CN101776666B - 一种混合脂肪酸的高效液相色谱分离方法及应用 - Google Patents
一种混合脂肪酸的高效液相色谱分离方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用高效液相色谱分离脂肪酸混合物的方法及其应用。针对现有技术中利用HPLC在同时分离化学、物理性质十分相近的亚麻酸、棕榈油酸、亚油酸等6种脂肪酸混合物时存在的方法单一，以及在洗脱方式与流动相组成选择等方面的缺陷，本发明提供一种利用HPLC同时分离亚麻酸、棕榈油酸、亚油酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸6种脂肪酸混合物的方法。该方法将待测脂肪酸溶液用ω-溴代苯乙酮的丙酮溶液和三乙醇胺的丙酮溶液进行脂化处理，再进行HPLC分离。HPLC采用等度洗脱方式，流动相选用乙腈与CTAB水溶液的混合液或者乙腈-水溶液。与现有技术相比，本发明操作简单易行、分离效果好、检测灵敏度高、结果准确可靠，能够同时分离6种脂肪酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种脂肪酸混合物的分离方法，特别是涉及一种利用高效液相色谱分离脂肪酸混合物的方法及其应用。
背景技术
脂肪酸是一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链，是重要的工业原料，也是有机体主要营养素的重要成分和主要能量来源之一。随着人们生活水平的提高，对脂肪酸的测定愈来愈显得重要。食品营养及安全方面，各种食用油、粮食、水果以及奶粉的脂肪酸组成成分及含量的测定是必不可少的；医药方面，一些疾病患者疾病的诊断，中草药、注射液等的品质好坏均依赖于对脂肪酸组成及含量的分析；能源方面，越发重要的生物能源的评价及研究需要越来越成熟的高效，低成本，精确的脂肪酸测定方法；环境卫生方面，污水中过氧脂肪酸等的检测也是一项十分重要的指标。在科学研究领域，如生物膜结构、功能，动植物及微生物的脂肪酸代谢等方面的研究，对脂肪酸进行原位水平研究的前提是对脂肪酸分离及含量测定甚至超微量分析。如何科学、精确地测定脂肪酸的组成及含量是诸多脂肪酸的研究、分析、生产等能够得到开展并得到可靠结果的基础。因此，如何高效、快速、精准地分析脂肪酸组成，并实现检测成本的最低化，是脂肪酸分离和定量的迫切要求。
很长一段时间内人们一直采用气相色谱(GC)完成对脂肪酸的分离和含量 测定，由于气相色谱的分离能力及灵敏度不如液相色谱高，使得该方法在混合脂肪酸样品及痕量分析中难以凑效。自上世纪90年代起有研究者开始尝试用液相色谱法分离不同的脂肪酸，但所能实现的分离效果不佳，能同时分离出的脂肪酸各类也很少。高效液相色谱(HPLC)法采用常规的紫外-可见光检测器，能够达到检测灵敏度明显提高的目的，并且检测结果达到ng级水平，因此在实际检测中的具有广阔的适用范围。在脂肪酸分析领域，由于HPLC定量准确度高、重现性好、分离能力强，在脂肪酸分离上的应用一直为研究者所重视，但研究成果却并不理想。表现为或者分离效果不佳，或者同时分离的脂肪酸种类很少。特别是在分离几种分子量和物化性质都很接近的脂肪酸混合物时，现有技术中更是鲜见报道。所以无论在实验室还是实际生产中，用HPLC分析脂肪酸的方法使用率并不高。
亚麻酸(C18:3)，棕榈油酸(C16:1)，亚油酸(C18:2)，油酸(C18:1)，棕榈酸(C16:0)，和硬脂酸(C18:0)是自然界中常见的6种脂肪酸，它们是生物膜组织和神经组织的重要组成成分。由于这6种脂肪酸通常是混合存在于生物组织中，因此对它们的分离与定量分析是诸多相关研究内容的基础。但这6种脂肪酸具有十分相近化学、物理性质，对它们的分离手段研究一直收效甚微。特别是利用HPLC完成的对这6种混合脂肪酸的共时分离与定量分析的方法更为有限。
