DE102017101012A1

DE102017101012A1 - At-column dilution verwendendes mehrdimensionales chromatographiesystem

Info

Publication number: DE102017101012A1
Application number: DE102017101012.2A
Authority: DE
Inventors: Dan Root; Edward Aig; Thomas Wheat; Amanda Dlugasch; Jean-Michel Plankeele; Isabelle Francois
Original assignee: Waters Technologies Corp
Current assignee: Waters Technologies Corp
Priority date: 2016-01-22
Filing date: 2017-01-19
Publication date: 2017-07-27
Also published as: GB201800812D0; GB2548678B; US20170209812A1; GB2556542A; US10668406B2; GB2548678A; GB2556542B; GB201700986D0

Abstract

Die vorliegende Offenbarung betrifft ein optimiertes mehrdimensionales Chromatographiesystem und -verfahren, bei dem auswählbare At-Column Dilution zur Verbesserung der Kompatibilität der Grenzfläche und des Transfers zwischen den mehreren Dimensionen zur Anwendung kommt. Die Verwendung von At-Column Dilution („ACD“) bei mehrdimensionaler Chromatographie kann für stärkeres Zurückhalten der umgeleiteten Komponenten in nachfolgenden stationären Phasen sorgen und die Empfindlichkeit und Peakform der an nachfolgenden Dimensionen getrennten Komponente(n) steigern.

Description

QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 62/286,187, eingereicht am 22. Januar 2016, und der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 62/286,603, eingereicht am 25. Januar 2016, deren Inhalte jeweils in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind.
TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Offenbarung betrifft allgemein ein Chromatographiesystem und -verfahren zur Durchführung von mehrdimensionaler Chromatographie. Insbesondere betrifft die vorliegende Offenbarung die Verwendung von auswählbarer At-Column Dilution (ACD) zur Optimierung der mehrdimensionalen Chromatographie.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Chromatographie beinhaltet die Trennung einer Mischung von Komponenten dadurch, dass die in einer mobilen Phase enthaltenen Komponenten durch eine stationäre Phase – mit unterschiedlichen Affinitäten zu jeder Komponente – geleitet werden. Die getrennten Komponenten können mithilfe einer Vielzahl von Detektoren identifiziert und/oder quantifiziert werden. Ein typisches Chromatographiesystem beinhaltet eine einzelne Säule, oder Dimension, in der die stationäre Phase enthalten ist. Eine der grundlegenden Einschränkungen herkömmlicher chromatographischer Techniken ist die begrenzte Anzahl von Komponenten, die in einer einzelnen Analyse aufgelöst werden können.
Dieser Einschränkung kann durch Verwendung der mehrdimensionalen Chromatographie begegnet werden. Beispielsweise wird, in der zweidimensionalen Chromatographie, eine bestimmte Gruppe von Komponenten auf eine zweite Trennsäule übertragen. Die Gruppe von Komponenten ist typischerweise eine, die an der ersten Dimension nicht gut getrennt wird und in einem einzelnen Peak oder Band koeluieren kann. Die Gruppe von Komponenten kann jedoch an der zweiten Trennsäule besser getrennt werden. Die zweite Trennsäule hat typischerweise, im Vergleich zur ersten Trennsäule, einen orthogonalen Trennungsmodus.
Um die zweite Chromatographiesäule und die mehrdimensionale Chromatographie in vollem Umfang auszuschöpfen, sollten die Grenzfläche und der Transfer zwischen den beiden Dimensionen kompatibel sein. Bei vielen mehrdimensionalen Chromatographietechniken, und insbesondere denjenigen mit orthogonalen Trennungsmodi, sind die Grenzfläche und der Transfer nicht kompatibel. Die für die orthogonalen Chromatographiemodi verwendeten mobilen Phasen sind für die Inkompatibilität hauptverantwortlich.
Die vorliegende Offenbarung betrifft ein optimiertes mehrdimensionales Chromatographiesystem und -verfahren, bei dem auswählbare At-Column Dilution zur Verbesserung der Kompatibilität der Grenzfläche und des Transfers zwischen mehreren Dimensionen zur Anwendung kommt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Offenbarung betrifft allgemein ein Chromatographiesystem und -verfahren zur Durchführung von mehrdimensionaler Chromatographie.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Offenbarung ein Chromatographiesystem, umfassend (i) eine erste Fluidpumpe zum Pumpen eines ersten Durchflussstroms, (ii) eine der ersten Pumpe nachgeschaltete erste Chromatographiesäule, (iii) ein der ersten Chromatographiesäule nachgeschaltetes erstes Ventil, worin das erste Ventil dafür konfiguriert ist, den ersten Durchflussstrom zu einem ersten Detektor oder zu einem Mischer umzuleiten, (iv) eine zweite Fluidpumpe zum Pumpen eines zweiten Durchflussstroms in Fluidkommunikation mit dem Mischer, worin die ersten und zweiten Durchflussströme mindestens einen physikalischen oder chemischen Unterschied aufweisen und zusammen einen dritten Durchflussstrom bilden, worin die Pumpen (oder Pumpensteuerungen) das Verhältnis von ersten zu zweiten Durchflussströmen, die den dritten Durchflussstrom bilden, von 0:1 bis 1:0 variieren können, (v) ein dem Mischer nachgeschaltetes zweites Ventil; worin das zweite Ventil dafür konfiguriert ist, den dritten Durchflussstrom zu einem Abscheider, Kreislauf oder Abfluss umzuleiten, wobei der Abscheider oder Kreislauf ein vorderes Ende und ein hinteres Ende aufweist und der dritte Durchflussstrom in Fluidkommunikation mit dem vorderen Ende des Abscheiders oder Kreislaufs steht, und worin der Abscheider oder Kreislauf dafür konfiguriert ist, einen Analyten im dritten Durchflussstrom physikalisch oder chemisch zurückzuhalten, (vi) eine dritte Fluidpumpe zum Pumpen eines vierten Durchflussstroms und in Fluidkommunikation mit dem zweiten Ventil; worin das zweite Ventil dafür konfiguriert ist, den vierten Durchflussstrom zu einer zweiten Chromatographiesäule oder zum hinteren Ende des Abscheiders oder Kreislaufs und dann durch die zweite Chromatographiesäule umzuleiten, und (vii) einen oder mehrere Detektoren, z. B. einen zweiten Detektor, der/die der zweiten Chromatographiesäule nachgeschaltet ist/sind.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Offenbarung ein Chromatographiesystem, umfassend (i) eine erste Fluidpumpe zum Pumpen eines ersten Durchflussstroms, (ii) eine der ersten Pumpe nachgeschaltete erste Chromatographiesäule, (iii) ein der ersten Chromatographiesäule nachgeschaltetes erstes Ventil, worin das erste Ventil dafür konfiguriert ist, den ersten Durchflussstrom zu einem ersten Detektor oder zu einem zweiten Ventil umzuleiten; worin das zweite Ventil dafür konfiguriert ist, den ersten Durchflussstrom zu einem Mischer oder zum Abfluss umzuleiten, (iv) eine zweite Fluidpumpe zum Pumpen eines zweiten Durchflussstroms in Fluidkommunikation mit dem Mischer, worin die ersten und zweiten Durchflussströme mindestens einen physikalischen oder chemischen Unterschied aufweisen und zusammen einen dritten Durchflussstrom bilden, worin die Pumpen oder Pumpensteuerungen das Verhältnis von ersten zu zweiten Durchflussströmen, die den dritten Durchflussstrom bilden, von 0:1 bis 1:0 variieren können, (v) einen dem Mischer nachgeschalteten Abscheider oder Kreislauf, wobei der Abscheider oder Kreislauf ein vorderes Ende und ein hinteres Ende aufweist, worin der dritte Durchflussstrom in Fluidkommunikation mit dem vorderen Ende des Abscheiders oder Kreislaufs steht und worin der Abscheider oder Kreislauf dafür konfiguriert ist, einen Analyten im dritten Durchflussstrom physikalisch oder chemisch zurückzuhalten, (vi) eine dritte Fluidpumpe zum Pumpen eines vierten Durchflussstroms und in Fluidkommunikation mit dem zweiten Ventil; worin das zweite Ventil dafür konfiguriert ist, den vierten Durchflussstrom umzuleiten zu (a) einer zweiten Chromatographiesäule oder (b) dem hinteren Ende des Abscheiders oder Kreislaufs, dann zum Mischer, worin der vierte und ein fünfter Durchflussstrom, die mindestens einen physikalischen oder chemischen Unterschied aufweisen, zusammen einen sechsten Durchflussstrom bilden, worin die zweiten und dritten Pumpen das Verhältnis von vierten zu fünften Durchflussströmen, die den sechsten Durchflussstrom bilden, von 0:1 bis 1:0 variieren können, und durch die zweite Chromatographiesäule, und (vii) einen oder mehrere Detektoren, z. B. einen zweiten Detektor, der/die der zweiten Chromatographiesäule nachgeschaltet ist/sind.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Offenbarung ein Chromatographieverfahren, umfassend (i) Injizieren einer Probe in einen ersten Durchflussstrom, (ii) Trennen der Probe in zwei oder mehr Komponenten an einer ersten Chromatographiesäule, (iii) Umleiten eines Teils der zwei oder mehr Komponenten aus dem ersten Durchflussstrom, (iv) Verdünnen des umgeleiteten Teils des ersten Durchflussstroms mit einem zweiten Durchflussstrom, um einen dritten Durchflussstrom zu bilden, (v) Isolieren des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten an einem Abscheider, (vi) Leiten eines vierten Durchflussstroms durch den Abscheider, um den umgeleiteten Teil der zwei oder mehr Komponenten zu eluieren, und (vii) Trennen des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten an einer zweiten Chromatographiesäule. Das Verdünnen des ersten Durchflussstroms durch den zweiten Durchflussstrom kann das Zurückhalten des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten am Abscheider steigern.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Offenbarung ein Chromatographieverfahren, umfassend (i) Injizieren einer Probe in einen ersten Durchflussstrom, (ii) Trennen der Probe in zwei oder mehr Komponenten an einer ersten Chromatographiesäule, (iii) Umleiten eines Teils der zwei oder mehr Komponenten aus dem ersten Durchflussstrom, (iv) Verdünnen des umgeleiteten Teils des ersten Durchflussstroms mit einem zweiten Durchflussstrom, um einen dritten Durchflussstrom zu bilden, (v) Isolieren des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten an einem Abscheider, (vi) Leiten eines vierten Durchflussstroms durch den Abscheider, um den umgeleiteten Teil der zwei oder mehr Komponenten zu eluieren, (vii) Verdünnen des vierten Durchflussstroms mit dem fünften Durchflussstrom, um einen sechsten Durchflussstrom zu bilden, und (viii) Trennen des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten an einer zweiten Chromatographiesäule. Das Verdünnen des ersten Durchflussstroms durch den zweiten Durchflussstrom kann das Zurückhalten des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten am Abscheider steigern. Das Verdünnen des vierten Durchflussstroms durch den fünften Durchflussstrom kann das Zurückhalten des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten an der zweiten Chromatographiesäule steigern.
Das System und Verfahren der vorliegenden Offenbarung bietet gegenüber dem Stand der Technik mehrere Vorteile. Die Verwendung der At-Column Dilution mit mehrdimensionaler Chromatographie kann für stärkeres Zurückhalten der umgeleiteten Komponenten in nachfolgenden stationären Phasen sorgen und die Empfindlichkeit und Peakform der an nachfolgenden Dimensionen getrennten Komponente(n) steigern. Es kann auch die Ladekapazität einer oder mehrerer Säulen innerhalb des mehrdimensionalen Chromatographiesystems optimieren, um die Reinigung und Isolation einer größeren Menge von Komponenten pro Trennung zu ermöglichen. Die Zusammensetzung der Lösung, z. B. mobilen Phase, die die Probe dem Abscheider oder der zweiten Säule zuführt, kann modifiziert oder verändert werden, um das Bewegen der Probe von einem Chromatographiemodus zu einem anderen, bislang inkompatiblen Modus zu ermöglichen. Ferner können auch mehr Informationen und gesteigerte Probencharakterisierung erhalten werden, wie zum Beispiel, wenn eine nichtflüchtige mobile Phase in eine umgesetzt wird, die mit dem Erfassen von Massenspektrometriedaten kompatibel ist. Ähnlich kann die Robustheit verbessert werden, und zwar durch Minimieren der Koelution einer Matrix und eines Analyten, wodurch es zu uneinheitlicher Massenspektrometrie-Ionisation kommt.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorstehend aufgeführten und anderen von der vorliegenden Offenbarung gebotenen Vorteile sind anhand der folgenden Beschreibung exemplarischer Ausführungsformen besser verständlich, wenn zusammen mit den beigefügten Zeichnungen gelesen, wobei gilt:
1 zeigt ein exemplarisches Flussdiagramm eines mehrdimensionalen Systems mit At-Column Dilution für eine Dimension.
2 zeigt eine exemplarische gestapelte Konfiguration eines mehrdimensionalen Systems mit At-Column Dilution für eine oder zwei Dimensionen.
3 zeigt eine Konfiguration des mehrdimensionalen Chromatographiesystems mit At-Column Dilution (zwei Dimensionen, duale At-Column Dilution) einschließlich eines rechten Ventils, linken Ventils, Abscheiders und Mischers.
4 zeigt den Fluiddurchfluss beim Durchfluss in der ersten Dimension eines mehrdimensionalen Systems mit At-Column Dilution für eine Dimension. Am rechten Ventil sind die Ports 1, 5 und 6 mit Stiftsteckern verschlossen.
