JPH07209299A - 良性及び悪性腫瘍の検出のための新規抗体の使用方法 - Google Patents
良性及び悪性腫瘍の検出のための新規抗体の使用方法Info
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- JPH07209299A JPH07209299A JP9495A JP9495A JPH07209299A JP H07209299 A JPH07209299 A JP H07209299A JP 9495 A JP9495 A JP 9495A JP 9495 A JP9495 A JP 9495A JP H07209299 A JPH07209299 A JP H07209299A
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明の目的は、システイン残基を含むp21
から生成されるポリクロナール抗-p21抗体を含んで成る
新規のELISA タイプ( サンドイッチ・エリザという) を
提供することである。 【構成】 本サンドイッチ・エリザ・タイプは、2 つの
ペプチドの特定のN-末端アミノ酸配列をもつ抗- 非-ras
-p21抗体の検出のために使用され、これらの抗体は、21
kDaタンパク質のキャッチャー及びディテクターとして
同時に使用され、この多価p21 抗原は9.6 のpHにおいて
そのキャッチャーに結合する。本エリザ手順は、様々な
タイプの腫瘍をもつ患者の臨床モニタリングに最も有用
であることが判明した。
から生成されるポリクロナール抗-p21抗体を含んで成る
新規のELISA タイプ( サンドイッチ・エリザという) を
提供することである。 【構成】 本サンドイッチ・エリザ・タイプは、2 つの
ペプチドの特定のN-末端アミノ酸配列をもつ抗- 非-ras
-p21抗体の検出のために使用され、これらの抗体は、21
kDaタンパク質のキャッチャー及びディテクターとして
同時に使用され、この多価p21 抗原は9.6 のpHにおいて
そのキャッチャーに結合する。本エリザ手順は、様々な
タイプの腫瘍をもつ患者の臨床モニタリングに最も有用
であることが判明した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規タイプのELISA(以
下、サンドイッチ・エリザ(Sandwich Elisa)という。)
並びに良性及び悪性腫瘍担持患者の生物学的液体中の非
-ras-p21タンパク質の検出のためのその使用に関する。
下、サンドイッチ・エリザ(Sandwich Elisa)という。)
並びに良性及び悪性腫瘍担持患者の生物学的液体中の非
-ras-p21タンパク質の検出のためのその使用に関する。
【０００２】
【従来技術】我々の先の欧州特許出願第92116788.8中に
は、21 kDaの分子量をもつ非-ras p21タンパク質に結合
する精製され且つ単離された抗- 非-ras抗体が記載され
ている。これらの抗体は、腫瘍をもつ患者の生物学的液
体とのそれらの反応により悪性疾患を検出することがで
きることが分かっている。使用された方法は、確立され
た腫瘍マーカーを欠く悪性腫瘍、例えば、腎細胞癌腫、
精上皮腫胚細胞腫瘍及び膀胱癌腫をもつ患者の臨床的モ
ニタリングを可能にする修飾ELISA 手順に基く。このや
り方において、残存癌が特定の治療後に残存するか否か
を測定することができる。上記方法は、かなり簡単であ
り、そしてときどき信頼できる結果を与えるけれども、
多くの場合、この直接ELISA は血清妨害因子により阻害
されることができた。さらに、今日まで、悪性リンパ腫
における治療に対する応答を測定することができる確立
された腫瘍マーカーは全くない。
は、21 kDaの分子量をもつ非-ras p21タンパク質に結合
する精製され且つ単離された抗- 非-ras抗体が記載され
ている。これらの抗体は、腫瘍をもつ患者の生物学的液
体とのそれらの反応により悪性疾患を検出することがで
