ｃ
１ｎ１ａａｌ　ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　（Ｈｕｎｔｅｒ
氏他堀、０民地ｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ
出版、（ｂ９８，５年））第１４７〜１６２頁に記載さ
れており、例えばＦｅ２Ｏ２を含有するセルロース組成
物の粒子が使用されうる。

不正確さがピはット操作、時間選定、温度等における過
誤から生じうる最終的な酵素反応段階を含む酵素免疫検
定のすべての段階の内部標準化のための第２の酵素標識
を使用するには、同時に検定されうる２種類の適当な酵
素を使用して、同じありうる変動および過誤が両方の反
応に適用されることが必要である。従って酵素免疫検定
に必要な基準（酵素活性または免疫活性を失うことなく
、マたは少ししか失うことなく適切な構成分に酵素が接
合される能力、および試料または検定条件による妨害を
受けないこそ）を満たすのみならず、ある条件下に免疫
反応中に相互に反応せずそして別々の基質の変換を同時
に触媒して相互に独立して測定されつる生成物を生成さ
せうる２種類の適当な酵素−基質対を確認することが必
要である。

本質的に両立でき従って同時に検定されうる２種類の酵
素アルカリホスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼ
による。基質変換に対する要件を見出した。

本発明方法は例えば１一部位および２一部位酵素免疫検
定の両方に適用しうる。

従って１本発明の態様の一つによれば。

（ａ）　　第１の酵素標識で標識されたりガント類似体
および第２の酵素標識で標識されたそのリガンドに対す
る抗体と試料とを連続してまたは同時に（前記第１の酵
素標識が前記第２の酵素標識とは独立して監視されうる
ようにして）保温培養して複合体を形成させ。

（ｂ））　　前記第１の酵素標識を含有する複合体形成
された構成分をリガンド類似体と複合体形成してない前
記第２の酵素標識のフラクションから分離し、そして （ｃ）　　前記第１の酵素標識を含有する工程（ｂ）が
ら分離された複合体形成された構成分中の前記第２の酵
素標識の量を前記分離された構成分中に存在する前記Ｍ
１の酵素標識の測定に関連して測定することにより　Ｉ
Ｊガントの標準化された検定を行う、 工程を包含する液体試料中の１個またはそれ以上のエピ
トープを有するリガンドの１一部位酵素免疫検定を行う
方法が提供される。

本発明のこの特徴はすべての１一部位酵素免疫検定に適
用できる。しかしながら特に、これはヨーロッパ特許出
願第８５５０６２７２．７　号記載の間接結合型の１一
部位酵素免疫検定に適用してかかる検定の内部標準化変
換を行いうる。

従って、本発明の好ましい特徴においては、第１の酵素
標識で標識されたリガンド類似体が試薬Ｘをも貼付され
ており（この試薬は検定混合物中に遊離の試薬としては
存在していない）そして工程（ｂ））が試薬Ｘに対して
特異的な結合相手を担持する固相を用いて達成されるこ
とからなる本発明による１一部位免疫検定を実施する方
法が提供される。

試薬Ｘは好都合には例えば、フルオレセイン誘導体（例
えばフルオレセインインチオシアネート（以下ＦＩＴＣ
と略記する））％　ローダミンインチオシアネート％２
．４−ジニトロフルオロベンゼン、フェニルイソチオリ
アネートおよびダンシルクロライドからなる群から選択
されるハプテンであることができ、そして試薬Ｘの特異
的な結合相手はこの場合それに対する抗原であろう。試
薬Ｘとして好ましいのはフルオレセインの誘導体特にＦ
　ＩＴＯである。試薬ＸがＦＩＴＯである場合、それに
対する固相上の特異的な結合相手は固形支持体に共有結
合された抗ＦＩＴＯ抗体でありうる。抗血清は常法によ
り例えば羊をキーホール・りンはット（ｋｅｙｈｏｌｅ
　ｌｉｍｐｅｔ）　ヘモシアニンに接合し九Ｆ　ＩＴＣ
ｔで免疫することにょシ調製されうる。固形支持体への
抗血清の結合は２例えば、　　Ａｘｏｎ氏他の民地ａｔ
ｕｒｅＪ２１４　、１３０２〜１３０４（ｂ９６７’）
記載の方法を用いて遂行されうる。

前記した試薬Ｘ／接抗−薬Ｘシステムに対する代替の好
都合な結合システムはアビジン／ビオチン結合システム
である。

本発明の第２の態様によれば、 （ａ）　　リガントと同時に複合体形成しうるところの
リガンドに対する抗体の２種またはそれ以上の集団を包
含する試薬（この試薬は２種類の酵素標識を用いており
、これら標識は集団の一方における第１の標識が他の集
団（類）における第２の標識とは独立して監視されうる
様式となっている）の存在下に試料を保温培養して複合
体形成を平衡に達せしめ。

