Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur beschleunigten chromatographischen Analyse von durch Aufspaltung von Eiweisstoffen entstandenen Gemischen mit einer Separierung einerseits der basischen und andererseits der neutralen und sauren Komponenten dieser Gemische in besonderen Kolonnen. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Einrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Die bekannten klassischen Formen von Analysatoren für Aminosäuren, auch in einer nichtautomatischen Ausführung, verwenden wenigstens drei Kolonnen, bei denen für die Analyse des Aminosäuregemisches eine kurze, sogenannte kleine oder basische Kolonne für die Separierung der einzelnen basischen Aminosäuren bestimmt ist, und die beiden anderen sogenannten grossen Kolonnen wechselnd so arbeiten. dass immer eine von ihnen die übrigen Aminosäuren in saure und neutrale trennt, während die andere regeneriert und restabilisiert wird. Im nachfolgenden Zyklus werden die Funktionen der beiden grossen Kolonnen gewechselt, so dass die zweite von ihnen für die Separation genützt wird, während die erste regeneriert und restabilisiert wird.
Eine der Erkenntnisse. aus denen die Erfindung hervorgeht, ist die Tatsache. dass die Analysen der obenerwähnten Gemische lediglich auf zwei Kolonnen durchgeführt werden können, also auf einer kleinen und lediglich auf einer grossen Kolonne.
Es entfällt also die Notwendigkeit, eine zweite grosse Kolonne zu verwenden, wodurch die Gesamtzahl der Kolonnen für die komplette Analyse von drei auf zwei reduziert wird und nocl weitere Vorteile erreicht werden können. Diese Vorteile ergeben insbesondere eine niedrige Anzahl von Pumpen und insbe son re bei einer vollkommen automatischen Durchführung der Analyse und automatischem Eintragen der für die Analyse bestimmten Proben aus dem Dosiersystem, in das die Proben vorher in einer für die Bedienung geeigneten Zeit eingebracht wurden.
Absolut \llkommene Gleichgewichte werden bei der Rege.
nerierung auch nicht nach sehr langen Regenerierzeiten erreicht. Die Verkürzung der Regenerierung und Restabilisierung auf eine Zeit. welche die Verwendung von lediglich einer langen Kolonne gemäss der Erfindung gestattet, ermöglicht eine genügende Regenerierung und Restabilisierung in der Weise. dass die Abweichungen im grossen analytischen Zyklus die durch die nicht ganz vollkommene Regenerierung und
Restabilisierung verursacht werden, vernachlässigbar sind im Vergleich zu anderen unvermeidlichen, jedoch tolerierbaren
Ursachen von Abweichungen vom idealen Prozess.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeich net. dass die zur Analyse bestimmten Gemische in einer Pufferlösung und die Elutions-, die Regenerations- und Restabili sierungslösungen durch Pumpen aus Behältern in je eine kleine Kolonne, die zur Separierung der basischen Komponen ten bestimmt ist, und in eine grosse Kolonne, die zur Separie rung der neutralen und sauren Komponenten bestimmt ist, gefördert werden, und die Elution der Komponenten aus der grösseren Kolonne und die nachfolgende Regeneration diese
Kolonne durch eine kontinuierliche Strömung einerseits durch mindestens zwei Puffer mit sprunghaft steigender Azidität und
Normalität und andererseits durch regenerierende und restabi lisierende Lösung durchgeführt wird und alle diese Flüssigkei ten auf die einzige grosse Kolonne mit Hilfe nur einer Pumpe, an welche die Kolonne dauernd angeschlossen ist, gepumpt werden.
Die Einrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die kleine Kolonne mit einer ersten Pumpe zum Fördern der für die Analyse bestimmten
Probe und die einzige grosse Kolonne mit einer zweiten
Pumpe zum Fördern der Elutions-, Regenerations- und Resta- hilisierungsl(isungen dauernd in Verbindung stehen.
Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Anordnung der Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens,
Fig. 2 bis 4 alternative Details der Anordnung, und
Fig. 5 ein Schema der Anordnung einer Einrichtung für die Durchführung des klassischen Verfahrens der Chromatographie auf einer Dreierkolonne.
Die Erfindung liegt also darin, dass für die Analyse von Eiweissabbauprodukten, zum Beispiel Hydrolysaten von Eiweisstoffen, Peptiden und Aminosäuregemischen, ausser der kurzen Kolonne für die Trennung basischer Komponenten, lediglich eine grosse Kolonne für die Trennung der sauren und neutralen Komponenten verwendet wird. Es ergibt sich somit eine Vereinfachung der Einrichtung, welche sich besonders bei einer Automatisierung des gesamten Systems günstig bemerkbar macht. Weiterhin werden die in der Einrichtung benötigten Pumpen auf ein Mindestmass reduziert.
Hierdurch ist eine wesentliche Vereinfachung auch bei einer nicht automatischen Funktion erreichbar. In weit grösserem Masse können die Vorteile und Vereinfachung des Verfahrens sowie der Einrichtung bei einer vollautomatischen Funktion sich bemerkbar machen, besonders in dem Sinne, dass ganze Serien von Analysen völlig automatisch, einschliesslich des Eintragens der Proben auf die Kolonnen, durchgeführt werden können, wobei die Proben automatisch auf die Kolonnen in geeigneten Zeiten aus den Dosiereinrichtungen befördert werden, in die sie in einer für die Bedienung geeigneten Zeit eingebracht wurden. Eine solche totale Automatisierung kann auf dem System gemäss der Erfindung durch wesentlich einfachere Mittel und mit erhöhter Sicherheit erreicht werden, als dies der Fall wäre, wenn eine Vollautomatisierung auf einer bekannten Dreierkolonne durchgeführt würde.
Diese Vorteile liegen nicht nur bei Analysatoren, bei denen auf die Einfachheit und eventuell die Geschwindigkeit der Funktion besonderer Wert gelegt wird, sondern auch bei anderen Typen, zum Beispiel bei Analysatoren, wo insbesondere Wert auf die Geschwindigkeit oder eine erhöhte Genauigkeit wie auch auf die Separationswirkung gelegt wird. Ebenso können die Vorteile auch bei universalen Analysatoren, die für die Durchführung sowohl beschleunigter, eventuell auch langsamer Analysen, die jedoch mit erhöhter Genauigkeit, Empfindlichkeit und Selektivität arbeiten, ausgestattet sind.
Die oben angeführten Vorteile des Verfahrens und der Einrichtung sind nicht nur, wie bereits angeführt, bei einer vollkommenen Automatisierung der serienmässigen Durchführung von Analysen wichtig, sondern auch bei Analysen, bei denen das Eintragen der Proben mit der Hand auf die Separationssäule nach dem Öffnen der Kolonne und gegebenenfalls auch bei manueller Umschaltung der hydraulischen Verbindungen durchgeführt wird, wie dies bei den bekannten Typen von Analysatoren der Fall ist. Wenn auch solche Typen als automatische bezeichnet werden, hat ihre Automatisierung jedoch einen wesentlich beschränkteren Sinn im Vergleich zu den oben angeführten.
Die Fig. 1 zeigt die Stutzen 1 bis 6, welche auf dem Umfang eines automatischen Sechsweghahns 7 angeordnet sind. Selbstverständlich können auch mehr als sechs Stutzen vorgesehen sein. Diese sind an den zentralen Stutzen 8, der über Leitung 9 mit der Pumpe 10 verbunden ist, angeschlossen, welche die Eluenten in die grosse Kolonne 11 drückt. Die Stutzen 1 bis 6 des Hahnes 7 sind an die Behälter, 12, 13, 14, 15 für die Elutionslösungen angeschlossen, wobei die Stutzen 1 und 3 miteinander verbunden und direkt an den Behälter für den ersten Elutionspuffer angeschlossen sind, während der zwi schen ihnen befindliche Stutzen 2 an den gleichen Behälter 12 über das drucklose Dosiersystem 16 angeschlossen ist.
