DE10134568C2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von alpha-Oxoaldehyd - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von α-Oxoaldehyd in gasför­ migen und/oder flüssigen Proben sowie Aerosolen. Hierdurch kann das Verfahren auch zur Bestimmung der Akkumulation von reaktiven α-Oxoaldehydverbindungen beim sogenannten Carbonyl-Streß von Diabetikern ange­ wendet werden.

In Folge von langjährigen Diabetes-Erkrankungen (in­ sulinabhängiger und/oder insulinunabhängiger Diabe­ tes) auftretende Komplikationen, wie Nierenschädigun­ gen oder Trübung der Augenlinsen, lassen sich nur schwer und erst spät erkennen. Entsprechende Marker für diese Erkrankungen sind bisher nur über eine auf­ wendige Blutanalytik im Labor möglich. Mitverantwort­ lich für diese Komplikationen bzw. Folgeerkrankungen sind reaktive Stoffwechselprodukte, die mit Kollagen, Enzymen und anderen zellulären Bestandteilen Glykola­ te bilden und durch diesen Mechanismus als Zellgifte wirken können. Besonders diskutiert wird in diesem Zusammenhang die Rolle der α-Oxoaldehyde, wie Methyl­ glyoxal, Glyoxal und 3-Deoxyglucuron. Diese Stoffe werden in den roten Blutkörperchen gebildet und lie­ gen in sehr geringen Konzentrationen im Blutplasma vor. Sie werden auf diesem Wege auch durch die Lunge transportiert. In der Lunge gehen sie aufgrund ihrer Membrangängigkeit durch Diffusion über die Alveolar­ membran aus dem Blut in die Atemluft über. Somit las­ sen sie sich statt in Blut auch in Atemgas bzw. im Atemkondensat bestimmen.

Von besonderem Interesse ist hierbei das α-Oxoaldehyd Methylglyoxal. Methylglyoxal kann aus Triosephosphat, der Metabolisierung von Keton-Körpern sowie bei der Verstoffwechselung von Threonin entstehen und wird durch Glyoxalase weiter abgebaut. Methylglyoxal rea­ giert dann mit Proteinen unter Bildung von Imidazo­ lon-Derivaten und bis-Lysyl-Quervernetzungen. Diese Quervernetzung der Proteine kann zur Stabilisierung von Kollagen und damit zur Verdickung von Membranen führen. Damit erklären diese Reaktionen zumindest ei­ nen Teil der diabetischen Komplikationen, wie Nieren­ versagen und Linsentrübung.

Die alleinige Blutzuckerbestimmung, wie sie bisher bei Diabetikern üblich ist, gibt keinen direkten Rückschluß auf die momentane Methylglyoxalkonzentra­ tion im Vollblut, im Plasma oder im Serum.

Nach dem Stand der Technik erfolgt die Bestimmung von α-Oxoaldehyden daher bis auf eine Ausnahme invasiv, d. h. aus dem Blutplasma. Bei Patienten mit eine insu­ linabhängigen Diabetes konnte von Thornally T. J., "Advanced Glycation and the development of diabetic complications/Unifying the involvement of Glucose, methylglyoxal and oxidative stress" Endocrinology and Metabolism, 1996, 3, 149-166, direkt im Plasma im Vergleich zu gesunden Vergleichsprobanden eine fünf- bis sechsfach höhere, bei Patienten mit insulinabhän­ giger Diabetes eine zwei- bis dreifach höhere Methyl­ glyoxalkonzentration nachgewiesen werden. Alternativ wäre eine Bestimmung von α-Oxoaldehyd im Urin mög­ lich, ist jedoch in der Literatur nicht beschrieben, da die zu erwartenden physiologisch bedingt sehr niedrigen Konzentrationen im Urin einen zu hohen Ana­ lyseaufwand erfordern würden. Daher ist eine direkte Bestimmung der α-Oxoaldehyde im Plasma erforderlich.

Diese Verfahren nach dem Stand der Technik sind folg­ lich extrem aufwendig und kostenträchtig und eignen sich daher bisher nicht für eine regelmäßige Routine­ kontrolle zur Bestimmung des α-Oxoaldehydgehaltes im Vollblut, Blutplasma oder Serum.