きることが分かっている。使用された方法は、確立され
た腫瘍マーカーを欠く悪性腫瘍、例えば、腎細胞癌腫、
精上皮腫胚細胞腫瘍及び膀胱癌腫をもつ患者の臨床的モ
ニタリングを可能にする修飾ELISA 手順に基く。このや
り方において、残存癌が特定の治療後に残存するか否か
を測定することができる。上記方法は、かなり簡単であ
り、そしてときどき信頼できる結果を与えるけれども、
多くの場合、この直接ELISA は血清妨害因子により阻害
されることができた。さらに、今日まで、悪性リンパ腫
における治療に対する応答を測定することができる確立
された腫瘍マーカーは全くない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ELIS
A の新規タイプ( 以下、サンドイッチ・エリザという)
を提供することである。本発明の他の目的は、実質的に
偽陽性結果を全くもたない上記サンドイッチ・エリザを
使用して、治療の前後において、悪性疾患による血清中
のp21 のレベルを評価することを可能にする方法を提供
することである。
A の新規タイプ( 以下、サンドイッチ・エリザという)
を提供することである。本発明の他の目的は、実質的に
偽陽性結果を全くもたない上記サンドイッチ・エリザを
使用して、治療の前後において、悪性疾患による血清中
のp21 のレベルを評価することを可能にする方法を提供
することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、新規タイプの
サンドイッチ・エリザであって、ジスルフィド結合を介
して他のシステイン含有ポリペプチドとホモマルチマー
又はヘテロマルチマーを形成するシステイン残基を含有
する21 kDaタンパク質から生じたポリクロナール抗体を
含んで成り、そのポリクロナール抗体が21kDa のキャッ
チャー及びディテクターとして同時に作用し、その多価
p21 抗原が9.6 のpHにおいてそのキャッチャーに結合す
るような検定法に関する。本新規タイプのサンドイッチ
・エリザは、その臨床経過に関連して療法の前後に悪性
疾患をもつ患者の血清中のp21 の正確なレベルを評価す
る方法として有用であることが見つかった。本発明に係
るサンドイッチ・エリザが活性疾患をもつ患者及び健康
対照に関してより信頼できる結果を与えることが判明し
た。このやり方において、抗-p21サンドイッチ・エリザ
・テストは、悪性疾患をもつ患者における治療の監視及
び再発の検出において最も価値がある。このサンドイッ
チ・エリザを使用して、悪性リンパ腫をもつ患者の72%
において疾患活性と血清p21レベルとを関係付けること
ができる。
サンドイッチ・エリザであって、ジスルフィド結合を介
して他のシステイン含有ポリペプチドとホモマルチマー
又はヘテロマルチマーを形成するシステイン残基を含有
する21 kDaタンパク質から生じたポリクロナール抗体を
含んで成り、そのポリクロナール抗体が21kDa のキャッ
チャー及びディテクターとして同時に作用し、その多価
p21 抗原が9.6 のpHにおいてそのキャッチャーに結合す
るような検定法に関する。本新規タイプのサンドイッチ
・エリザは、その臨床経過に関連して療法の前後に悪性
疾患をもつ患者の血清中のp21 の正確なレベルを評価す
る方法として有用であることが見つかった。本発明に係
るサンドイッチ・エリザが活性疾患をもつ患者及び健康
対照に関してより信頼できる結果を与えることが判明し
た。このやり方において、抗-p21サンドイッチ・エリザ
・テストは、悪性疾患をもつ患者における治療の監視及
び再発の検出において最も価値がある。このサンドイッ
チ・エリザを使用して、悪性リンパ腫をもつ患者の72%
において疾患活性と血清p21レベルとを関係付けること
ができる。
【０００５】精製され且つ単離された抗- 非-ras-p21抗
体を使用する良性及び悪性腫瘍の検出方法をサンドイッ
チ・エリザを使用して行った。公知のように、サンドイ
ッチ・エリザは、免疫酵素測定検定としても知られてい
