DE4008523C2 - Verfahren und Vorrichtung zur Analyse durch Flüssig-Chromatographie - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Analyse durch Flüssigchromatographie und insbesondere auf ein Verfahren und eine Vorrichtung, das zur Ana­ lyse von Proben mit anderen Bestandteilen neben dem Lösungs­ mittel und der Analysestoffe geeignet ist.

Es ist im allgemeinen bekannt, daß ein Elutionsmittel zum Ge­ brauch bei Separationen und Analyse von Analysestoffen in Proben durch Flüssigchromatographie eine Lösung sein sollte, die keine Verunreinigungen enthält, weil die Verunreinigungen einen nachteiligen Effekt auf das Resultat der Analyse aus­ üben.

Andererseits offenbart "Basic Liquid Chromatography, pp. 8.1-8.20, veröffentlicht durch Varian Aerograph (1971)", daß die Verunreinigungen in einem Elutionsmittel weder Messungen verhindern noch einen Fehler in den Meßwerten hervorrufen, weil, selbst wenn ein Elutionsmittel dieselben Substanzen wie die Analysestoffe in den Proben als Verunreinigungen enthalten, verhalten sich die Verunreinigungen, die in dem Elutionsmittel enthalten sind, als kon­ stanter Untergrund, wenn einmal ein Gleichgewichtszustand zwi­ schen dem Elutionsmittel, das kontinuierlich durch die Separationssäule und dem darin enthaltenen Füller in der Separationssäule läuft, etabliert ist und somit die Analysestoffe in den Proben oberhalb des Untergrunds gezeigt werden. Trotz allem offenbart "Bunseki Kagaku, Vol. 38, pp 94-97 (1989)", daß bei starken sauren Proben wie Salzsäureextrakten in der Analyse der Alkali­ metallionen oder Ammoniumionen mit Hilfe von Ionenchromato­ graphie die Säulenhalteenergie infolge der Einflüsse von Was­ serstoffionen in den Proben herabgesetzt wird, wodurch die Exaktheit der Analyse gemindert wird. In dem Artikel ist keine Bemerkung bezüglich des Zusammenhangs zwischen den Verunreini­ gungen in einem Elutionsmittel und den weiteren Bestandteilen in den Proben ge­ macht.

Als Ergebnis extensiver Analysestudien mit Hilfe von Flüssigchromatographie haben die Erfinder der vorliegenden Er­ findung herausgefunden, daß der zwischen dem Elutionsmittel und dem Füller in einer Separationssäule erreichte Gleichgewichtszustand für einen Moment durch Injektion einer Probe gestört ist, was Auswirkungen auf die Meßwerte hat. Es scheint, daß der Meßfehler darauf zurückzuführen ist, daß die­ selben Arten der Substanzen als Analysestoffe in den Proben auch in dem Elutionsmittel enthalten sind. Somit könnte der Meßfehler verringert werden, wenn die Verunreinigungen von dem Elutionsmittel entfernt würden. Trotz allem ist es in all den Fällen schwie­ rig, gänzlich die Verunreinigungen aus dem Elutionsmittel zu entfernen.

Aus der JP-A2 62-232564 ist ein qualitatives Analyseverfahren zur Feststellung von sehr kleinen Mengen einer Komponente in einer Probe, in der eine große Menge einer anderen Komponente vorhanden ist, bekannt, wobei das Problem auftritt, daß die Retentionszeit des Spurenelementes (C) durch den Einfluß der großen Menge der anderen Komponente (A) bei der Chromatographie verschoben wird.

Bei dem vorbekannten Verfahren wird ein Chromatogramm einer die Ionen-Analysestoffe A, B und C enthaltenden Standardprobe ohne jeglichen Einfluß einer dominierenden Menge der Ionen beispielsweise A im voraus ermittelt, wobei angenommen wird, daß die Retentionszeit des Analysestoffs C im Chromatogramm der korrekten Retentionszeit entspricht. Anschließend wird ein anderes Chromatogramm einer unbekannten, eine vorherrschende Menge der Ionen A und eine geringe Menge der Ionen C enthaltenen Probe bestimmt, wobei die Identifikation der Ionen c durch die Korrektur einer Retentionszeitdifferenz zwischen Peaks der in Spuren vorhandenen Ionen C und des Analysestoffs C im Chromatogramm der Standardprobe gemäß einer besonderen Berechnungsgleichung erfolgt.

Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Analyse durch Flüssigchro­ matographie bereitzustellen, die in der Lage sind, Analyse­ stoffe mit hoher Exaktheit zu messen, selbst wenn ein Elutionsmittel die gleichen Substanzen wie die Analysestoffe in den Proben enthält.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Analyse durch Flüssigchro­ matographie bereitzustellen, die in der Lage sind, nachteili­ ge Einflüsse durch die Anwesenheit von weiteren Bestandteilen in den Proben auf die Meßwerte der Analysestoffe zu korrigieren.

Diese Aufgaben werden durch die Merkmale der Patentansprüche 1 und 7 gelöst.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausge­ funden, daß, wenn ein Elutionsmittel dieselben Substanzen wie die Ana­ lysestoffe als Verunreinigungen enthält, die Meßwerte von einem oder mehreren Analysestoffen in jeder der Proben, die durch Flüssigchromatographie gewonnen wurden, einen Meßfehler beinhalten. Als Ergebnis weiterer Experimente haben die Er­ finder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, daß der Meßfehler in Verbindung steht mit den Konzentrationen der weiteren Bestandteile, die in einer flüssigen Probe enthalten sind.

Die vorliegende Erfindung ist ein Ergebnis einer Studie dieser Erkenntnisse.

Der nachfolgend für die weiteren Bestandteile gebrauchte Begriff "Matrixelemente" bezeichnet alle anderen Komponenten als die Analysestoffe und das Lö­ sungsmittel in einer Flüssigprobe.

