CN109679768A - 用于生产高度纯化的多不饱和脂肪酸的色谱方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从进料混合物中回收第一多不饱和脂肪酸的方法，其中除了所述第一多不饱和脂肪酸以外，所述进料混合物包含至少第二脂肪酸，所述方法包括：‑使用水性有机洗脱剂进行色谱分离的主要步骤并从而收集富集第一多不饱和脂肪酸的第一洗脱剂流和富集第二脂肪酸的第二洗脱剂流；‑使第二洗脱剂流经过浓缩步骤以一方面得到的浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第二洗脱剂流，其中耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比低于第二洗脱剂流的说与有机物之比；‑再循环至少部分的耗尽的洗脱剂流用于色谱分离的主要步骤中。

Description

用于生产高度纯化的多不饱和脂肪酸的色谱方法
技术领域
本发明涉及用于生产高度纯化的多不饱和脂肪酸及其衍生物的色谱方法。
技术背景
这一部分提供了与本发明相关的背景信息，其不一定是现有技术。
脂肪酸(FA)，并更具体是多不饱和脂肪酸(PUFA)及其衍生物是重要的生物化合物，其为细胞壁的组分并且参与多种生物过程，如激素(如前列腺素)合成，其在血小板聚积、炎症、甘油三酯水平降低、免疫应答等中起到作用。
正在开发并商业化日益增加的数量的基于PUFA的药物。一些PUFA具有非常特异性的功能。例如：
-已知花生四烯酸或ARA(C20 6ω3)对于肌肉生长和修复而言是必须的-二十二碳六烯酸或DHA(C22 6ω3)已知特别在脑部发育和神经传导中起到重要作用。
-二十碳五烯酸或EPA(C20 5ω3)已知降低甘油三酯。具体地，一些临床研究已经显示纯EPA降低甘油三酯的水平，而不升高低密度脂蛋白(LDL，也称为“坏”)胆固醇水平。
-二十二碳五烯酸或EPA(C22 5ω3)已知改善心血管健康。
一些其它研究已经显示EPA和DHA的混合物在降低甘油三酯的同时增加LDL。
因此，存在对生产包含EPA并含有不到0.5％DHA，优选不带0.05％DHA，甚至更优选没有可检测水平的DHA的组合物需求。类似地，存在对生产包含DHA且基本不含ARA、或包含ARA且基本不含DHA的组合物的潜在兴趣，并且一般而言存在对生产高度纯化的PUFA的潜在兴趣，其组合物基本排除其它PUFA(或其它FA)以能够基于具有更容易控制的功效和更少副作用的高度纯化的单一PUFA开发并商业化新药。
例如，一般从鱼油、藻类或酵母中纯化EPA。然而，鱼油和其它生物物质也含有大量的脂肪酸，尤其是大量的DHA，其需要从EPA中分离。
可从鱼油纯化DHA，鱼油中需要分离大量的其它脂肪酸包括EPA，在衍生自鱼类的大多数油中其丰度甚至高于DHA。替代地，例如，可从藻类生产DHA，由于藻类中存在相当量的ARA，并且因此需要从ARA中分离DHA。相反，当从藻类来源纯化ARA时，必须从DHA中分离ARA。
生产纯化的PUFA的方法是本领域技术人员熟知的。它们一般包括以下步骤中的一个或多个：水解步骤以将甘油三酯转化为游离脂肪酸，或者甘油三酯酯交换步骤以将脂肪酸转化为烷基酯(优选乙酯)，漂白步骤，尿素分馏步骤，分子蒸馏步骤，色谱步骤等。虽然分子蒸馏是一种广泛使用的富集长链PUFA技术，其不能用于高效彼此分离长链PUFA。此外，PUFA是非常脆的分子，其易于氧化和降解。当加热时，PUFA易于异构化、氧化、过氧化和寡聚化。
色谱过程是富集PUFA的高效手段并可与上述纯化技术中的一种或多种组合。最广泛描述的色谱过程是单根柱色谱过程，包括例如高效液相色谱(HPLC)过程或稳态回收色谱过程，和多柱色谱技术，如模拟移动床(SMB)、VARICOLTM或实际移动床(AMB)过程以及本领域技术人员已知的其它过程。由于PUFA一般以非常复杂的混合物生产，一般需要2或3个色谱步骤来达到高纯度。这些过程中的一些描述于以下文件：US 5,719,302、US 2011/0091947、WO 2011/080503、WO 2013/005048、WO 2013/005051、WO 2013/005052，其各自通过引用全文纳入本文。
在能够同时进行2个色谱步骤的一些SMB或AMB过程中，一个或多个具体含有中间纯度的目标PUFA的流可经再注射到SMB或AMB设备的非相邻柱而不需要浓缩。
大多数色谱过程包括使用反相模式，使用水性有机溶剂。按照极性分离脂肪酸(一般为酯形式)，其中极性更强的脂肪酸比极性更弱的脂肪酸更早洗脱，如本领域技术人员所熟知。
色谱过程的主要缺陷之一是它们导致纯化部分的大量稀释。连续过程如SMB、VARICOLTM和AMB可能优于分批过程如HPLC，因为它们一般产生浓度更高的流，其称为提取物(含有更需要保留的化合物)和萃余液(含有不太需要保留的化合物)。
但是，由色谱分离产生的纯化和废弃部分仍然是非常稀的，因而出于经济和环境上的原因，需要浓缩各收集的流以回收所用的洗脱剂(主要由一种或多种有机溶剂和水组成)并使它们在过程中再循环。
一般而言仍然存在对用有限的溶剂消耗将PUFA纯化至较高纯度的改进方法的需求。
发明内容
这一部分提供了本发明的发明内容，而不是其全部范围或其所有特征的全面公开。具体公开了用于从进料混合物中回收多不饱和脂肪酸的各种实施方式。方法可任选地包括超过一种本文所述的以下方法、步骤或特征的任意一种或任意组合。
本发明具体涉及以下项。
第1项一种从进料混合物中回收第一多不饱和脂肪酸的方法，其中除了所述第一多不饱和脂肪酸以外，所述进料混合物包含至少一种第二脂肪酸，所述方法包括：
-使用水性有机洗脱剂进行色谱分离的主要步骤并从而收集富集第一多不饱和脂肪酸的第一洗脱剂流和富集第二脂肪酸的第二洗脱剂流；
-使第二洗脱剂流经过浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第二洗脱剂流，其中耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比低于第二洗脱剂流的水与有机物之比；
-再循环至少部分的耗尽的第二洗脱剂流用于色谱分离的主要步骤中。
第2项第1项的方法，其中全部的耗尽的第二洗脱剂流再循环并用于色谱分离的主要步骤中。
第3项第1或第2项的方法，其中耗尽的第二洗脱剂流的流速相对于第二洗脱剂流的流速降低，优选相对于第二洗脱剂流的流速降低至少约2％，或至少约5％，或至少约10％，或至少约15％。
第4项第1-3项中任一项的方法，其中，耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比低于(或等于)第二洗脱剂流的水与有机物之比的约0.95倍，优选低于(或等于)第二洗脱剂流的水与有机物之比的约0.9倍、或低于(或等于)约0.8倍、或低于(或等于)约0.7倍、或低于(或等于)约0.6倍、或低于(或等于)约0.5倍、或低于(或等于)约0.4倍、或低于(或等于)约0.3倍、或低于(或等于)约0.2倍、或低于(或等于)约0.1倍。
第5项第1-4项中任一项的方法，该方法包括：
-使第一洗脱剂流经浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第一洗脱剂流，并且
-再循环至少部分、优选全部的耗尽的第一洗脱剂流，优选用于色谱分离的主要步骤中。
第6项第5项的方法，其中耗尽的第一洗脱剂流的流速是第一洗脱剂流的流速的至少90％，优选至少95％，最优选至少98％。
第7项第1-6项中任一项的方法，其包括单个分离步骤，即色谱分离的主要步骤。
第8项第1-6项中任一项的方法，其包括在色谱分离的主要步骤之前的单个预先的分离步骤，所述单个预先的分离步骤优选是预先的色谱分离步骤，其中所述单个预先的色谱分离步骤和色谱分离的主要步骤在相同的色谱单元或不同的色谱单元中进行。
第9项第1-6项中任一项的方法，其在色谱分离的主要步骤之前包括2个预先的分离步骤，其中优选2个预先的分离步骤中的一个是预先的色谱分离步骤，并且更优选2个预先的分离步骤是预先的色谱分离步骤，各预先的色谱分离步骤和色谱分离的主要步骤在相同的色谱单元或不同的色谱单元中进行，并且这2个预先的色谱分离步骤在相同色谱单元或不同色谱单元中进行。
第10项第8或9项的方法，其中部分的耗尽的第二洗脱剂流再循环用于预先的分离步骤。
第11项第1-6或8-9项中任一项的方法，其包括在色谱分离的主要步骤之后的单个额外分离步骤，所述单个额外分离步骤优选是额外的色谱分离步骤，其中所述额外的色谱分离步骤和色谱分离的主要步骤在相同的色谱单元或不同的色谱单元中进行。
第12项第1-6或8-9项中任一项的方法，其在色谱分离的主要步骤之后包括2个额外分离步骤，其中优选2个额外分离步骤中的一个是额外的色谱分离步骤，并且更优选2个额外的分离步骤是额外的色谱分离步骤，各额外的色谱分离步骤和色谱分离的主要步骤在相同的色谱单元或不同的色谱单元中进行，并且这2个额外的色谱分离步骤在相同色谱单元或不同色谱单元中进行。
第13项第1-6项中任一项的方法，该方法基本上由3个或更多个色谱分离步骤，优选3个色谱分离步骤组成(或由其组成)，所述色谱分离步骤在不同的色谱单元或至少部分在相同色谱单元中进行。
第14项第13项的方法，该方法基本上由色谱分离的主要步骤、色谱分离的主要步骤之前进行的预先的色谱分离步骤、以及色谱分离的主要步骤之后进行的额外的色谱分离步骤组成(或由其组成)。
第15项第13项的方法，该方法基本上由2个预先的色谱分离步骤和之后的色谱分离的主要步骤组成(或由其组成)。
第16项第13项的方法，该方法基本上由色谱分离的主要步骤和之后的2个额外的色谱分离步骤组成(或由其组成)。
第17项第1-16项中任一项的方法，其中进料混合物还包含至少第三脂肪酸，并且该方法包括：
-使用水性有机洗脱剂进行色谱分离的二级步骤并从而收集富集第一多不饱和脂肪酸的第三洗脱剂流和富集第三脂肪酸的第四洗脱剂流；
-使第三洗脱剂流经浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第三洗脱剂流，并且然后
-再循环至少部分、优选全部的耗尽的第三洗脱剂流，优选用于色谱分离的二级步骤中；和/或
-使第四洗脱剂流经过浓缩步骤以一方面得到的浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第四洗脱剂流，其中耗尽的第四洗脱剂流的水与有机物之比任选地低于第四洗脱剂流的水与有机物之比；并且然后
-再循环至少部分、优选全部的耗尽的第四洗脱剂流，优选用于色谱分离的二级步骤中。