るが、2 価又は多価抗原に利用することができる。この
検定においては、固相固定抗体が標準的又はテスト抗体
とインキュベートされる。本発明に従えば、本サンドイ
ッチ・エリザは、キャッチャー抗体並びにディテクター
抗体としてポリクロナール抗-p21抗体を使用する。p21
は、ジスルフィド結合を介して他のシステイン含有ポリ
ペプチドとホモマルチマー又はヘテロマルチマーを形成
するシステイン残基を含む。なぜなら、p21 が還元剤だ
けにより高分子量の複合体から放出されたからである。
図1 から分かるように、血清の希釈において線型におけ
るかなりの差異が存在する。多価p21 抗原は9.6 のpHに
おいてキャッチャー抗体に結合し、そして7.4のpHにお
ける正常のエリザによりPBS 中で普通には行われない。
9.6 のpHにおいては、健康対照と癌患者との間の差異
は、7.4 のpHにおける3 〜5 倍に比べて、3 〜80倍であ
る( 図4)。しかしながら、サンドイッチ・エリザの場合
には、この線型は、1/4,000 〜1/128,000 の間のレンジ
内の血清希釈について存在し、直接エリザは、1/16,000
〜1/128,000 のレンジ内にのみ線型を示す。結論とし
て、サンドイッチ・エリザの使用がより信頼できる結果
を与えるであろう。
体を使用する良性及び悪性腫瘍の検出方法をサンドイッ
チ・エリザを使用して行った。公知のように、サンドイ
ッチ・エリザは、免疫酵素測定検定としても知られてい
るが、2 価又は多価抗原に利用することができる。この
検定においては、固相固定抗体が標準的又はテスト抗体
とインキュベートされる。本発明に従えば、本サンドイ
ッチ・エリザは、キャッチャー抗体並びにディテクター
抗体としてポリクロナール抗-p21抗体を使用する。p21
は、ジスルフィド結合を介して他のシステイン含有ポリ
ペプチドとホモマルチマー又はヘテロマルチマーを形成
するシステイン残基を含む。なぜなら、p21 が還元剤だ
けにより高分子量の複合体から放出されたからである。
図1 から分かるように、血清の希釈において線型におけ
るかなりの差異が存在する。多価p21 抗原は9.6 のpHに
おいてキャッチャー抗体に結合し、そして7.4のpHにお
ける正常のエリザによりPBS 中で普通には行われない。
9.6 のpHにおいては、健康対照と癌患者との間の差異
は、7.4 のpHにおける3 〜5 倍に比べて、3 〜80倍であ
る( 図4)。しかしながら、サンドイッチ・エリザの場合
には、この線型は、1/4,000 〜1/128,000 の間のレンジ
内の血清希釈について存在し、直接エリザは、1/16,000
〜1/128,000 のレンジ内にのみ線型を示す。結論とし
て、サンドイッチ・エリザの使用がより信頼できる結果
を与えるであろう。
【０００６】図3 中、34人の健康対照においてサンドイ
ッチ・エリザにより測定されたような血清p21 レベルが
27.3±28.7 x 10 3 μ/ml(平均±標準偏差）であったこ
とが示される。これらの値は、直接エリザにより測定さ
れたもの( 200 ±125 x 10 3μ/ml)よりかなり低かっ
た。以下の表1 中、33リンパ腫患者の特徴を表す。
ッチ・エリザにより測定されたような血清p21 レベルが
27.3±28.7 x 10 3 μ/ml(平均±標準偏差）であったこ
とが示される。これらの値は、直接エリザにより測定さ
れたもの( 200 ±125 x 10 3μ/ml)よりかなり低かっ
た。以下の表1 中、33リンパ腫患者の特徴を表す。
【０００７】 表1 性別: 男性 21 女性 12 年齢: 平均 50 範囲 20-87 病歴: ホジキン(Hodgkin's) 病 非- ホジキン病 節硬化症: 7 低グレード: 7 混合細胞性(Mixed cellularity): 2 中間及び高グレード: 14 不明 :2 不明 : 1 段階 全身症状 IA: 6 A 29 IIA: 11 B 4 IIB: 1 IIIA: 3 IIIB: 2 IVA: 7 IVB: 1 再発: 2
