EP1407260A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von dicarbonylverbindungen - Google Patents

Verfahren zur quantitativen bestimmung von dicarbonylverbindungen

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EP1407260A1
EP1407260A1 EP02787122A EP02787122A EP1407260A1 EP 1407260 A1 EP1407260 A1 EP 1407260A1 EP 02787122 A EP02787122 A EP 02787122A EP 02787122 A EP02787122 A EP 02787122A EP 1407260 A1 EP1407260 A1 EP 1407260A1
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EP
European Patent Office
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carbonyl
compound
detection reagent
antibody
dicarbonyl
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02787122A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfgang KLEIBÖHMER
Göran KEY
Harald Peyrer
Uta Schulze-Pellengahr
Helga Korte
Sabine Schreiber-Pietrek
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ICB INSTITUT fur CHEMO- und BIOSENSORIK GmbH
Original Assignee
Icb Institut fur Chemo- und Biosensorik GmbH
Institut fuer Chemo und Biosensorik Muenster eV ICB
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/20—Oxygen containing
    • Y10T436/200833—Carbonyl, ether, aldehyde or ketone containing

Definitions

  • the present invention relates to a method for the quantitative determination of dicarbonyl compounds in gaseous and / or liquid samples and erosols.
  • the method can also be used to determine the accumulation of reactive carbonyl compounds in the so-called carbonyl stress of diabetics.
  • Methylglyoxal can arise from triose phosphate, the metabolism of ketone bodies and the metabolism of threonine and is further broken down by glyoxalase. Methylglyoxal then reacts with proteins to form iridazolone derivatives and bis-lysyl cross-links. This cross-linking of the proteins can lead to the stabilization of collagen and thus to the thickening of membranes. These reactions explain at least part of the diabetic complications such as kidney failure and lens opacification.
  • ⁇ -oxoaldehydes are therefore invasive with one exception, ie from the blood plasma.
  • patients with insulin-dependent diabetes, Thornally TJ, "Advanced Glycation and the development of diabetic complications / Unifying the involvement of Glucose, methylglyoxal and oxidative stress" Endocrinology and Metabolism, 1996, 3, 149-166 directly in plasma compared to healthy comparison subjects, five to six times higher, in patients with insulin-dependent diabetes, a two to three times higher methylglyoxal concentration can be detected.
  • a determination of ⁇ -oxoaldehyde in the urine would be possible, but is not described in the literature, since the expected physiologically very low concentrations in the urine increase would require a lot of analysis, therefore a direct determination of the ⁇ -oxoaldehydes in the plasma is required.
  • methylglyoxal plays a role in the pathogenesis of Alzheimer's syndrome and vascular diseases. This opens up further areas of application for breathing air or breathing condensate diagnostics.
  • a method for the quantitative determination of dicarbonyl compounds in gaseous and / or liquid samples and aerosols which includes the following steps:
  • the method is carried out using microtiter plates.
  • microtiter plates which are suitable for the coupling of dicarbonyl compounds can be used, and the surface of the microtiter plates can be derivatized so that the desired functionality for binding the dicarbonyl compounds is obtained.
  • the method can also be carried out with the aid of a flow injection system (FIA).
  • FSA flow injection system
  • the sample and other reagents are injected in a carrier stream that is transported using peristaltic pumps.
  • peristaltic pumps peristaltic pumps
  • other miniaturized flow systems are also possible.
  • the method can also be carried out using a cartridge.
  • the sample is passed through a cartridge containing the solid phase, e.g. with the help of a syringe.
  • the dicarbonyl compounds in the cartridge are bound to the solid phase and can then be detected either internally or externally.
  • the solid phase can be present both as a porous material or in particle form.
  • step a) the coupling reaction between a first carbonyl function and the carbonyl-reactive group is preferred, and then in step b) a coupling reaction between a detection reagent and the second, not yet bound carbonyl function which carries out the carbonyl compound.
  • step b) a fluorophoric hydrazide is preferably used as the detection reagent, which is subsequently detected fluorometrically in step c). Examples of fluorophore hydrazides are the following connections in question:
  • a compound containing hydrazide groups can also be used in step b), which can then be mixed with an additive specific for this compound.
  • antibody is coupled.