In ähnlicher Weise wird das Eluat in die einzige kleine Kolonne 17 durch die Pumpe 18 gedrückt, wobei der Eluent aus dem Behälter 19 entweder direkt oder gegebenenfalls unter Verwendung der drucklosen Dosiereinrichtung 20 über den mit Vorteil automatischen Dreiweghahn 21 angesaugt wird, der die Pumpe 18 in der einen Stellung direkt mit dem Gefäss 19 und in der anderen Stellung über das drucklose Dosiersystem 20 verbindet. Das drucklose Dosiersystem 16 für die grosse Kolonne 11 und das drucklose Dosiersystem 20 für die kleine Kolonne 17 können durch die gestrichelt eingezeichneten Druckdosiersysteme 22 und 23 ersetzt werden, die dicht vor der Kolonne 11 und 17 angeschlossen sind. In diesem Fall kann der Stutzen 2 des Mehrweghahns 7 an einen nicht eingezeichneten Behälter für eine weitere Elutionslösung angeschlossen sein, oder es kann die Zahl der Stutzen um zwei verringert werden.
Bei Verwendung zum Beispiel von nur zwei Elutionslösungen kann der dargestellte, automatische, standardmässig hergestellte Sechsweghahn 7 so verwendet werden, dass immer zwei gegenüberliegende Stutzen miteinander verbunden sind, wodurch für einen analytischen Zyklus lediglich drei, d. h. die Hälfte der Umdrehung des Kerns des Sechsweghahns 7 notwendig sind. Im Falle der Anwendung eines Druck-Dosiersystems 23 anstelle des drucklosen Dosiersystems 20 kann der Zweiweghahn 21 entfallen. Das gleiche gilt auch für den Fall, wenn eine manuelle Dosierung in die Kolonne in der klassischen Art angewendet werden soll, wobei die Dosiersysteme überhaupt entfallen. Die drucklosen Dosiersysteme haben gegenüber den Drucksystemen den Vorteil, dass bei ihnen minimale Forderungen an die Dichtheit gestellt werden.
Bei den klassischen Systemen für die Durchführung der Analysen auf einer kleinen und zwei grossen Kolonnen werden für die Elution der grossen Kolonne Zitratpuffer mit einer Azidität von pH 3,25-4,25 verwendet mit einer Lösungsnormalität von 0,2 und für die Regenerierung 0,2 NaOH. Für die kleine Kolonne wird nur ein Zitratpuffer mit einer Azidität von pH 5,28 bei einer Normalität von 0,35 angewendet.
Bei dem Verfahren und der Einrichtung gemäss der Erfindung können mit Vorteil diese Puffer und auch die Regenerierlösung verwendet werden, die beim klassischen Verfahren verwendet werden, wobei das Wesen des Effektes hinsichtlich der Elutionsdauer auf einer einzigen Kolonne, wie auch hinsichtlich einer besseren Trennung der verhältnismässig schwer trennbaren Aminosäuren, Thyrosin, Phenylalanin dadurch erreicht wird, dass für nur eine grosse Kolonne ein dritter Elutionspuffer mit einer grösseren Azidität und auch Normalität im Vergleich zu den beiden ersten Puffern verwendet wird.
Mit Vorteil kann auch dieser dritte Puffer für eine einzige grosse Kolonne identisch sein mit einem Elutionspuffer für die kleine Kolonne. Wenn die zugehörigen Leitungen miteinander verbunden sind, wie dies in der Fig. 1 durch die gestrichelte Verbindung 24 angedeutet ist, kann einer von den zwei Behältern 14 oder 19 entfallen.