【０００８】上記表1 におけるように、33患者における
サンドイッチ・エリザにより測定されるような血清p21
のレベルは、1,566 ±2,298 x 103 μ/ml(平均±標準偏
差）、レンジ0-8,000 x 103 μ/ml であった。明らか
に、33患者からの24、すなわち、約72% は、p21 の治療
前血清レベルにおいて、正常平均を2 標準偏差以上超え
る、有意な増加を示した。健康対照と癌患者との間の差
異は、リンパ腫患者において3 〜80倍上昇したp21 血清
レベルにある。本発明に従って、サンドイッチ・エリザ
を使用して評価されることができる悪性疾患の中に、以
下のものが挙げられる: 腎細胞癌腫、膀胱癌腫、前立腺
癌腫、精巣胚細胞腫瘍、卵巣癌腫、悪性リンパ腫及び胃
腸及び肝腫瘍。図4 中、治療の前後に評価され、そして
臨床経過関連した、悪性リンパ腫をもつ9 患者の血清中
のp21 のレベルに対する結果が表されている。血清p21
の正常な治療前レベルよりもよりも高いものをもつテス
トされた代表的なリンパ腫患者の中で、化学療法及び放
射療法後3 〜14カ月に完全に鎮静に至った8 患者におい
てp21 レベルが正常に減少した。しかしながら、p21 の
増加レベルが、10カ月後の再発において1 の非治療患者
において検出された。p21 血清レベルは、正常な又は検
出不能な治療前血清p21 レベルをもっていた4 患者にお
いて首尾良い治療の後に低く又は検出不能のまま残っ
た。本発明をいずれの限定を構成することなく本発明の
よりよい理解のために表した以下の実施例により以下に
説明するが、本明細書を読んだ後に当業者が添付クレー
ムによりカバーされるような本発明の範囲を変更するこ
となく1 以上の試薬を置き換える状態にあることが理解
されよう。
サンドイッチ・エリザにより測定されるような血清p21
のレベルは、1,566 ±2,298 x 103 μ/ml(平均±標準偏
差）、レンジ0-8,000 x 103 μ/ml であった。明らか
に、33患者からの24、すなわち、約72% は、p21 の治療
前血清レベルにおいて、正常平均を2 標準偏差以上超え
る、有意な増加を示した。健康対照と癌患者との間の差
異は、リンパ腫患者において3 〜80倍上昇したp21 血清
レベルにある。本発明に従って、サンドイッチ・エリザ
を使用して評価されることができる悪性疾患の中に、以
下のものが挙げられる: 腎細胞癌腫、膀胱癌腫、前立腺
癌腫、精巣胚細胞腫瘍、卵巣癌腫、悪性リンパ腫及び胃
腸及び肝腫瘍。図4 中、治療の前後に評価され、そして
臨床経過関連した、悪性リンパ腫をもつ9 患者の血清中
のp21 のレベルに対する結果が表されている。血清p21
の正常な治療前レベルよりもよりも高いものをもつテス
トされた代表的なリンパ腫患者の中で、化学療法及び放
射療法後3 〜14カ月に完全に鎮静に至った8 患者におい
てp21 レベルが正常に減少した。しかしながら、p21 の
増加レベルが、10カ月後の再発において1 の非治療患者
において検出された。p21 血清レベルは、正常な又は検
出不能な治療前血清p21 レベルをもっていた4 患者にお
いて首尾良い治療の後に低く又は検出不能のまま残っ
た。本発明をいずれの限定を構成することなく本発明の
よりよい理解のために表した以下の実施例により以下に
説明するが、本明細書を読んだ後に当業者が添付クレー
ムによりカバーされるような本発明の範囲を変更するこ
となく1 以上の試薬を置き換える状態にあることが理解
されよう。
【０００９】
【実施例】血清サンプル: Department of Oncology, Ra
mbam Medical Center, Haifaにおいて1991年6 月〜1993
年10月の間に血清サンプルを採取した。56サンプルを、
初期ホジキン病リンパ腫(22 pts)をもつ33患者から、提
示において及び化学療法及び放射療法の開始3-24カ月後
において採取した。平均年齢は、48.6±19.1歳( レンジ