  • This antibody can preferably be used with a detection reagent, e.g. B. a fluorophore, gold or latex particles, are marked.
  • the antibody can be labeled with an enzyme as a detection molecule.
  • an additional variant is the use of an avidin-enzyme complex as a detection reagent.
  • a biotin hydrazide is bound to the second carbonyl function of the dicarbonyl compound, and an enzyme can be coupled via the biotin-avidin interaction.
  • the use of avidin makes it possible to amplify the signal by crosslinking the avidin-enzyme conjugates with a diotin because of its four-bond nature. This cross-linking can take place in advance.
  • an enzyme When an enzyme is coupled in step c), it is preferably detected photometrically, fluorometrically, electrochemically and / or luminometrically.
  • a further variant for the detection consists in that a high-molecular compound is coupled to the dicarbonyl compound and this is then detected on the basis of the increase in mass.
  • quartz microwaves or direct optical methods such as surface plason resonance (English: surface plas on resonance, SPR) come into question.
  • a further variant for the detection consists in using in step b) nano- or microparticles which are suitable for optical detection and which carry carbonyl-reactive groups on their surface. These react with the second carbonyl function of the dicarbonyl compound.
  • the detection can be carried out photometrically, fluorimetrically, nephelometrically, turbidimetrically or visually.
  • a coupling reaction between the immobilized compound formed during the enrichment and a specific detection reagent can take place in step b).
  • Compounds from the group of the aminopyrazines, aminopyridines, aminopyrimidines and aminoguanidines are preferably selected as carbonyl-reactive groups. These compounds are able to covalently bind the carbonyl compounds such as methylglyoxal or glyoxal via their two carbonyl groups. In this variant, these compounds are therefore immobilized on the solid phase, so that they subsequently serve as a scavenger component for the dicarbonyl compounds.
  • the component formed as a result of the reaction between the dicarbonyl compound and the said compounds can then be detected using an antibody which is specific for this component.
  • this antibody is not reactive with the free dicarbonyl compounds or the capture component.
  • the antibody can be labeled with a detection molecule, for which fluorophores, enzymes, latex or gold particles are suitable. It is also possible for the antibody to be detected with the aid of an anti-antibody or via the avidin-biotin system.
  • the solid phase or the water-soluble polymer, which are derivatized with carbonyl-reactive groups serve as a specific detection reagent, an aromatic component being formed by a ring closure reaction. This in turn can then be detected photometrically or fluorometrically in step c).
  • the detectable product is created independently by the two-stage coupling reaction without further coupling of an additional detection reagent.
  • ⁇ -Oxoaldehydes are determined as the preferred dicarbonyl compound using the method. This particularly preferably includes methylglyoxal, glyoxal and / or 3-deoxyglucuron.
  • the method is carried out in gaseous and liquid samples and examples include breathing air, breathing condensate, saliva, broncheo-alveolar lavage,
  • dicarbonyl compounds here methylglyoxal (1)
  • solid phase derivatized with hydrazide groups are coupled to the solid phase derivatized with hydrazide groups.
  • Acetone (2) as a monocarbonyl compound is also bound to the solid phase, but has no further free carbonyl function for coupling the Detection reagent, whereby the monocarbonyl compounds are not detected and a disturbance by them is avoided.
  • the subsequent coupling of the enzyme takes place in two ways.
  • the dicarbonyl compound reacts via the second, still free carbonyl function with a biotin (5) which is bound to a hydrazide.
  • the biotin (5) is coupled with an avidin molecule (3), to which an enzyme (4) is in turn bound.
  • an enzyme (4) modified with a hydrazide group is bound directly.
  • Fig. 3 shows the principle of detection of the component formed due to the reaction between the dicarbonyl compound and the carbonyl-reactive capture component by means of a specific antibody.
  • Methylglyoxal (1) reacts with the capture component (2) immobilized on the solid phase (3) to form a component (4), which is detected by a specific antibody (5) which is provided with a label (6).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von alpha-Oxoaldehyden, im besonderen Glyoxal, Methylglyoxal und 3-Deoxyglucuron in flüssigen und gasförmigen Proben. Das Verfahren besteht aus 2 Schritten: Die Oxoaldehyde werden zuerst angereichert und dann mit einem Nachweisreagenz versetzt, das ein Fluorphor enthält. Der Anrecherungsschritt besteht in der Reaktion der Oxoaldehyde mit reaktiven Gruppen (Aminopyrazine, Aminopyridine, Aminopiperidine oder Aminoguanidine), die an einer festen Phase oder einem wasserlöslichen Polymer immobilisiert sind. Die gebundenen Aldehyde reagieren dann in einem 2. Schritt mit einem spezifischen Nachweisereagenz (ein flurophores Hydrazid, ein Avidin-Komplex oder ein markierter Antikörper).