Aufgrund dieser Untersuchungsmethoden nach dem Stand der Technik sind regelmäßige Kontrollen und eine eventuelle bedarfsorientierte Dosierung von Medika­ menten zur gezielten Reduzierung von α-Oxoaldehyden wie Methylglyoxal im Vollblut, Blutplasma und Serum sehr aufwendig.

Aus der DE 100 28 548 C1 ist die Bestimmung mittels gaschromatographischen Analysemethoden bekannt. Die gesteigerte AGE-Chemie im Körper ist jedoch nicht nur auf den Diabetes allein beschränkt und beruht nicht ausschließlich auf oxidativen Prozessen. Vermehrtes Substratangebot und verminderte Detoxifikation im Krankheitsfall und im Alter resultieren ebenfalls in der Akkumulation von reaktiven Carbonylverbindungen (sogenannter Carbonyl-Streß). Neben der Entstehung vieler diabetischer Komplikationen wie Retinopathie, Neuropathie und Nephropathie konnte ebenfalls eine Beeinflussung des Immunsystems durch Methylglyoxal­ modifizierte Proteine beobachtet werden, die durch Bindung an Monozyten die Ausschüttung von proinflam­ matorischen Cytokinen hervorrufen. Des weiteren wird vermutet, daß Methylglyoxal eine Rolle in der Pathol­ genese des Alzheimer-Syndroms und von Gefäßerkrankun­ gen spielt. Dies eröffnet noch weitere Einsatzgebiete für die Atemluft bzw. Atemkondensat-Diagnostik.

Eine regelmäßige Kontrolle und eine eventuelle be­ darfsorientierte Dosierung von Medikamenten zur ge­ zielten Reduzierung von Methylglyoxal ist bislang sehr aufwendig. Die alleinige Blutzuckerbestimmung, wie bei Diabetikern üblich, gibt keine direkten Rück­ schluß auf die momentane Methylglyoxalkonzentration im Plasma.

Aus Barros, A. et al.: "Determination of glyoxal, me­ thylglyoxal, and diacetyl in selected beer and wine, by HPLC with UV spectrophotometric detection, after derivatization with o-phenylenediamine". Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies (1999), 22 (13), S. 2061-2069 (abstract) Caplus (online) In: STN. AN 1999: 476160. DN 131: 227825 ist es bereits be­ kannt α-Oxoaldehyde in Bier oder Wein mittels Hoch­ druck-Flüssigchromatographie und Spektrophotometrie nachzuweisen. Auch Yamaguchi et al.: "Determination of methylglyoxal in mouse blood by liquid chromatography with fluorescence detection", Anal. Chim. Acta (1989), 221 (1), S. 163-166 offenbart den Nachweis von Methyl­ glyoxal mittels Flüssigchromatographie aus Mäuseblut.

Hierzu wird Methylglyoxal zu einer stark fluoreszie­ renden Quinoxalin-Verbindung derivatisiert.

Ausgehend hiervon war es Aufgabe der vorliegenden Er­ findung, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von α-Oxoaldehyden bereitzustellen, mit dem die Be­ stimmung dieser Verbindung in gasförmigen und/oder flüssigen Proben auf einfache und kostengünstige Wei­ se ermöglicht wird.

Diese Aufgabe wird durch das gattungsgemäße Verfahren mit den Merkmalen des Anspruches 1 gelöst. Die weite­ ren Unteransprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildun­ gen auf. Die Verwendung des Verfahrens wird in An­ spruch 18 beschrieben.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von α-Oxoaldehydverbindungen in gasförmi­ gen und/oder flüssigen Proben sowie Aerosolen bereit­ gestellt, das folgende Schritt umfaßt:

• a) Anreicherung des in der Probe enthaltenen α- Oxoaldehyd an einer Festphase und/oder einem ge­ eigneten wasserlöslichen Polymer, die mit car­ bonylreaktiven Gruppen, z. B. einer Hydrazid- Gruppe, derivatisiert sind. Hierbei kommt es zu einer Kupplungsreaktion zwischen mindestens einer Carbonylfunktion des α-Oxoaldehyd und der car­ bonylreaktiven Gruppe der derivatisierten Festpha­ se oder eines geeigneten wasserlöslichen Polymers.
• b) Eine Kupplungsreaktion zwischen einer zweiten Car­ bonylfunktion des α-Oxoaldehyd, und/oder der bei der Anreicherung gebildeten immobilisierten Ver­ bindungen mit einem spezifischen Nachweisreagenz.
• c) Eine quantitative Bestimmung der Dicarbonylverbin­ dungen anhand der Detektion des gebundenen Nach­ weisreagenzes mit nach dem Stand der Technik ge­ läufigen Verfahren.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfah­ ren mit Hilfe von Mikrotiterplatten durchgeführt. Da­ bei können sowohl kommerzielle Mikrotiterplatten, die für die Ankopplung von Dicarbonylverbindungen geeig­ net sind, verwendet werden, als auch eine Derivati­ sierung der Mikrotiterplattenoberfläche erfolgen, so daß die gewünschte Funktionalität zur Bindung der Di­ carbonylverbindungen erhalten wird.

Alternativ kann das Verfahren auch mit Hilfe eines Fließinjektionssystems (englisch: flow injection ana­ lysis, FIA) durchgeführt werden. Hierbei erfolgt die Injektion der Probe und der weiteren Reagenzien in einen Trägerstrom, der mit Hilfe peristaltischer Pum­ pen transportiert wird. Ebenso sind aber auch andere miniaturisierte Durchflußsysteme möglich.

Als weitere andere Alternative kann das Verfahren auch mit Hilfe einer Kartusche durchgeführt werden. Hierfür wird die Probe durch eine die Festphase ent­ haltende Kartusche geleitet, z. B. mit Hilfe einer Spritze. Dabei werden die α-Oxoaldehyde in der Kartu­ sche an der Festphase gebunden und können anschlie­ ßend entweder intern oder extern detektiert werden. Die Festphase kann dabei sowohl als poröses Material oder auch in Partikelform vorliegen.

Bevorzugt wird in Schritt b) als Nachweisreagenz ein fluorophores Hydrazid verwendet, das anschließend in Schritt c) fluorometrisch detektiert wird. Als fluo­ rophore Hydrazide kommen z. B. folgende Verbindungen in Frage:

• a) 5-(((2-(carbohydrazino)methyl)thio)acetyl)amino­ fluorescein;
• b) Fluorescein-5-Thiosemicarbizid;
• c) 4,4-difluoro5,7dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s- indacene-3-propionsäure-Hydrazid;
• d) Texas red® 350; -488; -568; -594; -633.

Alternativ kann in Schritt b) auch eine hydrazidgrup­ penhaltige Verbindung verwendet werden, die anschlie­ ßend mit einem für diese Verbindung spezifischen An­ tikörper gekoppelt wird. Dieser Antikörper kann be­ vorzugt mit einem Nachweisreagenz, z. B. einem Fluoro­ phor, Gold- oder Latex-Partikeln, markiert werden.

Als weitere Variante kann der Antikörper mit einem Enzym als Nachweismolekül markiert werden.

Als zusätzliche Variante bietet sich in Schritt b) die Verwendung eines Avidin-Enzym-Komplexes als Nach­ weisreagenz an. Bei dieser Verwendungsvariante wird ein Biotinhydrazid an die zweite Carbonylfunktion der α-Oxoaldehyde gebunden, wobei über die Biotin-Avidin- Wechselwirkung ein Enzym angekoppelt werden kann. Durch den Einsatz von Avidin ist aufgrund dessen Vierbindigkeit eine Signalverstärkung durch Querver­ netzung der Avidin-Enzym-Konjugate durch ein Dibiotin möglich. Diese Quervernetzung kann bereits im Vorfeld erfolgen.

Bei Ankopplung eines Enzyms erfolgt in Schritt c) die Detektion desselben bevorzugt photometrisch, fluoro­ metrisch, elektrochemisch und/oder luminometrisch er­ folgen.

Eine weitere Variante für die Detektion besteht dar­ in, daß eine hochmolekulare Verbindung and die α- Oxoaldehyde angekoppelt wird und diese anschließend anhang des Massenzuwachses detektiert wird. Hierfür kommen beispielsweise Quarzmikorwagen oder auch di­ rektoptische Methoden wie die Oberflächenplasmonenre­ sonanz (englisch: surface plasmon resonance, SPR) in Frage.