20-87 歳) であった。また。34正常ドナー、平均年齢4
0.6±14.0歳( レンジ18-84 歳) を分析した。サンプル
を得るときにおいて、31の新たに診断した患者を未だ治
療せず、そして2 人の再発患者を少なくとも3 カ月間治
療から外した。Ann Arbor Classification(Carbone PP
et. al. Cancer Research 31:1860 (1971)) に従う段階
は、IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB, IVA 及びIVB であ
った。段階は、物理的検査、実験室の定常的テスト、画
像形成手順( 胸及び腹のコンピューター連動断層X 線撮
影(computed tomography scans) 及びガリウム・スキャ
ン(gallium scan)) 、及び骨髄生検に基づいてた。患者
を化学療法 + 放射療法により治療した。完全な鎮静を
活性腫瘍のすべての臨床的証拠の消失として定義した。
病気の進行を、前現存病変のサイズにおける25% 以上の
増加又は新たな病変の出現として考えた。血清を使用す
るまで-20 ℃において保存した。検定直前に、血清を56
℃において30分間加熱し、補体及び血清妨害因子を失活
させた。
mbam Medical Center, Haifaにおいて1991年6 月〜1993
年10月の間に血清サンプルを採取した。56サンプルを、
初期ホジキン病リンパ腫(22 pts)をもつ33患者から、提
示において及び化学療法及び放射療法の開始3-24カ月後
において採取した。平均年齢は、48.6±19.1歳( レンジ
20-87 歳) であった。また。34正常ドナー、平均年齢4
0.6±14.0歳( レンジ18-84 歳) を分析した。サンプル
を得るときにおいて、31の新たに診断した患者を未だ治
療せず、そして2 人の再発患者を少なくとも3 カ月間治
療から外した。Ann Arbor Classification(Carbone PP
et. al. Cancer Research 31:1860 (1971)) に従う段階
は、IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB, IVA 及びIVB であ
った。段階は、物理的検査、実験室の定常的テスト、画
像形成手順( 胸及び腹のコンピューター連動断層X 線撮
影(computed tomography scans) 及びガリウム・スキャ
ン(gallium scan)) 、及び骨髄生検に基づいてた。患者
を化学療法 + 放射療法により治療した。完全な鎮静を
活性腫瘍のすべての臨床的証拠の消失として定義した。
病気の進行を、前現存病変のサイズにおける25% 以上の
増加又は新たな病変の出現として考えた。血清を使用す
るまで-20 ℃において保存した。検定直前に、血清を56
℃において30分間加熱し、補体及び血清妨害因子を失活
させた。
【００１０】抗-p21ポリクロナール抗体: 抗-p21ポリク
ロナール抗体を、還元条件下SDS-ポリアクリルアミド・
ゲル電気泳動により単離したp21 タンパク質を使用して
ウサギの免疫感作により生産した。特に、ウサギを、Fr
eund's完全アジュバント中に乳化したPBS 中のp21 ペプ
チドの10μg 部分を使用して免疫感作し、そして多数の
部位においてウサギに皮膚内に注射した。4-5 週間間隔
でFCA 中の10μg のペプチドを含む4 回のブースター注
射をウサギに与え、そしてその後2 週間飼養した(Shali
tin et al., Int. J. Oncol. 1, 107-112, 1992)。
ロナール抗体を、還元条件下SDS-ポリアクリルアミド・
ゲル電気泳動により単離したp21 タンパク質を使用して
ウサギの免疫感作により生産した。特に、ウサギを、Fr
eund's完全アジュバント中に乳化したPBS 中のp21 ペプ
チドの10μg 部分を使用して免疫感作し、そして多数の