（ｂ）　　前記第１の酵素標識を含有する構成分を複合
体形成してない前記第２の酵素標識を含有する構成分か
ら分離し、そして （ｃ）　　前記第１の酵素標識を含有する工程（ｂ）か
ら分離された複合体形成された構成分中の前記第２の酵
素標識の量を前記分離された構成分中に存在する前記第
１の酵素標識の測定に関連して測定することによりリガ
ンドの標準化された検定を行う、 工程を包含する、液体試料中における１個よシ多いエピ
トープを有するリガンドの２一部位酵素免疫検定を実施
する方法が提供される。

複合体形成してない第２の酵素標識を含有する構成分か
ら工程伽）により分離される第１の酵素標識を含有する
構成分が第２の酵素標識の複合体形成された７ラクシヨ
ンをも含有しようことは認識されよう。従って、工程伽
）は第２の酵素標識を担持する試薬の複合体形成された
相および複合体形成されてない相の分離をも同時に行う
ものである。本発明のこの特徴はすべての２一部位酵素
免疫検定に適用できる。しかしながら特に、間接結合型
のサンドイッチ酵素免疫検定に適用されてかかる検定の
内部標準化変換をもたらしうる。

従って１本発明の好ましい態様においては、（ａ）　　
液体試料、 （ｂ））　　第１の酵素標識で標識されたりガントに対
する抗体を包含する試薬、 （ｃ）　　第２の、独立して測定しうる酵素標識で標識
されたリガンドに対する抗体を包含する試薬、および （ｄ）　　非共有結合により構成分（ｂ）に結合しうる
が、構成分（ａ）または構成分（Ｃ）のいずれにも直接
結合できず、かつ固相支持体に結合された試薬、からな
る混合物を保温培養し、検定混合物から固相を分離しそ
して分離された固相構成分中の前記第２の酵素標識の量
を前記分離された構成分中に存在する前記第１の標識の
測定に関連して測定することによりリガンドの標準化さ
れた検定を行うことからなる本発明による２一部位免疫
検定を実施する方法が提供される。

構成分（ｂ）が第１の酵素標識に加え試薬Ｘに接合した
抗体からなシそして試薬（ｄ）が試薬Ｘにとっての特異
的な結合相手である（この試薬Ｘは検定混合物中に遊離
の試薬としては存在しない）ことが特に好ましい。適当
な試薬Ｘ／特異的な結合相手の対は１一部位酵素免疫検
定について前記したとおりである。

本発明による免疫検定法に用いられる２種類の酵素標識
が基質を独立して測定しうる生成物に同時に変換できそ
して、分離工程に続き、検定混合物からとり出された２
種類の標識の量が同時進行する酵素反応により測定され
るのが好ましい。２つの同時進行する酵素反応の生成物
が吸収測定により独立して測定しうろことが望ましい。

本発明による免疫検定法において、−緒に使用するのに
適する２種の酵素−基質の対はアルカリホスファターゼ
／フェノールフタレンモノホスヘートおよびβ−ガラク
トシダーゼ／　ｐ　−二トロフェニル−！−Ｄ−ガラク
トシド（以下ｐ−ＮＰＢＧと略記する）である。所望の
場合は、ｐ−ニトロフェニルーβ−Ｄ−ガラクトシドハ
。

−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドにより置き代
えられうる。アルカリホスファターゼおよびβ−ガラク
トシダーゼは、主にそれらが活性を実質上損うことなく
他のタン／ぞり質（例えば抗体）に容易に結合でき〔例
えば、工ａｈｉｋａｗａ民地の「Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙＪ　ｉ、　２０９〜３２７　（ｂ９８３年）お
よび「Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪη−１（ｂ９８４）Ｐ４３４〜４
４３参照〕そして着色した生成物を生ずる反応を触媒し
うるゆえに慣用の酵素免疫検定における標識として使用
するのに現在特に好ましい。

アルカリホスファターゼによるフェノールフタレンモノ
ホスヘートの加水分解く最適の−は９．８である。高濃
度（約０．２５Ｍ〜ＩＭ）のジェタノールアミンの存在
下では−は活性の損失を損うことなくＣ６に減少されう
ることか見出された。

！−ガラクトシダーゼはｐ−ニトロフェニル−／−Ｄ−
ガラクトシド（ｂ）−ＮＩ）Ｂ（）　）に対し至適ｐＨ
７，４を有するが、通常の基質濃度（約５ｍＭｔで）を
用いる単一の検定形式においては−はわずかなるのみの
活性損失（約２０１）Ｌか伴わずにＣ６に上昇されうる
。しかしながら同じ検定システムであるが但し約１Ｍの
ジェタノールアミンを含有するシステムにおいては、β
−ガラクトシダーゼの活性はほとんど全部破壊される。

