DE1773229A1 - Verfahren und Einrichtung zur Durchfuehrung der Chromatographie von Aminosaeuregemischen - Google Patents

Description

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Aktenz.8 P 17 73 229· 5-52 Anwo-Aktei 75.79

PATEHTANMELDUKG

Anmelder: Ceskoslovenska akademie ved, Praha T

Titel£ Verfahren und Einrichtung zur Durchführung

der Chromatographie von Aminosäuregemischen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Einrichtung zur Durchführung der Chromatographie von Aminosäuregemischen, welches besonders für die Trennung des kritischen Aminosäurepaares Tyrosin-PLenylalamin geeignet ist« Es ist bekannt, daß durch Zusatz organischer Lösungsmittel, vor allem des Hetanols bzw. anderer Alkohole mit kurzer Atomkette (. z.B. n-Butylalkohol- im weiteren nur als "Zusatz" bezeichnet ), eine bessere Trennung des Aminosäurepaares Threonin-Serin erzielt werden kann, welches bei der Trennung von Aminosäuregemischen als kritisches Paar berzeichnet wird. Der Zusatz dieser organischen Lösungsmittel ändert jedoch die gegenseitige chromatographische Lage auch anderer Aminosäuren bei manchen derart, daß eine Verschlechterung ihrer gegenseitigen Trennung eintritt. So hat z.B. Methylalkohol-Zusatz bzw. anderer organischer Lösungsmittel zum Zweck der Verbesserung der Trennung des Paares Threonin-Serin eine Verschlechterung des Paares Glycin-Alanin zur Folge, sodaß dieses Paar zu einem kritischen Paar werden kann»

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Es ist weiter "bekannt, den Elutionspuffern einen Metanolzusatz beizumischen,bei dem die Trennung von Aminosäuregemischen an einer mit Polystyrol-Kationenaustauschern gefüllten Säule durchgeführt wird, wobei die Elution durch einen Puffer mit kontinuierlich veränderlicher Zusammensetzung durchgeführt wird· Die Änderung der Elutionspuffer- -Zusammensetzung wird mittels einer hydrostatischen Mischeinrichtung sichergestellt. Der unerwünschte Einfluß des Zusatzes auf das Paar Glycin-Alanin und gegebenenfalls eines anderen Aminosäurepaarea tritt, neben der günstigen Einwirkung auf die Trennung des Paares Threonin-Serin, dadurch zum Vorschein, daß der Zusatz auf unerwünschte Art in dem Zeitabschnitt einwirkt, in dem das Paar Threonin- -Serin bereits aus der Säule herausgeschwämmt wurde, in dem jedoch an der Säule die Trennung weiterer Aminosäuren einschließlich des Paares Glycin-Alanin weiterläuft und zwar unter Einfluß bestimmter Zusatz-Konzentfcation in diesem Zeitabschnitt. Übrigends wirkt auch die Tatsache auf unerwünschte Art, daß die Zusatz-Anwesenheit dadurch zum Vorschein tritt, daß dieser in einer bestimmten Konzentration in den Harzkernen auch dann enthaltendet, wenn der Elutionspuffer zur weiteren Anreicherung bzw. Erhaltung der Zusatz- -Konzentration in den Harzkernen nicht mehr beiträgt. Wenn auch der Zusatz bei Beginn des chromatographischen Prozesses nur in der ersten Kammer bzw. in einigen der ersten Kammern der hydrostatischen Mischeinrichtung enthalten ist, so wird durch diese bekannte Art zwar die maximale Zusatz-Einwirkung

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zu Beginn der Elution mit einem günstigen Effekt auf das Paar Threonin-Serin erzielt, Jedoch es verbleibt die unerwünschte Einwirkung im weiteren Chromatographie-Yerlauf erhalten,, da die hydrostatische löscheinrichtung keine steile Senkung der Zusatzkonzentration im Verlauf der Elution bis auf Null ermöglicht· Dadurch wird die Verwirklichung der Forderung, daß nämlich der Zusatz-Einfluß nur scharf auf die Anfangsphasen des Ghromatogramms beschränkt wird, in denen der Zusatz noch keinen unerwünschten Einfluß auf weitere Aminosäuren ausübt, insbesondere auf das Paar G-lycin-Alanin, unmöglich gemachte