谭冰等人发表在1996年第1期《泸天化科技》的“HPLC法测定菜油中脂肪酸组成”一文中公开了一种用高效液相色谱(HPLC)法分析脂肪酸组成的方法，该方法对菜油样品经皂化后直接衍生形成脂肪酸苯乙酮酯进行色谱分离， 分离出了菜油中亚麻酸、棕榈油酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸、花生烯酸、芥酸和山嵛酸等9种脂肪酸的衍生物。该方法公开的主要色谱分离条件为：ZorbaxODS分析柱4.6×250mm，流动相甲醇∶水＝90∶10，进样30min后改为纯甲醇，流速2ml/min，检测波长254nm，灵敏度0.2AUFS。该方法采用梯度洗脱的方式分离目标脂肪酸。与等度洗脱方式相比，梯度洗脱存在多方面的缺点：比如操作复杂，对作为流动相的溶剂的互溶性要求高，对溶剂的纯度要求高；流动相不能循环利用，增加了分析成本；每次运行梯度洗脱之后必须重新平衡色谱柱、耗时较长，以及常常引起基线漂移和降低重现性等。并且某些色谱柱-流动相的联合应用不适于梯度洗脱也限制了梯度洗脱方式的适用性。该方法选用甲醇与水的混合物或者纯甲醇作为流动相。以甲醇作为流动相有两方面的不利影响，一是甲醇HPLC级的吸光度比乙腈大，在UV检测时，产生的噪声大，因此在进行UV短波长上的高灵敏度分析时甲醇HPLC级比乙腈差(分析脂肪酸正是短波长区)；二是甲醇与水混合后粘度增大，在同样的流速下会在柱内加上多余的压力，从而减少色谱柱的使用寿命。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足提供一种高效液相色谱(HPLC)法分离并定量分析混合脂肪酸组成的方法。该方法仅使用常规HPLC仪器配置就能在很短时间内同时分析出亚麻酸(C18:3)，棕榈油酸(C16:1)，亚油酸(C18:2)，油酸(C18:1)，棕榈酸(C16:0)，和硬脂酸(C18:0)6种化学、物理性质十分相近的常见脂肪酸的组成含量，方法简单易行、运行成本经济节约。为 实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种混合脂肪酸的高效液相色谱分离方法，首先将待测脂肪酸溶液用ω-溴代苯乙酮的丙酮溶液和三乙醇胺的丙酮溶液进行脂化处理得到待测液，再将待测液上样进行高效液相色谱分离，其特征在于：所述高效液相色谱分离采用等度洗脱方式分离，流动相采用乙腈与CTAB水溶液的混合液或者乙腈-水溶液。
HPLC分离效果主要由色谱分离条件决定，分离条件影响着被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱后样品分子与溶剂(即流动相或洗脱液)以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定了色谱过程的保留行为，从而决定了分离效果。色谱分离条件中以流动相组成、流速、色谱柱温度及洗脱方式最为重要。本技术方案采用HPLC分析脂肪酸组成，选择优化流动相组成、色谱柱温度、流动相流速等色谱分离条件。
在流动相组分选择方面，本技术方案以乙腈为主的乙腈-水溶液或乙腈与CTAB水溶液的混合液为流动相。HPLC中流动相是液体，与组分间有亲合作用力，并参与固定相对组分的竞争，能提高柱的选择性、改善分离度，因此流动相的正确选用直接影响组分分离度。本技术方案以乙腈为主的乙腈-水溶液为流动相在脂肪酸的HPLC分析中至少有两点优点：第一，低粘度。低粘度是流动相的优选方向，也是对流动相溶剂的基本要求之一。因为高粘度溶剂作为流动相势必增高柱压不利于分离，不利于系统的稳定运行，也不利于色谱柱的保护。乙腈的粘度虽然与甲醇相近，但是甲醇与水混合后粘度增高，而乙腈与水混合后粘度变化则不大。因此本技术方案中选用乙腈与水的混合物为流动相在与甲醇与水的混合物作流动相相比，在同样的流速下不需增加柱压，优势明显；第 二，低吸光度。在乙腈和甲醇的市销HPLC级和优级的吸收光谱中，乙腈HPLC级吸收最小，在UV检测时产生的噪声小，这一特征在短波长上最为显著。由于分析脂肪酸正是短波长区，因此本技术方案选用乙腈为流动相能够提高HPLC在脂肪酸分析中的灵敏度。并且乙腈HPLC级在UV检测中的梯度基线上产生鬼峰少，对色谱图分析的干扰小。
在洗脱梯度方面，本技术方案采用等度洗脱，即在同一分析周期内流动相组成保持恒定，以固定配比的溶剂系统洗脱组分。这样不仅稳定性高、色谱重现性好，并且方法操作简便也易于色谱柱再生，在系统运行时还可以实现流动相的循环利用(根据检测的具体情况，确定循环的次数)，能够节约方法运用的成本。
在色谱柱温度选择方面，本技术方案采用10℃～20℃柱温，优选温度为15℃。色谱柱温度因为影响容量因子k′而影响分离度，因而是影响HPLC分离效果的最要因子。
在流动相流速选择方面，流动相的不同流速会影响分离度，一般而言将流动相控制在较低的流速范围内可以使两物质的保留时间显著延长，有利于提高分离度。但由于保留时间变长所有纵向扩散会明显增加，表现为峰型矮胖，并且流速慢会使峰变宽，使柱效明显下降，大大延长了分析时间，提高了分析方法实施的时间成本。因此HPLC中，在流动相组成、色谱柱及柱温相同的条件下，流动相的流速在一定范围内均能满足对样品的分离效果，并会存在最佳流速。本技术方案提供流动相流率在1.0ml/min～2.0ml/min范围内均可以满足对混合脂肪酸的分离，其中以1.5ml/min为最优流速。