Die Merkmale der vorliegenden Erfindung sind wie folgt:

Zunächst werden eine Vielzahl von Probelösungen mit un­ terschiedlichen Konzentrationen der Matrixelemente, die aus der zu analysierenden Probe stammen, vorbereitet, insbesondere durch Verdünnen der Originalprobe. Konzentration oder andere Maßnahmen können ebenfalls für die Präparation der Probenlösungen ver­ wendet werden. Zu präparierende Probenlösungen sind nicht nur auf eine Vielzahl von verdünnten ursprünglichen Probenlösungen begrenzt, sondern die ursprüngliche Probe selbst kann als eine der Probenlösungen herangezogen werden. Eine der Probenlö­ sungen wird in einer Separationssäule mit einem Elutionsmittel ins Gleichgewicht gebracht, um erste Meßwerte auf der Grundlage der Analysestoffe zu erhalten. Danach wird eine andere Proben­ lösung in die Separationssäule eingeführt, um zweite Meßwerte, basierend auf derselben Art der Analysestoffe, zu erhalten. Danach werden die ersten Meßwerte und die zweiten Meßwerte einer Umwandlung auf der Basis des Verdünnungsverhältnisses oder Konzentrationsverhältnisses ausgesetzt und die umge­ wandelten Werte werden korreliert, um korrigierte Werte für eine oder mehrere Analysestoffe zu erhalten, die im wesentli­ chen frei von Einflüssen der Matrixelemente sind.

Wenn eine Flüssigprobe mit Matrixelementen in eine Sepa­ rationssäule eingeführt wird, nachdem ein Elutionsmittel mit Verunrei­ nigungen in einen Gleichgewichtszustand mit einem Füller in der Separationssäule gebracht wurde, scheint sich die Flüssig­ probe wie folgt zu verhalten:

Wenn eine Flüssigprobe mit Matrixelementen hoher Konzen­ trationen in die Separationssäule eingeführt wird, ändert sich für einen Moment der Gleichgewichtszustand in der Separa­ tionssäule. Die Verunreinigungen in dem Elutionsmittel werden auch in einem Gleichgewichtszustand gehalten durch Adsorption an dem Füller in der Separationssäule, bevor die Flüssigkeitsprobe eingeführt wurde, jedoch werden die adsorbierten Verunreini­ gungen in großem Ausmaß durch die Einführung der Flüssigprobe in die Separationssäule entfernt, und durch die Mitnahme für kurze Zeit durch den Strom des Elutionsmittels außerhalb der Separationssäule transportiert. Wenn angenommen wird, daß die Verunreinigungen dieselbe Substanz wie die Analysestoffe in der Flüssigprobe sind, ist die Menge der adsorbierten Verunreinigungen an den Füllern extrem herabgesetzt. Dann werden die Analysestoffe der Flüssigprobe an dem Füller adsor­ biert, aber die Analysestoffe müssen die durch Adsorptionsver­ ringerung entfallenen Verunreinigungen nachliefern. Wenn das Band einer Flüssigprobe durch die Separationssäule zieht, kehrt die Separationssäule zu dem anfänglichen Gleichgewichts­ zustand zurück und die Analysestoffe wandern durch die Separa­ tionssäule. Die zu eluierende Menge der Analysestoffe aus der Separationssäule ist beträchtlich kleiner als die Menge, die in die Flüssigprobe eingeführt wurde. Das heißt, die Meßwerte der Analysestoffe beinhalten einen Negativfehler und der Grad des Fehlers hängt mit der Menge zur Nachlieferung der Adsorp­ tionsverringerung zusammen.

Wenn eine Flüssigprobe mit Matrixelementen mit geringer Konzentration in die Separationssäule eingeführt wurde, ist der Grad des Einflusses kleiner als im Falle hoher Konzentra­ tionen, aber die Meßwerte der Analysestoffe beinhalten aus dem gleichen Grunde wie oben erklärt, einen Negativfehler.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine im wesentlichen proportionale Abhängigkeit zwischen den Konzen­ trationen der Matrixelemente in den Proben und dem Negativfeh­ ler, der in die Meßwerte der Analysestoffe involviert ist, herausgefunden. Es ist vorteilhaft, daß die Meßwerte auf der Peakfläche der Analysestoffe basieren, aber auch Peakhöhen der Analysestoffe können verwendet werden. Wenn eine Flüssigprobe keine Matrixelemente enthält, werden die Meßwerte der Analyse­ stoffe keine Fehler aufweisen. Somit können mit der vorliegen­ den Erfindung exakte analytische Ergebnisse der Mengen der Analysestoffe unter Annahme eines Status, daß nur Analysestof­ fe in der Lösung der Probe enthalten sind und von Meßwerten einer Vielzahl von Probenlösungen mit darin enthaltenen Ma­ trixelementen mit unterschiedlichen Konzentrationen erfaßt werden.

Die Anzahl der Proben mit darin enthaltenen Matrixelemen­ ten mit unterschiedlichen Konzentrationen und von derselben ursprünglichen Probe präpariert, ist nicht auf zwei begrenzt. Eher macht eine größere Anzahl von Probenlösungen, zum Beispiel drei oder mehrere Probenlösungen, das analytische Resultat verläßlicher.

Anhand der nachfolgenden Zeichnungen wird die Erfindung näher erläutert.

Fig. 1 ist ein schematisches Flußdiagramm einer Vorrichtung zur Analyse gemäß der einen Ausführungsform der vorliegen­ den Erfindung.

Fig. 2A und 2B sind Ansichten, die die Wirkungsweisen des Verdünners in der Ausführungsform der Fig. 1 zeigen.

Fig. 3A und 3B sind Ansichten, die die Wirkungsweise in einem niedrigen Verdünnungsverhältnis im selben Verdünner als in den Fig. 2A und 2B zeigen.

Fig. 4 ist ein Beispiel eines Chromatogramms, das bei einem Vorversuch gewonnen wurde.

Fig. 5 ist ein Diagramm, das graphisch die Resultate aus Fig. 4 zeigt.

Fig. 6 ist ein Diagramm, das graphisch die Ergebnisse anderer Vorversuche zeigt.

Fig. 7 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse der Messun­ gen mit dem Apparat zur Analyse aus Fig. 1 zeigt.

Fig. 8 ist ein Diagramm, das andere Resultate der Mes­ sungen mit dem Apparat zur Analyse aus Fig. 1 zeigt.