Der Erfindung liegt die Aufgale zugrunde, dia erwähnten Nachteile zu beseitigen. Diese Aufgabe wird erfindungage— maß dadurch gelöst,, daß zunächst die Elution sauerer und neutraler Aminosäuren bis zur Leucin-Elution durch einen oder mehrere Zitra±~Puffer durchgeführt wird, wodurch die Elution von Tyrosiap-Phenylalanin durch einen weiteren Puffer erfolgt» deaaen pH-Wert und Normalität sprunghaft gegenüber den Werten dea vorangehenden Puffers gesteigert wird.

Die zur Durchführung des Verfahrens dienende Einrichtung aua eimer oder mehreren chromatographischer Säulen be*teht darin, daß die chromatographische Säule mit ihrem oberen Ende an den Austritt der Pumpe aa^eachloasjsn wird, deren Eintritt mittels einer leitung mit dem Mehrweghahn in

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Verbindung steht - Dieaer Mehrweghahn ist mit EintrittshälaenTeusjeheh, die an den Eluent—Vorratsbehälter und an d en Probenbehälter angeschlossen sind. Der untere Teil der chromatographischen Säule ist durch ein Rohr über den Kapillarreaktor an die Ausweite einrichtung angeschlossen,,, wobei an das Rohr eine weitere Pumpe mit dem Vorratsbehälter der. AuswertungsKreagenz-mittel angeschlossen ist*.

Den Mehrweghahn kann noch mit weiteren Eintrittshälsen Tersehen werden, die an andere Eluent—Vorratabehälter angeschlossen sind.

fe Ea; iat naheliegend, daß das gleiche Prinzip auch für die Optimalisierung der Trenmingsbedingungen anderer Komponenten verwendet werden kann, einschließlich solcher, bei denen die Optimalisierung durch Zuführung des Zusatzes Im anderen Teil des; Chroniatogramms als Anfangs durchgeführt wird.

Die Zusatz—Z.uf uhr ungaz ei t bezieht adch nicht nur auf diß Zeit, der eigentlichen Chromatographie, sondern kann auch, bereits. Tor Beginn der eigentlichen Chromatographie durchgeführt weacdea, d.h. vor der Auftragung der Probe auf di· chromatographische Säule.

Die Wirkung dea, angereicherten Puff (esa vor dem Augenblick W der Pro bemuf tragung 1st dadurch g«g*b«m, dft& In dl· «ex Zeit dl· Hjarrkerne durch Diff ueicat der Säulenf üllung in geAilgtndtr 11·ί· bereiter or Prok#*uf tragung geeilt ti gt werden. Sie eigentlich· Chromatograph!· verläuft eomit bereit·; vom «raten Augenblick an durch Zueets geeftttigten Harzkernen^ welcher über die chromatographische Lage einzelner Komponenten entscheidet· Aufdies* Art kann eine maximale Zusatz-Einwirkung auf die Komponenten erzielt werdeau,. deren Migrationsgcachwindigkeiten groß sind»

In Fällen mmhr achaell verlaufender Chromatographie eher

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Trennungen kann eine maximale Wirkung sogar dann erzMt werden, wenn die Zusatzzuführung nur vor der Probeauftra— gung erfolgt and die Puff er zuführung ohne Zusatz, im Augenblick der Probeauftragung oder auch vorher begonnen wird, fl/ie ersichtlich handelt es sich im Wesentlichen darum, daß erfindungsgemäß ein genügend intensiver und kurzer Impuls der Zusatzkonzentration ausgebildet wird, derat, daß dieser Impuls eine intensive kurzzeitige tfelle der Zuaatzkonzentration in den Harzkernen hervorruft. Hierbei '73ia-t diese konzentrationswelle während des gesamten Chromatographie-Verlaufes eine solche Porm_r Größe und Lage auf, daß sie auf optimale Art eine positive Einwirkung für die Verbeaaerung der Trennung mancher Aminoaäurepaare hervorruftc. Der unerwünschte Einfluß auf übrige Komponenten wird auf einem Kleinstwert gehalten.