第18项第17项的方法，其中色谱分离的二级步骤是在色谱分离的主要步骤之前进行的预先的色谱分离步骤；或者其中色谱分离的二级步骤是在色谱分离的主要步骤之后进行的额外的色谱分离步骤。
第19项第17或18项的方法，其中在色谱分离的主要步骤和色谱分离的二级步骤中使用相同的水性有机洗脱剂；或者其中在色谱分离的主要步骤和色谱分离的二级步骤中使用不同的水性有机洗脱剂；并且优选在色谱分离的主要步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比与则色谱分离的二级步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比不同。
第20项第17-19项中任一项的方法，其中进料混合物还包含至少第四脂肪酸，并且该方法包括：
-使用水性有机洗脱剂进行色谱分离的三级步骤并从而收集富集第一多不饱和脂肪酸的第五洗脱剂流和富集第四脂肪酸的第六洗脱剂流；
-使第五洗脱剂流经浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第五洗脱剂流，并且然后
-再循环至少部分、优选全部的耗尽的第五洗脱剂流，优选用于色谱分离的三级步骤中；和/或
-使第六洗脱剂流经过浓缩步骤以一方面得到的浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第六洗脱剂流，其中耗尽的第六洗脱剂流的水与有机物之比任选地低于第四洗脱剂流的水与有机物之比；并且然后
-再循环至少部分、优选全部的耗尽的第六洗脱剂流，优选用于色谱分离的二级步骤中。
第21项第20项的方法，其中色谱分离的三级步骤是在色谱分离的主要步骤之前进行的预先的色谱分离步骤；或者其中色谱分离的三级步骤是在色谱分离的主要步骤之后进行的额外的色谱分离步骤。
第22项第20或21项的方法，其中：
-在色谱分离的主要步骤和色谱分离的三级步骤中使用相同的水性有机洗脱剂；或者其中在色谱分离的主要步骤和色谱分离的三级步骤中使用不同的水性有机洗脱剂；并且优选在色谱分离的主要步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比与则色谱分离的三级步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比不同；和/或
-在色谱分离的二级步骤和色谱分离的三级步骤中使用相同的水性有机洗脱剂；或者其中在色谱分离的二级步骤和色谱分离的三级步骤中使用不同的水性有机洗脱剂；并且优选在色谱分离的二级步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比与则色谱分离的三级步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比不同。
第23项第20-22项中任一项的方法，其中第一多不饱和脂肪酸是二十碳五烯酸，第二脂肪酸是二十二碳六烯酸或十八碳四烯酸，并且第三和第四酯饭馆选自其它的二十二碳六烯酸或十八碳四烯酸、饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸。
第23a项第1-23项中任一项的方法，其包括在色谱分离的主要步骤中再循环和使用之前向耗尽的第二洗脱剂流中添加新鲜的水。
第24项一种从进料混合物中回收第一多不饱和脂肪酸的方法，其中除了所述第一多不饱和脂肪酸以外，所述进料混合物包含至少至少一种第二脂肪酸，所述方法包括：
-使用水性有机洗脱剂进行色谱分离的主要步骤并从而收集富集第一多不饱和脂肪酸的第一洗脱剂流和富集第二脂肪酸的第二洗脱剂流；
-使第二洗脱剂流经浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第二洗脱剂流；
-再循环至少部分的耗尽的第二洗脱剂流用于除了色谱分离的主要步骤以外的其它处理步骤中。
所述其它处理步骤可以是回收第一多不饱和脂肪酸的步骤。替代地，其可以是另一个目的的步骤，如纯化或生产另一种化合物。
按照第24项的优选实施方式，用于另一个处理步骤的至少部分的耗尽的第二洗脱剂流以液体形式使用。优选不以从浓缩步骤中得到的蒸气相的形式直接使用。虽然从耗尽的第二洗脱剂流回收热量可能是第24项中提及的使用的部分，所述用途并不限于热量回收。所述使用优选包括混合至少部分的耗尽的第二洗脱剂流与另一种流或产物或者对至少部分的耗尽的第二洗脱剂流进行化学修饰(如使其经过燃烧)。
第25项第24项的方法，其中耗尽的第二洗脱剂流没有经再循环并用于色谱分离的主要步骤中。
第26项第24或25项的方法，其中至少部分、优选全部的耗尽的第二洗脱剂流经再循环以用作分离一种物质与另一种物质的步骤中的洗脱剂，优选色谱分离一种物质与离那个一种物质，和/或用作染料，和/或用于再生溶剂。
第27项第24-26项中任一项的方法，该方法包括：
-在色谱分离的主要步骤之前，使用相应的水性有机洗脱剂进行一个或多个预先的分离步骤；
-再循环至少部分的耗尽的第二洗脱剂流用于预先的色谱分离步骤中的一个或多个。
第28项第27项的方法，其中，预先的分离步骤中的至少一个是色谱分离步骤，并且优选所有预先的分离步骤都是色谱分离步骤。
第29项第27或28项的方法，其中基本所有的耗尽的第二洗脱剂流再循环用于预先的色谱分离步骤中的一个或多个。
第30项第24-29中任一项的方法，该方法包括在色谱分离的主要步骤之后的至少一个额外的分离步骤，并且优选单个额外的分离步骤，所述额外的分离步骤优选是额外的色谱分离步骤。
第31项第24-30项中任一项的方法，其中部分的耗尽的第二洗脱剂流再循环并用于色谱分离的主要步骤中。
第32项第24-31项中任一项的方法，该方法包括单个预先的分离步骤。
第33项第24-31项中任一项的方法，该方法包括2个预先的分离步骤。
第34项第28-33项中任一项的方法，其中色谱分离的主要步骤和至少一个预先的色谱分离步骤在相同的色谱单元中进行；和/或其中色谱分离的主要步骤和至少一个额外的色谱分离步骤在相同的色谱分离单元中进行；和/或所有预先的色谱分离步骤、所有任选的额外的色谱分离步骤和色谱分离的主要步骤在不同的色谱单元中进行。
第35项第24-34项中任一项的方法，该方法包括：
-使第一洗脱剂流经浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第一洗脱剂流，并且
-再循环至少部分、优选全部的耗尽的第二洗脱流，优选用于过程的分离步骤，更优选用于色谱分离的主要步骤和/或色谱分离的主要步骤之前的至少一个预先的分离步骤。
第36项第35项的方法，其中耗尽的第一洗脱剂流的流速是第一洗脱剂流的流速的至少约95％，优选至少约98％，最优选至少约99％。
第37项第24-36项中任一项的方法，其中进料混合物还包含至少第三脂肪酸，并且该方法包括：
-使用水性有机洗脱剂进行色谱分离的二级步骤并从而收集富集第一多不饱和脂肪酸的第三洗脱剂流和富集第三脂肪酸的第四洗脱剂流；
-使第三洗脱剂流经浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第三洗脱剂流，并且然后
-再循环至少部分、优选全部的耗尽的第三洗脱剂流，优选用于过程的分离步骤中，最优选用于色谱分离的二级步骤中；和/或
-使第四洗脱剂流经浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第四洗脱剂流；并且然后
-再循环至少部分、优选全部的耗尽的第四洗脱剂流，优选用于过程的分离步骤中，最优选用于色谱分离的二级步骤中。
第38项第37项的方法，其中色谱分离的二级步骤是在色谱分离的主要步骤之前进行的预先的色谱分离步骤；或者其中色谱分离的二级步骤是在色谱分离的主要步骤之后进行的额外的色谱分离步骤。
第39项第37或38项的方法，其中在色谱分离的主要步骤和色谱分离的二级步骤中使用相同的水性有机洗脱剂；或者其中在色谱分离的主要步骤和色谱分离的二级步骤中使用不同的水性有机洗脱剂；并且优选在色谱分离的主要步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比与则色谱分离的二级步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比不同。
第40项第37-39项中任一项的方法，其中进料混合物还包含至少第四脂肪酸，并且该方法包括：
-使用水性有机洗脱剂进行色谱分离的三级步骤并从而收集富集第一多不饱和脂肪酸的第五洗脱剂流和富集第四脂肪酸的第六洗脱剂流；
-使第五洗脱剂流经浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第五洗脱剂流，并且然后
-再循环至少部分、优选全部的耗尽的第五洗脱剂流优，选用于过程的分离步骤中，最优选用于色谱分离的三级步骤中；和/或
-使第六洗脱剂流经浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第六洗脱剂流；并且然后
-再循环至少部分、优选全部的耗尽的第六洗脱剂流，优选用于过程的分离步骤中，最优选用于色谱分离的三级步骤中。
第41项第40项的方法，其中色谱分离的三级步骤是在色谱分离的主要步骤之前进行的预先的色谱分离步骤；或者其中色谱分离的三级步骤是在色谱分离的主要步骤之后进行的额外的色谱分离步骤。
第42项第40或41项的方法，其中：
-在色谱分离的主要步骤和色谱分离的三级步骤中使用相同的水性有机洗脱剂；或者其中在色谱分离的主要步骤和色谱分离的三级步骤中使用不同的水性有机洗脱剂；并且优选在色谱分离的主要步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比与则色谱分离的三级步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比不同；和/或
-在色谱分离的二级步骤和色谱分离的三级步骤中使用相同的水性有机洗脱剂；或者其中在色谱分离的二级步骤和色谱分离的三级步骤中使用不同的水性有机洗脱剂；并且优选在色谱分离的二级步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比与则色谱分离的三级步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比不同。
第43项第40-42项中任一项的方法，其中第一多不饱和脂肪酸是二十碳五烯酸，第二脂肪酸是二十二碳六烯酸或十八碳四烯酸，并且第三和第四酯饭馆选自其它的二十二碳六烯酸或十八碳四烯酸、饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸。
