CN111089924A - 一种糖化血红蛋白高压液相色谱层析柱制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种糖化血红蛋白高压液相色谱层析柱制备工艺，包括以下制备步骤层析柱填料活化制备，称取一定量的强阳离子交换树脂，加0.01～1.2mol/LNaOH溶液，搅匀，置室温一定时间，其间搅拌至少一次以上；随后加入浓盐酸数滴，调至Ph5.0～7.5，除去上清液，并用蒸馏水洗多次；层析柱的装填灌装，称取上述适量填料，用匀浆液使之分散，将匀浆液倒入与色谱柱管连接好的匀浆管中，调节适宜的压力，用顶替液压匀浆液到色谱柱中，待压力稳定下来，保持一定的时间，然后调低压力使之稳定，接着缓慢调小压力直至到0，卸下色谱柱，填料应略微冒出柱管且柱口填料保持平整，盖上筛板和盖帽，即完成色谱柱的装填。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种糖化血红蛋白高压液相色谱层析柱制备工艺，属于糖化血红蛋白高压液相色谱层析柱制备技术领域。
背景技术
高效液相色谱法是国际临床化学联合会(IFCC)推荐的测定糖化血红蛋白的参考方法。其基本原理是：血红蛋白的糖化会导致血红蛋白分子表面电荷丢失，不同组分的糖化血红蛋白分子表面电荷丢失的程度也不同，经处理过的阳离子交换树脂带负电荷，与带正电荷的糖化血红蛋白有亲和力。用不同梯度的洗脱液将不同组分的糖化血红蛋白分子洗脱下来，并用检测器对分离后的各种糖化血红蛋白组分的吸光度进行检测。以百分率表示糖化血红蛋白的检测结果。但是该方法也存在以下问题：高压液相色谱层析柱是分析分离的核心，而层析柱的制备的好坏则影响柱效性能的高低。
发明内容
针对上述背景技术存在的问题，本发明旨在提供一种糖化血红蛋白高压液相色谱层析柱制备工艺。
为此，本发明采用以下技术方案：一种糖化血红蛋白高压液相色谱层析柱制备工艺，其特征是包括以下制备步骤：
第一步层析柱填料活化制备，称取一定量的强阳离子交换树脂，加0.01～1.2mol/LNaOH溶液，搅匀，置室温一定时间，其间搅拌至少一次以上；随后加入浓盐酸数滴，调至Ph5.0～7.5，除去上清液，并用蒸馏水洗多次；
第二步层析柱的装填灌装，称取上述适量填料，用匀浆液使之分散，将匀浆液倒入与色谱柱管连接好的匀浆管中，调节适宜的压力，用顶替液压匀浆液到色谱柱中，待压力稳定下来，保持一定的时间，然后调低压力使之稳定，接着缓慢调小压力直至到0，卸下色谱柱，填料应略微冒出柱管且柱口填料保持平整，盖上筛板和盖帽，即完成色谱柱的装填。
作为对上述技术方案的补充和完善，本发明还包括以下技术特征。
所述的填料粒度的直径为要1.2～10微米。
所述的强阳离子交换树脂基质为苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物，具有刚性，球形，单分散多孔等特征。
装填灌装所述的层析柱的装填装置包括空压机、气动增压泵、调压器或压力表、色谱柱管、匀浆罐。
所述的装填压力范围是5～45MPa；装填时间范围是5～95min。
本发明可以达到以下有益效果：本发明采用固定相树脂为强阳离子交换剂，基质为苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物，具有刚性，球形，单分散多孔等特征。另外，本发明采用1.2～10微米的填料粒度，在可接受的柱压下具有较好的柱效
附图说明
图1为本发明的制备的层析柱能够分离糖化血红蛋白各个组分示意图。
具体实施方式
本发明具体实施和研发过程如下：
1、装填材料，粒径
测试糖化血红蛋白的固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，作为固定相的离子交换剂，其基质大概有三大类：合成树脂(聚苯乙烯)、纤维素和硅胶。按表面基团的不同，离子交换树脂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分。如下表所示：
本发明中使用的固定相树脂为强阳离子交换剂，基质为苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物，具有刚性，球形，单分散多孔等特征。