ジェタノールデミンによるβ−ガラクトシダーゼ阻害力
学は複雑であるが、主なる作用は１Ｍ：）エタノールア
ミンの存在下におけるｐ−ＭＰｍに対するβ−ガラクト
シダーゼの−が６６μＭから２１　ｍＭに変えられる競
合である。ｐＨＣ６でｐ−ＮＰＢ（）の濃度を約１Ｍの
りエタノールアミンの存在下においてすらも増大させる
ことＫよシβ−ガラクトシダーゼの相当の活性が得られ
ることが見出された。

従って、本発明による免疫検定法に対し選択された酵素
標識がアルカリホスファターゼおよびβ−ガラクトシダ
ーゼである場合は、分離工程で検定混合物からとり出さ
れる２種類の標識の量は例えば当初的０．２５Ｍ〜１Ｍ
のりエタノールアミン、約１０ｍＭのフェノールフタレ
ンモノホスヘートおよび約５０ｍＭのｐ−ニトロフェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトシドを包含するーａ６の基質緩衝
溶液の存在下に保温培養することにより測定されうる、
アルカリホスファターゼ標識によるフェノールフタレン
そノホスヘートのフェノールフタレンへの変換は好まし
くは５５４　ｎｍでの吸収を測定することにより監視さ
れ、一方β−ガラクトシダーゼ標識によるｐ−ＮＰＢＧ
のｐ−二トロフェノールへの同時変換は好ましくは４０
４　ｎｍでの吸収を測定することにより監視され、フェ
ノールフタレンの低い吸収についてはこの波長で補正が
なされる。

本発明の免疫検定は複雑な器臭使用を必要とすることな
く高い一買した精度が達成されうるという長所を有する
。放射性同位元素標識を用いる免疫検定の場合における
ような特殊の安全性注意は何ら必要でなく、また螢光免
疫検定におけるよう表背景の妨害も問題とはならない。

本発明のもう一つの特徴においては本発明による免疫検
定法を実施するための試薬キットが提供される。かかる
キットは、例えば、酵素標識で標識された第１の構成分
および異なる、区別しうる酵素標識で標識された第２の
構成分を包含しうる。従って、本発明による１一部位免
疫検定用のキットの場合、該第１の構成分は酵素標識さ
れたりガント類似体を包含しそして該第２の構成分は第
２の酵素標識で標識されたリガンドに対する抗体を包含
するであろう。前記第１の構成分は固形支持体に接合さ
れうる。あるいはまた、間接結合型の本発明による１一
部位免疫検定用のキットの場合は、前記第１の構成分は
酵素標識に加え、試薬Ｘに接合されようし、そしてその
キットは試薬Ｘに対する特異的な結合相手に接合した固
形支持体をもさらに包含しうる。

本発明による２一部位免疫検定のための試薬のキットは
酵素標識で標識されたリガンドに対する抗体の第１の集
団および異なる酵素標識で標識されたところのリガンド
に対する抗体の第２の集団を包含することができ、かか
る抗体の集団は２種類の異なるエピトープに対するもの
である。前記した抗体の第１の集団は固形支持体く接合
されうるかまたはキットは別の固形支持体をさらに包含
することができる。従って。

例えば、抗体の前記した第１の集団は間接結合型の本発
明による２一部位免疫検定に使用するために酵素標識に
加えて試薬Ｘと接合され、キットは試薬Ｘに対する特異
的な結合相手に接合した固形支持体をさらに包含しうる
。

使用の便宜上、本発明によるキットの２種またはそれ以
上の構成分は単一の試薬中に一緒にされうる。１種また
はそれ以上の構成分が凍結乾燥された形態で供給されう
る。

前記したように１本発明方法によれば内部的に標準化さ
れた検定が実施されうる。理論的な考察に縛られること
を欲しないが、固形支持体を用いる本発明による免疫検
定の場合、相を分離したのちの第１の標識からのシグナ
ルはりガンどの濃度からは独立していようがしかし固相
との結合反応（Ｉ！＃に固相の容量および濃度、および
保温培養の時間および温度）、相分離の効率および標識
が監視される物理的条件における変動（例えば培養時間
、温度等）に従属しよう。

一方分離した後の第２の標識からのシグナルは試料中の
りガントの濃度、固相とのカップリング反応、相分離の
効率および標識が監視される物理的条件における変動に
従属しよう。従って標識２からのシグナルを標識１から
のそれを用いて標準化することにより、検定に影響する
多くのノミラメ−ターにおける変動の影響が制御できそ
して薬量応答関係が安定化されうる。