第44项一种从进料混合物中回收第一多不饱和脂肪酸的方法，其中除了所述第一多不饱和脂肪酸以外，所述进料混合物包含至少一种第二脂肪酸，所述方法依次包括：
-使用水性有机洗脱剂进行色谱分离的主要步骤并从而收集富集第一多不饱和脂肪酸的第一洗脱剂流和富集第二脂肪酸的第二洗脱剂流；
-使第二洗脱剂流经过浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第二洗脱剂流，其中耗尽的第二洗脱剂流的流速相对于第二洗脱剂流的流速降低；
-再循环至少部分的耗尽的洗脱剂流，用于色谱分离的主要步骤中。
第45项第44项的方法，其中耗尽的第二洗脱剂流的流速相对于第二洗脱剂流的流速降低至少约2％，或至少约5％，或至少约10％，或至少约15％。
第46项第44或45项的方法，其中全部的耗尽的第二洗脱剂流再循环用于色谱分离的主要步骤中。
第47项第44-46项中任一项的方法，其中，耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比低于第二洗脱剂流的水与有机物之比的约0.95倍，优选低于第二洗脱剂流的水与有机物之比的约0.9倍、或低于约0.8倍、或低于约0.7倍、或低于约0.6倍、或低于约0.5倍、或低于约0.4倍、或低于约0.3倍、或低于约0.2倍、或低于约0.1倍。
第48项第44-47项中任一项的方法，该方法包括：
-使第一洗脱剂流经浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第一洗脱剂流，并且
-再循环至少部分、优选全部的耗尽的第一洗脱剂流优选用于色谱分离的主要步骤中。
第49项第48项的方法，其中耗尽的第一洗脱剂流的流速是第一洗脱剂流的流速的至少约90％，优选至少约95％，最优选至少约98％。
第50项第44-49项中任一项的方法，其包括单个分离步骤，即色谱分离的主要步骤。
第51项第44-49项中任一项的方法，其包括在色谱分离的主要步骤之前的单个预先的分离步骤，所述单个预先的分离步骤优选是预先的色谱分离步骤，其中所述单个色谱分离的预先的分离步骤和色谱分离的主要步骤在相同的色谱单元或不同的色谱单元中进行。
第52项第44-49项中任一项的方法，其在色谱分离的主要步骤之前包括2个预先的分离步骤，其中优选2个预先的分离步骤中的一个是预先的色谱分离步骤，并且更优选2个预先的分离步骤是预先的色谱分离步骤，各预先的色谱分离步骤和色谱分离的主要步骤在相同的色谱单元或不同的色谱单元中进行，并且这2个预先的色谱分离步骤在相同色谱单元或不同色谱单元中进行。
第53项第51或52项的方法，其中部分的耗尽的第二洗脱剂流再循环用于预先的分离步骤。
第54项第44-49或51-53项中任一项的方法，其包括在色谱分离的主要步骤之后的单个额外分离步骤，所述单个额外分离步骤优选是额外的色谱分离步骤，其中所述额外的色谱分离步骤和色谱分离的主要步骤在相同的色谱单元或不同的色谱单元中进行。
第55项第44-49或51-53项中任一项的方法，其在色谱分离的主要步骤之后包括2个额外分离步骤，其中优选2个额外分离步骤中的一个是额外的色谱分离步骤，并且更优选2个额外的分离步骤是额外的色谱分离步骤，各额外的色谱分离步骤和色谱分离的主要步骤在相同的色谱单元或不同的色谱单元中进行，并且这2个额外的色谱分离步骤在相同色谱单元或不同色谱单元中进行。
第56项第44-49项中任一项的方法，该方法基本上由3个或更多个色谱分离步骤组成(或由其组成)，优选3个色谱分离步骤，所述色谱分离步骤在不同的色谱单元或至少部分在相同色谱单元中进行。
第57项第56项的方法，该方法基本上由色谱分离的主要步骤、色谱分离的主要步骤之前进行的预先的色谱分离步骤、以及色谱分离的主要步
骤之后进行的额外的色谱分离步骤组成(或由其组成)。
第58项第56项的方法，该方法基本上由2个预先的色谱分离步骤和之后的色谱分离的主要步骤组成(或由其组成)。
第59项第56项的方法，该方法基本上由色谱分离的主要步骤和之后的2个额外的色谱分离步骤组成(或由其组成)。
第60项第44-59项中任一项的方法，其中进料混合物还包含至少第三脂肪酸，并且该方法包括：
-使用水性有机洗脱剂进行色谱分离的二级步骤并从而收集富集第一多不饱和脂肪酸的第三洗脱剂流和富集第三脂肪酸的第四洗脱剂流；
-使第三洗脱剂流经浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第三洗脱剂流，并且然后
-再循环至少部分、优选全部的耗尽的第三洗脱剂流优选，用于色谱分离的二级步骤中；和/或
-使第四洗脱剂流经过浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第四洗脱剂流，其中耗尽的第四洗脱剂流的流速相对于第四洗脱剂流的流速任选降低；并且然后
-再循环至少部分、优选全部的耗尽的第四洗脱剂流，优选用于色谱分离的二级步骤中。
第61项第60项的方法，其中色谱分离的二级步骤是在色谱分离的主要步骤之前进行的预先的色谱分离步骤；或者其中色谱分离的二级步骤是在色谱分离的主要步骤之后进行的额外的色谱分离步骤。
第62项第60或61项的方法，其中在色谱分离的主要步骤和色谱分离的二级步骤中使用相同的水性有机洗脱剂；或者其中在色谱分离的主要步骤和色谱分离的二级步骤中使用不同的水性有机洗脱剂；并且优选在色谱分离的主要步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比与则色谱分离的二级步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比不同。
第63项第60-62项中任一项的方法，其中进料混合物还包含至少第四脂肪酸，并且该方法包括：
-使用水性有机洗脱剂进行色谱分离的三级步骤并从而收集富集第一多不饱和脂肪酸的第五洗脱剂流和富集第四脂肪酸的第六洗脱剂流；
-使第五洗脱剂流经浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第五洗脱剂流，并且然后
-再循环至少部分、优选全部的耗尽的第五洗脱剂流，优选用于色谱分离的三级步骤中；和/或
-使第六洗脱剂流经过浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第六洗脱剂流，其中耗尽的第六洗脱剂流的流速相对于第四洗脱剂流的流速任选降低；并且然后
-再循环至少部分、优选全部的耗尽的第六洗脱剂流，优选用于色谱分离的二级步骤中。
第64项第63项的方法，其中色谱分离的三级步骤是在色谱分离的主要步骤之前进行的预先的色谱分离步骤；或者其中色谱分离的三级步骤是在色谱分离的主要步骤之后进行的额外的色谱分离步骤。
第65项第63或64项的方法，其中：
-在色谱分离的主要步骤和色谱分离的三级步骤中使用相同的水性有机洗脱剂；或者其中在色谱分离的主要步骤和色谱分离的三级步骤中使用不同的水性有机洗脱剂；并且优选在色谱分离的主要步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比与则色谱分离的三级步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比不同；和/或
-在色谱分离的二级步骤和色谱分离的三级步骤中使用相同的水性有机洗脱剂；或者其中在色谱分离的二级步骤和色谱分离的三级步骤中使用不同的水性有机洗脱剂；并且优选在色谱分离的二级步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比与则色谱分离的三级步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物之比不同。
第66项第63-65项中任一项的方法，其中第一多不饱和脂肪酸是二十碳五烯酸，第二脂肪酸是二十二碳六烯酸或十八碳四烯酸，并且第三和第四酯饭馆选自其它的二十二碳六烯酸或十八碳四烯酸、饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸。
第67项前述项中任一项的方法，其中在膜过量设备、蒸发器、精馏柱、蒸馏柱、液-液萃取器或这些设备的组合中进行各浓缩步骤。
第68项前述项中任一项的方法，其中在方法结束时，以组合物回收所述第一多不饱和脂肪酸，所述组合物含有相对于组合物中脂肪酸总重量的低于约1重量％、优选低于约0.5重量％或低于约0.1重量％或低于约0.05重量％或低于约0.03重量％或低于约0.01重量％的第二脂肪酸。
第69项前述项中任一项的方法，其中第一多不饱和脂肪酸是二十碳五烯酸，第二脂肪酸是二十二碳六烯酸。
第70项前述项中任一项的方法，其中第一多不饱和脂肪酸是二十二碳六烯酸，第二脂肪酸是二十碳五烯酸。
第71项前述项中任一项的方法，其中第一多不饱和脂肪酸是二十碳五烯酸，第二脂肪酸是十八碳四烯酸。
第72项前述项中任一项的方法，其中第一多不饱和脂肪酸是二十二碳五烯酸，第二脂肪酸是二十二碳六烯酸。
第73项前述项中任一项的方法，其中第一多不饱和脂肪酸是二十二碳六烯酸，第二脂肪酸是二十二碳五烯酸。
第74项前述项中任一项的方法，其中第一多不饱和脂肪酸是花生四烯酸，第二脂肪酸是二十二碳六烯酸。
第75项前述项中任一项的方法，其中第一多不饱和脂肪酸是二十二碳六烯酸，第二脂肪酸是花生四烯酸。
第76项前述项中任一项的方法，其中进料混合物衍生自鱼类、藻类和/或酵母，优选鱼类。
第77项前述项中任一项的方法，该方法是连续方法。
第78项前述项中任一项的方法，其中至少色谱分离的主要步骤，优选所有色谱分离步骤是模拟移动床或实际移动床色谱分离。
第79项一种从进料混合物中回收第一多不饱和脂肪酸的方法，其中除了所述第一多不饱和脂肪酸以外，所述进料混合物包含至少至少一种第二脂肪酸，所述方法包括：
-使用水性有机洗脱剂进行色谱分离的主要步骤并从而收集富集第一多不饱和脂肪酸的第一洗脱剂流和富集第二脂肪酸的第二洗脱剂流；
其中，回收至少部分的第二洗脱剂流用作染料。
第80项第79项的方法，该方法还具有第25-43或67-78项中任一项的特征(除了在第25-43或67-78项中的表述“耗尽的第二洗脱剂流”应被“第二洗脱剂流”代替)。
应注意到，当采用用过的洗脱剂再利用为燃料(如按照第79项)时，浓缩步骤仅仅是任选的。根据第二洗脱剂的组合物，采用部分或全部的第二洗脱剂流直接(没有任何其它浓缩或加工)用作燃料。
