JP2004290024A - 大麦リポキシゲナーゼ−１遺伝子、大麦の選抜方法、麦芽アルコール飲料用原料及び麦芽アルコール飲料の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】麦芽アルコール飲料の香味耐久性および泡持ちを向上させるべく、大麦リポキシゲナーゼ−１欠失大麦を選抜する方法を提供すること。
【解決手段】大麦リポキシゲナーゼ−１遺伝子第５イントロンのスプライシング供与部位のグアニンが他の塩基に変異しているか否かにより大麦リポキシゲナーゼ−１欠失大麦を判別することを特徴とする大麦リポキシゲナーゼ−１欠失大麦の選抜方法とこの選抜方法によって得られた大麦のみに由来する麦芽アルコール飲料用原料を用いた麦芽アルコール飲料の製造方法。
【選択図】 なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、大麦リポキシゲナーゼ−１遺伝子、大麦の選抜方法、麦芽アルコール飲料用原料及び麦芽アルコール飲料の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
麦芽に含まれる酵素である大麦リポキシゲナーゼ−１（以下、「ＬＯＸ−１」という）は、麦芽アルコール飲料を製造する際の仕込工程において麦芽由来のリノール酸を酸化し９−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸を生成する（非特許文献１）。そして、９−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸はさらにペルオキシゲナーゼ様活性によりトリヒドロキシオクタデセン酸（ＴＨＯＤ）へと変換される（非特許文献２）。このＴＨＯＤは、ビールの泡もちを低下させ、また収斂味を与えたり、切れを悪くすることが知られ（非特許文献３、４）、麦芽アルコール飲料の品質の低下を招くことが知られている。また、９−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸は、老化した麦芽アルコール飲料のカードボード臭の原因物質とされるトランス−２−ノネナールにも変換されることが知られている（非特許文献５）。
【０００３】
麦芽アルコール飲料の香味耐久性及び泡持ちを改善するため、ＴＨＯＤやトランス−２−ノネナールの生成を抑える技術として、ＬＯＸ−１活性の低い麦芽を用いる麦芽アルコール飲料を製造する方法が提案されている（非特許文献６）。
【０００４】
また、Ｄｏｕｍａらは大麦に変異原（薬剤）処理を施すことにより誘発突然変異を起こし、ＬＯＸ−１活性が対照の９％に低下した誘発突然変異系統を作出し、それを用いて麦芽アルコール飲料の製造を試みている（特許文献１）。
【０００５】
しかし、そのような大麦を用いても、得られる麦芽アルコール飲料のトランス−２−ノネナール濃度の低減は不十分なものであり、香味耐久性が十分改善されていない。また、ＴＨＯＤ量の低減や泡持ちの改善に関しては何等明らかにされていない。
【０００６】
【特許文献１】
国際公開第０２／０５３７２１号パンフレット
【０００７】
【非特許文献１】
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｆｅｒｍｅｎｔ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ７６， ３７１−３７５， １９９３
【０００８】
【非特許文献２】
Ｋｕｒｏｄａ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ９３， ７３−７７， ２００２
【０００９】
【非特許文献３】
Ｋｏｂｙａｓｈｉ， Ｎ．， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｂｒｅｗ． Ｃｈｅｍ． ６０： ３７−４１． ２００２
【００１０】
【非特許文献４】
Ｋａｎｅｄａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ９２， ２２１−２２６． ２００１
【００１１】
【非特許文献５】
安井 醸造協会誌 ９６：９４−９９（２００１）
【００１２】
【非特許文献６】
Ｄｒｏｓｔ， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｂｒｅｗ． Ｃｈｅｍ． ４８：１２４−１３１ （１９９０）
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、遺伝子操作することなく、香味耐久性や泡持ちを改善された麦芽アルコール飲料を製造するために有用な、ＬＯＸ−１変異遺伝子と、ＬＯＸ−１欠失大麦の選抜方法と、選抜によって得られた大麦に由来する麦芽アルコール飲料用原料と、前記麦芽アルコール飲料用原料を用いた麦芽アルコール飲料の製造方法と、を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべき鋭意研究を重ねた結果、ＬＯＸ−１活性を全く欠いた在来大麦品種を見出すとともに、当該大麦品種から新規なＬＯＸ−１変異遺伝子を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明のＬＯＸ−１変異遺伝子は、既知のＬＯＸ−１遺伝子の第５イントロンのスプライシング供与部位（５’−ＧＴ−３’）のグアニンが他の塩基に変異していることを特徴とする。ここで、前記他の塩基がアデニンであることが好ましい。
【００１６】
また、本発明のＬＯＸ−１欠失大麦の選抜方法は、ＬＯＸ−１遺伝子第５イントロンのスプライシング供与部位のグアニンが他の塩基に変異しているか否かにより大麦ＬＯＸ−１欠失大麦を判別することを特徴とする。ここで、前記他の塩基がアデニンであることが好ましい。
【００１７】
さらに、本発明のＬＯＸ−１欠失大麦の選抜方法は、被検対象である大麦からゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工程と、抽出したゲノムＤＮＡからＬＯＸ−１遺伝子第５イントロンのスプライシング供与部位を含むＤＮＡ断片を増幅するＤＮＡ断片増幅工程と、前記ＤＮＡ断片増幅工程で増幅されたＬＯＸ−１遺伝子第５イントロンのスプライシング供与部位を含むＤＮＡ断片を制限酵素で切断して所定の塩基数のＤＮＡ断片を検出し、スプライシング供与部位のグアニンが他の塩基に変異しているか否かにより大麦ＬＯＸ−１欠失大麦を判別するＤＮＡ断片検出工程と、を含むことを特徴とする。
【００１８】
ここで、前記ＤＮＡ断片検出工程において使用する制限酵素が塩基配列５’−ＧＴＡＣ−３’を認識するＡｆａＩおよび／またはＲｓａＩであることが好ましい。
【００１９】
上記発明によれば、ＬＯＸ−１遺伝子第５イントロンのスプライシング供与部位のグアニンの変異の有無に基づき、ＬＯＸ−１活性欠失形質を有する大麦品種であるか否かを選別することが可能となる。