Bevor nun Beispiele der vorliegenden Erfindung beschrie­ ben werden, sollen Ergebnisse aus vorangegangenen Tests erklärt werden in Bezug auf die Fig. 4 bis Fig. 6.

In ersten und zweiten Vortests ist eine Säule, die mit Kationenaustauschharz gefüllt war, als eine Separationssäule, ein elektrischer Leitfähigkeitsüberwacher als Aufnehmer und eine wäßrige Lösung mit 0,5 mM Weinsteinsäure und 0,5 mM Ethy­ lendiamin als Elutionsmittel verwendet worden.

Erste vorläufige Tests werden nun mit Bezug auf die Fig. 4 und 5 erklärt.

Das Elutionsmittel wurde durch Auflösung kommerziell vorhandener Weinsteinsäure und Ethylendiamin in reinem Wasser aufgelöst. Andererseits wurden fünf Sorten einer Probenlösung präpariert. Die Probenlösung mit Weinsteinsäure und Ethylendiamin als Ma­ trixelemente, deren Konzentrationen für eine erste Probenlö­ sung 0,5 mM und 1,0 mM für eine zweite Probenlösung und 2,0 mM für eine dritte Probenlösung und 5,00 mM für eine vierte Pro­ benlösung und 20,0 mM für eine fünfte Probenlösung waren, wur­ den verwendet. Das Lösungsmittel der individuellen Probenlö­ sungen war reines Wasser und die individuellen Probenlösungen wurden jede mit 1 ppm Mg⁺⁺, Ca⁺⁺ und Sr⁺⁺ präpariert. Die Volumina der Probenlösungen, die in die Separationssäule eingeführt wurden, besaßen gleiche Zusammensetzung, das heißt 20 µl.

Nach der Stabilisierung der Separationssäule wurde die erste bis fünfte Probenlösung in die Separationssäule nach­ einander eingeführt und Chromatogramme entsprechend jeder der Probenlösungen wurden auf einem Druckerpapier eines Schrei­ bers ausgedruckt. Die so erhaltenen Meßergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt.

In Fig. 4 basieren die Chromatogramme (1) bis (5) auf der ersten bis zur fünften Probenlösung entsprechend. Bezüg­ lich der Ca⁺⁺-Spitze in den einzelnen Chromatogrammen zeigt Ca⁺⁺ eine negative Spitze, wenn die Konzentrationen der Matrixelemente 5,0 mM (Chromatogramm (4)) und 20,0 mM (Chroma­ togramm (5)) waren, da das Elutionsmittel Ca⁺⁺ Verunreinigungen ent­ hielt. Messungen des Elutionsmittels mit Hilfe von atomarer Absorp­ tionsspektrometrie zeigten einige Zehn ppm Ca⁺⁺.

Beziehungen zwischen den Peakflächen der Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ und Sr⁺⁺ als Analysenstoffe in Fig. 4 und den Konzen­ trationen der Matrixelemente in der ersten und der fünften Probenlösung sind in Fig. 5 gezeigt.

In Fig. 5 ändert sich die Peakfläche der Ca⁺⁺ umgekehrt proportional zu den Konzentrationen der Matrixelemente. Bei einer Konzentration der Matrixelemente von 3 mM ist die Peakfläche Null. Dieses könnte bedeuten, daß die Adsorptions­ menge von Ca⁺⁺ als eine Verunreinigung in dem verwendeten Elutionsmittel ausbalanciert ist. Ebenso die Peakfläche der Mg⁺⁺ ten­ diert zur Abnahme mit zunehmenden Konzentrationen der Matrix­ elemente. Es ist aber dort auffällig, daß der Mg⁺⁺-Gehalt als eine Verunreinigung in dem Elutionsmittel extrem klein ist im Ver­ gleich mit dem Ca⁺⁺-Gehalt. Die Peakfläche der Sr⁺⁺ wurde nicht verändert bei Änderungen der Konzentration der Matrix­ elemente und es kann angenommen werden, daß keine Sr⁺⁺ als Verunreinigung in dem Elutionsmittel enthalten sind.

Weitere vorläufige Tests werden nun mit Bezug auf Fig. 6 erklärt.

Weinsteinsäure und Ethylendiamin als Komponenten des Elutionsmittels werden sorgfältig gereinigt, um frei von Verunreinigungen zu sein und anstatt der Verunreinigungen wurden ein ppm jedes der Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, Sr⁺⁺ und Ba⁺⁺ dem Elutionsmittel zugegeben.

Andererseits wurden fünf Sorten von Probenlösungen präpa­ riert. Das Lösungsmittel war reines Wasser, die Matrixelemente waren Weinsteinsäure und Ethylendiamin und die Analysestoffe waren Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, Sr⁺⁺ und Ba⁺⁺. Weinsteinsäure und Ethylendiamin waren zu gleichen Konzentrationen pro Mol enthalten. Die Konzentrationen der Matrixelemente waren Null mM für eine erste Probenlösung, 0,5 mM für eine zweite Pro­ benlösung, 1,0 mM für eine dritte Probenlösung, 2,0 mM für eine vierte Probenlösung und 5,0 mM für eine fünfte Probenlö­ sung. Das heißt, die Konzentrationen der Matrixelemente der zweiten Probenlösung waren die gleichen wie die Konzentratio­ nen der Komponenten des Elutionsmittels und die Konzentrationen der Ma­ trixelemente der dritten und der vierten Probenlösung waren größer als die Konzentrationen der Komponenten des Elutionsmittels. Die ersten der fünf Probenlösungen enthielten alle 1 ppm Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, Sr⁺⁺ und Ba⁺⁺. Die Konzentrationen dieser Analy­ sestoffe waren dieselben wie die Konzentrationen der Verunrei­ nigungen derselben Spezies in dem Elutionsmittel. Die Volumina der ein­ zelnen Probelösungen, die in die Separationssäule eingeführt wurden, waren jeweils 20 µl. Diese Probenlösungen wurden in der gleichen Weise wie in den ersten vorläufigen Tests analysiert. Die somit erhaltenen analytischen Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt.