因此，按照一个实施方式，提供了用于从进料混合物中回收第一多不饱和脂肪酸的方法，该进料混合物包含第一多不饱和脂肪酸和除了第一多不饱和脂肪酸以外的至少第二脂肪酸。该方法包括使用水性有机洗脱剂进行色谱分离的主要步骤并从而收集富集第一多不饱和脂肪酸的第一洗脱剂流和富集第二脂肪酸的第二洗脱剂流。该方法还可包括在没有任何之前的浓缩步骤下再循环至少部分的第二洗脱流用作燃料。
本发明能够克服现有技术的缺陷。具体地，本发明提供了用有限的溶剂消耗纯化PUFA至较高纯度的改进方法(如用于纯化非常纯的DHA或非常纯的EPA)。
在某些方面中，本发明依赖于令人惊讶的发现，即在含通过色谱分离从起始PUFA流中分离的不需要的FA(并且尤其是不需要的PUFA)的色谱部分的浓缩期间(其通常涉及洗脱剂蒸发)，该不需要的FA的较小但是难以忽略的量被夹带到再循环的洗脱剂中，从而污染所述再循环的洗脱剂。结果，不需要的FA可污染含有需要PUFA的色谱流，从而阻碍达到终端产品中不需要的FA(尤其是不需要的PUFA)的目标规格。
由于FA具有非常高的沸点，在浓缩阶段中所述FA夹带到蒸气相是特别意外的。发明人已经鉴定FA(特别是PUFA)特别被水有机洗脱剂的水组分夹带。
在某些方面中，本发明的目的是降低或防止再循环洗脱剂后不希望的FA对希望的PUFA的污染。
提供了2种类似解决方案来实现该目的，两种解决方案都聚焦于如何处理从含有至少一种不需要的FA的从色谱单元收集的流中回收洗脱剂：
-第一解决方案包括在将洗脱剂再循环到色谱单元之前调节包含不需要的FA的流的浓缩阶段，以减少或防止所述不需要的FA夹带到收集的洗脱液中。更具体地，进行调节使得再循环的洗脱液的水与有机物之比在浓缩阶段降低(相对于从色谱单元收集的流的水与有机物之比)。
-第二解决方案包括不将(或不完全将)洗脱剂再循环到从中收集所述洗脱剂的色谱单元中，而是采用再循环洗脱剂并将其用于其它目的，并且例如再循环到另一个分离单元中，其位于从中收集洗脱剂的色谱单元的上游。按照这种第二解决方案，不采取任何特定的步骤来避免浓缩阶段中再循环的洗脱剂夹带一些不需要的FA，但是以一定方式在方法中使用再循环的洗脱剂使得所述色谱单元中没有不需要的FA累积。
附图的简要说明
图1显示了色谱步骤与蒸发和溶剂再循环方式偶联的实施例。
图2显示了使用具有强迫循环的降膜式蒸发器实施色谱流蒸发的一个
实施例
图3显示了实施色谱流浓缩的一个实施例，其中蒸发流之一用于蒸发第二流并降低总能耗。
图4显示了实施色谱流蒸发的一个实施例，其包括蒸发阶段和反萃取阶段。
图5显示了实施色谱流浓缩的一个实施例，其包括蒸馏阶段。
图6显示了实施色谱流浓缩的一个实施例，其包括纳米过滤阶段。
图7显示了实施色谱流浓缩的一个实施例，其包括2个连续的纳米过滤阶段。
图8显示了实施色谱流浓缩的一个实施例，其包括液-液萃取步骤，能够从残留水中分离浓缩的脂肪酸。
图9显示了实施色谱流浓缩的一个实施例，其包括蒸发阶段和纳米过滤阶段。
图10显示了实施色谱流浓缩，降低总能耗的一个实施例，其包括蒸发阶段和纳米过滤阶段。
图11显示了实施本发明的第一解决方案的实施例。
图12显示了实施本发明的第二解决方案的实施例。
图13显示了实施本发明的第二解决方案的另一个实施例。
具体实施方式描述
在以下说明书中，将更详细地描述本发明，而不构成限制。除非另有说明，所有浓度和比例以重量计。
尽管在本文中用术语第一、第二、第三等描述各种元件、部件、部分等，但是这些元件、部件、部分等不应受到这些术语的限制。这些术语仅用于区分一个元件、部件、部分等与其它元件、部件、部分等。本文使用的术语如“第一”、“第二”和其它数字术语并不提示顺序或次序，除非上下文另有明确说明。因此，下述的第一元件、部件、部分等可被称为第二元件、部件、部分等而不偏离示例性实施方式的教导。
纯化方法概述
该部分中提供的说明同时应用于本发明的第一解决方案和第二解决方案。
本发明的方式是用于从进料混合物中回收第一(所需)PUFA的方法。进料混合物还包含至少第二(不需要的)FA(优选是第二不需要的PUFA)，并且优选包含多种其它(不需要的)FA，如饱和或单不饱和脂肪酸和其它PUFA以及潜在的其他杂质。
进料混合物可以是来自鱼类、藻类和/或酵母，优选来自鱼类的脂肪酸的混合物。其可以是原料，例如鱼油或藻类油。其也可以是衍生自上述原料的产品，并且例如衍生自鱼油、藻类油和/或酵母油。“衍生自原料的产品”表示已经过一个或多个处理步骤的原料。所述处理步骤可包括一个或多个分离或纯化步骤(如分馏)、和/或水解步骤以将甘油三酯转化成游离脂肪酸、和/或甘油三酯酯交换步骤以将游离脂肪酸转化成烷基酯(优选乙酯)、和/或漂白步骤、和/或尿素分馏步骤、和/或分子蒸馏步骤、和/或一个或多个色谱步骤等。
优选地，进料混合物是已经酯化或酯交换的产物，如酯交换的鱼油、藻类油和/或酵母油。
因此，本发明的方法中获得或使用的各脂肪酸(并且尤其是各PUFA)可以是脂肪酸衍生物，特别是甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、酯、磷脂、酰胺、内酯或盐的形式。优选甘油三酯和酯。更优选酯。酯一般是烷基酯，优选C1-C6烷基酯，更优选C1-C4烷基酯。酯的示例包括甲酯和乙酯。最优选乙酯。
本发明的方法包括色谱分离的一个主要步骤。
上述表达中的术语“主要”仅用于在形式上区分关键的色谱分离与方法中的其它潜在分离步骤(本申请中其也称为预先的分离步骤，额外的分离步骤或二级或三级分离步骤)。这并不必然表示关键的色谱分离更重要，或占纯化方法的更大部分，或具有比方法的其它潜在分离步骤更高的通量。
在本发明的上下文中，色谱分离包括分离液相中夹带的物质，这是由于这些物质的一些与吸收床的不同相互作用。
色谱分离可以是连续、半连续或分批分离。
在色谱单元中进行本申请中提及的色谱分离的各步骤。用于进行色谱分离的主要步骤的色谱单元称为主要色谱单元。
术语“色谱单元”是指单柱色谱系统或多柱色谱系统。
单柱色谱系统的示例包括HPLC或CYCLOJETTM(也称为稳态回收)系统。多柱色谱系统的示例包括SMB、iSMB、AMB、VARICOLTM、MODICONTM、POWERFEEDTM、DCC、MCSGP或GSSR(多柱梯度色谱)系统。
CYCLOJETTM系统描述于文件US 6,063,284，其通过引用全文纳入本文。其是单柱不连续色谱分离系统，其中在柱的出口处收集分离的(i)更需要保留的，然后(ii)不太需要保留的物质，色谱的未分离部分通过主泵再循环。通过基本位于色谱的再循环部分中的注射环的方式来周期性注射待分离的混合物。注射环优选在主泵和柱之间连接(或位于中间)。在几次色谱循环之后，该方法达到周期性稳态，其中注射的产品的量等于在柱子出口出分开收集的分离产品的量。
按照一个实施方式，这种用稳态再循环进行的单柱稳态床系统中的色谱分离是环形的并包括以下步骤：
-通过洗脱泵的方式建立并维持循环的色谱形状(profile)；
-在各循环处不连续地向所述循环形状的内部注射包含至少2种待分离组分的样品，所述注射通过由注射阀控制在注射位置的注射环来进行，以将环中的样品注射到所述循环形状的内部，所述注射阀优选从注射时候直到所有概况流出柱时保持在注射位置上，并且优选当全部形状在柱子上时候将注射阀调节到加载位置以加载注射环，并且
-不连续并周期性地从所述循环形状中收集至少2种富集的部分。
这种分离还可包括以下步骤：
-在单次循环期间(优选部分收集期间，同时在再循环循环其余的洗脱剂期间)，通过洗脱剂泵将作为流动相的洗脱剂基本连续泵送到柱中。
这种分离还可包括以下步骤：
-相对于在开始收集第一部分之后发生事件的时间参考下一次开始所述收集第一部分的事件；
-在收集第三部分期间停止洗脱剂泵，这种停止持续直至循环结束，从而提供相对于时间可重复的循环。
按照一个实施方式，在向所述维持的循环概况上注射期间，没有发生循环概况的损失。
该系统的详细实施方式描述于上述US 6,063,284的第5栏1.36到第10栏1.41。
在文件US 5,630,943中描述了基于2个柱的CYCLOJETTM系统的变体，其通过引用纳入本文。
SMB系统由多个单独的含有吸收剂的串联在一起的柱组成。洗脱剂以第一方向通过柱。通过一系列阀的方式周期性并同时转换进料和洗脱剂的注射点，和系统中分开的组分收集点。总体效果是为了模拟含有固体吸收剂的移动床的单根柱的运行，固体吸收剂以洗脱剂流的反向移动。因此，由柱组成的SMB系统作为一个常规固定床系统，含有洗脱剂从中通过的固体吸收剂固定床，但是在SMB系统中，操作是为了模拟连续逆流移动床。
SMB系统的最常规形式是四区域SMB系统。其它形式是3区域SMB系统和2区域SMB系统(如Kwangnam Lee的文章《两区域模拟的移动床方法》(Two Section Simulated MovingBed Process),Separation Science and Technology 35(4):519-534,2000所述，通过引用全文纳入本文)。
iSMB系统在文件EP 0342629和US 5,064,539中描述，其通过引用全文纳入本文。在iSMB系统中，存在一个步骤，其中系统以封闭环运行，而没有任何材料的输入/输出。
SMB系统的其它变体是：随时间变化的SMB系统和POWERFEEDTM系统，如文件US 5,102,553和Zhang等的文章《模拟的移动床单元的自动进料：转换间隔期间改变流速》(PowerFeed operation of simulated moving bed units:changing flow-rates duringthe switching interval),Journal of Chromatography A,1006:87-99,2003，其通过引用全文纳入本文；和具有内部再循环的SMB系统，如文件US 8,282,831所述，其通过引用全文纳入本文。
AMB系统在操作上与SMB系统相似。然而，不同于转换进料混合物和洗脱剂的注射点和通过阀系统的方式分开的组分收集点，一系列吸收单元(即柱)相对于进料和抽出点物理移动。同时，操作是为了模拟连续逆流移动床。
在文件US 6,136,198、US 6,375,839、US 6,413,419和US 6,712,973中描述了VARICOLTM色谱系统，其通过引用全文纳入本文。VARICOLTM系统由多个单独的含有吸收剂的串联在一起的柱组成。洗脱剂以第一方向通过柱。与SMB系统相反，通过一系列阀的方式周期性但异步转换进料和洗脱剂的注射点，和系统中分开的组分收集点。总体效果是为了随着时间产生长度变化的分离区，从而动态分配这些最需要分配的区域中的固定相，并且因此使得类似的分离能量有较少的色谱单元和增加的生产率。与SMB系统相反，VARICOLTM系统并不模拟含有固体吸收剂的移动床的单柱运行，该固体吸收剂以洗脱剂的逆流方向移动，并且因此不可在等效的AMB系统中实现VARICOLTM工作原理。