层析柱填料的粒度有1～30微米不等，填料的粒度主要影响层析柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，柱压越大。例如3微米的柱效比5微米高，但是3微米的色谱柱背压是5微米的1～6倍。本次发明主要1.2～10微米的填料粒度，在可接受的柱压下具有较好的柱效。
2、活化工艺
称取阳离子交换树脂10g，加0.01～1.2mol/LNaOH溶液10～100ml，搅匀，置室温10分钟，其间搅拌1～5次。然后，加浓盐酸数滴，调至Ph5.0～
7.5，弃去上清液，用约70～100ml蒸馏水洗5次即可。
3、灌装方法、柱管材质及内径范围
根据填料的粒径有不同的装填方法，对于大于20微米大尺寸填料一般采用干法装填，即将填料直接加入到色谱柱管中，通过振动使其致密，得到均匀的填充床。对于小颗粒的填料则采用外部驱动力将填料装填到色谱柱中，形成均匀的床层。本次发明中糖化血红蛋白层析柱中填料小于10微米，通常使用匀浆填充法来装填。即用适宜的溶剂将填料经超声处理成高度分散的匀浆液，然后用加压溶剂在高压下将匀浆压入柱管中，制成均匀紧密的高效色谱柱床层。
色谱柱由柱管、填料压帽、密封环、筛板、接头、螺丝等组成。层析柱柱管的材质为不锈钢柱、石英毛细管柱或Peek材质柱。不锈钢柱管较为常用，能耐高压，为提高柱效，减少管壁效应，管内壁要求有很高的光洁度，不锈钢柱管内壁多经过抛光。柱管内径尺寸按照用途分类有以下几种，如下表所示：
| 用途 | 内径(单位：mm) | 柱长(单位：cm) |
| 毛细管柱 | 0.2-0.5 | |
| 窄径柱 | 1-2 | 10-20 |
| 常规分析柱 | 2-5 | 10-30 |
| 半制备柱 | >5 | |
| 实验室制备柱 | 20-40 | 10-30 |
本次发明中的糖化血红蛋白高压液相层析柱属于常规分析柱，一般选用>5mm的内径尺寸。
4、灌装设备，灌装过程及参数(压力、时间)
层析柱的装填需要用到专业的装填装置，包括空压机、气动增压泵、调压器或压力表、色谱柱管、匀浆罐等，装柱过程：称取适量填料，用匀浆液使之分散，将匀浆液倒入与色谱柱管连接好的匀浆管中，调节适宜的压力，用顶替液压匀浆液到色谱柱中，待压力稳定下来，保持一定的时间，然后调低压力使之稳定，接着慢慢调小压力直至到0，卸下色谱柱，填料应略微冒出柱管且柱口填料保持平整，盖上筛板和盖帽，即完成色谱柱的装填。
装填压力范围是5～45MPa；
装填时间范围是5～95min；
本发明制备的层析柱能够分离糖化血红蛋白各个组分，如图1所示。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (5)
1.一种糖化血红蛋白高压液相色谱层析柱制备工艺，其特征在于包括以下制备步骤：
第一步层析柱填料活化制备，称取一定量的强阳离子交换树脂，加0.01～1.2mol/LNaOH溶液，搅匀，置室温一定时间，其间搅拌至少一次以上；随后加入浓盐酸数滴，调至Ph5.0～7.5，除去上清液，并用蒸馏水洗多次；
第二步层析柱的装填灌装，称取上述适量填料，用匀浆液使之分散，将匀浆液倒入与色谱柱管连接好的匀浆管中，调节适宜的压力，用顶替液压匀浆液到色谱柱中，待压力稳定下来，保持一定的时间，然后调低压力使之稳定，接着缓慢调小压力直至到0，卸下色谱柱，填料应略微冒出柱管且柱口填料保持平整，盖上筛板和盖帽，即完成色谱柱的装填。
2.根据权利要求1所述的一种糖化血红蛋白高压液相色谱层析柱制备工艺，其特征在于：所述的填料粒度的直径为要1.2～10微米。
3.根据权利要求2所述的一种糖化血红蛋白高压液相色谱层析柱制备工艺，其特征在于：所述的强阳离子交换树脂基质为苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物。
4.根据权利要求3所述的一种糖化血红蛋白高压液相色谱层析柱制备工艺，其特征在于：装填灌装所述的层析柱的装填装置包括空压机、气动增压泵、调压器或压力表、色谱柱管、匀浆罐。
5.根据权利要求1或4所述的一种糖化血红蛋白高压液相色谱层析柱制备工艺，其特征在于：所述的装填压力范围是5～45MPa；装填时间范围是5～95min。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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