CN102921192B - 一种制备高纯度单不饱和脂肪酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备高纯度单不饱和脂肪酸顺、反式异构体的方法。本发明首次采用低压反相C18柱层析技术对单不饱和脂肪酸混合物粗品进行分离纯化。本方法可用于百克级到公斤级高纯度单不饱和脂肪酸的制备，并可实现单不饱和脂肪酸顺反异构体的拆分；实验设备简单，操作方便，节约成本。

Description

一种制备高纯度单不饱和脂肪酸的方法

技术领域：

本发明属于食品领域，具体涉及一种制备高纯度单不饱和脂肪酸，特别是能够制备高纯度的单不饱和脂肪酸异构体的方法。

背景技术：

单不饱和脂肪酸是指含分子结构中含有一个双键的脂肪酸，其种类和来源极为丰富，如肉豆蔻油酸(Myristoleic acid)、棕榈油酸(Palmitoleic acid)、油酸(Octadecenoicacid)、花生油酸(Eicosenoic acid)、芥酸(Docosenoic acid)的顺反异构体等。

在食品、化工、医药等行业中，往往需用高纯度的单不饱和脂肪酸作为原料和测定标准。有关脂肪酸的提取、制备已有多篇文献报道，如：

T.C.Marquardt,R.F.Wilson.An improved reversed-phase thin-layerchromatography method for separation of fatty acid methyl esters.Journal of theAmerican Oil Chemists' Society,1998,75(12):1889-1892采用银离子色谱法，实现了饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的分离。但银离子色谱填料非常昂贵，只适用于mg级别多不饱和脂肪酸样品分离纯化，并且填料制备过程复杂耗时，并且通常使用正己烷、石油醚等低极性有机溶剂，费用较高，产物纯度低。

傅红,爱咏.分子蒸馏法制备鱼油多不饱和脂肪酸.无锡轻工大学学报,2002,21(6):617，以及胡伟,李湘洲,吴志平,毛鹏飞.分子蒸馏法分离油茶籽油油酸乙酯工艺研究.中国油脂,2011,36(8):49-52采用分子蒸馏法分别对不饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸乙酯进行了纯化，通过多级处理后所获得的最高的脂肪酸(酯)纯度为91.5%。但是需要有专用的分子蒸馏设备，并且研究结果显示依靠单一分子蒸馏手段不能获得含量在99%以上的不饱和脂肪酸。

还有文献采用尿素包埋法，此法仅适用脂肪酸的前期纯化处理，最高含量在92%左右，并且需要多次反复冻融，工作效率低。

A.Robles Medina,A.Giménez Giménez,F.García Camacho,J.A.Sáinchez Pérez,E.Molina Grima,A.Contreras Gómez.Concentration and Purification ofStearidonic,Eicosapentaenoic,and Docosahexaenoic Acids from Cod Liver Oil andthe Marine Microalga Isochrysis galbana.Journal of the American Oil Chemists'Society,1995,72(5):575-583，采用了反相C18色谱，但是对象为多不饱和脂肪酸，所获得的脂肪酸最高纯度为96%,且只适用于g级别制备量；

以上这些研究采用的方式主要有尿素包埋、分子蒸馏、正相银离子色谱等技术手段，目标脂肪酸的得率在30-60%之间，最高纯度在95%左右，并且没有实现顺反异构体的完全分离。并且正相银离子色谱柱层析方法填料不能反复使用，如果拿到同样量的样品，不仅纯度难以满足要求，同时花费也更多。同时分子蒸馏需要有专用的昂贵仪器设备，并且同尿素包埋一样只适用于样品的初次提纯。因此采用以上的技术手段很难获得含量在99%以上的单不饱和脂肪酸原料，并且需多次重复才能获得既定纯度的目标脂肪酸。

虽然脂肪酸的分离纯化技术已有大量报道，但多为分离混合脂肪酸甲酯和多不饱和脂肪酸，很少涉及单不饱和脂肪酸分离，特别没有有关于获取高纯度的单不饱和脂肪酸的报道。

单不饱和脂肪酸具有一个双键，因此均存在顺反式异构体。

研究发现顺式单不饱和脂肪酸具有重要的生理功能，如对胆固醇有明显的降低作用，可以减少心脑血管疾病的患病几率，修复神经元细胞等，已经在药品和保健食品行业得到了广泛的应用，但是目前含量在99%以上的单不饱和脂肪酸很难从市场获取。