本混合脂肪酸的高效液相色谱分离方法适用于对样品中含有亚麻酸、棕榈油酸、亚油酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸六种脂肪酸中至少一种的混合脂肪液进行分离，或者对样品中亚麻酸、棕榈油酸、亚油酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸六种脂肪酸的同时分离。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：所述分析方法利用高效液相色谱同时分离化学、物理性质十分相近的亚麻酸(C18:3)，棕榈油酸(C16:1)，亚油酸(C18:2)，油酸(C18:1)，棕榈酸(C16:0)，和硬脂酸(C18:0)等6种常见脂肪酸。该方法操作简单易行、分离效果好、检测灵敏度高、结果准确可靠，同时分离6种脂肪酸分离时间短、效率高。并且，本技术方案提供的分析方法仅采用常规的HPLC仪器便可实施，无需专门配置价格昂贵的检测器。
附图说明
图1是实施例一色谱图。
图2是实施例二色谱图。
图3是实施例三色谱图。
图4是实施例四色谱图。
图5是实施例五色谱图。
图6是实施例六色谱图。
图7是实施例七色谱图。
图8是实施例八色谱图。
图9是实施例九色谱图。
图中吸引峰对应脂肪酸为：1--亚麻酸(C18:3)、2--棕榈油酸(C16:1)、3--亚油酸(C18:2)、4--油酸(C18:1)、5--棕榈酸(C16:0)、6--硬脂酸(C18:0)。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明优选实施例作进一步的描述。
实施例一
混合脂肪酸分析试验。
1、仪器与主要试剂
1.1试验使用仪器
色谱仪器配置：高效液相色谱仪(日本岛津(SHIMADZU)LC-20AD高效液相色谱仪，岛津CTO-10AS柱温箱，岛津SPD-M20A二极管阵列检测器)；记录色谱图(岛津LC solution色谱数据工作站)。
1.2试剂
标准样：亚麻酸(C18:3)，棕榈油酸(C16:1)，亚油酸(C18:2)，油酸(C18:1)，棕榈酸(C16:0)，和硬脂酸(C18:0)购自美国sigma公司，对照品级。
2、标准样的制备
6种脂肪酸分别用甲醇作为溶剂配成1mg/ml脂肪酸溶液；分别取等量脂肪酸溶液均匀混合成脂肪酸混合溶液。
3、脂肪酸脂化处理
取25μl脂肪酸混合溶液于试管中，氮气吹干，精密加入10mg/mlω-溴代苯乙酮的丙酮溶液和10mg/ml三乙醇胺的丙酮溶液各25μl，试管密封，混合均匀，于约100℃加热约15min；冷却至室温后，精密加入20mg/ml乙酸的丙酮溶液80μl，于约100℃加热5约min，氮气吹干；再加入甲醇500μl，振荡约1min，下离心约10min，取上清液上样分析。
4、HPLC分析
色谱分离条件如下：
色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）
柱温：15℃
流动相：乙腈：水（V/V，下同）=90：10
流速：1.5ml/min
检测波长：242±5nm
试验色谱图如图1所示，检测波长237nm、242nm、247nm。
实施例二
混合脂肪酸分析试验。其与实施例一中相同之处不再重复，不同之处在于，色谱分离条件如下：
色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）
柱温：10℃
流动相：乙腈：5%CTAB=90：10
流速：1.5ml/min
检测波长：242±5nm，检测波长237nm、242nm、247nm。
试验色谱图如图2所示。
实施例三
混合脂肪酸分析试验。其与实施例一中相同之处不再重复，不同之处在于，色谱分离条件如下：
色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）
柱温：15℃
流动相：乙腈：水=95：5
流速：1.5ml/min
检测波长：242±5nm。
试验色谱图如图3所示，检测波长242nm。
实施例四
混合脂肪酸分析试验。其与实施例一中相同之处不再重复，不同之处在于，色谱分离条件如下：
色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）
柱温：15℃
流动相：乙腈：5%CTAB=95：5