Die nötigen schnellen Qualitätsänderungen des Puffers oder dessen Austausch kann z.B. ein automatischer Mehr·- weghahn bzw* eine Programmpumpe sicherstellen.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahren» ist es besonder* vorteilhaft, wenn die Chromatographie einschließlich der Vorstabilisierung der Säule durch dea zugehörigen Puffer und die Probeauftragung kontinuierlich durch einem ununterbrochenen Pufferstrom erfolgt. Ein wichtige*, diesß erforderliche Kontinuität ermöglichendes., Element ist die /erwe ladung einea. Säulenverachluase, der einen freien Raum oberhalb Säulenfüllung ausschließt«,

Eia praktisches. Anwendungsbeispiel des erfingungsgemäßen Verfahrens; ist die Durchführung der Chromatographie von Aminosäuregemisches an einem Säulenpaar, von dem die eine Säule für die Trennung saurer und neutraler Aminosäuren und die zweite — die kleinere - für die Trennung basischer Aminosäuren bestimmt ist_e Die Elution an der großen oäule erfolgt derart,, daß die Säule ungefähr ö i.iinuten vor Einlassen der Probe durch Zi tratpuff er Lösung

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mit 5 /ό Zusatz organischen Lösungsmittels stabilisiert wird, wobei die Elution durch denselben angereicherten Puffer während etwa 13 Minuten weiterläuft, worauf die Elution ohne Zusatz eines organischen Lösungsmittels erfolgt. Die komplette Analyse an beiden Säulen dauert 120 Minuten bei einer fast vollständigen Trennung aller Einzelkomponenten. Der Chromatogramm-Abstand zwischen Threonin und Serin, der in der Re^eI kritisch klein ist, ii', iana ungefähr so groß wie jener zwischen der Asparaginsäure und Threonin. Hierbei verbleibt die Trennung der Aminosäuren fast vollkommen.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und wird im folgenden näher beschrieben. Ea zeigens

Fig. 1: ein Chromatοgramm ab Elution der Aminosäure Valin bis Phenylalanin.

Pig. 2: eine zur Durchführung des Verfahrens dienere Einrichtung.

Das Chromatogramm nach Fig. 1 zeigt den Ablauf des chromatographischen Vorganges ab Valin-Elution, dargestellt durch den Höhepunkt A. Bis zur Beendigung der Valin-Elution wird der Zitratpufier von dem «ert pH 4,25 und der NoCT|ali.tät 0,2 eingelassen. Der chromatographische Vorgang wird fortgesetzt mit einem Puffer pH 5,28 und einer Normalität 0,38, wobei der Austritt der Stirn dieses letzten Puffers zwischen dem Austritt der Aminosäuren Leucin und Tyrosin eintritt, deren Elution durch die Höhepunkte D, E dargestellt ist, und es wird die Regenerierung der chromatographischen Säule durch Natronlauge durchgeführt. Der Höhepunkt B stellt die Methoinin-Elution, Punkt C die Isoleucin-Elution und Punkt F die Phenylalamin-Elution dar. Wie aus den Höhepunkten E und F hervorgeht, wird die Trennung der Aminosäuren Tyrosin-Phenylalahin, die in der Regel das kritische Paar darstellen,

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nicht nur wesentlich beschleunigt, sondern auch verbessert.

Die in Fig. 2 dargestellt Einrichtung ist folgendermaßen gestaltet:

Die chromatographische Säule 1 ist mit ihrem oberen Verschluß 2 und über die Leitung 4 an den Austritt der Pumpe 3 angeschlossen. Der Eintritt der Pumpe 3 ist durch eine weitere Leitung 5 an den Mehrweghahn 6 angeschlossen, welcher die Leitung 5 mit einem der Anschlüsse 7,10,21,22,29 verbindet. Der Anschluß 7 ist mittels der Leitung 8 an den Eluent-Vorratsbehälter 9 angeschlossen. Der weitere Anschluß 10 ist mit dem Anschluß 30 des Probebehälters 11 verbunden. Die übrigen Anschlüsse 21,22,29 sind mittels der Leitungen 23,24,25 züweiteren Vorratsbehältern 26,27,28 weitere Eluente angeschlossen. Der zweite Anschluß 31 des Probebehälters 11 ist mit der Leitung 12 und mit der Leitung 32 verbunden. Die Leitung 12 verbindet den Probebehälter 11 mit der Leitung 8, die vom Eluent-Vorratsbehälter zum Anschluß 7 des Mehrweghahnes 6 führt. Die Leitung 32 ist an die Leitung 13 angeschlossen, die von einem weiteren Vorratsbehälter des weiteren Eluenten führt. Der untere Teil der chromatographischen Säule 1 ist mittels des Rohre« 15 Über den Kapillarreaktor 16 an die Auswerteeinrichtung 17 angeschlossen, die mit Vorteil durch ein Photometer gebildet wird· An da« Rohr 15 ist über die Lei tung 21 die Pump· 20 angeschlossen, durch die mittel* der Leitung 19 das Auewertereagens aua dem Vorratsbehälter gepumpt wird.

Die Funktion der Einrichtung besteht darin, daß der Mehrweghahn 6, der von Hand aus oder automatisch τοη einer nicht eingezeichneten Steuereinrichtung aus betätigt wer den kann, den Anschluß irgendeine der Vorratsbehälter 9,14, 26,27,26 an diechromatographische Säule 1 bewirkt. Hier durch wird die Wahl des nötigen Eluatea zur Durchführung

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der Säulenchromatographie von Aminosäuregemischen getroffen. Gleichzeitig wird mittels dieses Mehrweghahnes 6 auch der Probebehälter 11 an die chromatographische Säule angeschlossen.

Anstatt des Mehrweghahnes 6 kann mit Vorteil, besonders für das Programmieren der Eluatzuleitung in die chromatographische Säule 1, eine programmgesteuerte Pumpe verwendet werden.

Um die kontinuierliche Strömung des Eluats und der Probe in die chromatographische Säule 1 zu erzülen, ist es nötig, am oberen Verschluß 2 einen freien Raum zu vermeiden.

Bei Trennung des Eluatstromes im Kapillarreaktor in voneinander mittels Blaskolben getrennte Abschnitte kann z.B. im analytischen, 45 Minuten dauerndem Prozess, praktisch eine vollständige Trennung des Paares Threonin-Serin sowie auch der übrigen Aminosäuren derart erzielt werden, daß der mit einem Zusatz von 6fi organischem Lösungsmittel angereicherte Puffer zur Stabilisierung der Säulen während 2 l/2 Minuten vor Einlassen der Probe and nach diesem während 8 Minuten, eingelassen wird.

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Claims (3)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Durchführung der Chromatographie von Aminosäuregemischen, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst die Elution sauerer und neutraler Aminosäuren "bis zur Leucin-Elution mit einem oder mehreren Puffern, z. B. Zitratpuffern durchgeführt wird, worauf die Elution von Tyrosin-Phenylalanin mit einem weiteren Puffer erfolgt, dessen pH-Wert und Normalität sprunghaft gegenüber dem vorangegangenen Puffer erhöht wird.

2. Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 mit einer oder mehreren chromatographischen Säulen, dadurch gefcennz eichnet, daß die chromatographische Säule (1) mit ihrem oberen Verschluß (2) an den Austritt aus der Pumpe (3) angeschlossen ist, deren Eintritt durch die Leitung (5) zum Mehrweghahn (6) führt, welcher mit Einlassen (7,10) versehen ist, die mit dem Vorratsbehälter (9) des EIuates und dem Probenbehälter (11) verbunden sind, und der untere Teil des chromatographischen Säule (1) mittels des Rohres (15) über den Kapillarreaktor (16) an die Auswerteeinrichtung (17) angeschlossen ist, wobei zum Rohr (15) eine weitere Pumpe (20) mit dem Vorratsbehälter (18) der Auswertereagenzien angeschlossen ist»

3. Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mehrweghahn (6) mit weiteren Einlassen (21,22,29) versehen ist, die an weitere Vorratsbehälter (26,27,28) weiterer Eluate anschließbar sind,

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