【００２０】
その結果、ＬＯＸ−１活性を直接測定しなくとも遺伝子レベルの解析で容易にＬＯＸ−１活性を欠いた大麦品種を選別することができる。特に、酵素活性は直物個体の生育段階、環境などに影響され正確な測定が困難な場合があるが、この方法によれば酵素測定と異なり環境などに影響されることなくＬＯＸ−１活性が欠失した大麦品種を選抜することができる。さらに、酵素活性を測定するには種子が実るまで行うことができないが、ＤＮＡ判別は開花前に行えるため早期に活性欠失形質か否かの判定ができ、また連続戻し交配などに有効である。
【００２１】
また、本発明の麦芽アルコール飲料用原料は、本発明のＬＯＸ−１変異遺伝子を持つ大麦のみに由来する種子、麦芽、モルトエキス、大麦分解物または大麦加工物であることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明の麦芽アルコール飲料用原料は、本発明のＬＯＸ−１欠失大麦の選抜方法により選抜された大麦のみに由来する種子、麦芽、モルトエキス、大麦分解物または大麦加工物であることを特徴とする。
【００２３】
さらに、本発明の麦芽アルコール飲料の製造方法は、本発明の麦芽アルコール飲料用原料を用いることを特徴とする。
【００２４】
上記本発明によれば、原料中にＬＯＸ−１を含まないため、麦芽アルコール飲料の製造工程においてリノール酸から９−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸が生成し難くなり、したがってＴＨＯＤやトランス−２−ノネナールも生成し難くなるため、香味耐久性と泡持ちが向上した麦芽アルコール飲料を得ることができる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２６】
まず、本発明にかかるＬＯＸ−１変異遺伝子について説明する。
【００２７】
本発明にかかるＬＯＸ−１変異遺伝子は、本発明者らによって見出された新規遺伝子であり、既知のＬＯＸ−１遺伝子（配列番号１）と比較してＬＯＸ−１遺伝子第５イントロンの６０番目の塩基ＧがＡに置換されていることを特徴とする（配列番号２）。ＬＯＸ−１遺伝子第５イントロンの６０−６１番目はスプライシング供与部位（５’−ＧＴ−３’）であるため、この塩基の置換によりＬＯＸ−１はスプライシングに異常をきたし、活性のあるＬＯＸ−１を発現できなくなる。
【００２８】
なお、配列表の配列番号１には既知のＬＯＸ−１遺伝子の第５イントロン領域の塩基配列を、配列番号２には本発明のＬＯＸ−１変異遺伝子のＬＯＸ−１遺伝子の第５イントロン領域に相当する部分の塩基配列を示した。
【００２９】
次に、本発明のＬＯＸ−１欠失大麦の選抜方法について説明する。
【００３０】
本発明のＬＯＸ−１欠失大麦の選抜方法は、ＬＯＸ−１遺伝子の第５イントロンのスプライシング供与部位のグアニンが他の塩基に変異しているか否かにより大麦ＬＯＸ−１欠失大麦を判別することを特徴とする。
【００３１】
上記の塩基の変異を利用してＬＯＸ−１欠失大麦を選抜する方法としては、例えば、プライマー配列の３’末端、あるいはプライマー配列内部に上記変異部位を含むプライマーを用いてＤＮＡの増幅を行い、増幅の有無や増幅効率で塩基の変異を検出し、ＬＯＸ−１欠失大麦を選抜する方法や上記変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、塩基配列を決定することによっても塩基の変異を検出し、ＬＯＸ−１欠失大麦を選抜する方法などを用いることが可能である。
【００３２】
これら塩基の変異の検出には、ＤＮＡ断片が検出可能であれば特に制限は無いが、アガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いれば良い。また、増幅の有無や増幅効率でＤＮＡ変異を検出する場合には、上記電気泳動のほか、ＴＡＱＭＡＮ法など定量的ＰＣＲ法も用いることができる。
【００３３】
また、本発明のＬＯＸ−１欠失大麦の選抜方法は、好ましくは、
被検対象である大麦からゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工程と、
抽出したゲノムＤＮＡからＬＯＸ−１遺伝子第５イントロンのスプライシング供与部位を含むＤＮＡ断片を増幅するＤＮＡ断片増幅工程と、
前記ＤＮＡ断片増幅工程で増幅されたＬＯＸ−１遺伝子第５イントロンのスプライシング供与部位を含むＤＮＡ断片を制限酵素で切断して所定の塩基数のＤＮＡ断片を検出し、スプライシング供与部位のグアニンが他の塩基に変異しているか否かにより大麦ＬＯＸ−１欠失大麦を判別するＤＮＡ断片検出工程と、
を含むことを特徴とする。
【００３４】
まず、本発明にかかるゲノムＤＮＡ抽出工程について説明する。
【００３５】
被検対象である大麦からゲノムＤＮＡを抽出する方法としては特に制限はなく、公知の方法によって行うことができるが、具体的には例えば、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４３２１−４３２５）やＥｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ法（Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｐｒａｋａｓｈ １９９１， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ． ９：６−１２）によって抽出することができる。ここで、ゲノムＤＮＡを抽出する組織は大麦種子のみならず、葉、茎、根等を用いることも可能である。例えば、葉を用いることで、戻し交配世代途中の多数の個体選抜に利用することが可能となる。
【００３６】
次に本発明にかかるＤＮＡ断片増幅工程について説明する。
【００３７】
ＤＮＡ断片を増幅する方法としては特に制限されないが、例えば、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ）によって行うことができる。ここで、ＰＣＲ法において用いられるプライマーは、ＬＯＸ−１遺伝子第５イントロンのスプライシング供与部位を含むＤＮＡ断片を増幅することができる領域に設定されているものであれば、塩基配列は特に制限されないが、具体的には例えば、ＬＯＸ−１遺伝子において塩基数が１０〜６０個の連続した塩基であることが好ましく、１５〜３０個の連続した塩基であることがより好ましい。また、一般的には、プライマーの塩基配列におけるＧＣ含量が４０〜６０％であることが好ましい。さらに、ＰＣＲ法に用いる二つのプライマーのプライマー間のＴｍ値に差がないまたは少ないことが好ましい。また、プライマー内で２次構造を取らないことが好ましい。
【００３８】
次に本発明にかかるＤＮＡ断片検出工程について説明する。
【００３９】