下記の非限定的実施例により本発明を説明する。

実施例　１ 黄体形成ホルモン（ＬＨ）の検定における基質培養容量
と培養時間の補正 出発物質の調製 １、抗−ＬＨ抗体の調製 Ｍｉｌｓｔｅｉｎ氏他の「Ｎａｔ民地ｅＪ　２５６、（
ｂ９７５）４９５〜４９７記載の方法によりマウスの腹
水液からモノクローナル抗体を得た。それぞれのハイブ
リドーマ細胞系列から得られた抗体を調べて別々の抗原
決定基に対する抗体を産生ずるハイブリドーマを確認し
た。ＬＨに対し最大の親和性を有するものを選択して検
定に使用した。

Ｚ　アルカリホスファターゼ／抗−ＬＨ接合体の調製 Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン−１−カルホキシレー）　（ｓＭｃｃ）　
（ジメチルホルムアミド中６０ｍＭ）α１６ｍをアルカ
リホスファターゼ（５ｏｍＭポウ酸ナトリウム、１ｍＭ
塩化マグネシウム、およびα１　ｍＭ塩化亜鉛中２１１
ｖ／ｄ、　ｐＨ７，６＞　１．６−中に加えそして３０
℃で１時間保温培養した。−１０の１１Ｍトリス、１ｍ
Ｍ塩化マグネシウムおよびｌ１１ｍＭ塩化亜鉛中で平衡
となされたセファデックス（）−２５中等カラム（ＩＸ
３５ｍ）に通すととＫより酵素を分離した。精製された
酵素を必要時まで＋４℃で保存した。

Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート（以下８ＰＤＰと略記する）（エタノール中
２５ｍＭ）１６．３μ込を抗−ＬＥＥモノクローナル抗
体（ｐＨ６，０の２００ｍＭプロピオン酸ナトリタナト
リウム中／ｄ）１ｄ中に加えそして室温で３０分間保温
培養した。ｐＨ４，５の２００画酢酸ナトリウム緩衝液
中で平衡となされた使い捨てセファデックスＧ−２５カ
ラム（ＦＤ−１０）に通すことにより抗体を分離した。

この抗体にジチオトレイトール（ｂＭ）を加え（抗体容
量のＡＯが添加された）そして室温で１０分間放置した
。−６、ＯＯ２００ｍＭプロピオン酸ナナトリウム中平
衡となされたセファデックスＧ−２５中等カラム（ＩＸ
３５ｃｒＲ）を用いて抗体を脱塩した。

前記のようにして調製された抗体およびアルカリホスフ
ァターゼを等モル比にて混合しそして４℃で２４時間放
置して接合させた。得られる接合体を−６，０の２００
　ｍＭプロピオン酸ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウ
ムおよびα１ｍＭ塩化亜鉛中で平衡と表された１日に３
０００８Ｗカラム上の高性能液体クロマトグラフィー（
ＨＰＩＪ（りＫよシ精製した。この接合体を検定用緩衝
液中に２．５μｆ／−の濃度まで希釈して検定に使用し
た。

五　β−ガラクトシダーゼおよびフルオレセインインチ
オシアネート（Ｆ工ＴＯ）に接合した抗−ＬＨの調製 アルカリホスファターゼに接合した抗体とは異なるＬＨ
分子上のエピトープに特異的な抗−ＬＨ２，５岬を重炭
酸塩緩衝液（ｃ，０２Ｍ、、ｐＨ９，１）中に溶解させ
そして０．５ｎｐ／−の？工Ｔ０５００μ込と混合した
。４℃で一夜培養したのち、接合体をプロピオン酸ナト
リウム緩衝液（ｃ，２Ｍ、　ｐＨ６，０）で平衡となし
たセファデックスＧ−２５カラムに通すことにより精製
した。

５ＰＤＰ　（エタノール中２５ｍＭ）１５０．ａｆｆｉ
を精製した接合体に加えそして室温で３０分間保温培養
した。プロピオン酸ナトリウム（ｌ１ｌＬ２　Ｍ、　退
０）で平衡となしたＴＳＫ３００ＳＷカラム上のＨＰＩ
、Ｃによりさらに精製した。次にこの接合体をこれもプ
ロピオン酸ナトリウム緩衝液（ｃ，２Ｍ、　ｐＨ６，０
）中の等モル濃度のβ−ガラクトシダーゼと混合しそし
て４℃で培養した。得られる接合体をプロピオン酸ナト
リウム緩衝液（ｃ，２Ｍ、　ｐｉ１６．０　）　テ平衡
となされた７８に４０００カラム上で精製した。