Wie in Fig. 6 gezeigt wird, stehen Meßwerte (Peakflä­ chen) der ersten bis zur fünften Probenlösung in engem Zusam­ menhang mit den Konzentrationen der Matrixelemente in den ein­ zelnen Probenlösungen. Wenn die Konzentrationen der Matrix­ elemente und die Konzentrationen der Analysestoffe der zweiten Probenlösung identisch sind mit denen des Elutionsmittels, werden keine Spitzen der Analysestoffe erhalten. Selbst wenn die Konzentra­ tionen der Analysestoffe in der dritten bis zur fünften Pro­ benlösung identisch mit den Konzentrationen der Verunreini­ gungen derselben Spezies in dem Elutionsmittel sind, wird der negative Fehler bei den Meßwerten der Analysestoffe größer mit größer werdenden Konzentrationen der Matrixelemente.

Es ist eine wichtige Entdeckung, daß die Peakflächen der einzelnen Analysestoffe bei Null-Konzentrationen der Matrix­ elemente, die von der ersten Probenlösung erhalten werden, in vollkommener Übereinstimmung mit den Werten, die durch Verbin­ dung der individuellen Peakflächenwerte, die von der zweiten bis zur fünften Probenlösung durch gerade Linien erhalten wurde und durch Extrapolation die Null-Konzentration der Ma­ trixelemente erhalten wurde. Dies ermöglicht, daß selbst wenn die Konzentrationen der Matrixelemente in tatsäch­ lichen analytischen Ausführungen nicht zu Null gemacht werden können, Mengen der Analysestoffe in einem derartigen Verbindungszustand aus Meßwerten einer Vielzahl von Probenlö­ sungen mit unterschiedlichen Konzentrationen der Matrixelemen­ te, die von derselben ursprünglichen Probe präpariert wurden, abgeschätzt werden können.

Exakte Mengen der einzelnen Analysestoffe aus Fig. 6 können durch Aufzeichnen der Peakflächen der einzelnen Analy­ sestoffe mit Hilfe der Konzentrationen der Matrixelemente der zweiten bis fünften Probenlösung als Parameter und Verbindung der Peak-Flächenwerte mit geraden Linien erhalten werden, wodurch die Null-Konzentrationen der Matrixelemen­ te extra poliert werden. Somit kann durch Manipulation der Verdünnungsprozedur für eine ursprüngliche Probe oder Datenprozeßprozedur die oben er­ wähnte Extrapolationsprozedur in der Tat zur Analyse echter Proben angewendet werden.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird nun mit Bezug auf die Fig. 1 bis 3B beschrieben.

In einem Analyseapparat der Fig. 1 wird ein Elutionsmittel in ei­ nem Elutionsmitteltank 1 über einen Verdünner 3 mit Hilfe einer Speise­ pumpe 2 der Separationssäule 7 zugeführt und durch eine Fluß­ zelle 8 entleert. Die Speisepumpe 2 ist eine Dual-Kolbenum­ kehrpumpe, die in der Lage ist, die Pumprate in Größenordnun­ gen von Millilitern pro Minute zu steuern, wie sie beispiels­ weise in der US-Patent No. 48 10 168 offenbart wurde. Im Appa­ rat der Fig. 1 ist das Elutionsmittel durch Einstellen der Pumpenrate der Speisepumpe zu 1 ml/min gepumpt.

Die Separationssäule 7 und die Flußzelle 8 sind in einem Säulenofen 6 untergebracht und bei 40°C gehalten. Die Separa­ tionssäule 7 ist ein Edelstahlzylinder mit 4 mm Innendurchmes­ ser und 50 mm Länge, dicht gefüllt mit Anionen-Austauschharz niedriger Austauschkapazität. Dieser Typ der Separationssäule ist kommerziell erhältlich, z.B. als Hitachi Packed Column #2720IC. In der Flußzelle 8 sind Meßelektroden mit einem Über­ wacher 10 der elektrischen Leitfähigkeit verbunden. Der die elek­ trische Leitfähigkeit überwachende Apparat 10 ist mit einem Verstärker ausgerüstet, der in der Lage ist, den Verstär­ kungsgrad der aufgenommenen Signale durch Befehle eines Mikrocomputers 5, der wiederum als eine Computersteuerung ar­ beitet, zu verändern. Die Analogsignale, die durch den Auf­ nehmer mit der Flußzelle 8 und dem die elektrische Leit­ fähigkeit überwachenden Apparat 10 erhalten wurden, werden in den Mikrocomputer 5 als Computersteuerung als digitale Signale durch einen Analog-Digitalwandler 11 eingespeist und zur not­ wendigen Datenverarbeitung herangezogen. Andererseits werden die Analogsignale des Aufnehmers auf einem Schreiberpapier mit einem Schreiber 14 als Chromatogramme aufgeschrieben.

In dem Analyseapparat in der Fig. 1 werden Hitachi L-3700 Elektro-Leitfähigkeitsüberwacher und Flußzellen als Aufnehmer verwendet. Als Detektor können ein Spektro-Photome­ ter, ein Spektro-Photofluorometer, ein Elektro-chemischer Auf­ nehmer etc., abhängig von der Art der Proben, verwendet wer­ den.

Der Verdünner 3 kann eine Verdünnungsfunktion haben, um eine Vielzahl von Probenlösungen mit unterschiedlichen Verdün­ nungsverhältnissen von einer ursprünglichen Probe in der Fluß­ passage zu präparieren oder kann automatisch verdünnte Pro­ benlösungen in die Flußpassage einführen, nachdem die ur­ sprüngliche Probe zur Probenlösung in einem Kessel, der außer­ halb der Flußpassage vorgesehen ist, verdünnt ist. Ein Bei­ spiel einer Verdünnung in der Flußpassage ist in den Fig. 2a bis 3b gezeigt. Die Arbeitsweise des Verdünners wird später erklärt.