5 zeigt ein exemplarisches Beispiel für Verfahrensdetails und Fluiddurchflüsse bei einem mehrdimensionalen System mit At-Column Dilution für eine Dimension.
6 zeigt eine exemplarische Umleitung des ersten Fluiddurchflusses aus einer Trennung in der ersten Dimension bei einem mehrdimensionalen System mit At-Column Dilution für eine Dimension.
7 zeigt einen exemplarischen Waschschritt einer Abscheidepatrone in einem mehrdimensionalen System mit At-Column Dilution für eine Dimension.
8 zeigt einen exemplarischen Durchfluss in der zweiten Dimension eines mehrdimensionalen Systems mit At-Column Dilution für eine Dimension.
9 zeigt eine exemplarische Neugleichgewichtung, oder Rückkehr zu Ausgangsbedingungen, bei einem mehrdimensionalen System mit At-Column Dilution für eine Dimension.
10 zeigt ein exemplarisches Flussdiagramm eines mehrdimensionalen Systems mit ACD für beide Dimensionen.
11 zeigt eine exemplarische Tabelle mit Auflistung der Verfahrensdetails und Fluiddurchflüsse innerhalb eines mehrdimensionalen Systems mit At-Column Dilution für beide Dimensionen.
12 zeigt eine exemplarische Trennung in der ersten Dimension bei einem mehrdimensionalen System mit At-Column Dilution für beide Dimensionen.
13 zeigt ein exemplarisches Chromatogramm eines 3,0-µl-Injektionsvolumens einer an einer Säule in der ersten Dimension unter Verwendung eines UV-Detektors bei 254 nm analysierten Probenlösung. Das Chromatogramm kann zum Bestimmen des korrelierenden UV-Chromatogramms aufeinanderfolgender Injektionen verwendet werden. Ein Massenspektrometer kann auch inline mit dem UV-Detektor verwendet werden, um die korrelierenden Masse bei jedem Peak zu bestimmen.
14 zeigt eine exemplarische Umleitung einer oder mehrerer Komponenten aus einer Trennung in der ersten Dimension bei einem mehrdimensionalen System mit At-Column Dilution für beide Dimensionen.
15 zeigt einen exemplarischen Waschschritt einer oder mehrerer Komponenten an einer Abscheidepatrone in einem mehrdimensionalen System mit At-Column Dilution für beide Dimensionen.
16 zeigt ein exemplarisches Chromatogramm eines 3,0-µl-Injektionsvolumens einer an einer Säule in der ersten Dimension unter Verwendung eines UV-Detektors bei 254 nm analysierten Probenlösung, worin die Probe 1,6 bis 1,9 Minuten lang umgeleitet wurde. In dem Chromatogramm ist die „Haifischflosse“ von 1,6 bis 1,9 Minuten repräsentativ für die umgeleiteten Peaks. Während der Umleitung floss kein Fluid durch den UV-Detektor.
17 zeigt eine exemplarische Trennung, in der zweiten Dimension, einer oder mehrerer Komponenten in einem mehrdimensionalen System mit At-Column Dilution für beide Dimensionen.
18 zeigt ein exemplarisches Chromatogramm eines umgeleiteten Teils (1,6 bis 1,9 Minuten) aus einer ersten Dimension (3,0 µl Injektionsvolumen), der an einer Säule in der zweiten Dimension unter Verwendung eines QDa-Massenspektrometer-Detektors analysiert wurde. Das Chromatogramm der zweiten Dimension zeigt den umgeleiteten, zur einfachen Identifizierung in individuelle Peaks aufgetrennten Teil.
19 zeigt eine exemplarische Neugleichgewichtung, oder Rückkehr zu Ausgangsbedingungen, bei einem mehrdimensionalen System mit At-Column Dilution für beide Dimensionen.
20 zeigt ein exemplarisches Chromatogramm eines 0,5-µl-Injektionsvolumens einer an einer Säule in der ersten Dimension unter Verwendung eines UV-Detektors bei 254 nm analysierten Probenlösung. Ein kleineres Volumen wurde injiziert, um die Wirkung von Injektionsvolumen auf Peakformen zu bestimmen. Das Chromatogramm kann zum Bestimmen des korrelierenden UV-Chromatogramms aufeinanderfolgender Injektionen verwendet werden. Ein Massenspektrometer kann auch inline mit dem UV-Detektor verwendet werden, um die korrelierenden Masse bei jedem Peak zu bestimmen.
21 zeigt ein exemplarisches Chromatogramm eines 5,0-µl-Injektionsvolumens einer an einer Säule in der ersten Dimension unter Verwendung eines UV-Detektors bei 254 nm analysierten Probenlösung, worin die Probe 1,6 bis 1,9 Minuten lang umgeleitet wurde. In dem Chromatogramm ist die kleine „Haifischflosse“ von 1,6 bis 1,9 Minuten für die umgeleiteten Peaks repräsentativ. Während der Umleitung floss kein Fluid durch den UV-Detektor.
22 zeigt ein exemplarisches Chromatogramm eines umgeleiteten Teils (1,6 bis 1,9 Minuten) aus einer ersten Dimension (0,5 µl Injektionsvolumen), der an einer Säule in der zweiten Dimension unter Verwendung eines QDa-Massenspektrometer-Detektors analysiert wurde. Das Chromatogramm der zweiten Dimension zeigt den umgeleiteten, zur einfachen Identifizierung in individuelle Peaks aufgetrennten Teil.
23 zeigt die chromatographische Trennung eines synthetischen Peptids unter Verwendung von auswählbarer At-Column Dilution.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Offenbarung betrifft ein optimiertes mehrdimensionales Chromatographiesystem und -verfahren, bei dem auswählbare At-Column Dilution zur Verbesserung der Kompatibilität der Grenzfläche und des Transfers zwischen den mehreren Dimensionen zur Anwendung kommt.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Offenbarung ein Chromatographiesystem, umfassend eine erste Fluidpumpe zum Pumpen eines ersten Durchflussstroms, eine der ersten Pumpe nachgeschaltete erste Chromatographiesäule, ein der ersten Chromatographiesäule nachgeschaltetes erstes Ventil, worin das erste Ventil dafür konfiguriert ist, den ersten Durchflussstrom zu einem ersten Detektor oder zu einem Mischer umzuleiten, eine zweite Fluidpumpe zum Pumpen eines zweiten Durchflussstroms in Fluidkommunikation mit dem Mischer, worin die ersten und zweiten Durchflussströme mindestens einen physikalischen oder chemischen Unterschied aufweisen und zusammen einen dritten Durchflussstrom bilden, worin der Mischer das Verhältnis von ersten zu zweiten Durchflussströmen, die den dritten Durchflussstrom bilden, von 0:1 bis 1:0 variieren kann, ein dem Mischer nachgeschaltetes zweites Ventil; worin das zweite Ventil dafür konfiguriert ist, den dritten Durchflussstrom zu einem Abscheider (oder Kreislauf) oder zum Abfluss umzuleiten, wobei der Abscheider ein vorderes Ende und ein hinteres Ende aufweist und der dritte Durchflussstrom in Fluidkommunikation mit dem vorderen Ende des Abscheiders steht, und worin der Abscheider dafür konfiguriert ist, einen Analyten im dritten Durchflussstrom physikalisch oder chemisch zurückzuhalten, eine dritte Fluidpumpe zum Pumpen eines vierten Durchflussstroms und in Fluidkommunikation mit dem zweiten Ventil; worin das zweite Ventil dafür konfiguriert ist, den vierten Durchflussstrom zu einer zweiten Chromatographiesäule oder zum hinteren Ende des Abscheiders und dann durch die zweite Chromatographiesäule umzuleiten, und einen oder mehrere der zweiten Chromatographiesäule nachgeschaltete Detektoren.
Das Chromatographiesystem kann Chromatographietechnik jeder Art, die zu einem mehrdimensionalen Chromatographiesystem konfiguriert werden kann, beinhalten. Das Chromatographiesystem kann Normalphasen-Chromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie, kohlendioxidbasierte Chromatographie, Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophile Interaktionsflüssigkeitschromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Affinitätschromatographie und Kombinationen davon beinhalten. Das Chromatographiesystem kann auch beispielsweise die folgenden Kombinationen von Techniken wie Umkehrphasen-Umkehrphasen-Chromatographie, Normalphasen-Umkehrphasen-Chromatographie, Umkehrphasen-kohlendioxidbasierte Chromatographie, Normalphasen-kohlendioxidbasierte Chromatographie, Ionenaustausch-Umkehrphasen-Chromatographie, Ionenaustausch-Größenausschluss-Chromatographie, Affinitätschromatographie-Ionenaustausch-, Affinitätschromatographie-Größenausschluss-, Affinitätschromatographie-Umkehrphasen-Chromatographie beinhalten. Diese Kombinationstechniken können in beliebiger Reihenfolge kombiniert werden.
Das Chromatographiesystem kann eine oder mehrere Fluidpumpen beinhalten, z. B. eine erste Fluidpumpe, eine zweite Fluidpumpe, eine dritte Fluidpumpe usw. Jede Pumpe kann eine beliebige, zum Erzeugen eines Fluiddurchflusses (z. B. Durchflussstroms) durch das mehrdimensionale Chromatographiesystem fähige Pumpe sein. Jeder Fluiddurchfluss kann unabhängig eine Durchflussrate von etwa 0,01 µl/min, 0,1 µl/min, 1 µl/min, 0,01 ml/min, 0,1 ml/min, 1 ml/min, 10 ml/min, 100 ml/min oder etwa 300 ml/min aufweisen, je nach den eingesetzten Chromatographietechniken, dem Durchmesser der Schläuche, Ventilöffnungen, Säulendurchmessern, Detektorzellen usw. Diese Werte können auch zum Definieren eines Bereiches wie etwa 0,01 bis etwa 10 ml/min, oder etwa 0,1 bis etwa 2 ml/min, verwendet werden.
Jeder Fluiddurchfluss kann unabhängig verschiedene Mengen an organischem, wässrigem und verdichtbarem Fluid-(z. B. Kohlendioxid-)Anteil enthalten. Ein Fluiddurchfluss kann etwa 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 oder etwa 100 % organischen Anteil enthalten. Diese Werte können zum Definieren eines Bereiches wie etwa 70 % bis etwa 90 % verwendet werden. Ein Fluiddurchfluss kann auch etwa 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 oder etwa 100 % wässrigen Anteil enthalten. Diese Werte können zum Definieren eines Bereiches wie etwa 20 % bis etwa 40 % verwendet werden. Ein Fluiddurchfluss kann etwa 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 oder etwa 100 % verdichtbaren Fluid-(z. B. Kohlendioxid-)Anteil enthalten. In einer Ausführungsform kann ein Fluiddurchfluss, der Kohlendioxid enthält, z. B. eine kohlendioxidbasierte Chromatographietechnik, ein Co-Lösungsmittel oder einen Modifikator enthalten. Die Menge an Co-Lösungsmittel oder Modifikator in der mobilen Phase des Kohlendioxids kann je nachdem schwanken, ob dies organisch oder wässrig ist, wie oben angegeben. Das Co-Lösungsmittel oder der Modifikator kann Methanol sein. In einer Ausführungsform kann einer der Fluiddurchflüsse 95 % Kohlendioxid, das 5 % Methanol enthält, sein.
Jeder Fluiddurchfluss kann unabhängig verschiedene pH-Werte aufweisen. Ein Fluiddurchfluss kann einen pH-Wert von etwa 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5 und etwa 13 aufweisen. Diese Werte können zum Definieren eines Bereiches wie etwa 6 bis etwa 8, oder etwa 3 bis etwa 5, verwendet werden.
Jeder Fluiddurchfluss kann unabhängig verschiedene Ionenstärkenwerte von etwa 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4 oder etwa 5 M aufweisen. Diese Werte können zum Definieren eines Bereiches wie etwa 0,01 bis etwa 0,5 M verwendet werden.
Einer oder mehrere der Fluiddurchflüsse im System oder Verfahren der vorliegenden Offenbarung kann/können eine starke mobile Phase mit Bezug auf eine der Chromatographietechniken sein. Eine starke mobile Phase ist eine, die eine hohe Elutionsstärke aufweist und in wenig oder keinem Zurückhalten einer Komponente an einer Chromatographiesäule, oder Sorbens, resultiert. Eine in einer starken mobilen Phase aufgelöste Probe oder Komponente hat eine größere Affinität zu der mobilen Phase als der stationären Phase.
Einer oder mehrere der Fluiddurchflüsse kann/können eine schwache mobile Phase mit Bezug auf eine der Chromatographietechniken sein. Eine schwache mobile Phase ist eine, die eine niedrige Elutionsstärke aufweist und in starkem Zurückhalten einer Komponente an einer Chromatographiesäule, oder Sorbens, resultiert. Eine in einer schwachen mobilen Phase aufgelöste Probe oder Komponente hat eine geringere Affinität zu der mobilen Phase als der stationären Phase.
Das Chromatographiesystem kann eine oder mehrere Chromatographiesäulen beinhalten, z. B. eine erste Chromatographiesäule, eine zweite Chromatographiesäule usw. Bei den Säulen kann es sich um eine beliebige, zum Trennen eines oder mehrerer Analyte unter Verwendung einer oder mehrerer der Chromatographietechniken in einem mehrdimensionalen Chromatographiesystem verwendete Säule handeln. Die Säulen können präparative Säulen, analytische Säulen und Kapillarsäulen beinhalten.