Ebenso können aber auch sämtliche aus dem Stand der Technik bekannten Detektionsverfahren eingesetzt wer­ den.

In einer weiteren Variante kann in Schritt b) eine Kupplungsreaktion zwischen der bei der Anreicherung gebildeten immobilisierten Verbindung mit einem spe­ zifischen Nachweisreagenz erfolgen. Als carbonylreak­ tive Gruppen werden dabei bevorzugt Verbindungen aus der Gruppe der Aminopyrazine, Aminopyridine, Aminopy­ rimidine und Aminoguanidine ausgewählt. Diese Verbin­ dunge sind imstande, die Carbonylverbindungen wie Me­ thylglyoxal oder Glyoxal über ihre beiden Carbonyl­ gruppen kovalent zu binden. Bei dieser Variante wer­ den daher diese Verbindungen an der Festphase immobi­ lisiert, so daß sie anschließend als Fängerkomponente für die α-Oxoaldehyde dienen. Die aufgrund der Reak­ tion zwischen dem α-Oxoaldehyd und den besagten Ver­ bindungen gebildete Komponente kann anschließend mit­ tels eines Antikörpers, der für diese Komponente spe­ zifisch ist, nachgewiesen werden. Dieser Antikörper ist jedoch nicht reaktiv mit den freien Dicarbonyl­ verbindungen oder der Fängerkomponente. Der Antikör­ per kann mit einem Nachweismolekül markiert sein, wo­ für z. B. Fluorophore, Enzyme, Latex oder Gold- Partikel in Frage kommen. Ebenso ist es auch möglich, daß der Antikörper mit Hilfe eines anti-Antiköpers bzw. über das Avidin-Biotin-System nachgewiesen wird.

Eine weitere Alternative sieht vor, daß in Schritt b) als spezifisches Nachweisreagenz die Festphase oder das wasserlösliche Polymer, die mit carbonylreaktiven Gruppen derivatisiert sind, dienen, wobei durch eine Ringschlußreaktion eine aromatische Komponente ent­ steht. Diese wiederum kann dann in Schritt c) photo­ metrisch oder fluorometrisch detektiert werden. Das detektierbare Produkt entsteht bei dieser Variante durch die zweistufig Kopplungsreaktion selbstständig ohne weitere Ankopplung eines zusätzlichen Nachweis­ reagenzes.

Als bevorzugte α-Oxoaldehyde werden mit Hilfe des Verfahrens Methylglyoxal, Glyoxal und/oder 3- Deoxyglucuron bestimmt.

Das Verfahren wird in gasförmigen sowie flüssigen Proben durchgeführt und als Beispiel seien Atemluft, Atemkondensat, Speichel, Broncheo-alveolare Lavage, Blut, Plasma, Serum, Urin, Gewebeflüssigkeit und Trä­ nenflüssigkeit genannt.

Anhand der beiden folgenden Figuren soll das erfin­ dungsgemäße Verfahren näher erläutert werden, ohne dieses dadurch hierauf einzugrenzen.

Fig. 1 zeigt zwei Beispiele für den schematischen Ab­ lauf des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Zunächst erfolgt die Ankopplung einer Dicarbonylver­ bindung, hier Methylglyoxal (1), an die mit Hydrazid- Gruppen derivatisierte Festphase.

Aceton (2) als Monocarbonylverbindung wird ebenfalls an die Festphase gebunden, besitzt jedoch keine wei­ tere freie Carbonylfunktion für die Kopplung des Nachweisreagenzes, wodurch die Monocarbonylverbindun­ gen nicht mitdetektiert werden und eine Störung durch diese vermieden wird. Die sich anschließende Ankopp­ lung des Enzyms erfolgt über zwei Varianten. In der ersten Variante reagiert das α-Oxoaldehyd über die zweite, noch freie Carbonylfunktion mit ei­ nem Biotin (5), das an ein Hydrazid gebunden ist. In einen weiteren Schritt wird das Biotin (5) mit einem Avidin-Molekül (3) gekoppelt, an das wiederum ein En­ zym (4) gebunden ist.