如文件FR 2889077描述DCC色谱系统，其通过引用纳入本文。DCC系统是具有移动相和进料注射点的周期性转换连续过程，其特征在于总是以开放环运行。其利用2根或更多柱。
本发明的方法可包括单个分离步骤，其是色谱分离的上述主要步骤。
替代地，本发明的方法中可存在2个分离步骤(总共)，即前述的色谱分离的主要步骤加上另一个分离步骤。按照一个实施方式，可在前述的色谱分离的主要步骤之前进行其它分离步骤：其然后可称为预先的分离步骤。按照另一个实施方式，可在前述的色谱分离的主要步骤之后进行其它分离步骤：其然后可称为额外的分离步骤。
替代地，本发明的方法中可存在3个分离步骤(总共)，即前述的色谱分离的主要步骤加上2个其它分离步骤。按照一个实施方式，该方法包括以下的连续步骤：(i)预先的分离步骤，(ii)另一个预先的分离步骤，和(iii)前述的色谱分离的主要步骤。按照另一个实施方式，该方法包括以下的连续步骤：(i)预先的分离步骤，(ii)前述的色谱分离的主要步骤，和(iii)额外的分离步骤。按照另一个实施方式，该方法包括以下的连续步骤：(i)前述的色谱分离的主要步骤，(ii)额外的分离步骤，和(iii)另一个额外的分离步骤。
替代地，在本发明的方法中存在4个分离步骤(总共)，或超过4个分离步骤，一个分离步骤是前述的色谱分离的主要步骤，并且其它分离步骤是预先的分离步骤(在前述的色谱分离的主要步骤之前)或额外的分离步骤(在前述的色谱分离的主要步骤之后)。
在分离单元中进行各步分离。在所谓的相应预先的分离单元中进行预先的分离步骤，并且在所谓的额外分离单元中进行额外的分离步骤。
各预先的分离步骤和各额外的分离步骤可以是(与其它分离步骤独立)如上所述的相同类型的色谱分离－这种情况中的预先的分离单元或额外的分离单元是如上所述的色谱单元。
替代地，各预先的分离步骤和各额外的分离步骤可以是(与其它分离步骤独立)非色谱分离步骤，例如分子蒸馏的步骤。
按照一个实施方式，该方法包括2个(且仅2个)连续分离步骤，其可以是AMB、SMB或VARICOLTM分离步骤(这2个步骤之一是前述的色谱分离的主要步骤)。
按照另一个实施方式，该方法包括3个(且仅3个)连续分离步骤，其可以是AMB、SMB或VARICOLTM分离步骤(这2个步骤之一是前述的色谱分离的主要步骤)。
按照一个实施方式，该方法包括3个(且仅3个)连续分离步骤，即(预先的)VARICOLTM分离步骤，之后是前述的色谱分离的主要步骤(其可以是例如CYCLOJETTM分离步骤或HPLC分离步骤)，之后是(额外的)VARICOLTM分离步骤。
按照另一个实施方式，该方法包括3个(且仅3个)连续分离步骤，即(预先的)VARICOLTM分离步骤，之后是前述的色谱分离的主要步骤(其可以是例如CYCLOJETTM分离步骤或HPLC分离步骤)，之后是(额外的)CYCLOJETTM或HPLC分离步骤。
当该方法包括2个或更多个分离步骤时，可通过不同的分离单元同时进行所述步骤，或者它们可通过使用不同的分离单元或通过使用相同的分离单元连续进行。另外，在2个分离步骤是在SMB或AMB系统中进行的色谱步骤的情况中，可能在相同的SMB或AMB系统上同时进行这些步骤。这种在相同设备上同时进行的示例描述于文件WO 2011/080503，其通过引用纳入本文。
因此，用于实施上述分离步骤的分离单元中的一些可以相同。例如，主要的色谱单元和一个预先的分离单元可以是同一个单元；和/或主要的色谱多纳元和一个额外的色谱单元可以是同一个单元；和/或预先的分离单元和另一个预先的分离单元可以是同一个单元；和/或一个预先的分离单元和一个额外的分离单元可以是同一个单元；和/或一个额外的分离单元和另一个额外的分离单元可以是同一个单元。
替代地，所有的分离单元(包括主要色谱单元)可以不同。
可在逆向上进行各色谱分离步骤(包括色谱分离的主要步骤)。例如，可利用由基于弱极性树脂的吸收剂或基于二氧化硅的有机残基如烷基(特别是C4、C8、C18、C24、C30)、苯基或其它本领域技术人员确定的合适残基化学改性的固定相。
使用水有机洗脱剂来进行色谱分离的主要步骤。水有机洗脱剂是一种有机溶剂或几种有机溶剂和水的混合物。
优选地，如果方法中存在其它的色谱分离步骤，它们也可使用相应的水有机洗脱剂进行。替代地，使用基本纯的有机溶剂或基本纯的有机溶剂混合物来进行其它色谱分离步骤。
可用于本发明的有机溶剂(特别是形成水有机洗脱剂)是例如醇类如乙醇、丙醇、异丙醇和更优选的甲醇；酮类如丙酮或甲基乙基酮；腈类如乙腈；酯类如乙酸甲酯或乙酸乙酯；呋喃类如四氢呋喃；醚类如、二乙醚或甲乙醚；和上述两种或更多种的组合。优选的有机溶剂是甲醇和丙酮。
各水有机洗脱剂的特征在于水与有机物之比，其是洗脱剂的水组分相对于有机溶剂组分的重量比。
各水有机洗脱剂的水与有机物之比优选在0.01:99.99至30:70中变化，更优选在5:95至25:75中变化。
当方法中存在至少2个色谱分离步骤时，可使用具有相同组成或不同组成的洗脱剂来进行色谱分离。优选使用具有不同组成的洗脱剂，并且特别是具有不同的水与有机物之比的洗脱剂，因为这使得其可能在各分离步骤中调节洗脱剂的洗脱力并因此实现在各步骤对不同化合物的分离。也可优选在不同步骤中使用由不同有机溶剂组成的洗脱剂，因为这使得可能在各分离步骤处调节某些待分离物质之间的色谱选择性并因此实现各步骤处对不同化合物的分离。
按照特定实施方式，控制或调节各洗脱剂中有机溶剂的重量浓度到目标值，精度至少2％、或1％、或0.5％、或0.2％、或0.1％。这特别应用于第1-80项中所示的所有实施方式。这可通过使用水和/或有机溶剂组成和/或通过调节本文所述的洗脱剂浓度和再循环的参数来实施。
本发明的方法得到的最终产品含有纯化的第一PUFA和残留的杂质。最终产品中第一PUFA的量可以例如大于或等于约80％，优选大于或等于约90％，或大于或等于约95％，或大于或等于约97％，或大于或等于约98％，或大于或等于约99％(相对于脂肪酸的总量)。
具体地，最终产品可含有大于或等于约80％，或大于或等于约95％，或大于或等于约97％，或大于或等于约98％，或大于或等于约99％(相对于脂肪酸的总量)的量的EPA；以及小于或等于约1％，或小于或等于约0.1％，或小于或等于约0.05％，或小于或等于约0.03％，或小于或等于约0.01％的量的DHA。
可向该最终产品中加入稳定剂，如生育酚等。术语“稳定剂”包括稳定剂化合物的混合物。
洗脱剂的浓缩和再循环
该部分中提供的说明同时应用于本发明的第一解决方案和第二解决方案。
在主要的色谱单元的出口，收集至少2条流，即富集第一(需要的)PUFA的第一洗脱剂流和富集第二(不需要的)FA的第二洗脱剂流。例如，第一流可以是萃余液且第二流可以是提取物，反之亦然。
本发明的方法包括至少一个浓缩步骤，其在浓缩单元中对第二流进行。这一浓缩步骤一方面提供了浓缩的FA流，并且另一方面提供了耗尽的第二洗脱剂流。术语“耗尽的”是指已经从洗脱剂中基本除去第二FA(和任何其它脂肪酸)。也应理解表述“浓缩FA流”是指包含比浓缩步骤前的第二洗脱剂流高的浓度的FA，尤其是第二FA的组合物。该组合物可包含其它脂肪酸，并且尤其是其它不需要的脂肪酸以及一些水和/或溶剂。
然后在该方法中以下文详述的方式再循环耗尽的第二洗脱剂流。
可通过参考图1的通用方案来更好地理解色谱分离的主要步骤之后的浓缩和再循环阶段的一般原理(相同的原理也将应用于在其它色谱分离步骤，如预先的或额外的色谱分离步骤之后进行的浓缩和再循环阶段，如果存在这类浓缩和再循环阶段)。
通过进入的洗脱剂流1并通过进入的进料流2来进料主要色谱单元3。进料流2可以是(初始)进料混合物流，如果色谱分离的主要步骤是该方法的第一步骤；或者，如果已经进行了一个或多个处理步骤，如分离步骤，则进料流2可以是中间产物流。
在主要的色谱单元3的出口处，收集富集第一PUFA的第一洗脱剂流4和富集第二FA的第二洗脱剂流5。
向第一浓缩单元6中进料富集第一PUFA的第一洗脱剂流4，同时向第二浓缩单元7中进料富集第二FA的第二洗脱剂流5。
在各浓缩单元6、7中，蒸发洗脱剂然后冷凝；因此其基本与所有脂肪酸分离。因此，在第一浓缩单元6的出口处得到浓缩的FA的流9(具体含有浓缩形式的第一PUFA)而在第二浓缩单元7的出口处得到浓缩FA的另一条流8(具体含有浓缩形式的第二FA)。同时，在第一浓缩单元6的出口处回收耗尽的第一洗脱剂流11(即，耗尽第一PUFA和其它FA)，并且在第二浓缩单元7的出口处回收耗尽的第二洗脱剂流10(即，耗尽第二FA和其它FA)。
任选地，耗尽的第一洗脱剂流11可部分或全部再循环到主要的色谱单元3中或方法中使用的任意其它分离单元。不存在这第一耗尽的洗脱剂流的污染的问题，因为，如果流被任何残留PUFA污染，其将主要是第一(需要的)PUFA，，这不会对最终产品(纯化形式的PUFA)的纯度造成负面影响。
也可部分或完全再循环耗尽的第二洗脱剂流10。然而，在这些情况中，按照本发明，为了避免由于夹带到耗尽的第二洗脱剂流的一些残留第二(不需要的)FA对最终产品(纯化形式的第一PUFA)的纯度的负面影响而采取特定步骤。将如下详述这些特定步骤。
用于进行任何浓缩步骤的浓缩单元可以是，例如，具有强制再循环的降膜蒸发器，或者另一种本领域已知的蒸发器类型，使得能够蒸发洗脱剂组分并在装置的底部留下浓缩的脂肪酸。
参考图2，按照一个实施方式，浓缩单元包含具有强制再循环的多管蒸发器11，其连接到相分离器13和冷凝器12。待浓缩的洗脱剂流14进料到蒸发器11中。受热的流离开蒸发器11并进入相分离器13。在相分离器的出口处，回收浓缩的FA的流15，并且收集蒸发的洗脱剂并通向冷凝器12。洗脱剂蒸气在冷凝器12中冷凝成液体形式。在冷凝器12的出口处，通过回收管线16收集耗尽的洗脱剂流。
可用本领域已知的方式来实施蒸发技术以优化能量消耗水平，如使用两种或更多种作用、蒸气再压缩技术、或例如使用蒸发的色谱流作为另一色谱流的加热流体。
例如，参见图3。在此，偶联2个浓缩单元，例如，一个用于处理第一洗脱剂流而另一个用于处理第二洗脱剂流(其可以例如与上述定义的第一洗脱剂流和第二洗脱剂流相同，反之亦然)。第一浓缩单元包含与第一相分离器22和第一浓缩器23连接的第一蒸发器21。第一洗脱剂流26进料到第一蒸发器21中。在第一相分离器22的出口处回收浓缩的脂肪酸流27。也在第一相分离器22的出口处回收蒸发相并通向第一冷凝器23。
第二浓缩单元包含第二蒸发器23，其是与第一冷凝器23相同的装置。第二蒸发器23连接到第二相分离器24和第二冷凝器25。第二洗脱剂流28进料到第二蒸发器23中。由于来自第一浓缩单元的蒸气相的冷凝，第二洗脱剂流28的蒸发(至少部分)受到影响。在第二相分离器24的出口处回收浓缩的脂肪酸流29。也在第二相分离器24的出口处回收蒸发相并通向第二冷凝器25。