反式单不饱和脂肪酸对人有不利的影响，可以改变人体的正常代谢途径，干扰和影响婴幼儿的必需脂肪酸吸收，导致心脏病和糖尿病等疾病。目前各国已经对食品中的反式脂肪酸提出了2%的限量要求，并要求含有反式脂肪酸食品必须进行强制标示。

因此，不仅需要有获取高纯度的单不饱和脂肪酸的方法，而且需要有拆分顺、反式单不饱和脂肪酸的方法，以用于获取食品、药品分析检测标准和原料。

发明内容：

本发明的目的是提供一种制备高纯度单不饱和脂肪酸的方法，特别是研究出一种获得高纯度的单不饱和脂肪酸顺、反式异构体的方法。

本发明首次采用低压反相C18柱层析技术进行分离纯化，达到了发明目的。

发明人通过对层析柱填料、洗脱试剂等条件进行反复筛选，优化出了合适的分离条件，具体的技术方案如下：

1）填料：十八烷基键合硅胶（C18），填料的粒径为50μm，孔径

2）洗脱液：含0.1%（V/V）甲酸和水的甲醇溶液，根据单不饱和脂肪酸种类的不同调节水和甲醇在洗脱液中体积比，通常水的体积为0～5％；

3）监测：采用溴甲酚绿指示剂进行产物监测；

4）收集、浓缩：分段收集与溴甲酚氯反应显黄色的流份，然后分别进行减压浓缩；

5）气相色谱检测：采用气相色谱对4）中所得的浓缩的流份进行检测，通过与标准品的比对，确定单不饱和脂肪酸顺、反式异构体及脂肪酸纯度。

通过比较所收集到的脂肪酸洗脱流份与顺反油酸标准品在气相色谱上的保留时间和峰面积，实现单不饱和脂肪酸顺、反式异构体流份的定性和定量。

用本发明的方法已制备出了多种单不饱和脂肪酸，下表是部分单不饱和脂肪酸标准品的名称、结构及含量。

由于顺反式脂肪酸在C18固定相上分配系数的不同，在本发明人选择的层析条件下，如在一定的柱温和水的比例条件下，两种异构体洗脱时间会有不同，通常顺式脂肪酸会先于反式脂肪酸被洗脱出来。通过气相色谱检测可以对单不饱和脂肪酸顺、反式的异构体实现准确的定性和定量。

本发明方法所用的层析柱和待纯化样品的上样量可根据单不饱和脂肪酸的不制备量选择。

例如，当使用7.3cm×120cm(I.D.×L)层析柱，将市售的含量在70%-80%之间的脂肪酸原料配制成0.5g/ml的样品溶液，上样量为100ml时，可得到数十克级的高纯度单不饱和脂肪酸。

根据制备量及待分离样品的不同种类，确定洗脱液的流速和层析柱的柱温，通常，洗脱液的流速为2ml/min-5ml/min；柱温：15-25℃。

本方法的创新点和优点是：

1、首次采用低压反相C18柱层析技术对单不饱和脂肪酸进行分离纯化；

2、比现有技术制备量大，所获得的产品纯度高；本方法可用于百克级到公斤级高纯度单不饱和脂肪酸的制备，经一次分离产品纯度可以达到99%；

3、可实现单不饱和脂肪酸顺反异构体的拆分；

4、实验设备简单，操作方便；

5、层析柱中所使用的填料可反复多次使用，节约成本。

附图说明：

图1为采用本方法所制备的反式油酸气相色谱图；

图2为采用本方法所制备的顺式油酸气相色谱图；

图3为采用本方法所制备的顺式花生油酸气相色谱图。

具体实施方式

以下所有实施例中所进行的气相色谱的条件如下：

气相色谱检测前样品的处理：

1、准确称量2mg脂肪酸样品，加入到磨口瓶中

2、加入2%氢氧化钠甲醇溶液8ml

3、在80℃水浴上回流，直至油滴消失；

4、从冷凝器顶端加入15%三氟化硼甲醇溶液7mL，在80℃水浴中继续回流2min；

5、从水浴上取下烧瓶，迅速冷却至室温，准确加入10mL正己烷，振荡萃取4min

6、再加入饱和氯化钠水溶液10ml，静置分层，吸取上层正己烷提取溶液1mL，过滤上机测定。

气相色谱条件：

色谱柱：毛细管色谱柱（交联键合固定相，含50%氰丙基）

柱长：60m内径0.25mm膜厚0.25μm

检测器：氢火焰检测器（FID）

进样器温度：240℃

检测器温度：260℃

程序升温：

载气：氮气

分流比：50:1

进样体积：1μL

以下所有实施例中所用的材料和仪器如下：

层析柱：7.3cm×120cm(I.D.×L)