Das Chromatographiesystem kann ein oder mehrere Ventile beinhalten, z. B. ein erstes Ventil, ein zweites Ventil usw. Das Ventil kann ein beliebiges Ventil sein, das mit einer oder mehrerer der Chromatographietechniken verwendet wird und dazu fähig oder konfiguriert ist, mindestens einen Durchfluss zu mindestens zwei verschiedenen Durchflusswegen umzuleiten. Die Ventile können mehrfache Ports und Leitungen aufweisen und dazu fähig oder konfiguriert sein, mindestens zwei Durchflüsse zu mindestens zwei verschiedenen Durchflusswegen umzuleiten, worin jeder gleichzeitig umgeleitet werden kann. Die Ventile können auch dazu fähig oder konfiguriert sein, mindestens drei Durchflüsse zu mindestens zwei verschiedenen Durchflusswegen umzuleiten, worin jeder gleichzeitig umgeleitet werden kann (z. B. ein 4-Port-Ventil, ein 6-Port-Ventil, ein 8-Port-Ventil, ein 10-Port-Ventil).
Das Chromatographiesystem kann einen oder mehrere Detektoren beinhalten, z. B. einen ersten Detektor, einen zweiten Detektor usw. Der Detektor kann ein beliebiger, mit einer oder mehreren der Chromatographietechniken verwendeter Detektor sein. Der Detektor kann ein UV-Detektor, ein Photodiodenarray-Detektor, ein Massenspektrometer, ein NMR-Detektor, ein Fluoreszenz-Detektor, ein Verdampfungs-Lichtstreu-Detektor, ein Charged-Aerosol-Detektor, ein Leitfähigkeitsdetektor, ein elektrochemischer Detektor oder Kombinationen davon sein. In einigen Ausführungsformen kann die vorliegende Offenbarung traditionell nicht-kompatible Detektoren zur Analyse einer Probe durch Verwendung von auswählbarer At-Column Dilution, wie durch Eliminieren von Ionenpaar-Reagenzien oder pH-Einstellung für beste oder gleichmäßige Detektion, einschließen. Das Chromatographiesystem und -verfahren der vorliegenden Offenbarung kann zum Transfer und Verbinden mit anderen analytischen Techniken, wie einem Fraktionssammler, verwendet werden.
Einige aktuelle chromatographische Verfahren sind nicht für die Massendetektion geeignet. Diese Verfahren können unter Verwendung des mehrdimensionalen Systems der vorliegenden Offenbarung durchgeführt werden, wodurch die Verfahrensbedingungen so modifiziert werden können, dass sie mit einem Massendetektor kompatibel sind. Beispielsweise kann das aktuelle Verfahren an einer ersten Dimension durchgeführt werden, wobei ein Zielpeak an eine zweite Dimension übertragen wird. In der zweiten Dimension kann der isolierte Peak an einer Umkehrphasenpatrone abgeschieden werden. Nach dem Abwaschen des nicht zurückgehaltenen Salzes und Puffers kann der isolierte Peak auf eine zweite Umkehrphasensäule unter Verwendung einer flüchtigen mobilen Phase, z. B. Wasser-Acetonitril-Ameisensäure, gewaschen werden. Ein Gradient dieser Lösungsmittel kann zum Eluieren aus der zweiten Umkehrphasensäule in die Quelle des Massenspektrometers verwendet werden. In der zweiten Dimension können die Verfahrensbedingungen geändert werden, um den Zielpeak in individuelle Komponenten aufzutrennen und gleichzeitig Bedingungen zu erzielen, die für die Massendetektion der Komponente(n) innerhalb des Peaks geeignet sind. Alternativ kann die Veränderung in der zweiten Dimension eine Veränderung der Säulenchemie, mobilen Phase oder Kombinationen davon sein.
Das Chromatographiesystem kann mindestens einen ACD(At-Column Dilution)-Mischer (z. B. ACD „T“) beinhalten, der dazu fähig oder konfiguriert ist, mindestens zwei Fluiddurchflüsse zusammen zu mischen, um einen kombinierten Fluiddurchfluss zu bilden. Der Injektor kann ein Fitting wie in U.S.-Patent Nr. 6,790,361 ; 7,875,175 und 7,909,994 beschrieben sein, deren Inhalte jeweils in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind. Der Mischer kann ein standardmäßiges flüssigkeitschromatographisches „T“, „Y“, umgekehrtes „Y“ bzw. eine umgekehrte „Y“-Verbindung sein. Der Mischer kann auch ein kleiner Festbett-Mischer wie der zur Lösungsmittelvermischung verwendete (z. B. T/N 700002911, bei der Waters Corporation, Milford, MA, USA, erhältlich) sein. At-Column Dilution kann die Injektion großer Volumen starker Lösungsmittel gestatten, sowohl den Massendurchsatz als auch die Auflösung verbessern und die Säulenstandzeit verlängern.
Der At-Column Dilution Mischer kann mindestens zwei Durchflussströme kombinieren, z. B. die ersten und zweiten Durchflussströme, die mindestens einen physikalischen oder chemischen Unterschied unter ihnen aufweisen, um einen kombinierten Durchflussstrom, z. B. einen dritten Durchflussstrom, zu bilden. Der Mischer kann die Durchflussströme in einem beliebigen Verhältnis von 0:1 bis 1:0 kombinieren, um einen kombinierten Durchflussstrom zu erhalten. Die mindestens zwei Durchflussströme können einen physikalischen oder chemischen Unterschied unter ihnen aufweisen, u. a. das Verhältnis von organischem/wässrigem oder Kohlendioxid-/organischem/wässrigem Anteil, pH-Werte, Ionenstärkewerte oder Kombinationen davon. Der kombinierte Durchflussstrom kann isokratisch sein oder kann ein Gradient mit Bezug auf eine oder mehrere Eigenschaften sein.
Das System und Verfahren der vorliegenden Offenbarung kann die Grenzfläche und den Transfer zwischen mindestens zwei Dimensionen in einem mehrdimensionalen Chromatographiesystem durch Kontrollieren oder selektives Kombinieren mindestens zweier Fluiddurchflüsse, zum Bilden eines kombinierten Durchflusses mit bestimmten chemischen oder physikalischen Eigenschaften, verbessern. In einer Ausführungsform können die beiden Fluiddurchflüsse (z. B. ein erster und ein zweiter Fluidstrom) zu einem kombinierten Durchfluss (z. B. einem dritten Fluidstrom) kombiniert werden, worin der kombinierte Durchflussstrom etwa 80 %, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 oder etwa 5 %, oder weniger (oder mehr), nach Volumen, an organischem Anteil oder Zusammensetzung als einer der ersten Durchflussströme aufweist. Diese Werte können auch zum Definieren von Bereichen, wie etwa 50 % bis etwa 20 %, verwendet werden. Insbesondere können die zwei Fluiddurchflüsse zu einem kombinierten Durchfluss kombiniert werden, worin der kombinierte Durchfluss etwa 50 % oder weniger, nach Volumen, an organischem Anteil oder Zusammensetzung als der erste Durchflussstrom aufweist. In einigen Ausführungsformen kann der kombinierte Durchfluss mehr, nach Volumen, organischen Anteil aufweisen.
In einer anderen Ausführungsform können die beiden Fluidströme zu einem kombinierten Fluidstrom kombiniert werden, worin der kombinierte Durchflussstrom einen pH-Wert von etwa oder mindestens etwa 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 oder etwa 3 pH-Einheiten Unterschied (z. B. weniger oder größer) zu einem der ersten Durchflussströme aufweist. Insbesondere können die beiden Fluiddurchflüsse zu einem kombinierten Durchfluss kombiniert werden, worin der kombinierte Durchfluss einen pH-Wert von etwa oder mindestens etwa 1 pH-Einheit Unterschied zum ersten Durchflussstrom aufweist.
In einer anderen Ausführungsform können die beiden Fluidströme zu einem kombinierten Fluidstrom kombiniert werden, worin der kombinierte Durchflussstrom etwa 80 %, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 oder etwa 5 % oder weniger (oder mehr) Ionenstärke als einer der ersten Durchflussströme aufweist. Diese Werte können auch zum Definieren von Bereichen wie etwa 60 % bis etwa 30 % verwendet werden. Insbesondere können die beiden Fluiddurchflüsse zu einem kombinierten Durchfluss kombiniert werden, worin der kombinierte Durchfluss etwa 50 % oder weniger Ionenstärke als der erste Durchflussstrom aufweist. In einigen Ausführungsformen kann der kombinierte Durchfluss mehr oder eine höhere Ionenstärke aufweisen.
Das System kann einen Abscheider oder eine andere Komponente (z. B. Kreislauf, eine Chromatographiesäule, Patrone) zum Isolieren einer oder mehrerer der aus einer ersten Trennungsdimension umgeleiteten Komponenten beinhalten. Der Abscheider kann eine hohe Affinität zu einer oder mehreren der der aus einer ersten Trennungsdimension umgeleiteten Komponenten aufweisen. In einer Ausführungsform ist der Abscheider dafür konfiguriert, einen Analyten im dritten Durchflussstrom physikalisch oder chemisch zurückzuhalten. Der Abscheider kann ein vorderes Ende und ein hinteres Ende aufweisen, worin beide Enden mit mindestens einer Fluidpumpe zum Pumpen eines Fluiddurchflusses durch den Abscheider von vorne nach hinten, oder hinten nach vorne, verbunden werden können. Der Abscheider kann eine Abscheidesäule oder -patrone sein, die ein chromatographisches Medium enthält, das für Umkehrphase, Normalphase, Affinitätschromatographie-Ionenaustausch, Affinitätschromatographie-Größenausschluss, Affinitätschromatographie-Umkehrphase oder Kombinationen davon verwendet wird.
Das System und Verfahren der vorliegenden Offenbarung kann das Zurückhalten mindestens einer umgeleiteten Komponente (oder Analyt) an dem Abscheider (oder sonstiger Vorrichtung) oder einer zusätzlichen Chromatographiesäule, z. B. der zweiten Chromatographiesäule, steigern. Das Zurückhalten der mindestens einen umgeleiteten Komponente kann um etwa 5 %, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 oder etwa 100 % im Vergleich zu einem System oder Verfahren ohne At-Column Dilution wie hierin beschrieben gesteigert werden. Diese Werte können zum Definieren eines Bereiches, wie etwa 50 % bis etwa 90 %, verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Offenbarung ein Chromatographiesystem, umfassend eine erste Fluidpumpe zum Pumpen eines ersten Durchflussstroms, eine der ersten Pumpe nachgeschaltete erste Chromatographiesäule, ein der ersten Chromatographiesäule nachgeschaltetes erstes Ventil, worin das erste Ventil dafür konfiguriert ist, den ersten Durchflussstrom zu einem ersten Detektor oder zu einem zweiten Ventil umzuleiten; worin das zweite Ventil dafür konfiguriert ist, den ersten Durchflussstrom zu einem Mischer oder zum Abfluss umzuleiten, eine zweite Fluidpumpe zum Pumpen eines zweiten Durchflussstroms in Fluidkommunikation mit dem Mischer, worin die ersten und zweiten Durchflussströme mindestens einen physikalischen oder chemischen Unterschied aufweisen und zusammen einen dritten Durchflussstrom bilden, worin die ersten und zweiten Pumpen das Verhältnis von ersten zu zweiten Durchflussströmen, die den dritten Durchflussstrom bilden, von 0:1 bis 1:0 variieren können, einen dem Mischer nachgeschalteten Abscheider, wobei der Abscheider ein vorderes Ende und ein hinteres Ende aufweist, worin der dritte Durchflussstrom in Fluidkommunikation mit dem vorderen Ende des Abscheiders steht und worin der Abscheider dafür konfiguriert ist, einen Analyten im dritten Durchflussstrom physikalisch oder chemisch zurückzuhalten, eine dritte Fluidpumpe zum Pumpen eines vierten Durchflussstroms und in Fluidkommunikation mit dem zweiten Ventil; worin das zweite Ventil dafür konfiguriert ist, den vierten Durchflussstrom umzuleiten zu einer zweiten Chromatographiesäule oder dem hinteren Ende des Abscheiders oder Kreislaufs, dann zu dem Mischer, worin der vierte und ein fünfter Durchflussstrom, die mindestens einen physikalischen oder chemischen Unterschied aufweisen, zusammen einen sechsten Durchflussstrom bilden, worin die zweiten und dritten Pumpen das Verhältnis von vierten zu fünften Durchflussströmen, die den sechsten Durchflussstrom bilden, von 0:1 bis 1:0 variieren können, und durch die zweite Chromatographiesäule, und einen oder mehrere der zweiten Chromatographiesäule nachgeschaltete Detektoren.
In einigen Ausführungsformen kann der vierte Durchflussstrom eine starke mobile Phase sein und kann der fünfte Durchflussstrom eine schwache mobile Phase sein.
Das System und Verfahren der vorliegenden Offenbarung kann die Grenzfläche und den Transfer zwischen mindestens zwei Dimensionen in einem mehrdimensionalen Chromatographiesystem durch Kontrollieren oder selektives Kombinieren von mindestens drei (z. B. können die zweiten und fünften Durchflüsse identisch sein) oder mindestens vier Fluiddurchflüssen verbessern, um mindestens zwei kombinierte Durchflüsse mit bestimmten chemischen oder physikalischen Eigenschaften zu bilden. In einer Ausführungsform können zwei Fluiddurchflüsse (z. B. ein erster und ein zweiter Fluidstrom) zu einem kombinierten Durchfluss (z. B. einem dritten Fluidstrom) kombiniert werden und können zwei zusätzliche Fluiddurchflüsse (z. B. ein vierter und ein fünfter Fluiddurchfluss) zu einem kombinierten Durchfluss (z. B. einem sechsten Fluiddurchfluss) kombiniert werden, worin die dritten oder sechsten Durchflussströme etwa 80 %, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 oder etwa 5 %, oder weniger, nach Volumen, an organischem Anteil oder Zusammensetzung als einer der ersten bzw. vierten Durchflussströme aufweisen. In einigen Ausführungsformen können die zweiten und die fünften Durchflussströme dieselbe organische/wässrige/Kohlendioxid/Modifikator-Zusammensetzung, pH, Ionenstärke oder Kombinationen davon aufweisen.