分别在第一冷凝器23的出口和第二冷凝器25的出口处回收一条或两条耗尽的洗脱剂流30。
按照一个实施方式，具有强制循环的蒸发器可与分批或连续反萃取柱偶联以去除浓缩的脂肪酸流中的残留洗脱剂。例如，参考图4，浓缩单元可包含一方面与冷凝器32偶联并且另一方面与反萃取柱33偶联的蒸发器31。洗脱剂流38进料到蒸发器31中。在蒸发器31中生成的蒸发相通向冷凝器32，并且在冷凝器32的出口处回收耗尽的洗脱剂流37。蒸发器31中生成的液相通向反萃取柱33。气流34(如氮气流)也进料到反萃取柱33。在反萃取柱33的各出口处收集含残留洗脱剂蒸气的气流35和凝缩脂肪酸流36。
浓缩步骤也可包含蒸馏步骤，其中浓缩单元包含至少一根蒸馏柱。例如，参考图5，浓缩单元可包含与冷凝器42偶联的蒸馏柱41。洗脱剂流43进料到蒸馏柱中。在柱顶部回收蒸气相并通向冷凝器42。在冷凝器42的出口处收集耗尽的洗脱剂流44。在蒸馏柱41的底部收集浓缩的脂肪酸流45。
浓缩步骤也可包括膜过滤步骤，如纳米过滤步骤。例如，参考图6，浓缩单元可包括纳米过滤系统51。洗脱剂流52进料到纳米过滤系统51中。回收耗尽的洗脱剂流54作为渗透流。部分的滞留物流再循环到纳米过滤系统51中并且其部分以浓缩的脂肪酸流53回收。
也可能使用串联的2个膜过滤步骤。例如，参考图7，浓缩单元可包含第一纳米过滤系统61和第二纳米过滤系统62。洗脱剂流63进料到第一纳米过滤系统61中。部分的来自第一纳米过滤系统61的滞留物流再循环到第一纳米过滤系统61中并且其部分以浓缩的脂肪酸流64回收。来自第一纳米过滤系统61的渗透流与来自第二纳米过滤系统62的滞留物流混合。部分的这种混合流进料到第二纳米过滤系统62中并且其部分与来自第一纳米过滤系统61的滞留物流混合。最后，回收作为来自第二纳米过滤系统62的滞留物流的耗尽的洗脱剂流65。
也可能在浓缩单元中提供液-液萃取器。例如，参考图8，浓缩单元可包含与冷凝器72和液-液萃取器偶联的蒸发器71。洗脱剂流74进料到蒸发器71中。来自蒸发器71的蒸发相通向冷凝器72。在冷凝器72的出口处收集耗尽的洗脱剂流75。来自蒸发器71的液相部分再循环到蒸发器71中并部分通向液-液萃取器73。在液-液萃取器73的一个出口处回收浓缩的脂肪酸流76，并且在液-液萃取器73的另一个出口处回收残留水流77。在一个替代实施方式中，可用蒸馏柱代替蒸发器71。
也可能将膜过滤，如纳米过滤的步骤与蒸发步骤偶联。例如，参考图9，浓缩单元可包含与冷凝器82和纳米过滤系统83偶联的蒸发器81。洗脱剂流84进料到纳米过滤系统83中。浓缩的脂肪酸流85作为来自纳米过滤系统83的滞留物的一部分进行回收。其它部分的来自纳米过滤系统83的滞留物再循环到纳米过滤系统83中。来自纳米过滤系统83的滞留物通向蒸发器81。来自蒸发器81的蒸发相通向冷凝器82。在冷凝器82的出口处收集耗尽的洗脱剂流86。部分的来自蒸发器81的液相再循环到蒸发器81中，并且部分的来自蒸发器81的液相与来自纳米过滤系统83的滞留物流混合。
在另一个示例中，参考图10，浓缩单元可包含与冷凝器93和纳米过滤系统92偶联的蒸发器91。洗脱剂流94进料到纳米过滤系统92中。回收作为来自纳米过滤系统92的滞留物流的耗尽的洗脱剂流95。部分的来自纳米过滤系统92的滞留物流再循环到纳米过滤系统92中并且其部分通过通向蒸发器91被进一步浓缩。来自蒸发器91的蒸发相通向冷凝器93。在冷凝器93的出口处收集另一条耗尽的洗脱剂流97。部分的来自蒸发器91的液相再循环到蒸发器91，并且收集其部分以形成浓缩的脂肪酸流96。
洗脱剂再循环的变体
按照本发明，在色谱分离的主要步骤处得到富集第一(需要的)PUFA的第一洗脱剂流和富集第二(不需要的)FA的第二洗脱剂流。按照本发明，至少第二洗脱剂流经浓缩和再循环。
也可浓缩并再循环第一洗脱剂流(也示于图1)。使用上述的任意浓缩技术，或本领域已知的任意其它浓缩技术可再循环至少90％，优选至少99％并且甚至优选至少99.9％的这种第一洗脱剂流(特别是到主要的色谱单元中)(从脂肪酸如PUFA的高沸点来看)。
现在转向第二洗脱剂流的浓缩和再循环，本发明的第一解决方案是进行浓缩步骤使得耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比(即浓缩后)低于第二洗脱剂流的水与有机物之比(即浓缩前)。
这可通过调节浓缩阶段的参数来实现，由于水的沸点与洗脱剂中存在的有机溶剂的沸点不同。一般而言，仅部分却不完全进行蒸发或蒸馏或其它浓缩方法，以产生富集有机溶剂并耗尽水(和脂肪酸)的蒸气相并且然后收集该蒸气相以形成耗尽的第二洗脱剂流。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比相对于第二流出物流的水与有机物之比降低约1％至约10％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比相对于第二流出物流的水与有机物之比降低约10％至约20％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比相对于第二流出物流的水与有机物之比降低约20％至约30％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比相对于第二流出物流的水与有机物之比降低约30％至约40％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比相对于第二流出物流的水与有机物之比降低约40％至约50％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比相对于第二流出物流的水与有机物之比降低约50％至约60％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比相对于第二流出物流的水与有机物之比降低约60％至约70％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比相对于第二流出物流的水与有机物之比降低约70％至约80％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比相对于第二流出物流的水与有机物之比降低约80％至约90％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比相对于第二流出物流的水与有机物之比降低约90％至约95％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比相对于第二流出物流的水与有机物之比降低超过约95％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流含有少于或等于约20％的水，任选少于或等于约10％的水，优选少于或等于约5％的水，或少于或等于约2％的水，或少于或等于约1％的水，或少于或等于约0.5％的水，或少于或等于约0.1％的水，或少于或等于约0.05％的水，或少于或等于约0.01％的水，或少于或等于约0.005％的水，或少于或等于约0.001％的水。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的流速相对于第二流出物流的流速降低约1％至约5％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的流速相对于第二流出物流的流速降低约5％至约10％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的流速相对于第二流出物流的流速降低约10％至约20％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的流速相对于第二流出物流的流速降低约20％至约30％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的流速相对于第二流出物流的流速降低约30％至约40％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的流速相对于第二流出物流的流速降低约40％至约50％。
按照一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流的流速相对于第二流出物流的流速降低超过约50％。
由于其水与有机物之比相对于第二洗脱剂流降低，耗尽的第二洗脱剂流含有最小或低水平的夹带的不需要的第二FA，并且优选没有夹带不需要的第二FA。因此这种耗尽的第二洗脱剂流可部分或优选全部再循环到主要的色谱单元中，用于实施色谱分离的主要步骤。
可提供补充的(新鲜)水以弥补水的消耗。这种水的加入可发生在浓缩步骤和将流返回到主要的色谱单元之间的任何地方。其可具体发生在蒸气形式的耗尽的第二洗脱剂流冷凝之前，或优选在其冷凝之后。
水的加入可使流的水与有机物之比在浓缩步骤之前回到原始值，或可使其到不同值。
也可提供任选的补充的(新鲜)有机溶剂。
耗尽的第二洗脱剂流可在再循环并用于色谱分离的主要步骤之前经过其它类别的处理。
无论耗尽的第二洗脱剂流的水与有机物之比与第二洗脱剂流的水与有机物之比是否相同，本发明的第二解决方案由不再循环所有的耗尽的第二洗脱剂流(用于主要的色谱单元中)组成。按照这第二解决方案，至少部分的耗尽的第二洗脱剂流经过再循环以用于其它加工步骤，例如用作洗脱剂或用作燃料。
从而，潜在夹带不需要的第二FA并不损害色谱分离的主要步骤，同时工厂的总体运行成本仍然不会显著增加。
仍然可能再循环部分的耗尽的第二洗脱剂流以用于色谱分离的主要步骤中，前提是以这种方式再循环的耗尽的第二洗脱流的比例仍然低于特定阈值，使得在色谱分离的主要步骤结束时第二FA对第一PUFA的污染水平仍然低于特定限制。例如，0至70％、或约0至约60％、或约0至约50％、或约0至约40％、或约0至约30％、或约0至约20％、或约0至约10％的耗尽的第二洗脱剂流再循环并用于色谱分离的主要步骤中。
按照另一个实施方式，耗尽的第二洗脱剂流都没有再循环并用于色谱分离的主要步骤中。最优选地，其全部再循环并用于另一个加工步骤中。
耗尽的第二洗脱剂流可再循环并用于相同方法的另一个步骤中，或不同方法的步骤中，例如，用于生产不同产品。这种不同的方法可在相同或不同装置中进行(其中耗尽的第二洗脱剂流储存并从一个装置转移到其它装置)。
例如，耗尽的第二洗脱剂流可用于在相同装置或远程再生来自流的纯有机溶剂，这种纯有机溶剂可部分或完全用于进料主要的色谱步骤，使得该方法的总体成本不受显著影响。