部位においてウサギに皮膚内に注射した。4-5 週間間隔
でFCA 中の10μg のペプチドを含む4 回のブースター注
射をウサギに与え、そしてその後2 週間飼養した(Shali
tin et al., Int. J. Oncol. 1, 107-112, 1992)。
【００１１】サンドイッチ・エリザ法: ポリビニル・マ
イクロタイター・プレート(Costar)を、(4℃における2%
wt/vol,脱脂乾燥ミルク(Cadbury's Marvel)を含むPBS
pH 7.4中の1000倍希釈において) キャッチャー抗体とし
て200 μl/ウェル抗-p21抗血清によりコートした。プレ
ートをTBST(200μl/ウェル、0.05% Tween 20( 商品名)
を含む50mM Tris-HCl pH 8.0及び150mM NaCl) により3
回洗浄し、そして過剰の洗剤をTBS, 200μl/ウェル(50m
M Tris-HCl pH 8.0,150mM NaCl) によりそのプレートを
さらに洗浄することにより除去した。プレートは、室温
において4 週間又は37℃において1 週間安定であること
が分かった。
イクロタイター・プレート(Costar)を、(4℃における2%
wt/vol,脱脂乾燥ミルク(Cadbury's Marvel)を含むPBS
pH 7.4中の1000倍希釈において) キャッチャー抗体とし
て200 μl/ウェル抗-p21抗血清によりコートした。プレ
ートをTBST(200μl/ウェル、0.05% Tween 20( 商品名)
を含む50mM Tris-HCl pH 8.0及び150mM NaCl) により3
回洗浄し、そして過剰の洗剤をTBS, 200μl/ウェル(50m
M Tris-HCl pH 8.0,150mM NaCl) によりそのプレートを
さらに洗浄することにより除去した。プレートは、室温
において4 週間又は37℃において1 週間安定であること
が分かった。
【００１２】正常及び癌患者の血清をカーボネート・バ
ッファー(1mM PMSF を含む25mM Na 2 CO3 , 55mM NaHCO
3 , pH 9.6) により逐次的に希釈し(1/2000-1/16000)、
そして37℃において60分間又は4 ℃において一夜インキ
ュベートした。プレートをホスフェート・バッファー生
理食塩水(pH 7.4)により2 回洗浄した。プレートを、2%
(wt/vol)脱脂乾燥ミルクを含むPBS により室温において
90分間コートした。抗原捕獲プレートを、 2%(wt/vol)
脱脂乾燥ミルクを含むPBS 中の1/1000希釈における100
μl/ウェルの抗-p21 PAbにより37℃において60分間イン
キュベートした。次にこのプレートをTBST(200μl/ウェ
ル) により3 回洗浄した。抗原- 抗体複合体を、室温に
おいて30分間、(Sigmaからの) ビオチン化ヤギ抗- ウサ
ギIgG(TBST中1/1000) と共にインキュベートした。この
プレートをTBSTにより3 回洗浄した。最後に、TBST中1/
500 の(Sigmaからの) 余分なアビジン・ペルオキシダー
ゼを室温において30分間添加し、そしてそのプレートTB
STにより3 回洗浄した。固相結合酵素を、0.1Mホスフェ
ート・シトレート・バッファーpH 5.0中に0.05% o-フェ
ニレンジアミン及び0.05% 過酸化水素を含む発色基質(1
00μl / ウェル) を使用して検出した。10-30 分後、反
応を、50μl の2N H2 SO4 の添加により終了させ、そし
て生じた色をAnthos Labtech 2001 リーダーを使用して
492nm において評価した。陰性対照は、0.1-0.2 A492の
読みを作り出すアビジン- ビオチン化ペルオキシダーゼ
複合体の非特異的結合を測定するために、血清の代わり
のバッファーを含んでいた。血清p21 値を、1/10,000の
希釈における1ml 当たりp21 の100 任意単位について0.