Nachdem entschieden wurde, wieviel Probenlösungen unter­ schiedlicher Verdünnungsverhältnisse von der ursprünglichen Probe für die Analyse vorbereitet werden, gibt eine Bedienungs­ person Daten von Verdünnungsverhältnissen der Probenlösungen an einer Steuertafel 4 ein. Die Eingabedaten werden von der Steuertafel 4 in den Mikrocomputer 5 geleitet und in der Speichersektion des Mikrocomputers gespeichert. Auf der Basis dieser Daten setzt der Mikrocomputer 5 den Verdünner 3 in Gang, um die Probenlösungen nach einem vorgegebenen Zeitablauf in die Separationssäule 7 einzuführen. Wenn alle der vorbe­ stimmten Probenlösungen in die Separationssäule 7 eingeführt sind, vervollständigt der Verdünner 3 die Probenbearbeitung einer ursprünglichen Probe. Wenn eine andere ursprüngliche Probe analysiert werden soll, wird ihre Information in die Steuertafel 4 vorher eingegeben.

Wenn ein vorbestimmtes Volumen einer ersten Probenlösung in einem vorbestimmten Verdünnungsverhältnis in die Separa­ tionssäule 7 in einem Gleichgewichtszustand von dem Verdünner 3 eingeführt ist, wird die Probenlösung in die entsprechenden Komponenten in der Separationssäule 7 separiert und die sepa­ rierten Komponenten werden von der Separationssäule 7 eluiert. Danach werden die Spitzen der entsprechenden Komponenten, die in dem Aufnehmer aufgenommen wurden, separiert und die Spit­ zenflächenwerte der Analysestoffe werden im Speicherbereich des Mikrocomputers 5 gespeichert.

Andererseits mixt der Verdünner 3 die ursprüngliche Probe während dieser Zeit mit einem reinen Lösungsmittel, um eine zweite Probenlösung mit einem Verdünnungsverhältnis gleich dem des zweiten eingegebenen Verdünnungsverhältnisses zu präparie­ ren. Nach Abschluß der Messungen der ersten Probenlösung führt der Verdünner dasselbe Volumen der zweiten Probenlösung wie das der ersten Probenlösung in die Separationssäule 7 ein, die sich im Gleichgewichtszustand befindet. Da das Verdünnungsver­ hältnis der zweiten Probenlösung unterschiedlich von dem der ersten Probenlösung ist, sind die Konzentrationen der Matrix­ elemente zwischen diesen Probenlösungen unterschiedlich. Be­ züglich der zweiten Probenlösung werden die Peak-Flächenwerte der Analysestoffe derselben Sorte wie die der ersten Proben­ lösung gemessen und in der Speichersektion des Mikrocomputers 5 gespeichert.

Um die analytische Exaktheit zu erhöhen, ist es wün­ schenswert, drei oder mehr Probenlösungen zu messen. Um die Erklärung zu vereinfachen, wird ein Beispiel zur Erlangung korrigierter Mengen der Analysestoffe der Meßwerte der zwei Probenlösungen weiter unten erklärt.

Der Mikrocomputer 5 kann die Meßwerte (Peak-Flächenwerte oder Peak-Höhenwerte), die auf der Basis der entsprechenden Probenlösungen ursprünglich von derselben Probe stammen, auf einen Drucker 12 und/oder einem Bildschirm 13 gemäß der Anweisungs­ eingabe der Steuertafel 4 nach Abschluß der Messungen aller vorbestimmten Probenlösungen liefern.

Nach Abschluß der Messung einer Vielzahl von Probenlösun­ gen, die von derselben ursprünglichen Probe stammen, multipli­ ziert der Mikrocomputer 5 die Peak-Flächenwerte oder Peak- Höhenwerte, die für die entsprechenden Probenlösungen mit dem entsprechenden Eingabe-Verdünnungsverhältnis erhalten wurden, um konvertierte Werte für die entsprechenden tatsächlichen Meßwerte zu erhalten. Die konvertierten Werte entsprechen Men­ gen der Analysestoffe, wenn die ursprüngliche Probe in die Se­ parationssäule 7 eingeführt ist.

Danach errechnet der Mikrocomputer 5 von allen konvertierten Werten Peak-Flächenwerte oder Peak-Höhenwerte der entsprechenden Analysestoffe in einem vermuteten Zustand, wo keine Matrixelemente in der ursprüngli­ chen Probe sind, das heißt, wo nur Analysestoffe in dem reinen Lösungsmittel enthalten sind. Nur dieselbe Anzahl der korrigierten Werte wie die der Analy­ sestoffe können erhalten werden. Die korrigierten Werte können auch auf dem Drucker 12 und/oder Bildschirm 13 ausgedruckt werden, wenn dies notwendig erscheint. Die Rechnung kann durch Inkli­ nation der geraden Korrelationslinien von den konvertierten Werten erhalten werden, wenn unterschiedliche Verdünnungs­ verhältnisse in Betracht gezogen werden, unter Verwendung von Konzentrationen der Matrixelemente als Parameter und Extra­ polieren unendlicher Verdünnungsverhältnisse der geraden Korrelationslinien.

Weiterhin kann der Mikrocomputer Konzentrationen der ent­ sprechenden Analysestoffe berechnen, indem die vorher gespei­ cherten Arbeitskurven mit den durch Extrapolation erhaltenen korrigierten Werten angepaßt werden. Diese Ergebnisse kann der Drucker 12 und/oder Bildschirm 13 ausdrucken.

Ein Beispiel des Verdünners 3, der in dem Analyseapparat der Fig. 2 verwendet wurde, wird nun mit Bezug auf die Fig. 2a bis Fig. 3b erklärt. Die Fig. 2a und 2b zeigen Ope­ rationen in einem hochverdünnten Verhältnis einer ursprüngli­ chen Probe und Fig. 3a und 3b zeigen Operationen in einem niedrigen Verdünnungsverhältnis für eine ursprüngliche Probe. In jedem Verdünnungsverhältnis sind die Volumina einer Viel­ zahl von Probenlösungen aus der gleichen ursprünglichen Probe, die in die Separationssäule eingeführt werden soll, einander gleich. Weiterhin ist das gleiche Elutionsmittel während der analyti­ schen Operationen in der Separationssäule für eine Vielzahl von Probenlösungen aus der ursprünglichen selben Probe angewendet.