本発明にかかるＬＯＸ−１変異遺伝子は、上述したように既知のＬＯＸ−１と塩基配列に相違が見られるため、当該相違部分を認識するまたは切断する制限酵素を用いて増幅産物を切断すれば、得られるＤＮＡ断片のサイズに相違が見られる。本発明にかかる制限酵素としては、このように前記相違部分を認識するまたは切断するものであれば特に制限はないが、既にこのような作用を有することが判明している制限酵素ＡｆａＩおよび／またはＲｓａＩであることが好ましい。
【００４０】
すなわち、本発明のＬＯＸ−１変異遺伝子は、スプライシング供与部位のグアニンが他の塩基に変異していることにより、既知のＬＯＸ−１遺伝子に存在していた制限酵素ＡｆａＩおよびＲｓａＩの切断部位（５’−ＧＴＡＣ−３’：第５イントロン６０−６３番目）が消失している。その結果、この切断部位を含む遺伝子増幅産物をＡｆａＩおよび／またはＲｓａＩで切断した際の切断パターンが既知のＬＯＸ−１遺伝子の場合と異なるため、ＬＯＸ−１変異遺伝子か否かを判別することが可能である。
【００４１】
また、所定の塩基数のＤＮＡ断片とは、前記相違部分が存在することにより、増幅産物を制限酵素で切断して得られるＤＮＡ断片のサイズに相違が見られるようなＤＮＡ断片であれば、その塩基数は特に制限されない。
【００４２】
また、本工程にかかる検出とは、制限酵素によって切断されたＤＮＡ断片が検出可能な方法であれば特に制限されないが、具体的には例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出すればよい。
【００４３】
次に、本発明の麦芽アルコール飲料用原料について説明する。
【００４４】
本発明の麦芽アルコール飲料用原料は、本発明のＬＯＸ−１変異遺伝子を持つ大麦のみに由来する種子、麦芽、モルトエキス、大麦分解物または大麦加工物であることを特徴とし、また、本発明の大麦の選抜方法によって選抜された大麦のみに由来する種子、麦芽、モルトエキス、大麦分解物または大麦加工物であることを特徴とする。
【００４５】
ここで、モルトエキスとは麦芽の抽出物を指し、例えば麦芽中の糖成分やタンパク質成分の抽出物等が挙げられる。大麦分解物とは大麦を酵素等で分解処理したものを指し、大麦糖化液等がこれに該当する。大麦加工物とはビール・発泡酒の副原料として使用される大麦粉砕物などがこれに該当する。
本発明の麦芽アルコール飲料用原料はＬＯＸ−１を含まないため、麦芽アルコール飲料の製造工程においてリノール酸から９−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸が生成し難くなり、したがってＴＨＯＤやトランス−２−ノネナールも生成抑制が期待され、香味耐久性と泡持ちが向上した麦芽アルコール飲料を得ることが期待できる。
【００４６】
最後に、本発明の麦芽アルコール飲料の製造方法について説明する。
【００４７】
本発明の麦芽アルコール飲料の製造方法は、本発明の麦芽アルコール飲料用原料を用いることを特徴とする。
【００４８】
まず、本発明にかかる製麦工程について説明する。
【００４９】
本発明にかかる製麦工程は、ＬＯＸ−１欠失大麦を用いることを特徴とした麦芽を得る工程であり、製麦の方法としては特に制限されず公知の方法で行えば良い。具体的には、例えば、浸麦度が４０％〜４５％に達するまで浸麦後、１０〜２０℃で３〜６日間発芽させ、焙燥して麦芽を得ることができる。
【００５０】
次に、本発明にかかる仕込工程について説明する。
【００５１】
本発明にかかる仕込工程は、前記麦芽を糖化させて麦汁を得る工程である。具体的には、さらに以下の第１〜第４の工程に分けられる。
【００５２】
すなわち、第１の工程は、前記麦芽を含む原料と仕込用水とを混合し、得られた混合物を加温することにより麦芽を糖化させ、前記糖化された麦芽から麦汁を採取する仕込み工程である。
【００５３】
本工程において用いられる麦芽は、大麦に水分と空気を与えて発芽させ、乾燥して幼根を取り除いたものであることが望ましい。麦芽は麦汁製造に必要な酵素源であると同時に糖化の原料として主要なデンプン源となる。また、麦芽アルコール飲料特有の香味と色素を与えるため発芽させた麦芽を焙燥したものを麦汁製造に用いる。また、さらに原料として、上記麦芽以外に、本発明にかかるＬＯＸ−１欠失大麦あるいは一般大麦、コーンスターチ、コーングリッツ、米、糖類等の副原料を添加しても良い。
【００５４】
また、前記麦汁の製造工程において、本発明にかかるＬＯＸ−１欠失大麦あるいは一般大麦より調製されたモルトエキスあるいは大麦分解物、大麦加工物を仕込み用水と混合し、必要に応じて前記副原料を添加し麦汁を得ることもできる。
【００５５】
前記麦芽は仕込み用水に添加した後、混合される。前記副原料を添加する場合には、ここで混合すればよい。糖類の場合は、後述の煮沸の前に添加してもよい。また、前記仕込み用水は特に制限されず、製造する麦芽アルコール飲料に応じて好適な水を用いればよい。糖化は基本的に既知の条件で行えばよい。こうして得られた麦芽糖化液をろ過した後、ホップあるいはハーブなど、香り、苦味などを付与できる原料を添加して煮沸を行ない、それを冷却することにより冷麦汁が得られる。
【００５６】
また、第２の工程は、前記冷麦汁に酵母を添加して発酵させ麦芽アルコール飲料中間品を得る工程である。
【００５７】
ここで、用いられる酵母は、前記麦芽の糖化によって得られた麦汁内の糖分を代謝してアルコールや炭酸ガス等を産生する、いわゆるアルコール発酵を行う酒類酵母であればいずれでもよく、具体的には、例えば、サッカロミセス・セレビシェ、サッカロミセス・ウバルム等が挙げられる。
【００５８】
発酵は、上記仕込み工程で得られた麦汁を冷却し、ここに前記酵母を添加して行う。発酵条件については基本的に既知の条件と変わらず、例えば発酵温度が通常１５℃以下、好ましくは８〜１０℃であり、発酵時間が好ましくは８〜１０日である。
【００５９】
さらに、第３の工程は、前記発酵工程で得られた麦芽アルコール飲料中間品を貯蔵する貯酒工程である。
【００６０】
本工程では、アルコール発酵が終了した発酵液が密閉タンクに移され、貯蔵される。貯蔵条件については基本的に既知の条件と変わらず、例えば貯蔵温度は０〜２℃が好ましく、貯蔵時間が２０〜９０日間であることが好ましい。発酵終了液を貯蔵することにより残存エキスの再発酵と熟成が行われる。
【００６１】
そして、第４の工程は、前記貯酒工程で得られた麦芽アルコール飲料中間品をろ過し麦芽アルコール飲料を得るろ過工程である
ろ過条件については基本的には既知の条件と変わらず、例えばろ過助材として珪藻土、ＰＶＰＰ（ポリビニルポリピロリドン）、シリカゲル、セルロースパウダー等が用いられ、温度は０±１℃で行われる。
【００６２】
こうして麦芽アルコール飲料が得られる。ろ過された麦芽アルコール飲料はそのまま、または無菌ろ過や加熱処理を行った後、タンク詰め、樽詰め、ビン詰めまたは缶詰めされ市場に出荷される。
【００６３】
なお、麦芽アルコール飲料は、その製造に用いられる麦芽の使用比率の多少は特に制限されず、麦芽を原料として製造されるアルコール飲料であればよい。具体的には例えば、ビールや発泡酒が挙げられる。また、いわゆるノンアルコールビールやノンアルコール発泡酒も、ビール等の麦芽アルコール飲料と同様の製法を用いることから、麦芽アルコール飲料である。