Die aus den Kolonnen 11 und 17 ablaufenden Eluate werden durch die kapillaren Leitungen 25 und 26 zum hydraulischen Schalter 27 geführt, der in seinem Drehkern die beiden dünnen Kanäle 28, 29 besitzt, welche die Leitungen 25 und 26 so miteinander verbindet, dass, wenn eine von ihnen an die Zuleitung 30 zur Auswerteeinrichtung angeschlossen ist, die andere an die Abflussleitung 31 angeschlossen ist. Der hydraulische Schalter 27 kann gleich wie die hydraulischen Schalter 7 und 21 mit der Hand bedient werden, wenn auf eine Automatisierung kein Wert gelegt wird. Ein wichtiger Vorteil des Systems gemäss der Erfindung besteht darin, dass alle drei hydraulischen Schalter leicht automatisch auf Befehle einer in der Fig. 1 nicht eingezeichneten zentralen Programmiereinrichtung betätigt werden können.
Auch im Falle einer vollkommenen Automatisierung, einschliesslich einer automatischen Eintragung der Proben aus dem Dosiersystem auf die Kolonne kann eine vollständige Automatisierung durch ausserordentlich einfache Mittel erreicht werden, wie aus der vereinfachten Gesamtanordnung gegenüber der klassischen Anordnung hervorgeht, die später bei der Erläuterung zur Fig. 4 beschrieben ist. Die Vorteile einer auch manuellen Bedienung des ganzen analytischen Systems gemäss Fig. 1 auch im Falle einer Automatisierung liegen vor allem darin, dass sie eine Sicherung im Falle einer Störung des automatischen Systems oder in solchen Fällen bedeuten, wo aus irgendwelchen Gründen der Prozess individuell geführt werden soll, abweichend von einem automatischen, programmierten Prozess.
Für diesen Zweck sind die automatischen Schalter 7, 21 und 27 so ausgebildet, dass ihre manuelle Verschiebung auch im Falle eines Anschlusses an eine automatische Bedienung möglich ist.
Der hydraulische Schalter 27 schaltet das aus den Kolonnen 11 und 17 fliessende Eluat durch die Leitung 30 an die Auswerteeinrichtung in den Momenten, wo sie die separierten Komponenten nach deren Separierung auf der zugehörigen Kolonne wegführen. Hierdurch wird erreicht, dass die ganze Auswerteeinrichtung dauernd zur Auswertung des Eluats benützt wird, sei es von der ersten, sei es von der zweiten Kolonne 11 oder 17. Hierbei drückt das Eluat aus der einen Kolonne nach dem Umschalten das Eluat vor sich her, das sich für die Dauer von etwa 15 Minuten im Reaktor befindet, wohin es vor dem Umschalten aus der vorherigen Kolonne gedrückt wurde.
Die grosse Kolonne 11 funktioniert so, dass in der Zeit, wo das Eluat in die Auswerteeinrichtung aus der kleinen Kolonne 17 weggeführt wird, auf der grossen Kolonne 11 die Elution insbesondere durch einen dritten Elutionspuffer beendet, eine kurze Regenerierung und wiederum eine Stabilisierung mit dem Puffer vorgenommen wird, der mit Vorteil identisch mit dem ersten Elutionspuffer sein kann. Mit diesem wird in der Zeit des Wegführens des Eluats aus der kleinen Kolonne 17 in die Auswerteeinrichtung die Elution der vorhergehenden Analyse auf der grossen Kolonne 11 und weiters deren Regenerierung und Restabilisierung beendigt. Auf der kleinen Kolonne 17 verläuft vor dem Umschalten ihres Eluats auf die Auswerteeinrichtung die Elution der sauren und basischen Aminosäuren in einem im Wesen nicht separierten Zustand in den Abfall 31 vor dem Augenblick des Umschaltens.