In einer anderen Ausführungsform können zwei Fluiddurchflüsse (z. B. ein erster und ein zweiter Fluidstrom) zu einem kombinierten Durchfluss (z. B. einem dritten Fluidstrom) kombiniert werden und können zwei zusätzliche Fluiddurchflüsse (z. B. ein vierter und ein fünfter Fluiddurchfluss) zu einem kombinierten Durchfluss (z. B. einem sechsten Fluiddurchfluss) kombiniert werden, worin die dritten und die sechsten Durchflussströme einen pH-Wert mit etwa, mindestens etwa, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 oder etwa 3 pH-Einheiten Unterschied zum ersten bzw. vierten Fluidstrom aufweisen.
In einer anderen Ausführungsform können zwei Fluiddurchflüsse (z. B. ein erster und ein zweiter Fluidstrom) zu einem kombinierten Durchfluss (z. B. einem dritten Fluidstrom) kombiniert werden und können zwei zusätzliche Fluiddurchflüsse (z. B. ein vierter und ein fünfter Fluiddurchfluss) zu einem kombinierten Durchfluss (z. B. einem sechsten Fluiddurchfluss) kombiniert werden, worin die dritten oder sechsten Durchflussströme etwa 80 %, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 oder etwa 5 %, oder weniger Ionenstärke als der erste bzw. vierte Fluidstrom aufweisen.
In einigen Ausführungsformen kann die Anordnung der Chromatographietechniken erfordern, dass einer oder mehrere der kombinierten Ströme physikalische oder chemische Kenndaten aufweisen, die weniger als der/die ursprüngliche(n) Durchflussstrom/Durchflussströme, mehr als der/die ursprüngliche(n) Durchflussstrom/Durchflussströme oder Kombinationen davon sind. Ein kombinierter Durchflussstrom kann mehr oder weniger organischen/wässrigen/Kohlendioxid-Anteil, einen höheren oder niedrigeren pH-Wert, mehr oder weniger Ionenstrom aufweisen. Beispielsweise kann die Ionenstärke für eine Anordnung von Ionenaustausch-Größenausschluss-Chromatographie gesteigert werden.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Offenbarung ein Chromatographieverfahren, umfassend Injizieren einer Probe in einen ersten Durchflussstrom, Trennen der Probe in zwei oder mehr Komponenten an einer ersten Chromatographiesäule, Umleiten eines Teils der zwei oder mehr Komponenten aus dem ersten Durchflussstrom, Verdünnen des umgeleiteten Teils des ersten Durchflussstroms mit einem zweiten Durchflussstrom, um einen dritten Durchflussstrom zu bilden, Isolieren des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten an einem Abscheider oder Kreislauf, Leiten eines vierten Durchflussstroms durch den Abscheider, um den umgeleiteten Teil der zwei oder mehr Komponenten zu eluieren, und Trennen des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten an einer zweiten Chromatographiesäule.
Die Probe kann unter Verwendung standardmäßiger, bei präparativer, analytischer und Kapillar-Chromatographie verwendeter Injektionstechniken in den ersten Durchflussstrom eingeführt oder injiziert werden. Der erste Durchflussstrom kann eine starke mobile Phase sein. Der erste (und/oder vierte) Durchflussstrom kann mithilfe eines Gradienten erzeugt werden, worin der erste (und/oder vierte) Durchflussstrom eine schwache mobile Phase zu Beginn der Trennung und eine starke, oder stärkere, mobile Phase am Ende der Trennung oder zum Zeitpunkt, zu dem ein Teil des ersten Fluiddurchflusses zu einer zweiten Trennung umgeleitet wird, ist.
Die Probe kann in zwei oder mehr Komponenten an der ersten Chromatographiesäule, z. B. erste Dimension, unter Verwendung standardmäßiger, bei präparativer, analytischer und Kapillar-Chromatographie verwendeter Trennungsbedingungen und -verfahren getrennt werden. Die Trennung kann mithilfe einer Online-Detektionstechnik überwacht werden, um eine oder mehrere Komponenten zu identifizieren, die nicht gut aufgelöst sind oder die in einem Peak oder Band koeluieren. Diese eine oder mehreren Komponenten kann/können aus der Trennung auf Basis der Online-Analyse umgeleitet werden. Eine anfängliche Trennung an der ersten Chromatographiesäule kann ebenfalls durchgeführt werden, um die Zurückhaltungszeiten einer beliebigen oder mehrerer Komponenten zu identifizieren, die nicht gut aufgelöst sind oder die in einem Peak oder Band koeluieren. Diese eine oder mehreren Komponenten kann/können aus nachfolgenden Trennungen auf Basis der Zurückhaltungszeiten umgeleitet werden.
Mindestens ein Teil des ersten Fluiddurchflusses kann umgeleitet werden, um letztendlich an einer zweiten Chromatographiesäule getrennt zu werden. Der umgeleitete Teil kann eine oder mehrere Komponenten enthalten, die nicht gut aufgelöst sind oder die in einem Peak oder Band koeluieren. Der umgeleitete Teil kann mit einem zweiten Fluiddurchfluss verdünnt werden, um einen kombinierten – oder dritten – Fluiddurchflusses zu bilden.
In einigen Ausführungsformen kann der dritte Durchflussstrom 50 % oder weniger, nach Volumen, an organischer Zusammensetzung als der erste Durchflussstrom aufweisen. Der dritte Durchflussstrom kann einen pH-Wert mit mindestens 1 pH-Einheit Unterschied zum ersten Durchflussstrom aufweisen. Und der dritte Durchflussstrom kann 50 % oder weniger Ionenstärke als die des ersten Durchflussstroms aufweisen. In anderen Ausführungsformen kann das Verdünnen des ersten Durchflussstroms durch den zweiten Durchflussstrom das Zurückhalten des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten am Abscheider steigern.
Der umgeleitete Teil der zwei oder mehr Komponenten kann an einem Abscheider, oder einer sonstigen ähnlichen Vorrichtung, isoliert werden. Der kombinierte Fluiddurchfluss kann mindestens einen physikalischen oder chemischen Unterschied aufweisen, wie hierin angegeben, der das Zurückhalten beliebiger umgeleiteter Analyte, Verbindungen oder Komponenten am Abscheider, oder an einer ähnlichen Vorrichtung, oder in nachfolgenden stationären Phasen steigern kann.
Ein vierter Durchflussstrom kann durch den Abscheider, oder eine ähnliche Vorrichtung, geleitet werden oder fließen, um die isolierten oder zurückgehaltenen Komponenten zu eluieren. Der vierte Durchflussstrom kann eine starke mobile Phase im Vergleich zu den isolierten oder zurückgehaltenen Komponenten sein. Die eluierten Komponenten können an einer zweiten Chromatographiesäule getrennt werden.
Beispielsweise kann eine Probe unter Verwendung zweier Dimensionen getrennt werden, die ausgewählt werden, um einen Peak oder eine Gruppe von Peaks zu trennen und aufzulösen. Die für jede Trennungstechnik oder jeden Trennungsmodus verwendeten mobilen Phasen können inkompatibel sein, z. B. worin die Trennungsmodi zueinander orthogonal sind. Das System und Verfahren der vorliegenden Offenbarung kann eine oder mehrere der mobilen Phasenzusammensetzungen einstellen, um zwischen den Dimensionen die Kompatibilität zu verbessern oder die Inkompatibilität zu reduzieren. In einigen Ausführungsformen kann/können die umgeleitete(n) Komponente(n) oder der/die isolierte(n) Analyt(e) in Lösung gehalten werden oder kann/können diese(r) an einem festen Träger adsorbiert oder durch diesen abgeschieden werden.
In einigen Ausführungsformen kann das System und Verfahren der vorliegenden Offenbarung alle, oder nahezu alle, in einer einzelnen Probe enthaltenen Komponenten auflösen oder identifizieren. In einer anderen Ausführungsform kann das System und Verfahren mindestens zwei oder mehr in einer einzelnen Probe enthaltene Komponenten auflösen und identifizieren, im Vergleich zu einem System oder Verfahren, das nicht konfiguriert oder angeordnet ist, um die Grenzfläche und den Transfer von zwei oder mehr Komponenten zwischen Dimensionen in einem mehrdimensionalen Chromatographiesystem zu verbessern. Das mehrdimensionale System der vorliegenden Offenbarung kann dafür konfiguriert sein, At-Column Dilution für eine Dimension, zwei Dimensionen oder mehr Dimensionen aufzuweisen.
Die Trennungsleistung an der zweiten Chromatographiesäule kann vom System und Verfahren der vorliegenden Offenbarung verbessert werden. Beispielsweise kann die Einbeziehung des ACD(At-Column Dilution)-Merkmals die Empfindlichkeit, z. B. Rauschabstand, des einen oder der mehreren, der zweiten Chromatographiesäule nachgeschalteten Detektoren um etwa 10 %, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder etwa 95 % oder mehr im Vergleich zu einem System oder Verfahren ohne At-Column Dilution, wie hierin beschrieben, steigern. Die Einbeziehung des ACD(At-Column Dilution)-Merkmals kann auch die Peakform von an der zweiten Chromatographiesäule getrennten Komponenten um etwa 10 %, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder etwa 95 % oder mehr im Vergleich zu einem System oder Verfahren ohne At-Column Dilution, wie hierin beschrieben, verbessern.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Offenbarung ein Chromatographieverfahren, umfassend Injizieren einer Probe in einen ersten Durchflussstrom, Trennen der Probe in zwei oder mehr Komponenten an einer ersten Chromatographiesäule, Umleiten eines Teils der zwei oder mehr Komponenten aus dem ersten Durchflussstrom, Verdünnen des umgeleiteten Teils des ersten Durchflussstroms mit einem zweiten Durchflussstrom, um einen dritten Durchflussstrom zu bilden, Isolieren des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten an einem Abscheider, Kreislauf oder einer ähnlichen Vorrichtung, Leiten eines vierten Durchflussstroms durch den Abscheider, um den umgeleiteten Teil der zwei oder mehr Komponenten zu eluieren, Verdünnen des vierten Durchflussstroms mit dem fünften Durchflussstrom, um einen sechsten Durchflussstrom zu bilden, und Trennen des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten an einer zweiten Chromatographiesäule.
Der vierte Durchflussstrom kann eine starke mobile Phase im Vergleich zu den isolierten oder zurückgehaltenen Komponenten sein. Der vierte Durchflussstrom kann mit einem fünften Durchflussstrom kombiniert werden, der eine schwache mobile Phase sein kann. Die vierten und fünften Durchflussströme können zusammen einen sechsten Durchflussstrom bilden, der mindestens einen physikalischen oder chemischen Unterschied aufweist, wie hierin angegeben, der das Zurückhalten beliebiger umgeleiteter Analyte, Verbindungen oder Komponenten in nachfolgenden stationären Phasen, z. B. an der zweiten Chromatographiesäule, steigern kann. Der sechste Durchflussstrom kann isokratisch oder ein Gradient sein, der von einer schwachen mobilen Phase zu einer starken, oder stärkeren, mobilen Phase übergeht.
In einigen Ausführungsformen kann der sechste Durchflussstrom 50 % oder weniger, nach Volumen, an organischer Zusammensetzung als der vierte Durchflussstrom aufweisen. Der sechste Durchflussstrom kann einen pH-Wert mit mindestens 1 pH-Einheit Unterschied zum vierten Durchflussstrom aufweisen. Und der sechste Durchflussstrom kann 50 % oder weniger Ionenstärke als die des vierten Durchflussstroms aufweisen. In anderen Ausführungsformen kann das Verdünnen des vierten Durchflussstroms durch den fünften Durchflussstrom das Zurückhalten des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten an der zweiten Chromatographiesäule steigern.
Das System und Verfahren der vorliegenden Offenbarung kann verschiedene chromatographische Techniken und multiple Detektoren verwenden, um eine vollständige, oder nahezu vollständige, Einstufung jeder Komponente in einer Probe zu erhalten. Die zusätzlichen Dimensionen verbessern die Befähigung zum Auflösen von Komponenten, die in einer einzelnen Analysis an einem Einzeldimensionssystem vollständig aufgelöst werden können.
In anderen Ausführungsformen kann das Chromatographiesystem und -verfahren der vorliegenden Offenbarung verwendet werden, um die Isolation bei der Reinigung oder Probenherstellung zu verbessern.
Die Offenbarungen aller zitierten Quellen einschließlich Publikationen, Patente und Patentanmeldungen sind in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme ausdrücklich hierin aufgenommen.
Wenn eine Menge, eine Konzentration oder ein anderer Wert oder Parameter entweder als ein Bereich, ein bevorzugter Bereich oder eine Liste von oberen bevorzugten Werten und unteren bevorzugten Werten angegeben wird, ist dies als spezifische Offenbarung aller von einem beliebigen Paar beliebiger oberer Bereichsgrenzen oder bevorzugter Werte und beliebiger unterer Bereichsgrenzen oder bevorzugter Werte gebildeten Bereiche aufzufassen, ohne Rücksicht darauf, ob Bereiche gesondert offenbart werden. Wo ein Bereich von numerischen Werten hierin angeführt ist, soll, wenn nicht anders angegeben, der Bereich die Endpunkte davon, und alle ganzen Zahlen und Brüche innerhalb des Bereichs, einschließen. Es ist nicht vorgesehen, dass der Geltungsbereich der Erfindung auf die beim Definieren eines Bereiches angeführten spezifischen Werte beschränkt ist.