Description

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Di carbonyl erbindungen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Dicarbonylverbindungen in gasförmigen und/oder flüssigen Proben sowie erosolen. Hierdurch kann das Verfahren auch zur Bestimmung der Akkumulation von reaktiven Carbonylverbin- düngen beim sogenannten Carbonyl-Streß von Diabetikern angewendet werden .
In Folge von langj ährigen Diabetes-Erkrankungen ( insulinabhängiger und/oder insulinunabhängiger Diabe- tes ) auftretende Komplikationen, wie Nierenschädigungen oder Trübung der Augenlinsen, lassen sich nur schwer und erst spät erkennen . Entsprechende Marker für diese Erkrankungen sind bisher nur über eine aufwendige Blutanalytik im Labor möglich . Mitverantwort- lieh für diese Komplikationen bzw. Folgeerkrankungen sind reaktive Stoffwechselprodukte, die mit Kollagen, Enzymen und anderen zellulären Bestandteilen Glykola- te bilden und durch diesen Mechanismus als Zellgifte wirken können. Besonders diskutiert wird in diesem Zusammenhang die Rolle der α-Oxoaldehyde, wie Methyl- glyoxal, Glyoxal und 3-Deoxyglucuron. Diese Stoffe werden in den roten Blutkörperchen gebildet und liegen in sehr geringen Konzentrationen im Blutplasma vor. Sie werden auf diesem Wege auch durch die Lunge transportiert. In der Lunge gehen sie aufgrund ihrer Membrangängigkeit durch Diffusion über die Alveolar- embran aus dem Blut in die Atemluft über. Somit lassen sie sich statt in Blut auch in Atemgas bzw. im Atemkondensat bestimmen.
Von besonderem Interesse ist hierbei das α-Oxoaldehyd Methylglyoxal. Methylglyoxal kann aus Triosephosphat, der Metabolisierung von Keton-Körpern sowie bei der Verstoffwechselung von Threonin entstehen und wird durch Glyoxalase weiter abgebaut. Methylglyoxal rea- giert dann mit Proteinen unter Bildung von Irαidazo- lon-Derivaten und bis-Lysyl-Quervernetzungen. Diese Quervernetzung der Proteine kann zur Stabilisierung von Kollagen und damit zur Verdickung von Membranen führen. Damit erklären diese Reaktionen zumindest ei- nen Teil der diabetischen Komplikationen, wie Nieren- versagen und Linsentrübung.
Die alleinige Blutzuckerbestimmung, wie sie bisher bei Diabetikern üblich ist, gibt keinen direkten Rückschluß auf die momentane Methylglyoxalkonzentra- tion im Vollblut, im Plasma oder im Serum.
Nach dem Stand der Technik erfolgt die Bestimmung von α-Oxoaldehyden daher bis auf eine Ausnahme invasiv, d.h. aus dem Blutplasma. Bei Patienten mit eine insulinabhängigen Diabetes konnte von Thornally T.J., „Advanced Glycation and the development of diabetic complications / Unifying the involvement of Glucose, methylglyoxal and oxidative stress" Endocrinology and Metabolism, 1996, 3, 149-166, direkt im Plasma im Vergleich zu gesunden Vergleichsprobanden eine fünf- bis sechsfach höhere, bei Patienten mit insulinabhängiger Diabetes eine zwei- bis dreifach höhere Methyl- glyoxalkonzentration nachgewiesen werden. Alternativ wäre eine Bestimmung von α-Oxoaldehyd im Urin mög- lieh, ist jedoch in der Literatur nicht beschrieben, da die zu erwartenden physiologisch bedingt sehr niedrigen Konzentrationen im Urin einen zu hohen Analyseaufwand erfordern würden. Daher ist eine direkte Bestimmung der α-Oxoaldehyde im Plasma erforderlich.