按照一个优选的实施方式，本发明的方法包括再循环全部或部分的耗尽的洗脱剂流到主要的色谱单元上游的另一个分离单元(以在色谱分离的主要步骤之前进行预先的分离步骤)。
应注意到当再利用用过的洗脱剂作为燃料时，浓缩步骤是任选的。根据第二洗脱剂流的组成，可能直接将其部分或全部用作燃料而不首先产生含有少量脂肪酸(或水)的耗尽的第二洗脱剂流。
按照实施本发明的第一解决方案的一个实施方式，并参考图11，该方法包括色谱分离的主要步骤，该步骤包括在主要的色谱分离单元101中用洗脱剂流104处理含有第一(需要的)PUFA和第二(不需要的)FA的进入流103。在主要的色谱单元101的出口处收集富集第一PUFA的第一洗脱剂流105和富集第二FA的第二洗脱剂流106。
第一洗脱剂流105通向第一浓缩单元107，并且第二洗脱剂流106通向第二浓缩单元102。
在第一浓缩单元107的出口处分别收集第一浓缩脂肪酸流108(含有浓缩的第一PUFA和可能的其它组分)和耗尽的第一洗脱剂流111。耗尽的第一洗脱剂流111再循环到主要色谱单元101。最多基本所有的在第一洗脱剂流104中含有的洗脱剂可经再循环成耗尽的第一洗脱剂流111，并且耗尽的第一洗脱剂流111的水与有机物之比可与第一洗脱剂流104的水与有机物之比基本相同，因为不存在污染问题。
在第二浓缩单元102的出口处分别收集第二浓缩脂肪酸流109(含有浓缩的第二FA和可能的其它组分)和耗尽的第二洗脱剂流110。耗尽的第二洗脱剂流110再循环到主要色谱单元101。耗尽的第二洗脱剂流110的水与有机物之比低于第二洗脱剂流106的水与有机物之比。相关地，第二浓缩脂肪酸流109含有残留的洗脱剂，具有比第二洗脱剂流106大的水与有机物之比。例如，第二浓缩脂肪酸流109可含有残留水并且基本不含有机溶剂。
提供补充的水112以弥补再循环洗脱剂中水的消耗。也可提供补充的有机溶剂(未显示)。
应注意到进入流103可以是进料混合物，在该方法包括一个单独分离步骤的情况中，或在该方法包括几个分离步骤的情况中，其中所示的色谱分离的主要步骤是第一个。
类似地，第一浓缩脂肪酸流108可以是该方法的最终产品。或者，如果图11所示的色谱分离步骤之后的其它分离步骤，该流通向下一分离阶段，以将第一PUFA与流中存在的其它组分分开。
图12显示了一个变体，其实施本发明的第二解决方案。与图11相似的附图标记具有相同的含义。该变体与图11的上述实施方式之间的差异在于耗尽的第二洗脱剂流110并不再循环到主要色谱单元101。相反，这种耗尽的第二洗脱剂流110再循环到主要色谱单元101上游的另一个分离单元(未显示)。在这一情况中，耗尽的第二洗脱剂流110的水与有机物之比可能与第二洗脱剂流106的水与有机物之比相同(或不同)；并且第二浓缩脂肪酸流109可基本不含洗脱剂并且尤其是不含水。
在该变体中，补充的新鲜有机溶剂113的存在对于弥补耗尽的第二洗脱剂流110到主要色谱单元101的再循环缺失是必要的。可由单一补充的洗脱剂来代替补充的水112和补充的有机溶剂113。
图13显示了另一个变体，其实施本发明的第二解决方案。与图11相似的附图标记具有相同的含义。该变体与图11的上述实施方式之间的差异在于耗尽的第二洗脱剂流110分成2个部分。第一部分114再循环到主要色谱单元101，而第二部分115并不再循环到主要色谱单元101。相反，这种第二部分115再循环到主要色谱单元101上游的另一个分离单元(未显示)。在这一情况中，耗尽的第二洗脱剂流110的水与有机物之比可能与第二洗脱剂流106的水与有机物之比相同(或不同)；并且第二浓缩脂肪酸流109可基本不含洗脱剂并且尤其是不含水。
在该变体中，补充的新鲜有机溶剂113的存在对于弥补耗尽的第二洗脱剂流110到主要色谱单元101的总再循环缺失是必要的。可由单一补充的洗脱剂来代替补充的水112和补充的有机溶剂113。
在耗尽的第二洗脱剂流110的水与有机物之比低于第二洗脱剂流106的水与有机物之比的情况中，该变体也是本发明的第一解决方案的一个实施方式。
应理解耗尽的第二洗脱剂流可再循环到进料多个分离单元，尤其是多个色谱单元的洗脱剂池中。
作为一个一般性的注释，应注意到本发明的方法可在单个装置中实施，或在两个或更多个不同装置中实施。本文所述的任意流可储存并从一个装置转移至其它装置以能够完整进行该方法。例如，可在一个装置中提供分离单元，同时在另一个不同的装置中提供浓缩单元(包括，例如一个或多个蒸馏柱)。
可通过充分的方法或装置线上或线下分析各条流的组成，并且尤其是循环的洗脱剂流，如耗尽的第二流的组成，并使用本领域已知的方法分批或连续再调节。
优选的纯化方案
在第一优选实施方式中，使用一个或多个色谱步骤来从脂肪酸的混合物中纯化第一PUFA(例如，EPA)。具体地，含有第一PUFA的(最终)纯化流中第二FA(例如DHA)的量降低至低于或等于约2％，优选低于或等于约0.5％，优选低于或等于约0.05％，优选低于或等于约0.03％，更优选至不可检测的水平。
色谱步骤中的至少一个旨在从第二FA中分离第一PUFA并且优选使用水和甲醇的混合物作为洗脱剂。目标部分含有第一PUFA并含有降低的量的第二FA。通过蒸发或膜技术如纳米膜系统、蒸发器、蒸馏柱或本领域技术人员已知的其它合适的包括一种技术或技术组合的手段浓缩收集的目标部分，使得最大量的有机溶剂再循环到色谱方法中。
优选的蒸发手段是在减压下运行的具有强制循环的降膜蒸发器。该方法也产生含有第二FA的至少一个废料部分。为了从第二流中再循环最大部分的洗脱剂而不夹带第二FA，选择蒸发手段并且设定蒸发参数使得大部分的水和浓缩的第二FA保留在蒸发器的底部。结果，与水相比富集有机溶剂的经蒸馏溶剂混合物和溶剂蒸气中夹带的第二FA降低至可接受的水平，使得能够在相同的色谱单元中进行蒸馏物的再循环。
优选的手段包括蒸馏柱或蒸馏柱和具有强制循环的降膜蒸发器的组合。替代地，可使用膜技术来浓缩废物流中的第二FA，并且可与蒸发技术偶联以再循环溶剂混合物的部分到色谱过程中。
在第二优选实施方式中，使用一个或多个色谱步骤来从脂肪酸的混合物中纯化第一PUFA(例如，EPA)。具体地，含有第一PUFA的纯化流中第二FA(例如DHA)的量降低至低于或等于约2％，优选低于或等于约0.5％，优选低于或等于约0.05％，优选低于或等于约0.03％，更优选至不可检测的水平。
色谱步骤中的至少一个旨在从第二FA中分离第一PUFA并且优选使用水和甲醇的混合物作为洗脱剂。目标部分含有第一PUFA并含有降低的量的第二FA。将目标部分直接再注射到后续的色谱步骤中以进一步纯化第一PUFA。该方法也产生含有第二FA的至少一个废料部分。
为了从含有第二FA的第二流中再循环最大部分的洗脱剂而不夹带第二FA，选择蒸发手段并且设定蒸发参数使得大部分的水和浓缩的第二FA保留在蒸发器的底部。结果，与水相比富集有机溶剂的经蒸馏溶剂混合物和溶剂蒸气中夹带的第二FA降低至可接受的水平，使得能够在相同的色谱单元中进行蒸馏物的再循环。
优选的手段包括蒸馏柱和具有强制循环的降膜蒸发器的组合。替代地，可使用膜技术来浓缩废物流中的第二FA，并且可与蒸发技术偶联以再循环溶剂混合物的部分到色谱过程中。
在第三优选实施方式中，使用一个或多个色谱步骤来从脂肪酸的混合物中纯化第一PUFA(例如，EPA)。具体地，含有第一PUFA的纯化流中第二FA(例如DHA)的量降低至低于或等于约2％，优选低于或等于约0.5％，优选低于或等于约0.05％，优选低于或等于约0.03％，更优选至不可检测的水平。
色谱步骤中的至少一个旨在从第二FA中分离第一PUFA并且优选使用水和甲醇的混合物作为洗脱剂。目标部分含有第一PUFA并含有降低的量的第二FA。
通过蒸发或膜技术如纳米膜系统、蒸发器、蒸馏柱或本领域技术人员已知的其它合适的包括一种技术或技术组合的手段浓缩收集的目标部分，使得最大量的有机溶剂再循环到色谱方法中。优选的蒸发手段是在减压下运行的具有强制循环的降膜蒸发器。
该方法也产生含有第二FA的至少一个废料部分。来自废料部分的溶剂不再循环到旨在分离第一PUFA和第二FA的色谱步骤中。
在第四优选实施方式中，使用一个或多个色谱步骤来从脂肪酸的混合物中纯化第一PUFA(例如，EPA)。具体地，含有第一PUFA的纯化流中第二FA(例如DHA)的量降低至低于或等于约2％，优选低于或等于约0.5％，优选低于或等于约0.05％，优选低于或等于约0.03％，更优选至不可检测的水平。
色谱步骤中的至少一个旨在从第二FA中分离第一PUFA并且优选使用水和甲醇的混合物作为洗脱剂。目标部分含有第一PUFA并含有降低的量的第二FA。将目标部分在没有浓缩的情况下直接再注射到后续的色谱步骤中以进一步纯化第一PUFA。该方法也产生含有第二FA的至少一种废料部分。来自废料部分的溶剂不再循环到旨在分离第一PUFA和第二FA的色谱步骤中。
实施例
以下实施例说明本发明而非限制性的。
实施例1
从鱼油(4g)中得到的脂肪酸乙酯混合物溶解在甲醇(144g)和水(14.5g)的93/7v/v混合物中，并然后在60℃下搅拌反应器中经过蒸发。在0.6bar abs下在蒸发期间收集质量分别为33.1g和45.1g的2个部分馏出物F1和F2，在0.55bar abs下在蒸发期间收集质量为32.9g的一个部分F3，并且在0.05bar abs下在蒸发期间收集质量为18.9g的一个部分F4。下表1提供了对蒸发的部分的水含量和脂肪酸酯含量的分析。
表1：脂肪酸酯混合物存在下甲醇和水的混合物的蒸发
表1显示了馏出物中少量水(低于或等于5％w/w)夹带不可检测量的脂肪酸，并且显著的夹带(27ppm)发生在馏出物中有较高的水含量(20％w/w)。
通过GC色谱分析初始混合物的脂肪酸组成和F4部分的脂肪酸组成。结果列于下表2。
表2：与蒸发前的进料组成相比夹带的脂肪酸的组成
表2显示出F4中夹带的油的组成与长链脂肪酸相比富集短链脂肪酸，证明当增加量的水蒸发时出现热力学夹杂。
实施例2
在该实施例中，使用VARICOLTM多柱色谱设备得到含有约70％EPA和约10％DHA的预纯化ω-3PUFA的混合物，其中柱并C18 20μm反相二氧化硅填装，在含有约90％v/v的丙酮和10％v/v的水的移动相中总浓度为62g/l。使用如图2所示的具有强制再循环的多管蒸发器在单个蒸发步骤中连续浓缩该混合物：
-稀释的PUFA溶液流速：96l/h
-加热流体的温度：约100℃
-蒸发温度：约75℃
-蒸发压力：约250mbar
-浓缩流出口的流速：6l/h
将PUFA混合物注射到蒸发装置中，包括具有强制再循环的多管蒸发器11。通过管线15收集浓缩的PUFA混合物，同时在冷凝器12中冷凝蒸发的溶剂并通过管线16收集。