【００６４】
上記本発明によれば、原料中にＬＯＸ−１を含まないため、麦芽アルコール飲料の製造工程においてリノール酸から９−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸が生成し難くなり、したがってＴＨＯＤやトランス−２−ノネナールも生成抑制が期待され、香味耐久性と泡持ちが向上した麦芽アルコール飲料を得ることが期待できる。
【００６５】
【実施例】
以下、実施例により本発明の内容をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００６６】
探索試験１
（ＬＯＸ−１酵素活性測定によるＬＯＸ−１欠失大麦の探索）
以下の方法によりＬＯＸ−１酵素活性測定を行い、大麦遺伝資源の中からＬＯＸ−１欠失大麦の探索を行った。
【００６７】
まず、以下の方法により大麦種子より粗酵素液を抽出した。完熟大麦種子１粒をハンマーで破砕し、５００μＬの抽出バッファー（０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５））を用いて、４℃で３０分間振とうして抽出した。得られた抽出液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を粗酵素液とした。
【００６８】
次に、粗酵素液１０μＬに５μＬの基質液（４０ｍＭリノール酸、１．０％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０水溶液）及び８５μＬの抽出バッファーを加え混和した後、２４℃で５分間反応させた。反応の停止は、１００μＬの反応停止液（８０ｍＭ ２，６−ジ−ｔ−ブチル−ｐ−クレゾール メタノール溶液）を添加し混和することで行った。反応液を−２０℃で３０分間静置した後、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を次の発色反応に用いた。得られた上清２０μＬに、２００μＬの発色液（４ｍＭ２，６−ジ−ｔ−ブチル−ｐ−クレゾール、２５ｍＭ硫酸、０．２５ｍＭ硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）６水和物、１００ｍＭキシレノールオレンジ、９０％メタノール水溶液）を添加し、３０分間静置後、波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、陰性対照としては、粗酵素液を１００℃で５分間熱処理し、ＬＯＸ−１を失活させたものを同様に反応させたものを用い、陽性対照として大麦品種Ｋｅｎｄａｌｌの種子の粗酵素液を用いた。
【００６９】
遺伝資源の探索の結果、図１に示すように、ＳＶ７３（岡山大学保存ＯＵＩ００３）の種子には有意なＬＯＸ−１活性が認められないことが判明した。このＳＶ７３は在来種であることから、突然変異誘発を施した系統ではなく自然突然変異体である。
【００７０】
証明試験１
（ＳＶ７３粗酵素液にＬＯＸ−１阻害活性のないことの確認）
次に、ＳＶ７３粗酵素液のＬＯＸ−１阻害活性の有無について調べた。
【００７１】
ＬＯＸ−１活性を示す粗酵素液（陽性対照：ＰＣ）にＳＶ７３の粗酵素液（１０μＬ、２０μＬ、５０μＬ）を添加してＬＯＸ−１活性の変化を調べたところ、ＳＶ７３の粗酵素液の添加によってもＬＯＸ−１活性は変化せず、ＳＶ７３粗酵素液にＬＯＸ−１阻害活性は認められなかった（図２）。このことから、ＳＶ７３のＬＯＸ−１活性欠失の原因はＬＯＸ活性阻害物質によるものではないと考えられる。
【００７２】
証明試験２
（ＳＶ７３種子中のＬＯＸ−１タンパク質発現量の確認）
次に、抗ＬＯＸ−１抗体を用いて、ＳＶ７３の種子にＬＯＸ−１タンパク質が発現しているか否かを調べた。
【００７３】
まず、抗ＬＯＸ−１抗体の作成を行った。抗原として用いたＬＯＸ−１タンパク質は、大腸菌で発現させたＬＯＸ−１タンパク質を精製することで得た（Ｋｕｒｏｄａ ｅｔ． ａｌ． （２００２） Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９３：７３−７７）。精製したタンパク質をウサギに免疫し、ＬＯＸ−１抗体を作製した。本抗体は、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２を認識する。
【００７４】
次に、以下の方法でウェスタンブロッティングを行い、ＳＶ７３の種子におけるＬＯＸ−１タンパク質の発現について調べた。ＳＶ７３から０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて抽出した全可溶性タンパク質３μｇを、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分画後、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社）にブロッティングした。このメンブレンをＴＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％（ｗ／ｖ） アジ化ナトリウム））で洗浄後、ＬＯＸ−１抗体液（１０００倍希釈／ＴＴＢＳ）で３０分間反応させた。メンブレンのＴＴＢＳ洗浄を５分３回行った後、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体液（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、１０００倍希釈ＴＴＢＳ溶液）で３０分間反応させた。メンブレンをＴＴＢＳで５分間×２回洗浄を行い、さらにＡＰ９．５（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、５ｍＭ 塩化マグネシウム）で５分×１回洗浄を行った後、アルカリフォスファターゼ基質液（１ｍｇ／ｍｌ ニトロブルーテトラゾリウム、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＣＩＰ、 ＡＰ９．５溶液）と反応させ発色させた。その結果、対照品種（Ｋｅｎｄａｌｌ）では約９５Ｋｄの分子量を持つ強いバンドが得られたのに対して、ＳＶ７３系統種子では約９５Ｋｄおよび約５７Ｋｄの分子量領域に非常に薄いバンドが検出された（図３Ａ）。
【００７５】
また、この抽出サンプルを、ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、等電点電気泳動（ＩＥＦ、ｐＩ３−９）を行った後、同様にウェスタン解析した。その結果、ＳＶ７３では、ＬＯＸ−２のｐＩの位置にバンドが検出されたが、ＬＯＸ−１のｐＩの位置には明瞭なバンドは認められなかった（図３Ｂ）。このことから、ＳＶ７３の種子抽出タンパク質で認められた約９５Ｋｄのバンドは、ＬＯＸ−２タンパク質であると考えられる。