Diese Verfahren nach dem Stand der Technik sind folglich extrem aufwendig und kostenträchtig und eignen sich daher bisher nicht für eine regelmäßige Routinekontrolle zur Bestimmung des α-Oxoaldehydgehaltes im Vollblut, Blutplasma oder Serum.
Aufgrund dieser Untersuchungsmethoden nach dem Stand der Technik sind regelmäßige Kontrollen und eine eventuelle bedarfsorientierte Dosierung von Medika- menten zur gezielten Reduzierung von α-Oxoaldehyden wie Methylglyoxal im Vollblut, Blutplasma und Serum sehr aufwendig.
Aus der DE 100 28 326 AI ist die Bestimmung mittels gaschro atographischen Analysemethoden bekannt. Die gesteigerte AGE-Chemie im Körper ist jedoch nicht nur auf den Diabetes allein beschränkt und beruht nicht ausschließlich auf oxidativen Prozessen. Vermehrtes Substratangebot und verminderte Detoxifikation im Krankheitsfall und im Alter resultieren ebenfalls in der Akkumulation von reaktiven Carbonylverbindugnen (sogenannter Carbonyl-Streß) . Neben der Entstehung vieler diabetischer Komplikationen wie Retinopathie, Neuropathie und Nephropathie konnte ebenfalls eine Beeinflussung des Immunsystems durch Methylglyoxal- modifizierte Proteine beobachtet werden, die durch
Bindung an Monozyten die Ausschüttung von proinflam- matorischen Cytokinen hervorrufen. Des weiteren wird vermutet, daß Methylglyoxal eine Rolle in der Patho- genese des Alzheimer-Syndroms und von Gefäßerkrankun- gen spielt. Dies eröffnet noch weitere Einsatzgebiete für die Atemluft bzw. Atemkondensat-Diagnostik.
Eine regelmäßige Kontrolle und eine eventuelle bedarfsorientierte Dosierung von Medikamenten zur ge- zielten Reduzierung von Mehtylglyoxal ist bislang sehr aufwendig. Die alleinige Blutzuckerbestimmung, wie bei Diabetikern üblich, gibt keinen direkten Rückschluß auf die momentane Methylglyoxalkonzentra- tion im Plasma.
Ausgehend hiervon war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Dicarbonylverbindungen bereitzustellen, mit dem die Bestimmung dieser Verbindung in gasförmigen und/oder flüssigen Proben auf einfache und kostengünstige Weise ermöglicht wird.
Diese Aufgabe wird durch das gattungsgemäße Verfahren mit dem kennzeichnenden Merkmalen des Anspruches 1 gelöst. Die weiteren Unteransprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf. Die Verwendung des Verfahrens wird in Anspruch 18 beschrieben.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Dicarbonylverbindungen in gasförmigen und/oder flüssigen Proben sowie Aerosolen bereitge- stellt, das folgende Schritte umfaßt:
a) Anreicherung der in der Probe enthaltenen Dicarbonylverbindungen an einer Festphase und/oder ei- nem geeigneten wasserlöslichen Polymer, die mit carbonylreaktiven Gruppen, z.B. einer Hydrazid- Gruppe, derivatisiert sind. Hierbei kommt es zu einer Kupplungsreaktion zwischen mindestens einer Carbonylfunktion der Dicarbonalverbindung und der carbonylreaktiven Gruppe der derivatisierten Festphase oder eines geeigneten wasserlöslichen Polymers.
b) Eine Kupplungsreaktion zwischen der Dicarbonylver- bindung, und/oder der bei der Anreicherung gebildeten immobiliserten Verbindung mit einem spezifischen Nachweisreagenz.
c) Eine quantitative Bestimmung der Dicarbonylverbin- düngen anhand der Detektion des gebundenen Nachweisreagenzes mit nach dem Stand der Technik geläufigen Verfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfah- ren mit Hilfe von Mikrotiterplatten durchgeführt. Dabei können sowohl kommerzielle Mikrotiterplatten, die für die Ankopplung von Dicarbonylverbindungen geeignet sind, verwendet werden, als auch eine Derivati- sierung der Mikrotiterplattenoberflache erfolgen, so daß die gewünschte Funktionalität zur Bindung der Dicarbonylverbindungen erhalten wird.