8-0.9 A492の読みを作り出す陽性血清サンプルから得ら
れた線型換算曲線から計算した。
ッファー(1mM PMSF を含む25mM Na 2 CO3 , 55mM NaHCO
3 , pH 9.6) により逐次的に希釈し(1/2000-1/16000)、
そして37℃において60分間又は4 ℃において一夜インキ
ュベートした。プレートをホスフェート・バッファー生
理食塩水(pH 7.4)により2 回洗浄した。プレートを、2%
(wt/vol)脱脂乾燥ミルクを含むPBS により室温において
90分間コートした。抗原捕獲プレートを、 2%(wt/vol)
脱脂乾燥ミルクを含むPBS 中の1/1000希釈における100
μl/ウェルの抗-p21 PAbにより37℃において60分間イン
キュベートした。次にこのプレートをTBST(200μl/ウェ
ル) により3 回洗浄した。抗原- 抗体複合体を、室温に
おいて30分間、(Sigmaからの) ビオチン化ヤギ抗- ウサ
ギIgG(TBST中1/1000) と共にインキュベートした。この
プレートをTBSTにより3 回洗浄した。最後に、TBST中1/
500 の(Sigmaからの) 余分なアビジン・ペルオキシダー
ゼを室温において30分間添加し、そしてそのプレートTB
STにより3 回洗浄した。固相結合酵素を、0.1Mホスフェ
ート・シトレート・バッファーpH 5.0中に0.05% o-フェ
ニレンジアミン及び0.05% 過酸化水素を含む発色基質(1
00μl / ウェル) を使用して検出した。10-30 分後、反
応を、50μl の2N H2 SO4 の添加により終了させ、そし
て生じた色をAnthos Labtech 2001 リーダーを使用して
492nm において評価した。陰性対照は、0.1-0.2 A492の
読みを作り出すアビジン- ビオチン化ペルオキシダーゼ
複合体の非特異的結合を測定するために、血清の代わり
のバッファーを含んでいた。血清p21 値を、1/10,000の
希釈における1ml 当たりp21 の100 任意単位について0.
8-0.9 A492の読みを作り出す陽性血清サンプルから得ら
れた線型換算曲線から計算した。
【図１】図1 は、直接エリザ( ○) 、又はサンドイッチ
・エリザ( ●) により検定した血清p21 滴定曲線を表
す。データを以下のように得た: リンパ腫患者からの血
清のアリコットを9.6 のpHにおけるコーティング・バッ
ファー中で希釈し、そしてp21 レベルを( 先に記載した
ような、7.4 のpHにおける) 直接エリザにより、そして
本発明に係る(pH 9.6 における) サンドイッチ・エリザ
により、検定した。pHの変化により生じた予想外の結果
は、pH 9.6における抗原のS-S 橋の乖離により説明され
ることができる。
・エリザ( ●) により検定した血清p21 滴定曲線を表
す。データを以下のように得た: リンパ腫患者からの血
清のアリコットを9.6 のpHにおけるコーティング・バッ
ファー中で希釈し、そしてp21 レベルを( 先に記載した
ような、7.4 のpHにおける) 直接エリザにより、そして
本発明に係る(pH 9.6 における) サンドイッチ・エリザ
により、検定した。pHの変化により生じた予想外の結果
は、pH 9.6における抗原のS-S 橋の乖離により説明され
ることができる。
【図２】図2 は、明確なやり方で、本サンドイッチ・エ
リザにおける抗原結合に対する、標準的なエリザにおい
て使用されるような7.4 のpH(4-A) 及び本発明において
使用されるような9.6 のpH(4-B) の影響について説明す
る、ここで: ○ = リンパ腫患者の血清、そして △ = 健康対照。
リザにおける抗原結合に対する、標準的なエリザにおい
て使用されるような7.4 のpH(4-A) 及び本発明において
使用されるような9.6 のpH(4-B) の影響について説明す
る、ここで: ○ = リンパ腫患者の血清、そして △ = 健康対照。
【図３】前処理リンパ腫患者に対する、正常患者の血清
中のp21 血清レベルの検定。34人の健康なドナーからの
血清を活性疾患をもつ33人のリンパ腫患者の血清と比較
した。p21 をサンドイッチ・エリザにより検定した。表
示したデータは2 つの測定の平均である。
中のp21 血清レベルの検定。34人の健康なドナーからの
血清を活性疾患をもつ33人のリンパ腫患者の血清と比較
した。p21 をサンドイッチ・エリザにより検定した。表
示したデータは2 つの測定の平均である。
【図４】増加した前処理p21 レベルをもつ9 人のリンパ
腫患者の血清中のp21 のレベルに対する治療の効果。p2
1 レベルを化学療法 + 放射療法(3〜14カ月) の前(
○) 及び後( ●) のサンドイッチ・エリザにより検定し
た。矢印は、正常レンジの最高レベルを示し、そして*
は進行性疾患を患う患者。残りの患者は完全な鎮静に向