Um eine Probenlösung mit einem hohen Verdünnungsverhält­ nis von einer ursprünglichen Probe zu erhalten, wird ein Dros­ selventil 21 und ein Sechswegeventil 26 in einen in Fig. 2a gezeigten Zustand gemäß den Instruktionen des Mikrocomputers 5 eingestellt, um eine Verdünnung aus einem Lösungsmittel dem Verdünner 3 zuzuführen. In diesem Zustand ist das Elutionsmittel mit Hilfe der Speisepumpe 2 durch die Separationssäule 7 geführt, um ein Gleichgewicht zwischen dem Elutionsmittel und dem Füller in der Separationssäule 7 zu erzielen.

In die Flußpassage der Fig. 2a wird eine vorbestimmte Menge der ursprünglichen Probe von einem Probeninjektor 27 und der Verdünner (reines Lösungsmittel) aus einem Verdünnertank 30 eingeführt. Der Verdünner wird mit einer vorbestimmten Fluß­ rate von einer Speisepumpe 29 gepumpt. Eine vorbestimmte Menge der ursprünglichen Probe wird in die Flußpassage an einer Pro­ beninjektionspforte 28 von dem Probeninjektor 27 eingespritzt, und die eingespritzte ursprüngliche Probe wird zwischen den Verdünnern geleitet. Das Band der ursprünglichen Probe wird in den Verdünnern während des Durchgangs durch eine Schlange 25 mit einem großen Volumen und einer Verdünnungsschlange 23 fein verteilt. Je länger diese Schlangen sind, um so größer ist das Verdünnungsverhältnis. Wenn das Zentrum des fein verteilten Probenbands eine Verteilerschlange 22 mit einem Verteilerventil 21 erreicht, schaltet das Verteilerventil 21 gemäß den An­ weisungen des Mikrocomputers 5 um.

Nachdem das Verteilerventil 21 umgeschaltet hat, befindet sich die Flußpassage in dem in Fig. 2b gezeigten Zustand. Das vorbestimmte Volumen der Probenlösung mit einem vorbestimmten, mit Hilfe der Verteilerschlange 22 vorgenommenen Verdünnungsver­ hältnis wird in die Separationssäule 7 durch Mitnahme der Strömung des durch die Speisepumpe 29 geförderten Eluiermittels eingeführt.

Nach Beendigung der Messung der vorangegangenen Probenlö­ sung wird sie kontrolliert, um dieselbe ursprüngliche Probe wie vorher einzuführen. Um eine Probenlösung mit einem niedri­ gen Verdünnungsverhältnis, wie in Fig. 3a gezeigt, zu präpa­ rieren, wird das Sechswegeventil 26 umgeschaltet, um eine Schlange mit kleinem Volumen mit der Probeneinspritzpforte 28 und der Verdünnungsschlange 23 zu verbinden. Eine vorbestimmte Menge der ursprünglichen Probe ist in die Flußpassage von der Probeneinspritzung 27 eingespritzt und das Band der eingespritzten Probe wird zu der Verteilungsschlange 22 durch die Schlange 24 mit kleinem Volumen und die Verteilerschlange 23 während der Verteilung durch die Verdünnungen geleitet. Der Verdünnungsgrad der Probenlösung, die die Verteilerschlange 22 füllt, ist kleiner als das Verdünnungsverhältnis der vorange­ gangenen Probenverdünnung, da die Schlange 24 mit kleinem Volumen kürzer als die Schlange 25 mit großem Volumen ist.

Wenn das Zentrum des fein verteilten Probenbandes die Verteilerschlange 22 erreicht, schaltet das Ventil 21 um, wie in Fig. 3b gezeigt ist, und das vorbestimmte Volumen der Proben­ lösung, das durch die Verteilerschlange 22 aufgenommen ist, wird in die Separationssäule 7 durch Mitnahme durch die Strömung des Eluats eingeführt und separiert und analysiert. Die Länge jeder der Schlangen 23, 24 und 25 und die Pumprate der Verdünnung durch die Pumpe 9 werden im voraus so eingestellt, daß ein ge­ wünschtes Verdünnungsverhältnis in der Verteilerschlange 22 er­ zielt wird.

Eine Beziehung zwischen dem Probeneinspritz-Zeitablauf durch die Probeneinspritzung 27 und dem Umschalt-Zeitablauf dem Verteilerventil 21 wird in den Mikrocomputer 5 im voraus eingegeben.

Meßbeispiele mit dem Analyseapparat der Fig. 1 werden nun weiter unten gegeben.

Meßbeispiel 1

Ein Elutionsmittel wurde durch Auflösung gewissenhaft gereinigtem Weinsteinessig und Ethylendiamin in reinem Wasser mit Konzentrationen von je 0,5 mM präpariert. Als Substitute für die Verunreinigungen werden 1 ppm an Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, Sr⁺⁺ und Ba⁺⁺ dem Elutionsmittel zugeführt. Eine Lösung mit 25 ppm jeder der Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, Sr⁺⁺ und Ba⁺⁺ wurde als eine ursprüngliche Probe, die dem Verdünner 3 zugeführt wird, präpariert, wobei das Lösungsmittel der ursprünglichen Probe reines Wasser war und die Matrixelemente aus 2 mM Essigsäure und 2 mM Ethylendiamin bestanden. Der Verdünner zur Verdünnung der ursprünglichen Probe war reines Wasser.

Vier unterschiedliche Arten von Probenlösungen mit un­ terschiedlichen Konzentrationen der Matrixelemente von einer ursprünglichen Probe wurden präpariert. Eine erste Probenlö­ sung hatte ein Verdünnungsverhältnis von 1, was die ursprüng­ liche Probe selbst darstellt, und wurde in die Separationssäule 7 eingeführt, wobei die erste Probenlösung ein Matrixelement- Konzentrationsverhältnis von 1,0 hatte. Eine zweite Probenlösung hatte ein Verdünnungsverhältnis von 2, wobei ein Volumen der ursprünglichen Probe mit reinem Wasser auf zwei Volumina ver­ dünnt wurde und die zweite Probenlösung ein Matrixelement- Konzentrationsverhältnis von 0,5 hatte. Eine dritte Probenlö­ sung hatte ein Verdünnungsverhältnis von 4, wobei ein Volumen der ursprünglichen Probe auf vier Volumina mit reinem Wasser verdünnt wurde und die dritte Probenlösung ein Matrix­ element-Konzentrationsverhältnis von 0,25 hatte. Eine vierte Proben­ lösung hatte ein Verdünnungsverhältnis von 10, wobei ein Vo­ lumen der ursprünglichen Probe auf zehn Volumina mit reinem Wasser verdünnt wurde, wobei die dritte Probenlösung ein Matrixelement-Konzentrationsverhältnis von 0,10 hatte.