Alternativ kann das Verfahren auch mit Hilfe eines Fließinjektionssystems (englisch: flow injection ana- lysis, FIA) durchgeführt werden. Hierbei erfolgt die Injektion der Probe und der weiteren Reagenzien in einen Trägerstrom, der mit Hilfe peristaltischer Pumpen transportiert wird. Ebenso sind aber auch andere miniaturisierte Durchflußsysteme möglich.
Als weitere andere Alternative kann das Verfahren auch mit Hilfe einer Kartusche durchgeführt werden. Hierfür wird die Probe durch eine die Festphase enthaltende Kartusche geleitet, z.B. mit Hilfe einer Spritze. Dabei werden die Dicarbonylverbindungen in der Kartusche an der Festphase gebunden und können anschließend entweder intern oder extern detektiert werden. Die Festphase kann dabei sowohl als poröses Material oder auch in Partikelform vorliegt.
Bevorzugt wird in Schritt a) die Kupplungsreaktion zwischen einer ersten Carbonylfunktion und der carbonylreaktiven Gruppe sowie anschließend in Schritt b) eine Kupplungsreaktion zwischen einem Nachweisreagenz und der zweiten, noch nicht gebundenen Carbonyl- funktion der die CarbonylVerbindung durchführt. Dabei wird in Schritt b) als Nachweisreagenz bevorzugt ein fluorophores Hydrazid verwendet, das anschließend in Schritt c) fluorometrisch detektiert wird. Als fluo- rophore Hydrazide kommen z.B. folgende Verbindungen in Frage:
a) 5- ( ( (2- (carbohydrazino) methyl) thio) acetyl ) amino- fluorescein; b) Fluorescein-5-Thiosemicarbizid; c) 4,4-difluoro5,7dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s- indacene-3-propionsäure-Hydrazid d) Texas red® 350;-488;-568;-594;-633.
Alternativ kann in Schritt b) auch eine hydrazidgrup- penhaltige Verbindung verwendet werden, die anschließend mit einem für diese Verbindung spezifischen An- tikörper gekoppelt wird. Dieser Antikörper kann bevorzugt mit einem- Nachweisreagenz, z. B. einem Fluo- rophor, Gold- oder Latex-Partikeln, markiert werden.
Als weitere Variante kann der Antikörper mit einem Enzym als Nachweismolekül markiert werden.
Als zusätzliche Variante bietet sich in Schritt b) die Verwendung eines Avidin-Enzym-Komplexes als Nach- weisreagenz an. Bei dieser Verwendungsvariante wird ein Biotinhydrazid an die zweite Carbonylfunktion der DicarbonylVerbindung gebunden, wobei über die Biotin- Avidin-Wechselwirkung ein Enzym angekoppelt werden kann. Durch den Einsatz von Avidin ist auf Grund des- sen Vierbindigkeit eine Signalverstärkung durch Quervernetzung der Avidin-Enzym-Konjugate durch ein Di- biotin möglich. Diese Quervernetzung kann bereits im Vorfeld erfolgen.
Bei Ankopplung eines Enzyms erfolgt in Schritt c) die Detektion desselben bevorzugt photometrisch, fluoro- metrisch, elektrochemisch und/oder luminometrisch erfolgen.
Eine weitere Variante für die Detektion besteht darin, daß eine hochmolekulare Verbindung an die Dicar- bonylverbindung angekoppelt wird und diese anschließend anhand des Massenzuwachses detektiert wird. Hierfür kommen beispielsweise Quarzmikrowagen oder auch direktoptische Methoden wie die Oberflächenplas- monenresonanz (englisch: surface plas on resonance, SPR) in Frage.
Ebenso können aber auch sämtliche aus dem Stand der Technik bekannten Detektionsverfahren eingesetzt werden. Eine weitere Variante für die Detektion besteht darin, in Schritt b) Nano- oder Mikropartikel zu verwenden, die zum optischen Nachweis geeignet sind und an ihrer Oberfläche carbonylreaktive Gruppen tragen. Diese reagieren mit der zweiten Carbonylfunktion der Dicarbonylverbindung. Die Detektion kann photometrisch, fluorimetrisch, nephelometrisch, turbidi e- trisch bzw. visuell erfolgen.