この接合体を検定用緩衝液中に１７μｆ／−の濃度まで
希釈して使用した。

４、磁化しうる固相に共有結合された抗−Ｆ工ＴＣ抗体
の調製 抗−１１ＰＩＴＣハキ−ホール・リンにットヘモシアニ
ンに接合した？工ＴＣを用いて羊を免疫することにより
得られる慣用のポリクローナル抗血清である。磁化しう
るセルロース粒子は平均粒子直径３ミクロンを有する約
５０−の黒色酸化鉄（ＦｅｓＯａ）を含有するセルロー
スの組成物である（　Ｆｏｒｒｅｓｔ氏他の「工ｍ民地
ｎｏａｓ日ａｙｓ　ｆｏｒ　Ｃ１ｉｎｉｃａＣ１１ｎｉ
ｃａｌＣｈｅ第１４７〜１６２頁中の’　Ｍａｇｎｅｔ
ｉｃＰａｒｔｉｃｌｅ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａａｓ
ａｙ’　参照、Ｈｕｎｔｅｒ氏他編、Ｃ民地ｒｃｈｉｌ
ｌ　ＬｉｖｉｎｇｓｔＯｎｅ出版、（ｂ９８３年）〕。

抗−「工Ｔｏ抗血清はＡｘ８ｎ氏他の民地ａｔｕｒｅＪ
」１．１３０２〜１３０４（’９６７）記載の操作に従
いセルロースの臭化シアン活性化に続き磁化しうるセル
ロースに共有結合された。抗血清は磁化しうる固相１Ｆ
に対し抗血清２−の割合で結合された。

この固相を０１％のナトリウムアジド、ｃＬ５チの牛血
清アルブミン（以下ＢＡＡと略記する）、フラクション
ｖ、０．２５１ｉトゥイーン２ｏおよび０．５％のメト
セルを含有する…ａｏの５０ｍＭ）リス／ＨＣＱ緩衝液
中に２．５ｑ／−に希釈した。

ａ　　ＬＨ標準溶液の調製 国際基準製剤（工ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｆｅ
ｒｅｎｃｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）　６８　／　４０
に対して横変した凍結乾燥されたＬＨの製剤を牛血清栄
で希釈して濃度ｏ１１．２．１０．２５．５０．１００
および２００　ｍ工ｔ７　／ｍｉ！となした。

＆　検定用緩衝液の調製 検定用緩衝液はｐ！（ａｏｏｏ、１Ｍ　トリス／Ｈｃｘ
中のα５　％　ＢＥＴＡ　、フラクションｖ１　α２チ
羊血清、１ｍＭ塩化マグネシウム、α１ｍＭ塩化亜鉛、
（ＬＩＭ塩化ナトリウムおよびｃＬ２％ナトリウムアジ
ドからなる。

ｌ　洗浄用緩衝液の調製 洗浄用緩衝液は−＆６のα０１Ｍトリス／ＨＣｆｔ中の
０．９％塩化ナトリウムからなる。

ａ　基質緩衝液の調製 基質緩衝液はα９チ塩化ナトリウムおよび１鮨の塩化マ
グネシウムを含有する…＆６のジェタノールアミン１２
５Ｍ溶液からなる。次にこの緩衝液にアルカリホスファ
ターゼ用の基質（ｂ０ｍＭフェノールフタレ／モノホス
ヘート）およびβ−ガラクトシダーゼ用の基質（５０ｍ
Ｍｐ−二トロフェノール−β−Ｄ−ガ２クトシド）が溶
解された。

９　ストップ溶液の調製 ストップ溶液は５０　ｍＭ炭酸ナトリウム、５ｍＭ燐酸
ナトリウムおよび５０　ｍＭ　ＫＤＴＡナトリウムから
なる溶液をｐＨ１２に調製しそして次に２５ｍＭＮａＯ
Ｈを添加することによりｖ！４ｇされた。

検定方法 各標準物１００１ＩＱをポリスチレン製検定管中に２通
りずつピペットで移した。各抗体−酵素接合体５０μ℃
および検定用緩衝液１００μλずつを各管に加えた。す
べての管を混合しそして３７℃で２０分間培養した。磁
化しうる抗−「工ＴＣ固相２００μβを各管に加え続い
て混合および３７℃で５分間培養した。同相を磁気によ
り分離し、上澄みをデカンテーションしそして洗浄用緩
衝液５００μＬを各管に加えた。混合したのち、再び固
相を磁気的に分離した。この洗浄操作をさらに２回反復
し、最後の洗浄後、管を逆さにしそして５分間排液せし
めた。