Der Begriff „etwa“ bedeutet, dass der numerische Wert ungefähr ist und geringe Schwankungen die praktische Umsetzung der offenbarten Ausführungsformen nicht bedeutend beeinflussen würden. Wo eine numerische Einschränkung verwendet wird, bedeutet „etwa“, wenn vom Kontext nicht anders angegeben, dass der numerische Wert um ±10 % schwanken kann und innerhalb des Geltungsbereiches der offenbarten Ausführungsformen bleibt.
Die vorliegende Erfindung ist in den folgenden Beispielen weiter definiert. Es versteht sich, dass diese Beispiele zwar bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung angeben, aber nur zur Veranschaulichung vorgelegt werden.
Beispiele
Beispiel 1
Ein mehrdimensionales Chromatographiesystem mit At-Column Dilution für eine Dimension wurde vorbereitet. Das System (ein in 1 und 2 abgebildetes Beispiel) beinhaltete einen quaternären Solvent Manager als Pumpe der ersten Dimension(QSM, 100), einen Sample Manager (SM-FTN, 102), einen Column Manager (CM-A, 202) mit 2D-Ventilen mit 6 Ports/2 Positionen (VR, 104 und VL, 106), einen Photodiodenarray-Detektor als Detektor der ersten Dimension (PDA, 108), einen isokratischen Solvent Manager als Verdünnungspumpe (ISM, 110), einen binären Solvent Manager als Pumpe der zweiten Dimension (BSM, 112), einen Massendetektor (z. B. einen ACQUITY QDa^® QDa, erhältlich bei der Waters Corporation, Milford, MA, USA) als Detektor der zweiten Dimension (114) und eine Abscheidepatrone (116). Das System beinhaltete auch einen At-Column Dilution (d. h. ACD) Mischer (118). Das System lief unter Verwendung von Empower^TM Software auf ACQUITY^® DP4 SR1 Instrumentierung, allesamt bei der Waters Corporation, Milford, MA, USA, erhältlich. Am rechten Ventil (VR) sind Ports 1, 5 und 6 mit Stiftsteckern verschlossen. 1 zeigt einen Überblick über das Flussdiagramm und die Instrumentierung. Das Chromatographiesystem kann modifiziert werden, um verschiedene Detektoren und andere Konfigurationen der Module, zur Aufnahme zusätzlicher Dimensionen, einzuschließen.
Das System war in einem Zwei-Stapel-System konfiguriert. Der erste Stapel (2, links) beinhaltete die folgenden Module, im Stapel von unten nach oben: die erste Pumpe (QSM, 100), den Sample Manager (SM-FTN, 102), den Column Manager (CM-A, 202) und den ersten Detektor (PDA, 108). Im Column Manager (CM-A, 202) enthalten waren die beiden 2D-Ventile (VR, 104 und VL, 106). Der zweite Stapel (2, rechts) beinhaltete die folgenden Module, von unten nach oben: die Verdünnungspumpe, auch als zweite Pumpe (ISM, 110) bezeichnet, die dritte Pumpe (BSM, 112) und den zweiten Detektor (QDa, 114). Die Konfiguration des mehrdimensionalen Systems kann den ACD(At-Column Dilution)-Mischer oder „T“ an zwei Stellen platzieren. An der ersten Stelle wurde der ACD „T“ (118) zwischen dem rechten Ventil (VR, 104) und dem linken Ventil (VL, 106) platziert, wobei die zweite Pumpe (ISM, 110) das Verdünnungslösungsmittel bereitstellte. Bei dieser Platzierung wurde nur der Probenschnitt der ersten Dimension verdünnt. 3 zeigt eine Konfiguration des mehrdimensionalen Chromatographiesystems mit At-Column Dilution. Die zweite Konfiguration platzierte den ACD „T“ (118) nach dem linken Ventil (VL, 106) und vor der Abscheidepatrone (116). Die Konfiguration ist in Beispiel 2 beschrieben. An dieser Stelle wurden sowohl die erste Dimension als auch zweite Dimension verdünnt.
Ein Heart Cutting-Vorgang wurde durchgeführt, um die Fluiddurchflüsse und Verdünnung nachzuweisen. Eine erste Pumpe (QSM, 100) sorgte für einen ersten Fluiddurchfluss zur ersten Säule (Dimension 1, 402), zum ersten Ventil (VR, 104) und zum ersten Detektor (PDA, 108). Diese anfängliche Konfiguration beginnt die 1D-Trennung. Das erste Ventil (VR, 104) war so positioniert, dass der erste Durchfluss auf den ersten Detektor (Position 2) (PDA, 108) gerichtet werden konnte. Die zweite Pumpe (ISM, 110) und das zweite Ventil (VL, 106) waren positioniert (Position 2), um die Abscheidepatrone (116) vorzubehandeln. Die dritte Pumpe (BSM, 112) äquilibrierte die zweite Säule (Dimension 2, 404). 4 zeigt den Fluiddurchfluss für den Durchfluss in der ersten Dimension. Eine Zusammenfassung der Verfahrensdetails und Fluiddurchflüsse ist in 5 dargestellt. Zu den Verfahrensdetails zählt die Zeit, zu der die Ventile (VL und VR) die Positionen ändern. Ein Testschnitt des ersten Fluiddurchflusses erfolgte von 1,1 bis 1,2 Minuten, als die erste Ventil-(VR)Position geändert wurde, um den ersten Durchfluss auf die ACD und Abscheidesäule zu richten. Das erste Ventil (VR, 104) ist für das Umschalten konfiguriert, um den Peak aus der ersten Dimension zu „schneiden“ oder zu transferieren. Anfänglich war das erste Ventil (VR, 104) in Position 2; das zweite Ventil (VL, 106) war in Position 1.
6 zeigt die Konfiguration für die Umleitung des ersten Fluiddurchflusses für 1,1 und 1,2 Minuten. Der erste Fluiddurchfluss aus der ersten Pumpe (QSM, 100) wurde vom zweiten Fluiddurchfluss aus der zweiten Pumpe (ISM, 110) am ACD (118) verdünnt. Der Durchflussweg zum ersten Detektor (PDA, 108) war während des Transfers entfernt. Der erste Fluiddurchfluss wurde von ungefähr 30 % organische Zusammensetzung auf einen kombinierten dritten Fluiddurchfluss von etwa 8 % organischen Anteil verdünnt, vor dem Befördern zum vorderen Ende der Abscheidepatrone. Die Verdünnung kann das Zurückhalten der transferierten Analyte begünstigen.
7 zeigt die Konfiguration für den Abschluss der Trennung an der ersten Dimension (Dimension 1, 402) und den Waschschritt für die Abscheidepatrone (116). Das erste Ventil (VR, 104) war wieder in Position 2. Das zweite Ventil (VL, 106) war wieder in Position 2. Zum Zeitpunkt 1,2 wurde das erste Ventil (VR, 104) in die ursprüngliche Position zurückgestellt und der erste Fluiddurchfluss war wieder auf den ersten Detektor (PDA, 108) gerichtet, um die erste Trennung in der ersten Dimension (Dimension 1, 402) fortzusetzen. Die erste Pumpe (QSM, 100) setzt den ersten Fluiddurchfluss durch die erste Dimension (Dimension 1, 402) bis zum Abschluss fort. Bei erfolgter Positionierung des ersten Ventils (VR, 104) wusch die zweite Pumpe (ISM, 110) die Abscheidepatrone (116) mit dem zweiten Fluiddurchfluss. Die dritte Pumpe (BSM, 112) führte weiterhin die anfängliche Äquilibrierung für die 2D-Säule durch.
Zum Zeitpunkt 1,5 war das zweite Ventil (VL, 106) positioniert, um den Durchfluss durch die zweite Pumpe (ISM, 110) zum Abfluss (702) zu erlauben und das Richten der dritten Pumpe (BSM, 112) auf das hintere Ende der Abscheidepatrone (116), die zweite Säule (Dimension 2, 404) und den zweiten Detektor (QDa, 114) zu erlauben. 8 zeigt die Konfiguration für den vierten Fluiddurchfluss aus der dritten Pumpe (BSM, 112) zur Abscheidepatrone (116), zur zweiten Säule (Dimension 2, 404) und dann zum zweiten Detektor (QDa, 114). Das erste Ventil (VR, 104) war wieder in Position 2. Das zweite Ventil (VL, 106) war in Position 1, um den vierten Fluiddurchfluss mit der Abscheidepatrone (116) inline zu bringen. Der vierte Fluiddurchfluss besorgt das Rückspülen der Abscheidepatrone (116), wobei der/die transferierte(n) Analyt(e) zum Kopf der zweiten Säule (Dimension 2, 404) und zur nachfolgenden Trennung bewegt wird/werden. Die erste Pumpe (QSM, 100) setzt den ersten Fluiddurchfluss durch die erste Dimension (Dimension 1, 402) bis zum Abschluss, und/oder bis eine Neugleichgewichtung erfolgt, fort. Die zweite Pumpe (ISM, 110) pumpt den zweiten Fluiddurchfluss zum Abfluss (702) oder wird reduziert.
9 zeigt die Rückkehr zu Ausgangsbedingungen des mehrdimensionalen Systems mit ACD für die erste Dimension. Die erste Pumpe (QSM, 100) sorgt für den ersten Fluiddurchfluss zur ersten Säule (Dimension 1, 402), zum ersten Ventil (VR, 104) und zum ersten Detektor (PDA, 108). Das erste Ventil (VR, 104) war wieder in Position 2. Die zweite Pumpe (ISM, 110) sorgt für den zweiten Fluiddurchfluss zum zweiten Ventil (VL, 106) und zur Abscheidepatrone (116). Das zweite Ventil (VL, 106) war wieder in Position 2. Die dritte Pumpe (BSM, 112) äquilibrierte die zweite Säule (Dimension 2, 404).
Beispiel 2
Das mehrdimensionale Chromatographiesystem mit At-Column Dilution für zwei Dimension beinhaltete: einen quaternären Solvent Manager(QSM, 100)-Pumpe der ersten Dimension; einen Sample Manager (SM-FTN, 102); einen Column Manager (CM-A, 202) mit 2D-Ventilen mit 6 Ports/2 Positionen (VR, 104 und VL, 106); einen Photodiodenarray-Detektor(PDA, 108)-Detektor der ersten Dimension; einen isokratischen Solvent Manager (ISM, 110)-Verdünnungspumpe; einen binären Solvent Manager(BSM, 112)-Pumpe der zweiten Dimension; und einen Massendetektor(z. B. einen ACQUITY QDa^® QDa, erhältlich bei der Waters Corporation, Milford, MA, USA)-Detektor der zweiten Dimension (114). Das System beinhaltete auch einen ACD „T“ Mischer (118). Das System lief unter Verwendung von Empower^TM Software auf ACQUITY^® DP4 SR1 Instrumentierung, beide bei der Waters Corporation, Milford, MA, erhältlich.
10 zeigt das Flussdiagramm des mehrdimensionalen Systems mit At-Column Dilution für beide Dimensionen. Am rechten Ventil (VR, 104) sind Ports 1, 5 und 6 mit Stiftsteckern verschlossen. Der Instrumentenaufbau, die Säulen, mobilen Phasen und Detektoren lauten wie folgt. Die erste Dimension-(Dimension 1, 402)Säule war eine BEH C18, 2,1 × 50 mm, 1,7 µm. Die zweite Dimension-(Dimension 2, 404)Säule war eine BEH C18 2,1 × 50 mm, 1,7 µm. Die Abscheidesäule (116) war eine XBridge C18 Direct Connect 2,1 × 30 mm. Alle Säulen stammten von der Waters Corporation, Milford, MA. Die mobile Phase für die erste Pumpe (QSM, 100) war Lösungsmittel A: Wasser, Lösungsmittel B: Acetonitril, Lösungsmittel C: 1 % Ameisensäure in Wasser. Die mobile Phase für die dritte Pumpe (BSM, 112) war Lösungsmittel A: 0,1 % Ammoniumhydroxid in Wasser und Lösungsmittel B: 0,1 % Ammoniumhydroxid in Acetonitril. Die mobile Phase für die zweite Pumpe (ISM, 110) war Wasser. Die Nadelwäsche war 80/20 ACN/Wasser. Die Dichtungswäsche war 10 % ACN. Das Injektionsvolumen: 3,0 µl und 0,5 µl. Der erste Detektor-(PDA, 108)Scan betrug von 210 bis 400 nm, Kanal: 254 nm. Der zweite Detektor-(QDa, 114) Scan betrug von 100 bis 650 Da. Die Temperaturen lauteten (Dimension 1, 402) 40°C, (Dimension 2, 404) 40°C und die Abscheidesäule: Raumtemperatur. Eine Zusammenfassung der Verfahrensdetails und Fluiddurchflüsse ist in 11 dargestellt.
Die unter Verwendung des mehrdimensionalen Systems mit At-Column Dilution für beide Dimensionen getestete(n) Probe(n) lauten wie folgt. Die Probe war eine Mischung der folgenden Standards: je 2 mg/ml 3-Benzoylpyridin, Cortison, 4-Nitroanilin, 4,4’-Biphenol (in Methanol), je 200 µg/ml Acetaminophen, Acetamidophenol, Acetanilid, Acetylsalicylsäure, Koffein, Phenacetin, Salicylsäure (in Acetonitril) und je 1,0 mg/ml Sulfadimethoxin, Terfenadin, Reserpin, Acetaminophen und Koffein (in Acetonitril). Die abschließende Probenlösung lautete 0,45 mg/ml Sulfadimethoxin, Terfenadin, Reserpin, Acetaminophen, Koffein, 90 µg/ml Acetamidophenol, Acetanilid, Acetylsalicylsäure, Phenacetin und 0,20 mg/ml Salicylsäure, 3-Benzoylpyridin, Cortison, 4-Nitroanilin, 4,4’-Biphenol.