【００７６】
以上の結果から、ＳＶ７３の種子には、ＬＯＸ−１タンパク質がほとんど発現していないことが確認された。
【００７７】
証明試験３
（ＳＶ７３の種子のＬＯＸ−１ＲＮＡの解析）
ＳＶ７３の登熟約４週間目の種子および発芽３日目の種子から抽出した全ＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行った。反応は市販のキット（ロシュダイアグノスティック社製、パーキンエルマー社製）を用いて、キットのマニュアルに従い行った。プライマーは既報の配列（ＤＮＡデータバンク：アクセッションＬ３５９３１）をもとに、５’−ＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号３）及び５’−ＧＧＴＴＧＣＣＧＡＴＧＧＣＴＴＡＧＡＴ−３’（配列番号４）に設計した。ＰＣＲは、９４℃２分を１回、９４℃１分、６０℃２分、７２℃４分の反応を３１回繰り返した後、７２℃で７分の伸長反応を行った。
【００７８】
増幅されたＤＮＡを電気泳動したところ、対照（品種Ｋｅｎｄａｌｌ）よりは若干増幅量が少ないものの、登熟中および発芽中のＲＮＡに対して、約２．５Ｋｂのバンドの増幅が検出された（図４）。このことは、ＬＯＸ−１遺伝子が正常に転写されていることを示している。
【００７９】
以上、ＳＶ７３の種子において、（１）ＬＯＸ−１活性が認められなかったこと、（２）ＬＯＸ−１抗体に反応する抗原タンパク質が微量にしか存在しなかったこと、（３）約５７Ｋｄの分子量のタンパク質の存在が認められたこと、（４）ＬＯＸ−１のｍＲＮＡが認められたことなどから、ＳＶ７３のＬＯＸ−１活性が欠失しているメカニズムは、転写以降の異常によると考えられる。
【００８０】
証明試験４
（ＳＶ７３のＬＯＸ−１遺伝子イントロン領域の構造解析）
ＬＯＸ−１遺伝子のイントロンおよびエクソン領域の構造を解析するため、全エクソンを含む領域のゲノムＤＮＡを単離した。鋳型にはＳＶ７３の全ＤＮＡを用いた。プライマーは既報の配列（ＤＮＡデータバンク：アクセッション Ｕ８３９０４，Ｌ３５９３１）をもとに、設計した（５’−ＣＡＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＣＧＡＴＣＣＡＴＣ−３’（配列表配列番号５）、５’−ＧＧＴＴＧＣＣＧＡＴＧＧＣＴＴＡＧＡＴ−３’（配列表配列番号４））。ＰＣＲは、９４℃１分、６５℃２分、７２℃３分の反応を３１回繰り返した後、７２℃で７分の伸長反応を行った。得られたＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１にクローニングし（ｐＧＬＸＡＢＡＬ１）、構造解析の鋳型とした。構造解析はＡＢＩ社のシーケンサーを用い、シークエンス反応はダイターミネーター法を用いた。
【００８１】
配列表の配列番号１は、既報のＬＯＸ−１遺伝子の塩基配列（ＷＯ ０２０５３７２１）のうち、第５イントロンがある領域の構造を示した。スプライシングの供与部位は６０−６１番目の塩基配列５’−ＧＴ−３’である。
【００８２】
一方、解析の結果から分かったＳＶ７３の対応する領域の塩基配列を配列番号２に示した。ＳＶ７３では、スプライシング供与部位である６０番目のグアニンがアデニンに変異していることが明らかになった。
【００８３】
また、配列番号２の６０番目の塩基がアデニンに置換されていることにより、終止コドンが新たに形成され（配列表配列番号２の５８−６０番目の塩基配列５’−ＴＧＡ−３’）、スプライシング部位の５’上流への変化が生じていない場合にはＬＯＸ−１タンパク質の翻訳はここで終了すると考えられる（図５）。
【００８４】
第５イントロンの近傍のエクソン領域は、植物ＬＯＸの活性中心であることが知られており（Ｓｈｉｂａｔａ ａｎｄ Ａｘｅｌｒｏｄ （１９９５） Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｄｉａｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ １２：２１３−２２８）、上記スプライシング異常は、ＬＯＸ−１酵素活性に大きな影響を及ぼすと考えられる。
【００８５】
証明試験５
（第５イントロンにおけるスプライシングの解析）
第５イントロンにおいて実際にスプライシング異常が起こっていることを確認するためにＲＴ−ＰＣＲによる解析を行った。
【００８６】
発芽中のＳＶ７３およびＫｅｎｄａｌｌから全ＲＮＡを抽出し、市販のキット（ロシュダイアグノスティック社製）を用いてｃＤＮＡを合成し鋳型ＤＮＡとした。ゲノムＤＮＡにおいて、増幅断片が第３イントロン（１０６ｂｐ）、第４イントロン（１３２ｂｐ）および第５イントロン（７９ｂｐ）を含むように設計した２種のプライマー（５’−ＣＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＧＧＣＡＴＣＣＴＧ−３’（配列表配列番号６），５’−ＧＣＧＴＴＧＡＴＧＡＧＣＧＴＣＴＧＣＣＧ−３’（配列表配列番号７））を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃１分、６５℃２分、７２℃３分の反応を３１回繰り返した後、７２℃で７分の伸長反応を行った。増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動したところ、ＳＶ７３の増幅断片は、Ｋｅｎｄａｌｌの増幅断片より約８０ｂｐ塩基数が大きかった（図６Ａ）。なお、ＳＶ７３のゲノムＤＮＡに対しては約１．２Ｋｂの断片が増幅されており、上記ＲＴ−ＰＣＲの結果は、発現しているＲＮＡに対する結果であると考えられる。
【００８７】
次に、第３イントロン（１０６ｂｐ）、第４イントロン（１３２ｂｐ）および第５イントロン（７９ｂｐ）のいずれのイントロンがスプライシング異常をおこしているか調べるために、上記増幅断片を第４イントロン（１３２ｂｐ）と第５イントロンの間のエクソン領域に存在する制限酵素ＳｔｕＩ部位で消化した。その結果、第５イントロンを含むＤＮＡ断片は、ゲノムＤＮＡの増幅断片の移動度と等しいことから、第５イントロンのスプライシングが異常をおこし、スプライシングされないか、あるいはスプライシング部位が３’側にずれこんでいることが明らかになった（図６Ｂ）。すなわち、図５で示した新たにできた終止コドンにより、ＳＶ７３のＬＯＸ−１タンパク質の翻訳はこのコドンで終了し、ＬＯＸ−１活性が失われていることが明らかになった。
【００８８】
証明試験６
（第５イントロン変異を用いた大麦交配系統のマッピングと選抜）