Nach dem Umschalten auf die grosse Kolonne 11 sorgt das Eluat aus dieser Kolonne für den Transport der auf der kleinen Kolonne 17 separierten Aminosäuren. In manchen Fällen ist es zweckmässig, dass auch die kleine Kolonne 17 nach jedem analytischen Zyklus regeneriert wird, damit die Elution auf ihr mit mehr als einer Elutionslösung durchgeführt werden kann.
Die Fig. 2 zeigt schematisch eine Alternative eines Details der Anordnung für diesen Zweck. Der Dreiweghahn 21 ist durch einen Mehrweghahn 32 ersetzt, dessen Umfangsstutzen in einer nicht weiter dargestellten Weise an Behälter mit den zugehörigen Lösungen angeschlossen sind, und zwar analog zum hydraulischen Umschalter 7 der Fig. 1. Eine solche kompliziertere Elution auf der kleinen Kolonne 17 und eine eventuelle Regenerierung ist zweckmässig im Falle von komplizierteren Gemischen, die neben den Grundaminosäuren noch weitere Stoffe enthalten.
Es ist vorteilhaft, dass für verschiedene Typen von Analysen, insbesondere von komplizierteren Gemischen als Aminosäuregemischen, wie sie sich bei Hydrolysaten von Eiweisstoffen und Peptiden ergeben, alternativ andere kleine Kolonnen verwendet werden als die, welche im Prinzip bei der Separierung von einfachen Gemischen basischer Aminosäuren, die lediglich aus den Grundaminosäuren bestehen, verwendet werden.
Die Fig. 3 zeigt schematisch die Möglichkeit des Ersatzes des hydraulischen Mehrwegschalters 7 durch zwei oder mehrere Zweiwegschalter 33, 34 usw. Mittels deren Serienschaltung werden ähnliche Funktionen erreicht wie durch die Anordnung der Fig. 1. So z. B. kann die Leitung 35 entweder an ein druckloses Dosiersystem. wie das System 16 der Fig. 1, oder direkt an einige Behälter 12 bis 15 für die Elutionslösung geschaltet werden. In ähnlicher Weise kann durch die Leitung 36 der Zweiweghahn 34 an einen weiteren Umschalter oder direkt an weitere Behälter der zugehörigen Lösungen angeschlossen werden, In ähnlicher Weise kann auch eine gleiche Funktion gemäss der Fig. 7 für eine kleine Kolonne durch den hydraulischen Mehrwegschalter 32 erreicht werden.
Die Fig. 4 zeigt schematisch eine weitere Detailausführung von zwei Zweiweghähnen 37, 38. die beim Umschalten die Funktion des hydraulischen Schalters 27 gemäss der Fig. 1 ersetzen können.
Die Fig. 5 stellt schematisch denjenigen Teil der üblichen, nichtautomatischen Standardeinrichtungen für die Analyse von Aminosäuregemischen und ähnlichen Stoffen dar, die eine ähnliche Grundfunktion wie die Einrichtung gemäss der in der Fig. 1 dargestellten Erfindung haben. Beim Vergleich beider Schemata gehen deutlich die Unterschiede und Vorteile der Einrichtung gemäss der Erfindung hervor. Die Standardeinrichtung der Fig. 5 enthält die kleine basische Kolonne 40 und zwei grosse Kolonnen 41, 42, die sich in der Funktion des Separierens. Regenerierens und Stabilisierens abwechseln.
Um möglichst gleiche Separierungen auf den beiden Kolonnen 41 und 42 zu erreichen. wird die wichtige Forderung gestellt, dass diese beiden Kolonnen, sowohl was die Geometrie, wie auch die Füllungen anbelangt, identisch sind. was nicht immer leicht erreicht werden kann. Alle drei Kolonnen 40, 41, 42 und eventuell auch weitere Kolonnen in der vorhandenen Einrichtung sind abwechselnd mit Hilfe der von Hand bedienbaren Zweiweghähne 43, 44. l5 gegebenenfalls mit weiteren Hähnen versehen, die entweder an die zur Auswerteeinrichtung führenden Leitungen 46 oder an den Abfall 47 geschaltet sind.