In einer weiteren Variante kann in Schritt b) eine Kupplungsreaktion zwischen der bei der Anreicherung gebildeten immobilisierten Verbindung mit einem spezifischen Nachweisreagenz erfolgen. Als carbonylreak- tive Gruppen werden dabei bevorzugt Verbindungen aus der Gruppe der Aminopyrazine, Aminopyridine, Aminopy- rimidine und Aminoguanidine ausgewählt. Diese Verbindungen sind imstande, die Carbonylverbindungen wie Methylglyoxal oder Glyoxal über ihre beiden Carbonyl- gruppen kovalent zu binden. Bei dieser Variante werden daher diese Verbindungen an der Festphase immobilisiert, so daß sie anschließend als Fängerkomponente für die Dicarbonylverbindungen dienen. Die aufgrund der Reaktion zwischen der Dicarbonylverbindung und den besagten Verbindungen gebildete Komponente kann anschließend mittels eines Antikörpers, der für diese Komponente spezifisch ist, nachgewiesen werden. Dieser Antikörper ist jedoch nicht reaktiv mit den freien Dicarbonylverbindungen oder der Fängerkomponente. Der Antikörper kann mit einem Nachweismolekül, markiert sein, wofür z.B. Fluorophore, Enzyme, Latexoder Gold-Partikel in Frage kommen. Ebenso ist es auch möglich, daß der Antikörper mit Hilfe eines anti-Antikörpers bzw. über das Avidin-Biotin-System nachgewiesen wird. Eine weitere Alternative sieht vor, daß in Schritt b) als spezifisches Nachweisreagenz die Festphase oder das wasserlösliche Polymer, die mit carbonylreaktiven Gruppen derivatisiert sind, dienen, wobei durch eine Ringschlußreaktion eine aromatische Komponente entsteht. Diese wiederum kann dann in Schritt c) photometrisch oder fluorometrisch detektiert werden. Das detektierbare Produkt entsteht bei dieser Variante durch die zweistufige Kopplungsreaktion selbständig ohne weitere Ankopplung eines zusätzlichen Nachweisreagenzes.
Als bevorzugte Dicarbonylverbindung werden mit Hilfe des Verfahrens α-Oxoaldehyde bestimmt. Hierzu zählen besonders bevorzugt Methylglyoxal, Glyoxal und/oder 3-Deoxyglucuron.
Das Verfahren wird in gasförmigen sowie flüssigen Proben durchgeführt und als Beispiel seien Atemluft, Atemkondensat, Speichel, Broncheo-alveolare Lavage,
Blut, Plasma, Serum, Urin, Gewebeflüssigkeit und Tränenflüssigkeit genannt.
Anhand der beiden folgenden Figuren soll das erfin- dungsgemäße Verfahren näher erläutert werden, ohne dieses dadurch hierauf einzugrenzen.
Fig. 1 zeigt zwei Beispiele für den schematischen Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens. Zunächst er- folgt die Ankopplung der Dicarbonylverbindungen, hier Methylglyoxal (1), an die mit Hydrazid-Gruppen deri- vatisierte Festphase.
Aceton (2) als Monocarbonylverbindung wird ebenfalls an die Festphase gebunden, besitzt jedoch keine weitere freie Carbonylfunktion für die Kopplung des Nachweisreagenzes, wodurch die Monocarbonylverbindun- gen nicht mitdetektiert werden und eine Störung durch diese vermieden wird. Die sich anschließende Ankopplung des Enzyms erfolgt über zwei Varianten. In der ersten Variante reagiert die Dicarbonylverbindung über die zweite, noch freie Carbonylfunktion mit einem Biotin(5), das an ein Hydrazid gebunden ist. In einen weiteren Schritt wird das Biotin (5) mit einem Avidin-Molekül (3) gekoppelt, an das wiederum ein En- zym (4) gebunden ist.
In der weiteren Variante erfolgt dagegen eine direkte Bindung eines mit einer Hydrazidgruppe modifizierten Enzyms (4) .
Fig. 2 zeigt das Ergebnis einer Testung, die nach dem gleichen Prinzip, mit Nachweis über Biotinhydrazid und Avidin-Peroxidase mit nachfolgender Absorptionsmessung, durchgeführt wird.