既報のＬＯＸ−１塩基配列においては、第５イントロンのスプライシング供与部位を含む配列は（配列表配列番号１の６０−６３番目：５’−ＧＴＡＣ−３’）、ＧＴＡＣ配列を認識する制限酵素ＡｆａＩ（ＲｓａＩ）で消化できる。一方、ＳＶ７３系統では、この領域の配列に変異があり（配列表配列番号２の６０−６３番目：５’−ＡＴＡＣ−３’）、ＡｆａＩおよび／あるいはＲｓａＩで消化できなくなっていること（図５）を利用して、ＬＯＸ−１欠失遺伝子のマッピングを行った。大麦品種ＫｅｎｄａｌｌとＳＶ７３の雑種第２世代（Ｆ２）１４４個体の葉からＤＮＡを抽出し、増幅断片がこのＡｆａＩ部位を含むように設計した２種のプライマー（５’−ＣＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＧＧＣＡＴＣＣＴＧ−３’（配列表配列番号６），５’−ＧＣＧＴＴＧＡＴＧＡＧＣＧＴＣＴＧＣＣＧ−３’（配列表配列番号７））を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃１分、６５℃２分、７２℃３分の反応を３１回繰り返した後、７２℃で７分の伸長反応を行った。増幅された断片をＡｆａＩで切断し、２．５％アガロースゲル電気泳動で分析した（以上をＡｆａＩ法と呼ぶ）。その結果、ＳＶ７３型、Ｋｅｎｄａｌｌ型、およびヘテロ型を容易に見分けることが出来た（図７）。ＡｆａＩ法多型調査に加え、ＬＯＸ−１遺伝子が座上している大麦４Ｈ染色体のＬＯＸＡ遺伝子座近傍のＤＮＡマーカー（ＪＢＣ９７０）についても、各系統の多型調査を行った（図８）。
【００８９】
次に、このＦ２個体に実った種子を用いて、種子ＬＯＸ活性を調査した。ＬＯＸ活性が認められない系統については、さらに複数種子（４〜７粒）の活性測定を行った（図８）。
【００９０】
以上のＦ２世代のＡｆａＩ法多型調査とＦ３種子のＬＯＸ活性測定の結果、ＳＶ７３のＬＯＸ−１欠失形質の分離は上記ＡｆａＩ法多型の分離と完全に一致した。すなわち、ＳＶ７３のＬＯＸ−１欠失遺伝子がＬＯＸＡ遺伝子座にあることが、これら一連の遺伝学的調査から明らかとなった。
【００９１】
また、この結果は、ＤＮＡ変異を利用した大麦選抜法の１例であるＡｆａＩ法を用いれば、ＬＯＸ−１欠失の交配系統を大麦成育初期の葉の段階で選抜でき、種子が実るのを待つ必要はないことを示している。
【００９２】
実施例１
（他の大麦品種のＡｆａＩ多型調査）
一般的な大麦品種／系統を用いて、ＡｆａＩ法多型調査を行った。用いた品種は、ミカモゴールデン、ゴールデンメロン、はるな二条、みょうぎ二条、さきたま二条、ワセドリ二条、あぐりもち、ハルピン二条、りょうふう、北育３３号、北育３５号、Ｐｒｉｏｒ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｓｌｏｏｐ、Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ｂｅｔｚｅｓ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｎｌｅｙ、Ｂ１２５１、ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、ＣＤＣ Ｓｔｒａｔｕｓ、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、Ｈａｎｎａ、Ｍｅｒｉｔ、ＡＣ Ｍｅｔｃａｌｆｅ、ＴＲ１４５、Ｃｈａｒｉｏｔ、Ｓｔｉｒｌｉｎｇ、Ｐｒｏｃｔｏｒ、Ｋｏｒａｌ、Ｈｅａｒｔｌａｎｄ、計３２品種／系統である。ＡｆａＩ法多型調査の結果、供試したこれらの品種はＳＶ７３型ではなく、第５イントロンのスプライシング供与配列を含む制限酵素ＡｆａＩ部位（配列表配列番号１の６０−６３番目：５’−ＧＴＡＣ−３’）が消化されていた（図９）。このことは、これら育成系統において、ＡｆａＩ部位（配列表配列番号１の６０−６３番目：５’−ＧＴＡＣ−３’）にＤＮＡ変異が認められないことを示すものであり、交配系統のＬＯＸ−１欠失遺伝子の選抜に、このＡｆａＩ法が有効に利用できる。
【００９３】
実施例２
（遺伝資源の探索）
岡山大学保存の世界の遺伝資源（在来種）についてＡｆａＩ法による調査を行った。その結果、新たな５系統において、第５イントロンのスプライシング供与配列を含む制限酵素ＡｆａＩ部位（配列表配列番号１の６０−６３番目：５’−ＧＴＡＣ−３’）が消化されない系統を見出した（岡山大学保存ＯＵＩ００１（インド），ＯＵＪ０９５（台湾）、ＯＵＪ６９５（台湾）、ＯＵＮ３４５（ネパール）、ＯＵＮ３４７（ネパール））（図１０）。
【００９４】
次に、これらの系統の種子のＬＯＸ−１活性を探索試験１に記載の方法で測定した。なお、ＯＵＮ３４５およびＯＵＮ３４７につては活性測定を反応５分で行い（図１１Ａ）、ＯＵＩ００１、ＯＵＪ０９５、ＯＵＪ６９５についてはより活性の有無を明確にできるよう反応時間を９０分にのばして活性測定した（図１１Ｂ）。その結果、これらの全ての系統において有意な活性は認められなかった（図１１）。
【００９５】
このことから、ＳＶ７３、ＯＵＩ００１（インド），ＯＵＪ０９５（台湾）、ＯＵＪ６９５（台湾）、ＯＵＮ３４５（ネパール）、ＯＵＮ３４７（ネパール）（ＳＶ７３型ＬＯＸ−１欠失大麦）はＬＯＸ−１欠失大麦であることが明らかとなった。これらの系統はいずれも、在来種であり、変異誘発を行った系統ではないことから、ＬＯＸ−１遺伝子に関して自然突然変異体である。
【００９６】
以上の結果から、ＤＮＡ変異を利用した大麦選抜法の１例であるＡｆａＩ法は、ＬＯＸ−１欠失大麦交配後代系統の選抜のみならず、大麦遺伝資源からでも効率的にＬＯＸ−１欠失大麦の選抜を可能にする技術であることが明らかとなった。
【００９７】
実施例３
（試験醸造用大麦の育成）
大麦品種大正麦とＳＶ７３を交配し、得られた雑種第１代（Ｆ１）を自殖して得られるＦ２世代において、上記実施例１に記載のＬＯＸ−１酵素活性測定法および上記実施例７に記載の上記ＡｆａＩ法によりＬＯＸ−１欠失形質を確認し、ＬＯＸ−１欠失系統６個体、ＬＯＸ−１保有系統１０個体を集団として、以降の種子増殖に供試した。
【００９８】
種子増殖は各系統（集団）ごとに行い、Ｆ４種子が得られるまで均一な畑あるいは温室を用いて行った。Ｆ４種子についてＬＯＸ−１酵素活性を測定したところ、Ｆ２個体で判別されたＬＯＸ−１活性の有無を維持しており、この結果からＬＯＸ−１欠失形質は安定して後代に伝達されることが明らかになった。
【００９９】
以降の麦芽製造試験および麦芽アルコール飲料製造試験には、このＦ４種子を供試した。
【０１００】
実施例４
（試験醸造用麦芽の製造）
上記大正麦×ＳＶ７３の交配に由来する、ＬＯＸ−１活性を有しない大麦種子からなるＬＯＸ−１欠失大麦Ｆ４集団（ＬＯＸ−Ｆ４）と、ＬＯＸ−１を有する大麦種子からＬＯＸ活性保有大麦Ｆ４集団（ＬＯＸ＋Ｆ４）をつくり、製麦に用いた。
【０１０１】
製麦は、Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｍａｌｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈｅｎｉｘ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、浸麦１６℃合計８２時間（５時間ＷＥＴ／７時間ＤＲＹサイクル）、発芽１５℃１３９時間、焙燥２９時間（５５℃１３．５時間、６５℃８時間、７５℃３．５時間、８３℃４時間）の条件で行った。