かった。
腫患者の血清中のp21 のレベルに対する治療の効果。p2
1 レベルを化学療法 + 放射療法(3〜14カ月) の前(
○) 及び後( ●) のサンドイッチ・エリザにより検定し
た。矢印は、正常レンジの最高レベルを示し、そして*
は進行性疾患を患う患者。残りの患者は完全な鎮静に向
かった。
Claims (6)
- 【請求項１】 ジスルフィド結合を介して他のシステイ
ン含有ポリペプチドとホモマルチマー又はヘテロマルチ
マーを形成するシステイン残基を含有するp21 から生じ
たポリクロナール抗-p21抗体を含んで成るサンドイッチ
ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)であって、
その抗体が21kDa タンパク質のキャッチャー及びディテ
クターとして同時に使用され、その多価p21 抗原が9.6
のpHにおいてそのキャッチャーに結合することを特徴と
する検定法。 - 【請求項２】 請求項１のサンドイッチELISA タイプを
使用して悪性疾患をもつ患者の血清中のp21 の正確なレ
ベルを評価する方法。 - 【請求項３】 その臨床経過に関連して療法の前後に悪
性疾患をもつ患者の血清中のp21 の正確なレベルを評価
する請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 抗-p21サンドイッチELISA テストが、悪
性疾患をもつ患者における治療の監視及び再発の検出に
おいて使用される、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 活性な悪性疾患をもつ患者と健康対照と
の間の差異が、サンドイッチ検定を使用するとき、直接
ELISA テストに比べて、有意に増加する、請求項４に記
載の方法。 - 【請求項６】 悪性疾患が、腎細胞癌腫、膀胱癌腫、前
立腺癌腫、精巣胚細胞腫瘍、卵巣癌腫、悪性リンパ腫、
胃腸リンパ腫及び肝腫瘍を含む、請求項５に記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL108269 | 1994-01-05 | ||
| IL10826994A IL108269A0 (en) | 1991-10-02 | 1994-01-05 | A method of using novel antibodies for the detection of benign and malignant tumours |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07209299A true JPH07209299A (ja) | 1995-08-11 |
Family
ID=11065671
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9495A Pending JPH07209299A (ja) | 1994-01-05 | 1995-01-04 | 良性及び悪性腫瘍の検出のための新規抗体の使用方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0662612A1 (ja) |
| JP (1) | JPH07209299A (ja) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4737453A (en) * | 1984-12-12 | 1988-04-12 | Immunomedics, Inc. | Sandwich immunoassay utilizing a separation specific binding substance |
| IL79755A0 (en) * | 1985-08-21 | 1986-11-30 | Oncogene Science Inc | Immunoassay for detection of ras encoded protein |
| IL99630A0 (en) * | 1991-10-02 | 1992-08-18 | Channa Shalitin | Novel antibodies useful for the detection of benign and malignant tumors |
-
1995
- 1995-01-04 JP JP9495A patent/JPH07209299A/ja active Pending
- 1995-01-05 EP EP95400021A patent/EP0662612A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0662612A1 (en) | 1995-07-12 |
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