Eine anfängliche Trennung wurde in der ersten Dimension unter Verwendung der ersten Pumpe (QSM, 100), der ersten Dimension-(Dimension 1, 402)Säule, des ersten Ventils (VR, 104) und des ersten Detektors (PDA, 108) durchgeführt. Das erste Ventil (VR, 104) war in Position 2 und positioniert, um das Richten des ersten Durchflusses auf den ersten Detektor (PDA, 108) zu erlauben. Das zweite Ventil (VL, 106) war in Position 2 und positioniert, damit die zweite Pumpe (ISM, 110) die Abscheidepatrone (116) vorbehandeln konnte. Die dritte Pumpe (BSM, 112) äquilibrierte die zweite Dimension-(Dimension 2, 404)Säule. 12 zeigt den Fluiddurchfluss für die Trennung in der ersten Dimension. Eine anfängliche Trennung wurde unter Verwendung eines 3,0-µl-Injektionsvolumens durchgeführt, um das Zurückhalten der Peaks zu bestimmen und etwaige nicht aufgelöste Komponenten zu identifizieren.
13 zeigt das Chromatogramm des 3,0-µl-Injektionsvolumens der Probenlösung, analysiert an der Säule der ersten Dimension-(Dimension 1, 402) unter Verwendung des UV-Detektors, d. h. des ersten Detektors (PDA, 108) bei 254 nm. Eine Gruppe von nicht aufgelösten Komponenten eluierte zwischen 1,6 und 1,9 Minuten. Die nicht aufgelösten, zwischen 1,6 und 1,9 Minuten eluierenden Komponenten wurden durch Positionieren des ersten Ventils (VR, 104) umgeleitet, damit der erste Durchfluss auf das zweite Ventil (VL, 106), ACD „T“ (118) und die Abscheidepatrone (116) gerichtet werden konnte.
14 zeigt die Umleitung der nicht aufgelösten, zwischen 1,6 und 1,9 Minuten eluierenden Komponenten. Das erste Ventil (VR, 104) wurde in Position 1 gebracht, um eine oder mehrere Komponenten aus der ersten Dimension umzuleiten oder zu „schneiden“. Der erste Fluiddurchfluss aus der ersten Pumpe (QSM, 100) wurde vom zweiten Fluiddurchfluss aus der zweiten Pumpe (ISM, 110) am ACD „T“ (118) verdünnt. Der erste Fluiddurchfluss wurde von einem etwa 40%igen organischen Anteil auf einen kombinierten Durchfluss mit etwa 20 % organischem Anteil, der die nicht aufgelösten Komponenten zum vorderen Ende der Abscheidepatrone (116) beförderte, verdünnt. Die Abscheidepatrone (116) hielt die nicht aufgelösten Komponenten in einem scharfen Band zurück. Die dritte Pumpe (BSM, 112) führte weiterhin die anfängliche Äquilibrierung für die Säule der zweiten Dimension durch.
Die zweite Pumpe (ISM, 110) verdünnte den ersten Durchfluss, um die umgeleitete eine oder mehreren Komponenten aus der ersten Dimension an der Abscheidepatrone zurückzuhalten. Der erste Detektor (PDA, 108) wurde aus dem Durchflussweg entfernt.
Sobald die nicht aufgelösten Komponenten auf oder an der Abscheidepatrone (116) befindlich waren, wurde das erste Ventil (VR, 104) in Position 2 zurückgestellt, damit der erste Fluiddurchfluss auf den ersten Detektor (PDA, 108) gerichtet werden konnte, um die Trennung in der ersten Dimension fortzusetzen. Bei erfolgter Positionierung des ersten Ventils (VR, 104) wusch die zweite Pumpe (ISM, 110) die Abscheidepatrone (116) mit dem zweiten Fluiddurchfluss. 15 zeigt die Konfiguration für den Abschluss der Trennung an der ersten Dimension und den Waschschritt für die Abscheidepatrone. Die dritte Pumpe (BSM, 112) führte weiterhin die anfängliche Äquilibrierung für die zweite Dimension-(Dimension 2, 404) Säule durch.
16 zeigt das Chromatogramm des 3,0-µl-Injektionsvolumens einer Probenlösung an einer Säule der ersten Dimension (Dimension 1, 402) unter Verwendung eines UV-Detektors bei 254 nm, worin die Probe 1,6 bis 1,9 Minuten lang umgeleitet wurde. Im Chromatogramm ist die „Haifischflosse“ von 1,6 bis 1,9 Minuten repräsentativ für die umgeleiteten Peaks. Während der Umleitung floss kein Fluid durch den UV-Detektor, den ersten Detektor (PDA, 108).
Nach dem Waschen der Abscheidesäule (116) wurde das zweite Ventil (VL, 106) in Position 1 bewegt, damit ein vierter Fluiddurchfluss aus der dritten Pumpe (BSM, 112) zum, oder inline mit dem, hinteren Ende der Abscheidepatrone (116), zum ACD „T“ (118), zur zweiten Säule (Dimension 2, 404) und zum zweiten Detektor (QDa, 114) gerichtet werden konnte. Der vierte Fluiddurchfluss befördert die nicht aufgelösten Komponenten aus dem Abscheider (116) zu der zweiten Säule (Dimension 2, 404) und dem zweiten Detektor (QDa, 114) zur Trennung und Identifizierung. Der vierte Fluiddurchfluss aus der dritten Pumpe (BSM, 112) wurde vom fünften Fluiddurchfluss aus der Verdünnungspumpe (ISM, 110) verdünnt. Der vierte Durchfluss wurde mit Bezug auf organischen Anteil, pH-Wert und Ionenstärke zu einem kombinierten sechsten Durchfluss verdünnt, der die nicht aufgelösten Komponenten zu der zweiten Säule (Dimension 2, 404) und dem zweiten Detektor (QDa, 114) beförderte. Das Zurückhalten der Komponenten war verbessert, die Auflösung zwischen den Komponenten war verbessert, die Peakform der Komponente war verbessert und die Empfindlichkeit des Detektors war verbessert. 17 zeigt die Konfiguration für den Abschluss der Trennung an der ersten Säule (Dimension 1, 402) und den Waschschritt für die Abscheidepatrone (116). 18 zeigt das Chromatogramm der nicht aufgelösten Komponenten, die unter Verwendung der zweiten Säule (Dimension 2, 404) aufgelöst wurden und unter Verwendung des zweiten Detektors (QDa, 114) identifiziert wurden. Die erste Pumpe (QSM, 100) setzte die Trennung in der ersten Dimension fort und wurde zu anfänglichen Bedingungen zurückgebracht, zur Neugleichgewichtung für die nächste Injektion. Die zweite Pumpe (ISM, 110) setzte das Strömen und Verdünnen der Probe fort, da sie aus der Abscheidepatrone entfernt wird. Die dritte Pumpe (BSM, 112) führte weiterhin die anfängliche Äquilibrierung für die Säule der zweiten Dimension durch. Die mobile Phase fließt durch die Abscheidesäule in der umgekehrten Richtung, um die Rückspülung der einen oder mehreren Komponenten aus der Abscheidepatrone vorzunehmen. Ein vollständiger Gradient wird zum Abschluss gebracht, zur kompletten Trennung der Verbindungen innerhalb des „geschnittenen“ Peaks.
Nach Durchführung und Abschluss beider Trennungen werden die Ventile (VR, 104 und VL, 106) wieder in ursprünglichen Positionen positioniert (beide in Position 2), um das System erneut zu äquilibrieren. 19 zeigt die Rückkehr zu Ausgangsbedingungen des mehrdimensionalen Systems mit dem ACD „T“ (118) für beide Dimensionen. Die Probenanalyse wurde unter Verwendung eines Injektionsvolumens von 0,5 µl wiederholt. Die erste Pumpe (QSM, 100), zweite Pumpe (ISM, 110) und dritte Pumpe (BSM, 112) wurden für die nächste Injektion auf Ausgangsbedingungen rückgesetzt. 20 zeigt das Chromatogramm des 0,5-µl-Injektionsvolumens der Probenlösung, analysiert an der Säule der ersten Dimension unter Verwendung des UV-Detektors bei 254 nm. Die Gruppe von nicht aufgelösten Komponenten eluierte zwischen 1,6 und 1,9 Minuten. 21 zeigt das Chromatogramm des 0,5-µl-Injektionsvolumens einer Probenlösung an einer Säule der ersten Dimension unter Verwendung eines UV-Detektors bei 254 nm, worin die Probe 1,6 bis 1,9 Minuten lang umgeleitet wurde. 22 zeigt das Chromatogramm der nicht aufgelösten Komponenten, die unter Verwendung der zweiten Säule (Dimension 2) aufgelöst und unter Verwendung des zweiten Detektors (QDa) identifiziert wurden.
Beispiel 3 – Anwendung von orthogonalen Trennungsmodi bei der Analyse multipler Attribute von Biopharmazeutika
Zubereitungen von biopharmazeutischen Peptiden und Proteinen können multiple molekulare Formen, die eine modifizierte Struktur repräsentieren, beinhalten. Messung dieser Spezies kann sowohl informationsreiche Detektion als auch eine Toolbox von
Trennungsmodi erfordern. Die Verwendung eines Massenspektrometers kann Aufschlüsse über die Verteilung varianter Strukturen geben, die Spektren können aber schwer interpretierbar werden, da die Anzahl von Kombinationen von Varianten größer wird. Chromatographische Techniken können verwendet werden, um die in den Massendetektor eintretende Mischung zu vereinfachen. Alle Trennungstechniken können jedoch eine fundamentale Grenze hinsichtlich der Anzahl von Komponenten, die aufgelöst werden können, erreichen. Dieser Einschränkung kann durch Verwendung von mehrdimensionaler Chromatographie, wie hierin beschrieben, begegnet werden, wobei ein bestimmter Peak oder eine Gruppe von Peaks an eine zweite Trennsäule transferiert wird. Dies kann sowohl aus chemischer als auch mechanischer Perspektive anspruchsvoll sein. Die vorliegende Offenbarung beschreibt ein automatisiertes System zur Erfüllung dieser Bedürfnisse. Ein Satz Ventile kann multiple Positionen für das Isolieren von Peaks oder Segmenten eines Chromatogramms bereitstellen. Jeder Analyt kann in Lösung in der mobilen Phase innerhalb eines Kreislaufs gespeichert oder an einer – chromatographisches Material enthaltenden – Patrone adsorbiert werden. Wenn die erste chromatographische Trennung abgeschlossen oder im Wesentlichen abgeschlossen ist, können die Komponenten kann mit dem zweiten Chromatographiemodus analysiert werden. Das System beinhaltet eine ACD(At-Column Dilution)-Stufe zum Einstellen der Lösungsmittelstärke vor dem zweiten Chromatographiemodus. Diese Technik kann zur Einstellung von Lösungsmittelstärke, pH und Ionenstärke verwendet werden. Der Effluent fließt zu einem Massendetektor zur weiteren Analyse. Die vorliegende Offenbarung gilt für Kombinationen von Chromatographiebedingungen mit alternativen mobilen Phasen, unter Verwendung von sowohl Modellverbindungen als auch synthetischen Peptiden.
Eine synthetische Peptidsequenz NH₂-VGIGAMFLGFLGAA-OH wurde getestet. Die erste Dimension-(Dimension 1, 402)Säule war eine ACQUITY UPLC^® BEH C18, 2,1 × 50 mm, 1,7 µm. Die zweite Dimension-(Dimension 2, 404)Säule war eine ACQUITY UPLC^® BEH C18, 2,1 × 50 mm, 1,7 µm. Die Abscheidesäule (116) war eine XBridge C8 Direct Connect 2,1 × 30 mm, 10 µm. Alle Säulen stammten von der Waters Corporation, Milford, MA. Die mobile Phase für die erste Pumpe (QSM, 100) war Lösungsmittel A: Wasser, Lösungsmittel B: Acetonitril, Lösungsmittel C: 1 % Ameisensäure in Wasser. Die mobile Phase für die dritte Pumpe (BSM, 112) war Lösungsmittel A: 0,1 % Ammoniumhydroxid in Wasser und Lösungsmittel B: 0,1 % Ammoniumhydroxid in Acetonitril. Die mobile Phase für die zweite Pumpe (ISM, 110) war Wasser. Das
Injektionsvolumen: 2,1 µl. Der erste Detektor-(PDA, 108)Scan betrug von 210 bis 500 nm, Kanal: 214 nm. Der zweite Detektor-(QDa, 114)Scan betrug von 100 bis 1250 Da. Die Temperaturen lauteten (Dimension 1, 402) 30°C, (Dimension 2, 404) 30°C und die Abscheidesäule: Raumtemperatur. Die erste Dimension lief unter Verwendung einer Durchflussrate von 0,89 ml/min und eines Gradienten 5–85 % in 2,2 Minuten. Die zweite Dimension lief unter Verwendung einer Durchflussrate von 0,6 ml/min und eines Gradienten 5–80 % in 3 Minuten.