填料：十八烷基键合硅胶（C18）填料，填料的粒径50μm，孔径(SiliCycle）

所用试剂甲醇、溴甲酚氯、正己烷、甲酸均为分析纯。

正相薄层板；

气相色谱仪FID检测器

流份收集器

旋转蒸发仪

恒温水浴锅

万分之一天平

实施例1、顺式油酸和反式油酸的制备

准确称取油酸原料50g（经测定，含顺式油酸40g，反式油酸5g）于烧杯中，加入100mL甲醇，使油酸原料样品配制成浓度为0.5g/mL的甲醇溶液。

通过移液管将已经配制好的样品均匀缓慢的注入到C18低压制备柱上层，打开层析柱截止活塞，使样品均匀充分的吸附到C18填料上，待吸附完成后采用流动相进行洗脱。

流动相为含0.1％甲酸的甲醇/水(95：5，V/V）混合溶液，等度洗脱，流速为3mL/min。

采用流份收集器进行自动收集，每份收集体积为150ml。

通过溴甲酚绿显色反应对收集的洗脱液流份进行显色分析，将在薄层板上与溴甲酚氯显黄色反应的流份减压浓缩，并通过气相色谱检测分析。

图1为采用本方法所制备的反式油酸气相色谱图；图2为采用本方法所制备的顺式油酸气相色谱图。

通过比较所收集到的脂肪酸流份与顺反油酸标准品在气相色谱上的保留时间和峰面积，实现顺反油酸流份的定性和定量。合并纯度在99％的流份，进一步在80℃减压浓缩，除去其中的甲醇、水和甲酸，分别得到高纯度的32g油酸样品和4.3g反式油酸样品。油酸和反式油酸的收率分别为80%和86%，纯度均大于99％。

实施例2、高纯度顺式花生油酸制备

准确称取花生油酸原料50g（经测定，含花生油酸37.5g）于烧杯中，加入100mL甲醇，使花生油酸样品浓度为0.5g/mL。

通过移液管将已经配制好的样品均匀缓慢的注入到C18低压制备柱上层，打开层析柱截止活塞，使样品均匀充分的吸附到C18填料上，待吸附完成后采用流动相进行洗脱。

流动相为含0.1％甲酸的甲醇溶液，等度洗脱，流速为3mL/min。

采用流份收集器进行自动收集，每份收集体积为150ml。

通过溴甲酚绿显色反应对收集的洗脱液流份进行显色分析，将在薄层板上与溴甲酚氯显黄色反应的流份减压浓缩，并通过气相色谱检测分析。

通过比较所收集到的脂肪酸流份与花生油酸标准品在气相色谱上的保留时间和峰面积，实现花生油酸流份的定性和定量。合并纯度在99％的流份，进一步在80℃减压浓缩，除去其中的甲醇和甲酸，得到29g高纯度的顺式花生油酸样品。样品收率为78%，纯度大于99％。

图3为采用本方法所制备的顺式花生油酸气相色谱图。

Claims (4)

1.一种制备高纯度单不饱和脂肪酸顺、反式异构体的方法，采用低压反相柱层析方法对单不饱和脂肪酸混合物粗品进行分离纯化，其特征为：

1)填料：十八烷基键合硅胶，填料的粒径为50μm，孔径

2)洗脱液：含0.1％V/V甲酸和0～5％水V/V的甲醇溶液；

3)监测：采用溴甲酚绿指示剂进行产物监测；

4)收集、浓缩：分段收集与溴甲酚氯反应显黄色的流份，然后分别进行减压浓缩；

5)气相色谱检测：采用气相色谱对4)中所得的浓缩的流份进行检测，通过与标准品的比对，确定单不饱和脂肪酸顺、反式异构体及脂肪酸纯度。

2.权利要求1所述的方法，洗脱液的流速为2ml/min-5ml/min。

3.权利要求1所述的方法，柱温为：15-25℃。

4.权利要求1所述的方法，所述单不饱和脂肪酸选自肉豆蔻油酸、棕榈油酸、油酸或花生油酸。