Auf allen Kolonnen 40, 41, 42 werden die Proben mit der Hand mit Hilfe einer Pipette nach der Inbetriebnahme der einzelnen Kolonnen und nach der Beseitigung des Gehaltes der Flüssigkeit durch die lonenaustauschersäule aufgetragen.
Nach weiteren heiklen Prozeduren des Eindrückes der Proben und ihre Reste abspülender Flüssigkeit. die ebenfalls mit einer Pipette auf den Scheitel der Säule aufgetragen wird, werden die einzelnen Kolonnen wieder mit Flüssigkeit ergänzt und mit dem Kugelverschluss 48,49, 50 verschlossen. Die Pumpe 51 drückt während der Funktion der kleinen Kolonne den Puffer aus dem Behälter 52 über den Verschluss 48 in die kleine
Kolonne 40. Die zweite Pumpe 53 drückt verschiedene Puffer aus den Behältern 54, 55 über den Zweiweghahn 56 in eine der beiden grossen Kolonnen 41, 42 über den Verschluss 49, der entweder an die Kolonne 41 oder an die Kolonne 42 angeschaltet wird. Dies ist durch den Doppelpfeil 57 angedeutet.
Während durch eine Kolonne, z. B. 41. der Elutionspuffer in dieser Weise durchgedrückt wird, wird mit der zweiten
Kolonne, z. B. 42, in der gleichen Zeit im längeren Verlauf die
Regenerierlösung und nach ihr der Stabilisierungspuffer aus den Behältern 5X und 59 über den Zweiweghahn 60 eingedrückt mit Hilfe der besonderen Pumpe 61 oder einer anderen den notwendigen Überdruck erzeugenden Einrichtung, wodurch die angeführten Lösungen über den Verschluss 50 gegebenenfalls 49 in die zugehörige Kolonne (42 resp. 41) und dann in den Abfall 47 gedrückt werden.
Bei manchen bekann ten Einrichtungen werden anstelle der Pumpe 61 und des Schalthahns 60 zwei Pumpen oder andere, einen Überdruck in den geschlossenen Behältern 58, 59 hervorrufende Einrichtun gen benützt, wodurch ein Durchfluss dieser Lösung allmählich durch eine der grossen Kolonnen 41, 42 sichergestellt wird, während die andere die Separationsfunktion ausführt.
Wie aus dem Vergleich der Fig. 5 und der Beschreibung der Fig. 1 hervorgeht, ist zu ersehen, dass auch bei nicht automatischer Funktion der Einrichtung gemäss der Fig. 5 diese Einrichtung und ihre Funktion komplizierter sind als das Verfahren und die Einrichtung gemäss der Fig. 1. Letztere kann die Funktion der Separation von Aminosäuregemischen und ähnlichen Stoffen mit wesentlich höherer Effektivität und mit einer Automatisierung in verschiedenen Stufen bis zur totalen Automatisierung durchführen.
Es ist ersichtlich, dass beim Verfahren und der Einrichtung gemäss der Erfindung nicht nur die Zahl der Kolonnen um eine grosse Kolonne, aber auch die Zahl der Pumpen und eventuell der Schaltelemente verkleinert werden kann. Wenn die Funktion einer Einrichtung gemäss der standardisierten Schaltung entsprechend der Fig. 5 automatisiert werden sollte, dann wäre eine unverhältnismässig kompliziertere Automatisiereinrichtung nötig als eine Einrichtung der Fig. 1.
In keinem der Schemata der Fig. 1 bis 5 sind Elemente eingezeichnet, die der Auswertung des Eluats dienen, mit Ausnahme des Reaktors, der Schreibeinrichtung und anderer Teile, die insbesondere eine weitere Pumpe für das Fördern der Auswertereagentien enthalten.