流速：1.5ml/min
检测波长：242±5nm
试验色谱图如图4所示，检测波长242nm。
实施例五
混合脂肪酸分析试验。其与实施例一中相同之处不再重复，不同之处在于， 色谱分离条件如下：
色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）
柱温：18℃
流动相：乙腈：5%CTAB=95：5
流速：1.5ml/min
检测波长：242±5nm
试验色谱图如图5所示，检测波长242nm。
实施例六
混合脂肪酸分析试验。其与实施例一中相同之处不再重复，不同之处在于，色谱分离条件如下：
色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）
柱温：15℃
流动相：乙腈：10%CTAB=94：6
流速：1.5ml/min
检测波长：242±5nm
试验色谱图如图6所示，检测波长242nm。
实施例七
混合脂肪酸分析试验。其与实施例一中相同之处不再重复，不同之处在于，色谱分离条件如下：
色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）
柱温：17℃
流动相：乙腈：10%CTAB=94：6
流速：1.5ml/min
检测波长：242±5nm
试验色谱图如图7所示，检测波长242nm。
实施例八
混合脂肪酸分析试验。其与实施例一中相同之处不再重复，不同之处在于，色谱分离条件如下：
色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）
柱温：20℃
流动相：乙腈：10%CTAB=94：6
流速：1.5ml/min
检测波长：242±5nm
试验色谱图如图8所示，检测波长242nm。
实施例九
小麦叶片内囊体膜脂肪酸定量分析试验。
1、仪器、材料与主要试剂
1.1 试验使用仪器
同实施例一。
1.2 材料
新鲜小麦旗叶于-80℃保存备用。
1.3 试剂
内囊体膜提取液：水溶液，每升溶液包含：50mmolNa、K磷酸缓冲液(PH7.4)，200mmolNaCl，100mmol蔗糖，5mmolMgCl2，1mmol DTT。
2、小麦叶片内囊体膜脂肪酸样品制备
2.1内囊体膜的提取
称4g植物材料，加入提取液40ml，研磨成匀浆，用四层纱布过滤。滤液经1000×g离心5min，取上清液，再6000×g离心10min。用提取液分散沉淀过滤，滤液经1000×g离心5min，取上清液，再6000×g离心10min，得到提纯内囊体膜液，其中叶绿素的浓度控制在1～2mg/ml之间。叶绿素浓度用Amon的方法(Arnon，D.I.，1949)在663nm和645nm两种波长测定光吸收和计算。所得内囊体膜液用液氮保存备用。
2.2膜脂肪酸的制备
300μl内囊体膜液中加入6ml氯仿∶甲醇(2∶1，V/V)提取类脂，加入2mL0.76％NaCl使液体分层。取下层，氮气吹干。立即加入2mL2.0％的KOH-甲醇溶解，取500μl溶解液，于100℃水浴皂化30min，待冷至室温后，加入250μl水和25μl浓盐酸，得到自由脂肪酸释放溶液，再用700μl正己烷抽提三次制得膜脂肪酸溶液待用。
3、膜脂肪酸脂化处理
取200μl脂肪酸混合溶液于试管中，以下步骤同实施例一中“3、脂肪酸脂化处理”步骤得到上样待测液。
4、HPLC分析
色谱分析条件
色谱柱：色谱柱：Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)
柱温：18℃
流动相：乙腈∶5％CTAB水溶液＝95∶5
流速：1.5ml/min
检测波长：242nm
试验重复3次，分离色谱图如图9所示。谱图用峰面积法定量，试验结果见表1、2。
表1色谱峰面积值
| 峰面 积 | 亚麻酸 | 棕榈油酸 | 亚油酸 | 油酸 | 棕榈酸 | 硬脂酸 |
| 1 | 328533 | 7100 | 47755 | 15428 | 153348 | 50066 |
| 2 | 359409 | 8472 | 54204 | 15231 | 150988 | 52853 |
| 3 | 319937 | 7354 | 44313 | 14787 | 147174 | 51967 |
| 平均 ±SD | 335959.67 ±11984.38 | 7642.00±421.4 3 | 48757.33±289 8.94 | 15148.67±189. 56 | 150503.33±17 98.68 | 51628.67±822. 13 |