Eine einstufige At-Column Dilution wurde durchgeführt, Beispiel 1 ähnlich (siehe z. B. 4–9). Mit beiden Ventilen in Position 2 bewegte sich die Probe durch den herkömmlichen chromatographischen Weg zum PDA-Detektor. Zum Elutionszeitpunkt des gewünschten Analyts wurde das erste Ventil auf Position 1 geschaltet, um den Analyt zur Abscheidepatrone umzuleiten. Die Abscheidepatrone kann den Analyt wegen des Lösungsmitteltyps nicht effizient zurückhalten. Wenn das erste Ventil umgeschaltet wird, wird der Durchfluss vom isokratischen Solvent Manager aktiviert und mit dem Säuleneffluent an einem T kombiniert und gelangt zum Kopf der Abscheidepatrone. Bei abgeschlossener Analytelution wird das erste Ventil auf Position 2 rückgesetzt. Der isokratische Solvent Manager spült die mobile Phase von Dimension 1 aus der Abscheidepatrone. Das zweite Ventil wird auf Position 1 geschaltet, um den Analyten aus der Abscheidepatrone zu eluieren und diesen durch die zweite Dimension und in den QDa-Massendetektor zu leiten.
Auswählbare At-Column Dilution wurde ebenfalls durchgeführt, Beispiel 2 ähnlich (siehe z. B. 10, 12, 14, 15, 17 und 19). Der ACD(At-Column Dilution)-Mischer wurde dem zweiten Ventil nachgeschaltet verlegt. Mit beiden Ventilen in Position 2 bewegte sich die Probe durch den herkömmlichen chromatographischen Weg zum PDA-Detektor. Der isokratische Solvent Manager kann nach Bedarf ein-/ausgeschaltet und die Durchflussrate entsprechend der erforderlichen Verdünnung eingestellt werden. Zum festgelegten Zurückhaltungszeitpunkt wurde das erste Ventil in Position 1 umgestellt, um den Durchfluss auf das zweite Ventil zu richten. Gleichzeitig begann der isokratische Solvent Manager mit dem Fließen, um für die erforderliche Verdünnung zu sorgen. Der Analytstrom gelangte durch das zweite Ventil und wurde mit dem Verdünnungsmittel am „T“ der At-Column Dilution kombiniert. Der verdünnte Strom gelangte in die Abscheidepatrone und der Analyt wurde zurückgehalten.
Am Ende des Abscheidefensters wurde das erste Ventil daraufhin zurück in Position 2 geschaltet und der abgeschiedene Analyt wurde gespült. Der Verdünnungsmittelfluss durch die Abscheidepatrone hindurch wurde fortgesetzt, um die erste mobile Phase vollständig zu verdrängen. Der isokratische Solvent Manager wurde benutzt, um ein geeignetes Lösungsmittel zum Einbringen in die zweite Dimension zuzuführen. Danach wurde das zweite Ventil in Position 1 geschaltet. Als das zweite Ventil in die Elutionsposition geschaltet war, führte der binäre Solvent Manager den Elutionsgradienten durch die Abscheidepatrone zu. Da dieser Strom aus der Abscheidepatrone eluierte, wurde er am ACD-„T“ verdünnt. Der Analyt wurde dann an der zweiten Säule unter Verwendung des Lösungsmittelgradienten aus dem binären Solvent Manager getrennt. Der Gradient kann auch am „T“ verdünnt werden, oder der isokratische Solvent Manager kann abgeschaltet werden, um einen schnelleren Gradienten zu ermöglichen.
23 (A und B) zeigt die auswählbare At-Column Dilution für das synthetische Peptid. 23A zeigt die Trennung, in Dimension 1, des synthetischen Peptids. Das unverarbeitete, 14 Reste aufweisende Peptid wurde unter Verwendung von Umkehrphasen-Chromatographie bei pH 2 getrennt. Um 2 Minuten wurden die Ventile und der isokratische Solvent Manager betätigt, um das Peptid abzuscheiden. 23B zeigt die Elution des Peptids an Dimension 2. Nach dem Spülen der mobilen Phase aus der Abscheidepatrone wurde das Ventil betätigt und eluierte der binäre Solvent Manager-Gradient das Peptid. Die Elution in Dimension 2 erfolgte bei pH 10. Die zweidimensionale Trennung sorgte für orthogonale Selektivität durch Anwendung einer mobilen Phasenmodifikation, um den Ladezustand des Analyten zu ändern. [00109] Die At-Column Dilution gewährleistete gutes Zurückhalten des Analyten, da er aus dem Multimodus-Chromatographiesystem eluierte. Das System kann konfiguriert werden, um für At-Column Dilution sowohl der Abscheide- als auch Trennungsstufen zu sorgen. Die At-Column Dilution kann zum Einstellen von organischer Lösungsmittelkonzentration, pH und Ionenstärke verwendet werden. Abschließend kann zweidimensionale Chromatographie benutzt werden, um alternative Selektivität bei synthetischen Peptidtrennungen zu erhalten.
Beispiel 4 – Zusätzliche Anwendungen
Eine zusätzliche Anwendung beinhaltete auswählbare At-Column Dilution zur Optimierung der mehrdimensionalen Chromatographie bei alternativer Umkehrphasen-Säulentrennung kleiner Moleküle. Der Instrumentenaufbau, die Säulen, mobilen Phasen und Detektoren lauten wie folgt. Die erste Dimension-(Dimension 1, 402)Säule war eine BEH C18, 2,1 × 50 mm, 1,7 µm. Die zweite Dimension-(Dimension 2, 404)Säule war eine BEH Phenyl 2,1 × 50 mm, 1,7 µm. Die Abscheidesäule (116) war eine XBridge C18 Direct Connect 2,1 × 30 mm. Alle Säulen stammten von der Waters Corporation, Milford, MA. Die mobile Phase für die erste Pumpe (QSM, 100) war Lösungsmittel A: Wasser, Lösungsmittel B: Acetonitril, Lösungsmittel C: 1 % Ameisensäure in Wasser. Die mobile Phase für die dritte Pumpe (BSM, 112) war Lösungsmittel A: 0,1 % Ameisensäure in Wasser und Lösungsmittel B: 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril. Die mobile Phase für die zweite Pumpe (ISM, 110) war 0,1 % Ameisensäure in Wasser. Die Nadelwäsche war 80/20 ACN/Wasser. Die Dichtungswäsche war 10 % ACN. Das Injektionsvolumen: 1,0 µl. Der erste Detektor-(PDA, 108) Scan betrug von 210 bis 400 nm, Kanal: 254 nm. Der zweite Detektor-(QDa, 114)Scan betrug von 100 bis 650 Da. Die Temperaturen lauteten (Dimension 1, 402) 40°C, (Dimension 2, 404) 40°C und die Abscheidesäule: Raumtemperatur.
Eine andere Anwendung beinhaltete auswählbare At-Column Dilution zur Optimierung der mehrdimensionalen Chromatographie bei einer alternativen Umkehrphasentrennung synthetischer Peptide mithilfe mobiler Phasen. Der Instrumentenaufbau, die Säulen, mobilen Phasen und Detektoren lauten wie folgt. Die erste Dimension-(Dimension 1, 402)Säule war eine BEH C18, 2,1 × 50 mm, 1,7 µm. Die zweite Dimension-(Dimension 2, 404)Säule war eine BEH C18, 2,1 × 50 mm, 1,7 µm. Die Abscheidesäule (116) war eine XBridge C18 Direct Connect 2,1 × 30 mm. Alle Säulen stammten von der Waters Corporation, Milford, MA. Die mobile Phase für die erste Pumpe (QSM, 100) war Lösungsmittel A: Wasser, Lösungsmittel B: Acetonitril, Lösungsmittel C: 1 % Ameisensäure in Wasser. Die mobile Phase für die dritte Pumpe (BSM, 112) war Lösungsmittel A: 0,1 % Ammoniumhydroxid in Wasser und Lösungsmittel B: 0,1 % Ammoniumhydroxid in Acetonitril. Die mobile Phase für die zweite Pumpe (ISM, 110) war Wasser. Die Nadelwäsche war 80/20 ACN/Wasser. Die Dichtungswäsche war 10 % ACN. Das Injektionsvolumen: 1,0 µl. Der erste Detektor-(PDA, 108)Scan betrug von 210 bis 400 nm, Kanal: 214 nm. Der zweite Detektor-(QDa, 114)Scan betrug von 100 bis 1250 Da. Die Temperaturen lauteten (Dimension 1, 402) 40°C, (Dimension 2, 404) 40°C und die Abscheidesäule: Raumtemperatur.
Eine andere Anwendung beinhaltete auswählbare At-Column Dilution zur Optimierung der mehrdimensionalen Chromatographie bei einer alternativen Umkehrphasen-Säulentrennung synthetischer Peptide. Der Instrumentenaufbau, die Säulen, mobilen Phasen und Detektoren lauten wie folgt. Die erste Dimension-(Dimension 1, 402)Säule war eine BEH C18, 2,1 × 50 mm, 1,7 µm. Die zweite Dimension-(Dimension 2, 404)Säule war eine CSH C18, 2,1 × 50 mm, 1,7 µm. Die Abscheidesäule (116) war eine XBridge C18 Direct Connect 2,1 × 30 mm. Alle Säulen stammten von der Waters Corporation, Milford, MA. Die mobile Phase für die erste Pumpe (QSM, 100) war Lösungsmittel A: Wasser, Lösungsmittel B: Acetonitril, Lösungsmittel C: 1 % Ameisensäure in Wasser. Die mobile Phase für die dritte Pumpe (BSM, 112) war Lösungsmittel A: 0,1 % Ameisensäure in Wasser und Lösungsmittel B: 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril. Die mobile Phase für die dritte Pumpe (ISM, 110) war 1 % Ameisensäure in Wasser. Die Nadelwäsche war 80/20 ACN/Wasser. Die Dichtungswäsche war 10 % ACN. Das Injektionsvolumen: 1,0 µl. Der erste Detektor-(PDA, 108) Scan betrug von 210 bis 400 nm, Kanal: 214 nm. Der zweite Detektor-(QDa, 114)Scan betrug von 100 bis 1250 Da. Die Temperaturen lauteten (Dimension 1, 402) 40°C, (Dimension 2, 404) 40°C und die Abscheidesäule: Raumtemperatur.
Eine andere Anwendung beinhaltete auswählbare At-Column Dilution zur Optimierung der mehrdimensionalen Chromatographie bei intakten Proteinen mittels Größenausschluss-Umkehrphase mit Entsalzung für MS-Detektion (Trennung). Der Instrumentenaufbau, die Säulen, mobilen Phasen und Detektoren lauten wie folgt. Die erste Dimension-(Dimension 1, 402)Säule war eine ACQUITY UPLC^® Protein BEH SEC 200 Å, 4,6 × 150 mm, 1,7 µm. Die zweite Dimension-(Dimension 2, 404)Säule war eine ACQUITY UPLC^® Protein BEH C4, 300 Å, 2,1 × 50 mm, 1,7 µm. Die Abscheidesäule (116) war eine MassPREP Micro Desalting Column 2,1 × 5 mm. Alle Säulen stammten von der Waters Corporation, Milford, MA. Die mobile Phase für die erste Pumpe (QSM, 100) war Lösungsmittel A: 20 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, pH 6,8. Die mobile Phase für die dritte Pumpe (BSM, 112) war Lösungsmittel A: 0,1 % Ameisensäure in Wasser und Lösungsmittel B: 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril. Die mobile Phase für die zweite Pumpe (ISM, 110) war 1 % Ameisensäure in Wasser. Die Nadelwäsche war 20 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, pH 6,8. Die Dichtungswäsche war 10 % ACN. Das Injektionsvolumen: 1,0 µl. Der TUV-Detektorkanal war 280 nm. Der SQD2-Scan betrug von 100 bis 3000 Da. Die Temperaturen lauteten (Dimension 1, 402) Raumtemperatur (Dimension 2, 404) 40°C und die Abscheidesäule: Raumtemperatur.
Eine andere Anwendung beinhaltete auswählbare At-Column Dilution zur Optimierung der mehrdimensionalen Chromatographie bei intakten Proteinen mittels Ionenaustausch-Umkehrphase mit Entsalzung für MS-Detektion (Trennung). Der Instrumentenaufbau, die Säulen, mobilen Phasen und Detektoren lauten wie folgt. Die erste Dimension-(Dimension 1, 402)Säule war eine Protein-Pak Hi Res Q, 4,6 × 100 mm, 5 µm. Die zweite Dimension-(Dimension 2, 404)Säule war eine ACQUITY UPLC^® Protein BEH C4, 300 Å, 2,1 × 50 mm, 1,7 µm. Die Abscheidesäule (116) war eine MassPREP Micro Desalting Column 2,1 × 5 mm. Alle Säulen stammten von der Waters Corporation, Milford, MA. Die mobile Phase für die erste Pumpe (QSM, 100) war Lösungsmittel A: 20 mM TRIS-HCl, 8,5, Lösungsmittel B: 20 mM TRIS-HCl, 250 mM Natriumchlorid, pH 8,5. Die mobile Phase für die dritte Pumpe (BSM, 112) war Lösungsmittel A: 0,1 % Ameisensäure in Wasser und Lösungsmittel B: 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril. Die mobile Phase für die zweite Pumpe (ISM, 110) war 1 % Ameisensäure in Wasser. Die Nadelwäsche war 20 mM TRIS-HCl, pH 8,5. Die Dichtungswäsche war 10 % ACN. Das Injektionsvolumen: 1,0 µl. Der TUV-Detektorkanal war 280 nm. Der SQD2-Scan betrug von 100 bis 3000 Da. Die Temperaturen lauteten (Dimension 1, 402) Raumtemperatur (Dimension 2, 404) 40°C und die Abscheidesäule: Raumtemperatur.