基質溶液３００μλを各管に加え、混合し、そして管を
３７℃で１５分間培養した。ストップ溶液１−ずつを各
管に加えそして検定物を磁気により分離した。上澄み液
の４０４　ｎｍおよび５５４　ｎｍ　ｉｃおける吸収を
Ｈａｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　（ＨＰ８４５１Ａ　
Ｄｉｏｄｅ　Ａｒｒａｙ）分光光度計で測定し、β−ガ
ラクトシダーゼ反応の生成物は４０４　ｎｍでそしてア
ルカリホスファターゼ反応の生成物は５５４　ｎｍで吸
収した。アルカリホスファターゼ反応生成物は４０４　
ｎｍでもわずかに吸収しそしてそれゆえ４０４　ｎｍで
の吸収はそれに合うように補正された。

アルカリホスファターゼ活性はＬＨの濃度と正の相関を
有しており従って５５４　ｎｍでの吸収値から標準曲線
が構成されうる。内部測定体であるβ−ガラクトシダー
ゼ活性は標準曲線全体を通して一定に留まっていなけれ
ばならない。

１０種の標準曲線を調要しそして５５４　ｎｍでの平均
光学濃度（ｃ，Ｄ）が各標準物について計算された。全
体にわたる４０４　ｎｍでの平均０．Ｄ、も計算された
。かくして標準物および測定体に対する予期された吸収
が定められた。

検定条件における変動は４０４　ｎｍおよび５５４ｎｍ
での観察された吸収に影響する。５５４　ｎｍでの吸収
は下記式を用いて標準化される。

５５４　ｎｍでの標準化された吸収はその標準物につい
て予期された平均の±１５１５チに該当すべきである。

実験の第１シリーズには検定における酵素培養工程で存
在する基質容量の、減少（２５０μ２）および増大（３
５０μぶ）の両方が包含される。その結果（第１表）で
は高濃度のＬＨでは、基質容量の変化が予期された値の
１５チよシ大きい過誤を示す検定を生ずることが示され
る。内部標準化補正因子を適用することにより、　ＩＨ
値は再び予期された値の±１５チ過誤以内となる。従っ
て、内部標準化は基質容量における過誤を補正しうる。

基質培養期間の長さを次に変える、すなわち２０分まで
増大させおよび１０分まで減少させる。いずれの場合で
も観察されたデータに内部標準化操作を適用することに
よりＬＨ濃度値が予期された値の±１５％以内に補正さ
れた（第２表）。

このことは内部標準化操作により誤った基質培養時間が
補正されうろことを示している。

実施例　２ チロキシン（Ｔ４）検定における基質培養容量および培
養時間の補正 出発物質の調製 １、　抗−Ｔ４４膜の調製 実施例１における抗−ＬＨ抗体の調製と同じ方法が用い
られた。

２、　アルカリホスファターゼ／Ｔ４／ＦＩＴＣ接合体
の調製 Ｆｒ　ｉｋ氏民地［Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃ
ａｌ　Ｂｌｏｃｈｅｍｉ−ｓｔｒｙ　Ｊ　２１．　（ｂ
９８４）　ｐ４３４〜４４３記載の方法によりアルカリ
ホスファターゼをチロキシンに結合させた。重炭酸塩緩
衝液（ｃ，０２Ｍ、　ｐＨ９，１）３ｔＩＩｌ中の酵ｊ
ｌ　３１５　ｎモルをｐｉ４９．４の０．０４Ｍ禮パル
ビタール緩衝液１２−中に加えた。この溶液に０．０１
Ｍ水酸化す）　ＩＪウム２．５−中のチロキシン３．７
５μモル続いて水５０μを中のグルタルアルデヒド２．
５μモルを加えた。２６℃で２１／Ａ時間後、水２００
μを中のＬ−リジン塩酸塩２０μモルの溶液を加え１時
間後に水中の水素化硼素ナトリウム３．７５μモルを添
加しそしてさらに０℃で１時間培養した。生成物を＋４
℃で４８時間透析したのち、試料をＡ前記ｃｏｎ　ＹＭ
　１０膜での限外濾過により濃縮しそしてトリエタノー
ルアミン緩衝液（ｃ，１Ｍ、　１）８７．０　）を用い
て平衡となしたセファデックスＧ−２５カラムで順次６
回クロマトグラフィーした。次にこの物質を高性能液体
クロマトグラフィーカラム（ＴＳＫ　３０００　ＳＷ）
上トリエタノールアミン緩衝液（ｂ００ｍＭ％ｐＨ７０
）で溶離することにより′Ｎ製した。溶離した物質をＰ
ｈａｒｍａｃｉａ　Ｇ−２Ｓ　Ｐｏ　１０カラムに通す
ことにより重炭酸塩緩衝液（ｃ，０２Ｍ、　ｐｔｉ９．
０　）中で平衡化させ、そして４℃で一夜培養すること
により接合体１−当り０．０８３Ｑにてフルオレセイン
イソチオシアネー）（ＦＩＴＣ）に結合させた。得られ
ルＦＩＴＣ／Ｔ４　／アルカリホスファターゼ接合体を
トリエタノールアミン緩衝液（ｏ、１Ｍ、ｐｉ（Ｚｏ）
中で平衡となしたＰｈａｒｍａｃｌａ　ＰＤｌｏ　Ｇ−
２５カラムに通すことにより精製した。