20 µl jeder der ersten bis zur vierten Probenlösung wur­ den in die Separationssäule eine nach der anderen eingeführt, um Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, Sr⁺⁺ und Ba⁺⁺ als Analysestoff festzu­ stellen. Für jeden der Analysestoffe wurde ein Produkt der Peak-Flächenwerte der Verdünnungsverhältnisse mit Hilfe des Mikrocomputers 5 errechnet und die Ergebnisse wurden auf einem Drucker 12 ausgedruckt.

Die Verhältnisse zwischen den Multiplikationswerten und der Konzentration der Matrixelemente sind in Fig. 7 gezeigt. Für jedes der Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, Sr⁺⁺ und Ba⁺⁺ wurde eine In­ klination der geraden Linien von den Multiplikationswerten er­ halten, die auf den ersten bis zu den vierten Probenlösungen basieren, so daß Werte am Punkt der Null-Konzentration erhal­ ten wurden. Die Konzentrationen der Analysestoffe in der ur­ sprünglichen Probe, die von den korrigierten Werten frei von Einflüssen der Matrixelemente erhalten wurden, wurden in gutem Einklang mit den Mengen der Analysestoffe gefunden, die der ursprünglich präparierten Probe zugegeben wurden.

Meßbeispiel 2

Ein Elutionsmittel wurde durch Mischen kommerziell vorhandener konzentrierter Salpetersäure mit reinem Wasser präpariert, um eine wäßrige 1,6 mM Salpetersäurelösung herzustellen. Die Pumprate des Eluats durch die Pumpe 2 war 0,7 ml pro Minute.

Die Messung wurde durchgeführt, um die Konzentrationen der Verunreinigungen des Elutionsmittels zu untersuchen. Vier Sorten von Probelösungen wurden präpariert. Um die Konzentrationen von Na⁺ und NH₄⁺ in dem Elutionsmittel zu bestimmen, wurden 2 ppm von Na⁺ und NH₄⁺ in Lösungsmittel zur Herstellung der Probenlösungen hin­ zugegeben. Als ein gewöhnliches Matrixelement der Probenlö­ sungen wurde Salpetersäure hoher Reinheit zu jeder der Proben­ lösungen hinzugegeben. Die Konzentration des Matrixelements war 2 mM für eine erste Probenlösung, 3 mM für eine zweite Probenlösung, 6,5 mM für eine dritte Probenlösung und 8 mM für eine vierte Probenlösung. Das Lösungsmittel war reines Wasser bei allen Probenlösungen.

20 µl jeder der Probenlösungen wurden in die Separations­ säule 7 eine nach der anderen eingeführt, um die Peakhöhen der Verunreinigungen in den Probenlösungen zu messen. Die Ergeb­ nisse sind in Fig. 8 gezeigt. Der Meßwert von Na⁺ ist mit ansteigender Konzentration der Matrixelemente in der Proben­ lösung erniedrigt. Der extrapolierte Wert von Na⁺⁺ bei Null-Konzentration der Matrixelemente durch den Gradienten der geraden Linie in dem Graphen ist im Einklang mit 2 ppm Na⁺⁺. Von diesem Ergebnis kann geschätzt werden, daß etwa 30 ppb von Na⁺ in dem Elutionsmittel als Verunreinigung enthalten ist.

Andererseits wurden die Meßwerte von NH₄⁺ nicht ver­ ändert bei Änderungen der Konzentration der Matrixelemente. Somit ist es augenscheinlich, daß kein NH₄⁺ in dem Elutionsmittel als Verunreinigung enthalten ist.

In dem Analyseapparat der Fig. 1 kann die Ausgangsemp­ findlichkeit des Aufnehmers 10 erhöht werden, entsprechend der Verdünnungsverhältnisse gemäß den Anweisungen des Mikrocom­ puters 5 auf der Basis der Verdünnungsverhältnisse, die in den Eingang der Steuertafel 4 eingegeben wurden. In diesem Falle ist es unnötig, die Multiplikation der Meßwerte mit Verdünnungsverhältnissen zu berechnen. Ähnliche Daten wie in Fig. 7 können in dem Aufnehmer 10 erhalten werden und somit auf den Schreiber 14 und/oder Drucker 12 ausgegeben werden.

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird nun erklärt.

Die gesamte Struktur eines Analyseapparats gemäß der an­ deren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist fast identisch mit der der Fig. 1, aber die Struktur des Verdün­ ners 3 ist unterschiedlich von der der Fig. 2A. Das heißt, ein kommerziell erhältlicher Probenwechsler mit einer Verdün­ nungsfunktion, wie beispielsweise Hitachi AS-4000, ist als Verdünner 3 verwendet worden. In dem automatischen Proben­ wechsler kann eine pipettenartige Düse in X-Richtung, Y-Rich­ tung und in vertikaler Richtung über einer Platte bewegt wer­ den, um eine Probe und eine Verdünnung auf der Platte bereit­ zustellen, die in den Behälter eingeführt werden.

Vorbestimmte Volumen der Probenlösungen, die in vorbe­ stimmten Verdünnungsverhältnissen verdünnt wurden, werden in die Flußpassage mit der Probeneinspritzpforte der Flüssigchro­ matographie durch die pipettenartige Düse eingespritzt.