表2单位重量叶片的内囊体中各脂肪酸的含量
| 含量(μg/g) | 亚麻酸 | 棕榈油酸 | 亚油酸 | 油酸 | 棕榈酸 | 硬脂酸 |
| 1 | 187.8920 | 3.1063 | 26.2453 | 8.9997 | 83.2215 | 25.4784 |
| 2 | 205.9030 | 3.7065 | 30.4774 | 8.8848 | 81.8449 | 27.1041 |
| 3 | 182.8776 | 3.2174 | 23.9864 | 8.6258 | 79.6200 | 26.5873 |
| 平均±SD | 192.22±6.99 | 3.34±0.18 | 27.61±1.90 | 8.84±0.11 | 81.56±1.05 | 26.39±0.48 |
Claims (7)
1.一种混合脂肪酸的高效液相色谱分离方法，首先将待测脂肪酸溶液用ω-溴代苯乙酮的丙酮溶液和三乙醇胺的丙酮溶液进行脂化处理得到待测液，再将待测液上样进行高效液相色谱分离，其特征在于：所述高效液相色谱分离用于对样品中亚麻酸、棕榈油酸、亚油酸、油酸、棕榈酸或硬脂酸六种脂肪酸任意组成的混合脂肪酸的同时分离，采用等度洗脱方式分离，色谱柱c18柱，柱温10℃～20℃，检测波长242±5nm，流动相为乙腈与CTAB水溶液的混合液，其中乙腈90%～95%，CTAB水溶液10%～5%，所述CTAB水溶液浓度≤10%。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：采用如下步骤进行：
S1、脂肪酸脂化处理
取25μl脂肪酸溶液至试管中，氮气吹干，加入10mg/mlω-溴代苯乙酮的丙酮溶液和10mg/ml三乙醇胺的丙酮溶液各25μl；试管密封，混合均匀，于沸水中加热15min，待冷却至室温后，加入20mg/ml乙酸的丙酮溶液80μl，于沸水中加热5min，氮气吹干，加入甲醇500μl，振荡1min，在10000r/min条件下离心10min，取上清液待测；
S2、高效液相色谱分离
取S1制得待测液上样分析，流动相流速1.0ml/min～2.0ml/min。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：采用如下步骤进行：
S1、脂肪酸脂化处理
取25μl脂肪酸溶液至试管中，氮气吹干，加入10mg/mlω-溴代苯乙酮的丙酮溶液和10mg/ml三乙醇胺的丙酮溶液各25μl；试管密封，混合均匀，于沸水中加热15min，待冷却至室温后，加入20mg/ml乙酸的丙酮溶液80μl，于沸水中加热5min，氮气吹干，加入甲醇500μl，振荡1min，在10000r/min条件下离心10min，取上清液待测；
S2、高效液相色谱分离
取S1制得待测液上样分析，流动相流速1.0ml/min～2.0ml/min，流动相为如下三种溶液之一：
一、乙腈与CTAB水溶液的混合液，乙腈：CTAB水溶液＝90：10；
二、乙腈与CTAB水溶液的混合液，乙腈：CTAB水溶液＝94：6；
三、乙腈与CTAB水溶液的混合液，乙腈：CTAB水溶液＝95：5。
4.根据权利要求1或2或3所述的分离方法，其特征在于：所述CTAB水溶液浓度为5%。
5.根据权利要求1或2或3所述的分离方法，其特征在于：所述柱温为10℃～17℃。
6.根据权利要求1或2或3所述的分离方法，其特征在于：所述分离色谱条件为：柱温15℃，流动相流速1.5ml/min，流动相为乙腈：5%CTAB水溶液＝95：5。
7.一种小麦叶片内囊体膜脂肪酸分析测定方法，以小麦叶片为植物材料提取得到叶片内囊体膜液，并制得内囊体膜脂肪酸溶液，再将内囊体膜脂肪酸溶液脂化处理，并利用高效液相色谱进行分析测定，其特征在于：所述内囊体膜脂肪酸溶液脂化处理的操作为：取200μl脂肪酸溶液至试管中，氮气吹干，加入10mg/mlω-溴代苯乙酮的丙酮溶液和10mg/ml三乙醇胺的丙酮溶液各25μl；试管密封，混合均匀，于沸水中加热15min，待冷却至室温后，加入20mg/ml乙酸的丙酮溶液80μl，于沸水中加热5min，氮气吹干，加入甲醇500μl，振荡1min，在10000r/min条件下离心10min，取上清液待测；所述高效液相色谱分析测定的色谱分析条件为：色谱柱C18，柱温18℃，流动相乙腈：5%CTAB水溶液=95：5，流速1.5ml/min，检测波长242±5nm。
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