Fig. 3 zeigt das Prinzip des Nachweises der aufgrund der Reaktion zwischen Dicarbonylverbindung und der carbonylreaktiven Fängerkomponente gebildete Komponente mittels eines spezifischen Antikörpers.
Methylglyoxal (1) reagiert mit der an der Festphase (3) immobilisierten Fängerkomponente (2) zu einer Komponente (4) , die durch einen spezifischen Antikörper (5), der mit einem Label (6) versehen ist, detek- tiert wird.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Dicarbonylverbindungen in gasförmigen und/oder flüssigen Proben mit folgenden Schritten:
a) Anreicherung der in der Probe enthaltenen Dicarbonylverbindungen an einer Festphase • und/oder einem wasserlöslichen Polymer, die mit carbonylreaktiven Gruppen derivatisiert sind, über eine Kupplungsreaktion zwischen mindestens einer Carbonylfunktion der Dicarbonylverbindung und der carbonylreakti- ven Gruppe,
b) Kupplungsreaktion der Dicarbonylverbindung und/oder der bei der Anreicherung gebildeten immobilisierten Verbindung mit einem spezifischen Nachweisreagenz,
c) quantitative Bestimmung der Dicarbonylverbindungen anhand der Detektion der Menge des gebundenem Nachweisreagenzes.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mittels Mikrotiterplatten durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in ei- nem Fließinjektionssystem durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in einem miniaturisierten Durchflußsystem durchgeführt wird.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt a) die Probe durch eine die Festphase enthaltende Kar- tusche geleitet wird.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt a) die Kupplungsreaktion zwischen einer ersten Carbonylfunktion und der carbonylreaktiven Gruppe und anschließend in Schritt b) eine Kupplungsreaktion zwischen einem Nachweisreagenz und der zweiten Carbonylfunktion der Dicarbonylverbin- düng durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) als Nachweisreagenz ein fluorophores Hydrazid ver- wendet und dieses in Schritt c) fluorometrisch detektiert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) als Nachweisreagenz ein Avidin-Enzym-Ko plex eingesetzt wird, der über ein Biotinhydrazid an die zweite Carbonylfunktion der Dicarbonylverbindung gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) Nano- oder Mikropartikel verwendet werden, die an der Oberfläche mit carbonylreaktive Gruppen modifiziert sind und die im Anschluß photometrisch, fluorimetrisch, nephelometrisch, turbidimetrisch bzw. visuell detektiert werden.
10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) eine hydrazidgruppenhaltige Verbindung verwendet wird, die anschließend mit einem für diese Verbindung spezifischen Antikörper gekoppelt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit einem Nachweisreagenz, z. B. einem Fluorophor, Gold- oder Latex-Partikeln, markiert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit einem Enzym als Nachweismolekül markiert wird.
13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c) photometrisch, fluorometrisch, elektrochemisch, luminometrisch, direkt-optisch und/oder mit einer Quarzmikrowaage detektiert wird.
14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die carbonylreakti- ve Gruppe in Schritt a) ausgewählt ist aus der Gruppe der Aminopyrazine, Aminopyridine, A ino- pyri idine und Aminoguanidine.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß als für die immobi- lisierte Verbindung spezifisches Nachweisreagenz ein markierter Antikörper verwendet wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit einem Fluorphor, einem Enzym, Gold-Partikeln, einem markierten anti-Antikörper oder einem Avi- din-Biotin-System markiert wird.
17. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) als spezifisches Nachweisreagenz die Festphase und/oder das wasserlösliche Polymer, die mit carbonylreaktiven Gruppen derivatisiert sind, fungieren, wobei durch eine Ringschlußreaktion eine aromatische Komponente hergestellt wird, die in Schritt c) photometrisch oder fluorome- trisch detektiert wird.
18. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß als Dicarbonylverbindung α-Oxoaldehyde bestimmt werden.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß als Dicarbonylverbindung Methylglyoxal, Glyoxal und/oder 3- Deoxyglucuron bestimmt wird.
20. Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 19, zur Bestimmung von Dicarbonylverbindungen in Atemluft, Atemkondensat, Körperflüssigkeiten und/oder Broncheo-alveolare
Lavage .
EP02787122A 2001-07-16 2002-07-09 Verfahren zur quantitativen bestimmung von dicarbonylverbindungen Withdrawn EP1407260A1 (de)

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