离开蒸发器的浓缩的PUFA混合物含有约0.2％的水和1％的丙酮。在管线16中回收的蒸发溶剂的混合物含有30至100ppm的脂肪酸酯。在该方法中的相同纯化步骤中回收并再循环超过99％的溶剂。
实施例3a
在该实施例中，使用装备了5根20.2cm内径和8.5cm长度的柱的VARICOLTM多柱色谱设备纯化含约70％EPA和约10％DHA的预纯化ω-3PUFA的混合物，该柱填充C18 20μm反相二氧化硅和含有约93％v/v的甲醇和7％v/v的水的流动相，并且洗脱液中残留量的DHA为约0.1ppm。运行条件如下：
-进料速率：1.5l/h
-洗脱剂速率：279l/h
-提取物速率：226l/h
-萃余液速率：54.5l/h
-运行温度：35℃
目标萃余液含有大约92％的GC纯度的纯化的EPA和低于0.03％DHA，总浓度为19g/l。使用如图2所述的具有强制再循环的多管蒸发器在单个连续蒸发器中连续浓缩该混合物：运行条件如下：
-稀释的PUFA溶液流速：54.5l/h
-加热流体的温度：约100℃
-蒸发温度：约75℃
-蒸发压力：约250mbar
-浓缩流出口的流速：6l/h
离开蒸发器的浓缩的PUFA混合物含有约0.04％的水和0.6％的甲醇。超过99％的来自萃余液的溶剂被回收并再循环到本发明方法的相同纯化步骤中。
含有GC纯度为约36％的DHA和浓度为约1.7g/l的总脂肪酸酯的提取物流在与图2所述类似的连续蒸发装置中部分浓缩。运行条件如下：
-稀释的PUFA溶液流速：226l/h
-加热流体的温度：约100℃
-蒸发温度：约70℃
-蒸发压力：约1000mbar
-浓缩流出口的流速：40l/h
离开蒸发器的浓缩混合物含有约40％的水和60％的甲醇。仅约82％的来自提取流的溶剂被回收并再循环到本发明方法的相同纯化步骤中。
来自提取物和萃余液蒸发器的经蒸馏的洗脱剂含有约93.2％的甲醇、约12ppm的脂肪酸酯和仅0.1pm的DHA，并在色谱过程中再循环。
实施例3b(比较例)
在该实施例中，通过计算机模拟来估计再循环的洗脱剂中DHA的影响。使用装备了5根20.2cm内径和8.5cm长度的柱的VARICOLTM多柱色谱设备纯化含约70％EPA和约10％DHA的预纯化ω-3PUFA的混合物，该柱填充C18 20μm反相二氧化硅和含有约93％v/v的甲醇和7％v/v的水的流动相，并且洗脱液中的DHA为约20ppm。运行条件如下：
-进料速率：1.5l/h
-洗脱剂速率：279l/h
-提取物速率：226l/h
-萃余液速率：54.5l/h
-运行温度：35℃
目标萃余液含有大约92％的GC纯度的纯化的EPA和约0.12％DHA，总浓度为19g/l。从提取物和萃余液流的完全浓缩中得到的洗脱剂流中20ppm DHA的影响是纯化的EPA流中约0.1％DHA。

Claims (16)

1.一种从进料混合物中回收第一多不饱和脂肪酸的方法，其中除了所述第一多不饱和脂肪酸以外，所述进料混合物包含至少第二脂肪酸，所述方法包括：
-使用水性有机洗脱剂进行色谱分离的主要步骤并从而收集富集所述第一多不饱和脂肪酸的第一洗脱剂流和富集所述第二脂肪酸的第二洗脱剂流；
-使第二洗脱剂流经过浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第二洗脱剂流；
-再循环至少部分的所述耗尽的第二洗脱剂流，用于除了色谱分离的主要步骤以外的其它处理步骤中。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述耗尽的第二洗脱剂流没有经再循环以用于色谱分离的主要步骤中。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，至少部分、优选全部的所述耗尽的第二洗脱剂流经再循环以用作分离一种物质与另一种物质、优选色谱分离一种物质与另一种物质的步骤中的洗脱剂，和/或用作染料，和/或用于再生溶剂。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述方法包括：
-在色谱分离的主要步骤之前，使用一种或多种水性有机洗脱剂进行一个或多个预先的分离步骤；
-再循环至少部分、优选全部的所述耗尽的第二洗脱剂流以用于预先的色谱分离步骤中的一个或多个。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括在色谱分离的主要步骤之后的至少一个额外的分离步骤，并且优选单个额外的分离步骤，所述额外的分离步骤优选是额外的色谱分离步骤。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，所述方法包括：
-使所述第一洗脱剂流经过浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第一洗脱剂流，并且
-再循环至少部分、优选全部的所述耗尽的第一洗脱流，优选用于所述方法的分离步骤，更优选用于所述色谱分离的主要步骤和/或所述色谱分离的主要步骤之前的至少一个预先的分离步骤。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述进料混合物还包含至少第三脂肪酸，并且所述方法包括：
-使用水性有机洗脱剂进行色谱分离的二级步骤并从而收集富集所述第一多不饱和脂肪酸的第三洗脱剂流和富集所述第三脂肪酸的第四洗脱剂流；
-使所述第三洗脱剂流经过浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第三洗脱剂流，并且然后
-再循环至少部分、优选全部的所述耗尽的第三洗脱剂流，优选用于所述方法的分离步骤中，最优选用于色谱分离的二级步骤中；和/或
-使第四洗脱剂流经过浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第四洗脱剂流；并且然后
-再循环至少部分、优选全部的耗尽的第四洗脱剂流，优选用于所述方法的分离步骤中，最优选用于色谱分离的二级步骤中。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：
-所述色谱分离的二级步骤是在所述色谱分离的主要步骤之前进行的预先的色谱分离步骤；或
-所述色谱分离的二级步骤是在所述色谱分离的主要步骤之后进行的额外的色谱分离步骤；或
-所述色谱分离的二级步骤和色谱分离的主要步骤同时进行，优选在相同色谱单元中进行。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，在所述色谱分离的主要步骤和色谱分离的二级步骤中使用相同的水性有机洗脱剂；或者其中在所述色谱分离的主要步骤和色谱分离的二级步骤中使用不同的水性有机洗脱剂；并且优选在所述色谱分离的主要步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物的重量比与所述色谱分离的二级步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物的重量比不同。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述进料混合物还包含至少第四脂肪酸，并且所述方法包括：
-使用水性有机洗脱剂进行色谱分离的三级步骤并从而收集富集所述第一多不饱和脂肪酸的第五洗脱剂流和富集所述第四脂肪酸的第六洗脱剂流；
-使第五洗脱剂流经过浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第五洗脱剂流，并且然后
-再循环至少部分、优选全部的所述耗尽的第五洗脱剂流，优选用于所述方法的分离步骤中，最优选用于色谱分离的三级步骤中；和/或
-使第六洗脱剂流经过浓缩步骤以一方面得到浓缩脂肪酸流和另一方面得到耗尽的第六洗脱剂流；并且然后
-再循环至少部分、优选全部的所述耗尽的第六洗脱剂流，优选用于所述方法的分离步骤中，最优选用于色谱分离的三级步骤中。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：
-所述色谱分离的三级步骤是在所述色谱分离的主要步骤之前进行的预先的色谱分离步骤；或
-所述色谱分离的三级步骤是在所述色谱分离的主要步骤之后进行的额外的色谱分离步骤；或
-所述色谱分离的三级步骤和色谱分离的主要步骤同时进行，优选在相同色谱单元中进行。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中：
-在所述色谱分离的主要步骤中和色谱分离的三级步骤中使用相同的水性有机洗脱剂；或
-在所述色谱分离的主要步骤中和色谱分离的三级步骤中使用不同的水性有机洗脱剂；并且优选所述色谱分离的主要步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物的重量比与所述色谱分离的三级步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物的重量比不同；和/或
-在所述色谱分离的二级步骤中和色谱分离的三级步骤中使用相同的水性有机洗脱剂；或
-在所述色谱分离的二级步骤中和色谱分离的三级步骤中使用不同的水性有机洗脱剂；并且优选所述色谱分离的二级步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物的重量比与所述色谱分离的三级步骤中使用的水性有机洗脱剂的水与有机物的重量比不同。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在所述方法结束时，以组合物回收所述第一多不饱和脂肪酸，所述组合物含有相对于所述组合物中脂肪酸总重量的低于约1重量％、优选低于约0.5重量％或低于约0.1重量％或低于约0.05重量％或低于约0.03重量％或低于约0.01重量％的所述第二脂肪酸。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一多不饱和脂肪酸是二十碳五烯酸，而所述第二脂肪酸是二十二碳六烯酸。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，至少所述色谱分离的主要步骤，优选所有色谱分离步骤是模拟移动床或实际移动床色谱分离的步骤。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所有脂肪酸，包括所述第一多不饱和脂肪酸均是酯化的形式，并且优选乙酯。
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