Eine andere Anwendung beinhaltete auswählbare At-Column Dilution zur Optimierung der mehrdimensionalen Chromatographie bei intakten Proteinen mittels Ionenaustausch-Größenausschluss-Trennung. Der Instrumentenaufbau, die Säulen, mobilen Phasen und Detektoren lauten wie folgt. Die erste Dimension-(Dimension 1, 402)Säule war eine Protein-Pak Hi Res Q, 4,6 × 100 mm, 5 µm, und stammte von der Waters Corporation, Milford, MA. Die zweite Dimension-(Dimension 2, 404)Säule war eine ACQUITY UPLC^® Protein BEH SEC 200 Å, 4,6 × 150 mm, 1,7 µm, und stammte von der Waters Corporation, Milford, MA. Die Abscheidesäule (116) war ein leerer 50-µl-Kreislauf. Die mobile Phase für die erste Pumpe (QSM, 100) war Lösungsmittel A: 20 mM TRIS-HCl, 8,5, Lösungsmittel B: 20 mM TRIS-HCl, 250 mM Natriumchlorid, pH 8,5. Die mobile Phase für die dritte Pumpe (BSM, 112) war Lösungsmittel A: 20 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, pH 6,8. Die mobile Phase für die zweite Pumpe (ISM, 110) war 20 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, pH 6,8. Die Nadelwäsche war 20 mM TRIS-HCl, pH 8,5. Die Dichtungswäsche war 10 % ACN. Das Injektionsvolumen: 1,0 µl. Der TUV1-Detektorkanal war 280 nm. Der TUV2-Detektorkanal war 280 nm. Alle Säulentemperaturen waren Raumtemperatur.
Eine andere Anmeldung beinhaltete auswählbare At-Column Dilution zur Optimierung der mehrdimensionalen Chromatographie bei intakten Proteinen mittels Größenausschluss-Ionenaustausch-Trennung. Der Instrumentenaufbau, die Säulen, mobilen Phasen und Detektoren lauten wie folgt. Die erste Dimension-(Dimension 1, 402)Säule war eine ACQUITY UPLC^® Protein BEH SEC 200 Å, 4,6 × 150 mm, 1,7 µm, und stammte von der Waters Corporation, Milford, MA. Die zweite Dimension-(Dimension 2, 404)Säule war eine Protein-Pak Hi Res Q, 4,6 × 100 mm, 5 µm, und stammte ebenfalls von der Waters Corporation, Milford, MA. Die Abscheidesäule (116) war ein leerer 50-µl-Kreislauf. Die mobile Phase für die erste Pumpe (QSM, 100) war Lösungsmittel A: 20 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, pH 6,8. Die mobile Phase für die dritte Pumpe (BSM, 112) war Lösungsmittel A: 20 mM TRIS-HCl, pH 8,5, Lösungsmittel B: 20 mM TRIS-HCl, 250 mM Natriumchlorid, pH 8,5. Die mobile Phase für die zweite Pumpe (ISM, 110) war 20 mM TRIS-HCl, pH 8,5. Die Nadelwäsche war 20 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, pH 6,8. Die Dichtungswäsche war 10 % ACN. Das Injektionsvolumen: 1,0 µl. Der TUV1-Detektorkanal war 280 nm. Der TUV2-Detektorkanal war 280 nm. Alle Säulentemperaturen waren Raumtemperatur.
Bei Verwendung in dieser Schrift und den Ansprüchen bedeuten die Begriffe „umfasst“ und „umfassend“ und Abänderungen davon, dass die spezifizierten Merkmale, Schritte oder ganzen Zahlen inbegriffen sind. Die Begriffe sind nicht dahingehend auszulegen, dass sie das Vorhandensein anderer Merkmale, Schritte oder Komponenten ausschließen.
Die in der vorangehenden Beschreibung oder den folgenden Ansprüchen oder den beigefügten Zeichnungen offenbarten Merkmale, die in ihren spezifischen Formen oder in Bezug auf ein Mittel zur Durchführung der offenbarten Funktion oder ein Verfahren oder einen Prozess zur Erzielung des offenbarten Ergebnisses ausgedrückt sind, können je nach Fall gesondert oder in beliebiger Kombination derartiger Merkmale zur Realisierung der Erfindung in verschiedenen Formen davon genutzt werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 6790361 [0050]
US 7875175 [0050]
US 7909994 [0050]

Claims

Chromatographiesystem, umfassend: (i) eine erste Fluidpumpe zum Pumpen eines ersten Durchflussstroms; (ii) eine der ersten Pumpe nachgeschaltete erste Chromatographiesäule; (iii) ein der ersten Chromatographiesäule nachgeschaltetes erstes Ventil, worin das erste Ventil dafür konfiguriert ist, den ersten Durchflussstrom zu einem ersten Detektor oder zu einem Mischer umzuleiten; (iv) eine zweite Fluidpumpe zum Pumpen eines zweiten Durchflussstroms in Fluidkommunikation mit dem Mischer, worin die ersten und zweiten Durchflussströme mindestens einen physikalischen oder chemischen Unterschied aufweisen und zusammen einen dritten Durchflussstrom bilden, worin die ersten und zweiten Pumpen das Verhältnis von ersten zu zweiten Durchflussströmen, die den dritten Durchflussstrom bilden, von 0:1 bis 1:0 variieren können; (v) ein dem Mischer nachgeschaltetes zweites Ventil; worin das zweite Ventil dafür konfiguriert ist, den dritten Durchflussstrom zu einem Abscheider oder zum Abfluss umzuleiten, wobei der Abscheider ein vorderes Ende und ein hinteres Ende aufweist und der dritte Durchflussstrom in Fluidkommunikation mit dem vorderen Ende des Abscheiders steht und worin der Abscheider dafür konfiguriert ist, einen Analyten im dritten Durchflussstrom physikalisch oder chemisch zurückzuhalten; (vi) eine dritte Fluidpumpe zum Pumpen eines vierten Durchflussstroms und in Fluidkommunikation mit dem zweiten Ventil; worin das zweite Ventil dafür konfiguriert ist, den vierten Durchflussstrom zu einer zweiten Chromatographiesäule oder zum hinteren Ende des Abscheiders und dann durch die zweite Chromatographiesäule umzuleiten; und (vii) einen oder mehrere der zweiten Chromatographiesäule nachgeschaltete Detektoren.
Chromatographiesystem nach Anspruch 1, worin die Chromatographie Folgendes umfasst: Normalphasen-, Umkehrphasen-, kohlendioxidbasierte Chromatographie, Ionenaustausch-, Größenausschluss-, hydrophile Interaktionsflüssigkeitschromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie oder Affinitätschromatographie.
Chromatographiesystem nach Anspruch 1, worin der erste Durchflussstrom eine starke mobile Phase ist und der zweite Durchflussstrom eine schwache mobile Phase ist.
Chromatographiesystem nach Anspruch 1, worin der dritte Durchflussstrom 50 % oder weniger nach Volumen an organischer Zusammensetzung als der erste Durchflussstrom aufweist.
Chromatographiesystem nach Anspruch 1, worin der dritte Durchflussstrom einen pH-Wert mit mindestens 1 pH-Einheit Unterschied zum ersten Durchflussstrom aufweist.
Chromatographiesystem nach Anspruch 1, worin der dritte Durchflussstrom 50 % oder weniger Ionenstärke als der erste Durchflussstrom aufweist.
Chromatographiesystem, umfassend: (i) eine erste Fluidpumpe zum Pumpen eines ersten Durchflussstroms; (ii) eine der ersten Pumpe nachgeschaltete erste Chromatographiesäule; (iii) ein der ersten Chromatographiesäule nachgeschaltetes erstes Ventil, worin das erste Ventil dafür konfiguriert ist, den ersten Durchflussstrom zu einem ersten Detektor oder zu einem zweiten Ventil umzuleiten; worin das zweite Ventil dafür konfiguriert ist, den ersten Durchflussstrom zu einem Mischer oder zum Abfluss umzuleiten; (iv) eine zweite Fluidpumpe zum Pumpen eines zweiten Durchflussstroms in Fluidkommunikation mit dem Mischer, worin die ersten und zweiten Durchflussströme mindestens einen physikalischen oder chemischen Unterschied aufweisen und zusammen einen dritten Durchflussstrom bilden, worin die ersten und zweiten Pumpen das Verhältnis von ersten zu zweiten Durchflussströmen, die den dritten Durchflussstrom bilden, von 0:1 bis 1:0 variieren können; (v) einen dem Mischer nachgeschalteten Abscheider, wobei der Abscheider ein vorderes Ende und ein hinteres Ende aufweist, worin der dritte Durchflussstrom in Fluidkommunikation mit dem vorderen Ende des Abscheiders steht und worin der Abscheider dafür konfiguriert ist, einen Analyten im dritten Durchflussstrom physikalisch oder chemisch zurückzuhalten; (vi) eine dritte Fluidpumpe zum Pumpen eines vierten Durchflussstroms und in Fluidkommunikation mit dem zweiten Ventil; worin das zweite Ventil dafür konfiguriert ist, den vierten Durchflussstrom umzuleiten zu (a) einer zweiten Chromatographiesäule, oder (b) dem hinteren Ende des Abscheiders oder Kreislaufs, dann zu dem Mischer, worin der vierte und ein fünfter Durchflussstrom, die mindestens einen physikalischen oder chemischen Unterschied aufweisen, zusammen einen sechsten Durchflussstrom bilden, worin die zweiten und dritten Pumpen das Verhältnis von vierten zu fünften Durchflussströmen, die den sechsten Durchflussstrom bilden, von 0:1 bis 1:0 variieren können, und durch die zweite Chromatographiesäule; und (vii) einen oder mehrere der zweiten Chromatographiesäule nachgeschaltete Detektoren.
Chromatographiesystem nach Anspruch 7, worin die Chromatographie Folgendes umfasst: Normalphasen-, Umkehrphasen-, kohlendioxidbasierte Chromatographie, Ionenaustausch-, Größenausschluss-, hydrophile Interaktionsflüssigkeitschromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie oder Affinitätschromatographie.
Chromatographiesystem nach Anspruch 7, worin der vierte Durchflussstrom eine starke mobile Phase ist und der fünfte Durchflussstrom eine schwache mobile Phase ist.
Chromatographiesystem nach Anspruch 7, worin der sechste Durchflussstrom 50 % oder weniger nach Volumen an organischer Zusammensetzung als der vierte Durchflussstrom aufweist.
Chromatographiesystem nach Anspruch 7, worin der sechste Durchflussstrom einen pH-Wert mit mindestens 1 pH-Einheit Unterschied zum vierten Durchflussstrom aufweist.
Chromatographiesystem nach Anspruch 7, worin der sechste Durchflussstrom 50 % oder weniger Ionenstärke als der vierte Durchflussstrom aufweist.
Chromatographieverfahren, umfassend: (i) Injizieren einer Probe in einen ersten Durchflussstrom; (ii) Trennen der Probe in zwei oder mehr Komponenten an einer ersten Chromatographiesäule; (iii) Umleiten eines Teils der zwei oder mehr Komponenten aus dem ersten Durchflussstrom; (iv) Verdünnen des umgeleiteten Teils des ersten Durchflussstroms mit einem zweiten Durchflussstrom, um einen dritten Durchflussstrom zu bilden; (v) Isolieren des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten an einem Abscheider; (vi) Leiten eines vierten Durchflussstroms durch den Abscheider, um den umgeleiteten Teil der zwei oder mehr Komponenten zu eluieren; und (vii) Trennen des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten an einer zweiten Chromatographiesäule.
Verfahren nach Anspruch 13, worin der erste Durchflussstrom eine starke mobile Phase ist und der zweite Durchflussstrom eine schwache mobile Phase ist.
Verfahren nach Anspruch 13, worin der dritte Durchflussstrom 50 % oder weniger nach Volumen an organischer Zusammensetzung als der erste Durchflussstrom aufweist.
Verfahren nach Anspruch 13, worin der dritte Durchflussstrom einen pH-Wert mit mindestens 1 pH-Einheit Unterschied zum ersten Durchflussstrom aufweist.
Verfahren nach Anspruch 13, worin der dritte Durchflussstrom 50 % oder weniger Ionenstärke als der erste Durchflussstrom aufweist.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das Verdünnen des ersten Durchflussstroms durch den zweiten Durchflussstrom das Zurückhalten des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten am Abscheider steigert.
Chromatographieverfahren, umfassend: (i) Injizieren einer Probe in einen ersten Durchflussstrom; (ii) Trennen der Probe in zwei oder mehr Komponenten an einer ersten Chromatographiesäule; (iii) Umleiten eines Teils der zwei oder mehr Komponenten aus dem ersten Durchflussstrom; (iv) Verdünnen des umgeleiteten Teils des ersten Durchflussstroms mit einem zweiten Durchflussstrom, um einen dritten Durchflussstrom zu bilden; (v) Isolieren des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten an einem Abscheider; (vi) Leiten eines vierten Durchflussstroms durch den Abscheider, um den umgeleiteten Teil der zwei oder mehr Komponenten zu eluieren; (vii) Verdünnen des vierten Durchflussstroms mit dem fünften Durchflussstrom, um einen sechsten Durchflussstrom zu bilden; und (viii) Trennen des umgeleiteten Teils der zwei oder mehr Komponenten an einer zweiten Chromatographiesäule.
Verfahren nach Anspruch 19, worin der vierte Durchflussstrom eine starke mobile Phase ist und der fünfte Durchflussstrom eine schwache mobile Phase ist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin der sechste Strom 50 % oder weniger nach Volumen an organischer Zusammensetzung als der vierte Durchflussstrom aufweist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin der sechste Durchflussstrom einen pH-Wert mit mindestens 1 pH-Einheit Unterschied zum vierten Durchflussstrom aufweist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin der sechste Durchflussstrom 50 % oder weniger Ionenstärke als der vierte Durchflussstrom aufweist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin das Verdünnen des vierten Durchflussstroms durch den fünften Durchflussstrom das Zurückhalten des umgeleiteten Teils von zwei oder mehr Komponenten am Abscheider steigert.