Ein Beispiel der Entfernung von Matrixelementen aus Pro­ benlösungen wird nun erklärt. Wenn Matrixelemente aus Proben­ lösungen entfernt werden sollen, wenn die Probenlösungen in die Flußpassage eingeführt werden, können Meßwerte der Ana­ lysestoffe mit kleinen Fehlern erhalten werden. In diesem Falle ist es günstig, eine Säule vorzusehen, die in der Lage ist, die Matrixelemente zwischen der Separationssäule und der Probeneinspritzungspforte herauszunehmen. Wenn die Proben­ lösungen Natriumhydroxide als ein Matrixelement und Cl⁻ und SO₄ ^-- als Analysestoffe analysiert werden, kann eine mit H-Form Kationenaustauschharz gefüllte Säule verwendet werden, die in der Lage ist, die Matrixelemente herauszuziehen.

2 ml einer wäßrigen 0,2 N NaOH-Lösung wurde durch eine Matrixelement-Entfernungssäule geschickt. In einem Zylinder mit 6 mm Innendurchmesser und 10 mm Länge, gefüllt mit Hitachi-marktüblichem Ionenaustauschharz #2613, wurde die behandelte Probenlösung einer flüssigchromatographischen Separation unterzogen, um Cl⁻ und SO₄ ^-- zu analysieren. Es wurde herausgefunden, daß die Analysestoffe der Anionen mit einer hohen Empfindlichkeit analysiert werden können.

Um Spuren von Metallionen in einer salzsauren Lösung zu analysieren, ist es günstig, eine Säule, gefüllt mit OH-Form, stark basischem Anionenaustauschharz zu benutzen, wobei die Anionen von der Probe entfernt werden können. Somit können Metallionen als Analysestoffe mit hoher Exaktheit analysiert werden.

Ob Matrixelemente von der Probe entfernt werden konnten, kann tatsächlich durch Verdünnung derselben Probe mit einem Verdünner (reinem Lösungsmittel) überprüft werden, um wenig­ stens zwei Sorten der Probenlösung mit unterschiedlichen Ver­ dünnungsverhältnissen zu präparieren, Leitfähigkeitsanalyse der Probenlösungen und Vergleiche der Multiplikationswerte der Peak-Flächenwerte mit Lösungsverhältnissen zu präparieren. Wenn ein Unterschied zwischen den Produktwerten gefunden wird, sind die Matrixelemente von den Probenwerten vor der Analyse zu entfernen.

Claims (9)

1. Analyseverfahren mittels Flüssig-Chromatographie zur quantitativen Bestimmung von Analysestoffen, unter Verwendung eines mit einem oder mehreren der Analysestoffe verunreinigten Elutionsmittels, bei dem mindestens zwei Probenlösungen mit unterschiedlichem Gehalt des verwendeten Elutionsmittels gebildet weden, diese Probenlösungen nacheinander flüssig- chromatographisch unter Bestimmung der Analysestoffe analysiert werden und die dabei erhaltenen Meßwerte unter Eliminierung der durch das verunreinigte Elutionsmittel hervorgerufenen Meßwertverfälschung auswertbar sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
Bilden von mindestens zwei Probenlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen aus der Probe;
Einführen der ersten Probenlösung in die Separationssäule und Erfassen mindestens eines ersten Meßwertes auf der Basis des mindestens einen Analysestoffes, der an der Separationssäule durch chromatographische Separation eluiert wurde;
Einführen der zweiten Probenlösung in die Separationssäule und Erfassen mindestens eines zweiten Meßwertes auf der Basis des mindestens einen eluierten Analysestoffs;
Auswerten des ersten und zweiten Meßwertes zur Eliminierung des Einflusses der im Elutionsmittel vorhandenen Verunreinigung.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der erste und der zweite Meßwert ein Maximal-Flächenwert oder ein Maximal- Höhenwert ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Auswertung einen Schritt der Ermittlung eines Maximal-Flächenwertes oder Maxi­ mal-Höhenwertes des Analysestoffes umfaßt, der für fiktive Konzentrationen der weiteren Bestandteile von 0 bestimmt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der beiden Meßwerte durch Multiplikation mit dem Verdünnungsverhältnis in einen Wert für ein Verdünnungsverhältnis von 1 umgerechnet wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die erste oder die zweite Probenlösung die ursprüngliche Probe selbst ist.

7. Flüssig-Chromatographievorrichtung mit
einer Separationssäule (7) zur Separierung von Elementen, die in der Probe enthalten sind;
einer Vorrichtung (1, 2) zur Zuführung eines Elutionsmittels an die Separationssäule (7);
eine Probenzuführvorrichtung (21, 22) für die Zuführung von Probenlösungen; und
einer Aufnahmevorrichtung (8) zur Aufnahme der von der Separationssäule (7) eluierten Analysestoffe;
gekennzeichnet durch die folgenden Merkmale zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche:
eine Einrichtung (3) zur Einstellung unterschiedlicher Konzentrationen der ursprünglichen Probe mit einem Lösungsmittel;
eine computergesteuerte Einrichtung (5) zur Errechnung korrigierter Werte der Analysestoffe in einem Zustand, der im wesentlichen frei vom Einfluß der weiteren Bestandteile in der Probenlösung ist; und
eine Eingabeeinrichtung (10), die in der Lage ist, Informationen einzelner Verdünnungsverhältnisse einer Mehrzahl von Probenlösungen mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen, die aus derselben ursprünglichen Probe stammen, in die computergesteuerte Einrichtung (5) zu geben.

8. Flüssig-Chromatographievorrichtung nach Anspruch 7, bei dem die Verdünnungseinrichtung mit einer Strömungspassage (22) ausgerüstet ist, in der die ursprüngliche Probe und das reine Lösungsmittel eingeführt werden und ein Umschaltventil (21) zur Verbindung der Strömungspassage (22) mit der Separationssäule (7) vorgesehen ist.

9. Flüssig-Chromatographievorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, gekennzeichnet durch ein Sechswegeventil (26) sowie eine erste Schlange (24) und eine zweite Schlange (25) mit einem Volumen, das größer ist als das Volumen der ersten Schlange (24), wobei das Sechswegeventil (26) in einer ersten Stellung die erste Schlange (24) und in einer zweiten Stellung die zweite Schlange (25) in den Strömungspfad für die Probenlösung schaltet.