３、　β−ガラクトシダーゼに接合した抗−Ｔ４４膜の
調製 ５ＰＤＰ　（エタノール中２５ｍＭ）１５０μｔをｐＨ
６［の０．２Ｍプロピオン酸ナトリウム緩衝液中の１０
０μ？／−の抗−Ｔ４４膜９４−に加えそして室温で６
０分間培養した。生成する抗体を次にプロピオン酸ナト
リウム緩衝液（ｃ，０２Ｍ、　ｐ１′１６．０　）中で
平衡化したＨＰＬＣＴＳＫ　３０００　ＳＷカラムに通
すことにより精製した。かくして得られた抗体を等モル
濃度のβ−カラクトシダーゼと混合しそして４℃で一夜
培養し次にプロピオン酸ナトリウム緩衝液（ｃ，２Ｍ、
　ｐＨ６，Ｑ　）中で平衡化されたＴＳＫ　４０００カ
ラムで精製した。

４、　磁化しうる固相に共有結合した抗−ＦＩＴＣ抗体
のｙ４展 固相を７．５　ｍｙ／讐の濃度まで希釈してＴ４検定に
使用する以外は実施例１と同じ方法でこの試薬を調製し
た。

５、Ｔ４の標準溶液の調製 Ｌ−チＩ：Ｉキシンナトリウム塩（８１ｇｍａ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａ１社製品、ロンドン〕を０．１Ｍ水酸化ナトリ
ウム溶液中に溶解させそして次ＫＴ４を除去したヒトの
血清で希釈してＴ４２１．２３μｍ−の原液となした。

次にこの原液なＴ４を除去したヒトの血清でさらに希釈
してＴ４の最終濃度０．２５，６、ｓｔｉ、１１７．１
６３．２１５および３１１　ｎｆ／ｄとした。Ｔ４ゼロ
試料はさらにアフイニテイ稍製してヒト血清中に存在す
るすべての甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を除去した。

６　検定用、洗浄用、基質用緩衝液およびストップ溶液
の調製 これらすべての試薬は実施例１記載のものと同じである
。

検定法 実施例１においてＬＨについて記載されたものと同じで
あるが、以下の修正がなされた、すなわち 各酵素接合体１００μｔが添加されそして当初培養時間
が６０分間に延長された。

基質培養時間が６０分に延長された。

計算 β−ガラクトシダーゼ活性はＴ４の濃度と負の相関を有
しており、従って標準物は４０４ｎｍでの吸収から構成
される。アルカリホスファターゼ活性は内部測定体とし
て用いられた。

６種の標準曲線が作られそして４０４ｎｍでの平均０．
Ｄ、が各標準について計算された。

５５４ｎｍでの全体にわたる平均０．Ｄ、も計算された
。

５５４ｎｍでの吸収は下記の式を用いて標準化される。

標準化された０−Ｄ−４０４＝ ４０４ｎｍでの標準化された吸収はその標準物について
予期された平均の±１５％以内に該当すべきである。

実験の第１シリーズには検定の酵Ｘｆ＠養工程中に存在
する基質容量の変化が包含され、より多い量（３５０μ
ｔ）およびより少ない量（２５０μｔ）の両方が用いら
れる。その結果（第６表）ではＴ４の低いレベルおよび
高いレベルのいずれにおいても、内部標準化操作を適用
することは検定におげろ±１５チより大きいすべての過
誤を補正するのみならず、その値が予期された値の±１
５チ以内に該当する試料についての過誤をも減少させよ
うことが示される。従って、内部標準化操作は基質容量
における過誤を補正するであろう。