In der weiteren Variante erfolgt dagegen eine direkte Bindung eines mit einer Hydrazidgruppe modifizierten Enzyms (4).

Fig. 2 zeigt das Ergebnis einer Testung, die nach dem gleichen Prinzip, mit Nachweis über Biotinhydrazid und Avidin-Peroxidase mit nachfolgender Absorptions­ messung, durchgeführt wird.

Fig. 3 zeigt das Prinzip des Nachweises der aufgrund der Reaktion zwischen Dicarbonylverbindung und der carbonylreaktiven Fängerkomponente gebildete Kompo­ nente mittels eines spezifischen Antikörpers.

Methylglyoxal (1) reagiert mit der an der Festphase (3) immobilisierten Fängerkomponente (2) zu einer Komponente (4), die durch einen spezifischen Antikör­ per (5), der mit einem Label (6) versehen ist, detek­ tiert wird.

Claims (18)

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von α-Oxoaldehyden in gasförmigen und/oder flüssigen Proben mit folgenden Schritten:

• a) Anreicherung des in der Probe enthaltenen α-Oxoaldehyd an einer Festphase und/oder einem wasserlöslichen Polymer, die mit carbonylreakti­ ven Gruppen derivatisiert sind, über eine Kupp­ lungsreaktion zwischen mindestens einer ersten Carbonylfunktion des α-Oxoaldehyd und der car­ bonylreaktiven Gruppe,
• b) Kupplungsreaktion zwischen einer zweiten Carbonylfunktion des α-Oxoaldehyd und/oder der bei der Anreicherung gebildeten immobilisierten Verbindung mit einem spezifischen Nachweisrea­ genz,
• c) quantitative Bestimmung der Dicarbonylver­ bindungen anhand der Detektion der Menge des ge­ bundenen Nachweisreagenzes.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mit­ tels Mikrotiterplatten durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in ei­ nem Fließinjektionssystem durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in ei­ nem miniaturisierten Durchflußsystem durchge­ führt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt a) die Probe durch eine die Festphase enthaltende Kar­ tusche geleitet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt a) die Kupplungsreaktion zwischen einer ersten Car­ bonylfunktion des α-Oxoaldehyd und der carbonyl­ reaktiven Gruppe durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) als Nachweisreagenz ein fluorophores Hydrazid ver­ wendet und dieses in Schritt c) fluorometrisch detektiert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) als Nachweisreagenz ein Avidin-Enzym-Komplex einge­ setzt wird, der über ein Biotinhydrazid an die zweite Carbonylfunktion des α-Oxoaldehyd gebun­ den wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) eine hydrazidgruppenhaltige Verbindung verwendet wird, die anschließend mit einem für diese Ver­ bindung spezifische Antikörper gekoppelt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit einem Nachweisreagenz, z. B. einem Fluorophor, Gold- oder Latex-Partikel, markiert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit einem Enzym als Nachweismolekül markiert wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c) photo­ metrisch, fluorometrisch, elektrochemisch, lumi­ nometrisch, direkt-optisch und/oder mit einer Quarzmikrowaage detektiert wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die carbonylreaktive Gruppe in Schritt a) ausgewählt ist aus der Gruppe der Aminopyrazine, Aminopyridine, Amino­ pyrimidine und Aminoguanidine.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als für die immobi­ lisierte Verbindung spezifisches Nachweisreagenz ein markierter Antikörper verwendet wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit einem Fluorophor, einem Enzym, Gold-Partikeln, einem markierten anti-Antikörper oder einem Avi­ din-Biotin-System markiert wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) als spezifisches Nachweisreagenz die Festphase und/oder das wasserlösliche Polymer, die mit carbonylreaktiven Gruppen derivatisiert sind, fungieren, wobei durch eine Ringschlußreaktion eine aromatische Komponente hergestellt wird, die in Schritt c) photometrisch oder fluorome­ trisch detektiert wird.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß als Dicarbonylver­ bindung Methylglyoxal, Glyoxal und/oder 3- Deoxyglucuron bestimmt wird.

18. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprü­ che 1 bis 17, zur Bestimmung von α-Oxoaldehyd in Atemluft, Atemkondensat, Körperflüssigkeiten und/oder Broncheo-alveolare Lavage.