【０１０２】
実施例５
（麦芽及び麦汁の分析）
麦芽の分析は、ＥＢＣ標準法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｒｅｗｅｒｙ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ編、Ａｎａｌｙｔｉｃａ ＥＢＣ （４^ｔｈ Ｅｄ）、１９８７）に従い行った。その結果、ＬＯＸ−Ｆ４とＬＯＸ＋Ｆ４を用いた麦芽には大きな差がなく、ＬＯＸ−１活性の有無を比較する目的の麦芽アルコール飲料醸造に問題なく使用できることが明らかになった（図１２）。
【０１０３】
次に、麦芽５０ｇを用いて、コングレス法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｒｅｗｅｒｙ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ編、Ａｎａｌｙｔｉｃａ ＥＢＣ （４^ｔｈ Ｅｄ）、１９８７）により麦汁を作製し、麦汁中の脂質酸化物を分析した。
【０１０４】
まず、麦汁中のトランス−２−ノネナール量を以下の方法で測定した。麦汁サンプル８ｍＬにバイアルに入れ、３ｇのＮａＣｌを添加しキャップをした。次にスペルコ製ポリジメチルシロキサンＳＰＭＥファイバーを挿入し、４０℃で１５分間インキュベートした後、ガスクロマトグラフィーに供試した。
【０１０５】
ガスクロマトグラフィー・マススペクトロメトリーは、キャピラリーカラムとしてＪ＆Ｗ社製ＤＢ−１（３０ｍ Ｘ ０．２５ｍｍ， フィルム厚１μｍ）を、キャリアガスとしてヘリウム（１ｍＬ／分）を用い、オーブン条件は６０℃から２２５℃（５℃／分）とし、セレクトイオンモード（ｍ／ｚ：７０）でトランス−２−ノネナールの定量を行った。なお、定量には、シグマ社製トランス−２−ノネナールを標準品とした標準添加法を用いた。
【０１０６】
その結果、ＬＯＸ−Ｆ４、ＬＯＸ＋Ｆ４を用いて作製した麦汁のトランス−２−ノネナール濃度はそれぞれ０．３６ｐｐｂと３．８５ｐｐｂであった。したがって、本発明にかかる麦芽を使用して麦汁を製造すれば、従来の麦芽をした場合に比べて、トランス−２−ノネナール生成量を１／１０以下に抑制できることが明らかとなった。
【０１０７】
また、麦汁ノネナールポテンシャルは以下の方法で測定した。まず、Ｄｒｏｓｔらの方法（Ｄｒｏｓｔ， Ｂ． Ｗ．， ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ， Ｒ．， Ｆｒｅｉｊｅｅ， Ｆ． Ｊ．Ｍ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅ， Ｅ． Ｇ．， ａｎｄ Ｈｏｌｌｅｍａｎｓ， Ｍ．， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｂｒｅｗ． Ｃｈｅｍ．， ４８， １２４−１３１， １９９０）により麦汁を２時間煮沸した。その後、上記トランス−２−ノネナールの測定方法に従いサンプル中のトランス−２−ノネナールの量を測定し、麦汁中のノネナールポテンシャルを算出した。
【０１０８】
その結果、ＬＯＸ−Ｆ４、ＬＯＸ＋Ｆ４を用いて作製した麦汁のノネナールポテンシャルは、それぞれ２．７４ｐｐｂと１１．９ｐｐｂであった。ノネナールポテンシャルは製品老化を予測できる指標として知られることから（Ｄｒｏｓｔ， Ｂ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｂｒｅｗ． Ｃｈｅｍ．， ４８， １２４−１３１， １９９０、Ｕｅｄａ ｅｔ．ａｌ．（２００１）ＥＢＣ−ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ５５：ｐ３ ２８ｔｈ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ）、本発明にかかる大麦から作製した麦芽を利用し、麦芽飲料を醸造すれば、麦芽アルコール飲料の香味耐久性を大きく改善する事が出来る。
【０１０９】
また、ＬＯＸ−Ｆ４を用いて作製した麦汁のトランス−２−ノネナール濃度とノネナールポテンシャルを、市販の麦芽を用いて作製した麦汁のそれらと比較したのが図１３である。図１３に示した結果から明らかなように、本発明にかかる麦汁は、従来の大麦では達成できなかった分析値を示した。
【０１１０】
以上の結果から、本発明にかかる大麦を利用すれば、従来品にはない品質を有する麦芽を製造する事が出来ることが明らかとなった。
【０１１１】
さらに、麦汁中のＴＨＯＤ濃度を高速液体クロマトグラフィー質量分析にて測定した。高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。移動相の流速０．３ｍＬ／分とし、移動相には０．５％酢酸（Ａ液）とアセトニトリル（Ｂ液）の混合液を用い、Ａ液：Ｂ液＝３５：６５（０分）−Ａ液：Ｂ液＝５：９５（３０分）のリニアグラジエントの条件で行った。また、カラムはウォーターズ社製Ａｓｓｙｍｅｔｒｙ （Ｎｏ．１０６００５； Ｃ１８， ３．５μ ｍ： ２．１ｘ１５０ｍｍ）を用い、カラム温度は５０℃とし、ヒュレットパッカード社製１１００型高速液体クロマトグラフシステムを用いて、５μＬの麦汁またはビールサンプルを分離した。質量分析はウォーターズＺＱを用い、ＥＳイオン化ネガティブモードで質量３２９をモニタリングした。なお、ＴＨＯＤの標準液はビール抽出サンプルを利用した（Ｋｏｂａｙｓｈｉ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ９０， ６９−７３， ２０００）。
【０１１２】
その結果、ＬＯＸ−Ｆ４、ＬＯＸ＋Ｆ４を用いて作製した麦汁のＴＨＯＤ濃度はそれぞれ６．５ｐｐｍと１４．７ｐｐｍであり、本発明にかかる麦芽を使用して麦汁を製造すれば麦汁ＴＨＯＤ濃度を１／２以下に抑制できることが明らかとなった。
【０１１３】
前述したようにＴＨＯＤは仕込工程において麦芽ＬＯＸ−１と麦芽ペルオキシゲナーゼ様活性の働きによりリノール酸から変換されることにより生成するが、麦芽ペルオキシゲナーゼ様活性がＴＨＯＤ生成の律速段階と考えられるため（Ｋｕｒｏｄａ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ９３， ７３−７７， ２００２）、麦芽ＬＯＸ−１活性を低下させた場合、ＴＨＯＤの生成がどの程度抑制されるかは明らかではなかった。しかし、本実施例の結果からＬＯＸ−１活性のない大麦種子から製造される麦芽を使用すれば、麦汁中のＴＨＯＤ量が減少する事が証明された。ＴＨＯＤは酵母によって代謝されること無く最終製品に移行する事から（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｓｔ． Ｂｒｅｗ．， １０６， １０７−１１０ （２０００））、本発明にかかる大麦由来の麦芽を利用すれば、香味品質や泡品質の良い麦芽アルコール飲料の製造が可能となることが明らかとなった