次に基質培養時間の長さを４５分に減少させることによ
りおよび５５分まで延長させることにより変動させた。

ここでもまた、その結果（第４表）では、検定に内部標
準化操作を適用することにより、その過誤が予期された
値の±１５％より大きい任意のデータポイントが補正さ
れて値が予期された値の過誤以内に該当しうることが示
される。このことは内部標準化操作が誤まった基質培養
時間を補正しうろことを示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）液体試料中のリガンドの免疫学的検定を行うにあた
   り、２種類の独立して測定しうる酵素標識を検定系の２
   種類またはそれ以上の構成分または構成分の集団に別々
   に接合させ、複合体形成反応が完結したのち第１の酵素
   標識の実質上すべておよび第２の酵素標識のある割合を
   検定混合物からとり出し、とり出された第２の標識の割
   合が前記リガンドの量に関連しておりそして第２の標識
   の前記した割合の測定により得られた検定がとり出され
   た総第一標識の測定と比較することにより標準化される
   ことからなる検定法。 ２）（ａ）第１の酵素標識で標識されたリガンド類似体
   および第２の酵素標識で標識されたそのリガンドに対す
   る抗体と試料とを連続してまたは同時に（前記第１の酵
   素標識が前記第２の酵素標識とは独立して監視されうる
   ようにして）培養して複合体を形成させ、 （ｂ）前記第１の酵素標識を含有する複合体形成された
   構成分をリガンド類似体と複合体形成してない前記第２
   の酵素標識のフラクシヨンから分離し、そして （ｃ）前記第１の酵素標識を含有する工程（ｂ）から分
   離された複合体形成された構成分中の前記第２の酵素標
   識の量を前記分離された構成分中に存在する前記第１の
   酵素標識の測定に関連して測定することによりリガンド
   の標準化された検定を行う、 工程を包含する前記特許請求の範囲第１項記載の１−部
   位免疫学的検定を行う方法。 ３）第１の酵素標識で標識されるリガンド類似体が試薬
   Ｘをも貼付されており（この試薬は検定混合物中に遊離
   の試薬としては存在していない）そして工程（ｂ）が試
   薬Ｘに対する特異的な結合相手を担持する固相を用いて
   達成されることからなる前記特許請求の範囲第２項記載
   の方法。 ４）（ａ）リガンドと同時に複合体形成しうるところの
   リガンドに対する抗体の２種またはそれ以上の集団を包
   含する試薬（この試薬は２種類の酵素標識を用いており
   、これら標識は集団の一方における第１の標識が他の集
   団（類）における第２の標識とは独立して監視されうる
   様式となつている）の存在下に試料を保温培養して複合
   体形成を平衡に達せしめ、 （ｂ）前記第１の酵素標識を含有する構成分を複合体形
   成してない前記第２の酵素標識を含有する構成分から分
   離し、そして （ｃ）前記第１の酵素標識を含有する工程（ｂ）から分
   離された複合体形成された構成分中の前記第２の酵素標
   識の量を前記分離された構成分中に存在する前記第１の
   酵素標識の測定に関連して測定することによりリガンド
   の標準化された検定を行う、 工程を包含する前記特許請求の範囲第１項記載の２−部
   位免疫学的検定を行う方法。 ５）（ａ）液体試料、 （ｂ）第１の酵素標識で標識されたリガンドに対する抗
   体を包含する試薬、 （ｃ）第２の、独立して測定しうる酵素標識で標識され
   た、リガンドに対する抗体を包含する試薬、および （ｄ）非共有結合により構成分（ｂ）に結合しうるが、
   構成分（ａ）または構成分（ｃ）のいずれにも直接結合
   できず、且つ固相支持体に結合された試薬、 からなる混合物を保温培養し、検定混合物から固相を分
   離しそして分離された固相構成分中の前記第２の酵素標
   識の量を前記分離された構成分中に存在する前記第１の
   標識の測定に関連して測定することによりリガンドの標
   準化された検定を行うことからなる前記特許請求の範囲
   第４項記載の方法。 ６）試薬（ｂ）が第１の酵素標識に加え試薬Ｘに接合し
   た抗体からなりそして試薬（ｄ）が試薬Ｘにとつての特
   異的な結合相手である（この試薬Ｘは検定混合物中に遊
   離の試薬としては存在しない）ことからなる前記特許請
   求の範囲第５項記載の方法。 ７）試薬Ｘがフルオレセイン誘導体、ローダミンイソチ
   オリアネート、２，４−ジニトロフルオロベンゼン、フ
   ェニルイソチオリアネートおよびダンシルクロライドか
   らなる群から選択されるハプテンである前記特許請求の
   範囲第３または６項記載の方法。 ８）使用される酵素と基質の対がアルカリホスファター
   ゼ／フェノールフタレンモノホスヘートおよびβ−ガラ
   クトシダーゼ／ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクト
   シドまたはβ−ガラクトシダーゼ／ｏ−ニトロフェニル
   −β−Ｄ−ガラクトシドである前記特許請求の範囲第１
   〜７項のいずれか１項記載の方法。 ９）検定混合物から分離後の固相中の２種類の酵素標識
   の量が、この固相を当初約０．２５Ｍ〜１Ｍのジエタノ
   ールアミン、約１０ｍＭのフェノールフタレンモノホス
   ヘートおよび約５０ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ
   −ガラクトシドを包含するｐＨ８．６の基質緩衝溶液の
   存在下に保温培養することにより測定されることからな
   る前記特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０）前記特許請求の範囲第１項記載の方法を実施する
   ための試薬キット。