実施例６
（麦芽アルコール飲料試験醸造）
１．冷麦汁の製造と分析
上記実施例１１で得られたＬＯＸ−Ｆ４麦芽とＬＯＸ＋Ｆ４麦芽の２点について、５０Ｌスケール仕込設備により発泡酒仕様（麦芽使用率２４％）での仕込を行なった。仕込条件は以下の通りである。
【０１１４】
各々の麦芽１．５ｋｇを単用で１５Ｌの仕込用水により５０℃、２０分→６５℃、３０分→７５℃、３分のダイアグラムに従って仕込み、ロイター設備により麦汁ろ過を行ない、最終的に３５Ｌのろ過麦汁を得た。
【０１１５】
得られたろ過麦汁は液糖（糖分７５％）５ｋｇと混合し、ホップペレット（苦味分析値８７．０ＢＵ（ＥＢＣ））１３ｇを添加して７０分間煮沸し、１０℃まで冷却し、加水によるエキス調整によりエキス含量１１．６〜１１．８％の冷麦汁とした。
【０１１６】
得られた冷麦汁の分析は、ＥＢＣ標準法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｒｅｗｅｒｙ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ編、Ａｎａｌｙｔｉｃａ ＥＢＣ （４^ｔｈ Ｅｄ）、１９８７）に従い行った。分析値を表１に示した。表１に記載したように、一般的な分析項目に関してはＬＯＸ−Ｆ４とＬＯＸ＋Ｆ４の間で明らかな差は認められなかった。
【０１１７】
【表１】

【０１１８】
２．麦芽アルコール飲料（発泡酒）の製造
上記１で得られた冷麦汁を蒸気殺菌した３０Ｌスケールのシリンドロコニカル型タンクに移し、初期濃度３０００万ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように酵母を添加し、１３℃にて主発酵を行なった。発酵液のエキスが２．５％まで切れた段階で同型のタンクに移し替え、貯酒工程を行った。貯酒工程は最初の６日間は１３℃にて、その後の２週間は０℃にて行った。
【０１１９】
貯酒工程の終わった発酵液は、ビールろ過設備及び充填設備にて、ビールをろ過し、壜への充填を行なった。
３．発泡酒の分析
上記２で得られた発泡酒の分析を以下のように行った。
【０１２０】
まず、ＥＢＣ標準法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｒｅｗｅｒｙ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ編、Ａｎａｌｙｔｉｃａ ＥＢＣ （４^ｔｈ Ｅｄ）、１９８７）に従い分析を行ったところ、脂質酸化物分析値以外の一般分析値に関してはＬＯＸ−Ｆ４とＬＯＸ＋Ｆ４の間で、明らかな差は認められなかった（表２）。
【０１２１】
【表２】

【０１２２】
次に以下の方法により上記２で得られた発泡酒の泡持ちについて分析を行った。
【０１２３】
泡持ち分析は、ＮＩＢＥＭ法を利用した。Ｈａｆｆｍａｎｓ社のＦＯＡＭ ＳＴＡＢＩＬＩＴＹ ＴＥＳＴＥＲを使用し、泡持ちを分析したところ（表３）、ＬＯＸ−Ｆ４大麦はＬＯＸ＋Ｆ４大麦に比べて、ＮＩＢＥＭ値が２１ポイント高く、高い泡持ちを有する事が明らかとなった。
【０１２４】
また、上記実施例１２に記載した方法により、ＴＨＯＤ濃度を測定した結果、ＬＯＸ−Ｆ４はＬＯＸ＋Ｆ４に比べ半分以下に減少していた。
【０１２５】
以上の結果から、本発明の麦芽アルコール飲料製造方法により製造される麦芽アルコール飲料は、ＴＨＯＤの蓄積を抑制することができ、製品の泡持ちを改善できたことが明らかとなった。
【０１２６】
【表３】

【０１２７】
次に、以下のように１３人のパネルによる官能検査を行い、上記２で得られた発泡酒の香味耐久性を比較した。
【０１２８】
まず、ＬＯＸ−Ｆ４及びＬＯＸ＋Ｆ４の麦芽アルコール飲料を３７℃で１週間保存した。次に、それを通常の飲用温度でコップに注いだものをパネルの官能検査に供し、老化臭、総合老化度（老化臭、老化味を加味して評価）の２項目について０〜４までの評点（老化が進むほど評点が高い）で評価した（表４Ａ、Ｂ）。
【０１２９】
その結果、老化臭に関しては、１３人中１０人がＬＯＸ−Ｆ４の方に低い評点をつけており、ＬＯＸ−Ｆ４はＬＯＸ＋Ｆ４と比べて、低い評点（平均値）を示した。その差はｔ検定により５％の危険率で有意であると判定された（表４Ａ）。
【０１３０】
また、総合老化度に関しては、１３人中１１人がＬＯＸ−Ｆ４の方に低い評点をつけており、ＬＯＸ−Ｆ４はＬＯＸ＋Ｆ４と比べて、低い評点（平均値）を示し、その差はｔ検定により５％の危険率で有意と判定された（表４Ｂ）。
【０１３１】
以上の官能検査と統計分析により、ＬＯＸ−Ｆ４はＬＯＸ＋Ｆ４と比べて、老化臭が低減され、低い総合老化度を有することが明らかとなった。
【０１３２】
【表４】

【０１３３】
また、３７℃、１週間保存の前後で上記２で得られた発泡酒のトランス−２−ノネナール濃度を測定した結果、ＬＯＸ−Ｆ４は、保存前でもトランス−２−ノネナール濃度がＬＯＸ＋Ｆ４に比べて低減し、保存後はＬＯＸ＋Ｆ４の約１／３に抑制できた事が明らかとなった（表５）。
【０１３４】
【表５】

【０１３５】
以上、官能検査の結果と麦芽アルコール飲料中のトランス−２−ノネナール濃度の解析結果から、本発明の麦芽アルコール飲料の製造方法により麦芽アルコール飲料を製造すれば、香味耐久性が改善された麦芽アルコール飲料が得られることが明らかとなった。
【０１３６】
最後に、上記２で得られた発泡酒の濃醇さとキレに関して官能検査と脂質膜センサーにより解析を行った。
【０１３７】
まず、１３人のパネルによる官能検査を行い香味品質を比較した。ＬＯＸ−Ｆ４及びＬＯＸ＋Ｆ４の発泡酒を官能検査に供し、濃醇さとキレの２項目について０〜４までの評点（濃醇さが強い、またはキレが良いほど評点が高い）で評価を行った（表６）。
【０１３８】
濃醇さに関しては、ＬＯＸ−Ｆ４とＬＯＸ＋Ｆ４との間に有意差（５％の危険率）はみられなかった（表６Ａ）。
【０１３９】
キレに関しては、１３人中８人がＬＯＸ−Ｆ４の方に高い評点をつけた（表６Ｂ）。また、ＬＯＸ−Ｆ４はＬＯＸ＋Ｆ４に比べて高い評点（平均値）を示し、その差はｔ検定により５％の危険率で有意であると判定された。
【０１４０】
以上の結果から、ＬＯＸ−Ｆ４を用いて麦芽アルコール飲料を醸造すると、濃醇さに影響を与えることなく、キレを改善できる事が明らかとなった。
【０１４１】
【表６】

【０１４２】
さらに、金田等の方法により（Ｋａｎｅｄａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ９２， ２２１−２２６， ２００１．）、脂質膜センサーを用いて製品の濃醇さとキレを評価した（表７）。
【０１４３】
濃醇さは脂質膜への吸着性により評価されるが、その結果、ＬＯＸ−Ｆ４とＬＯＸ＋Ｆ４の吸着性の間に統計的有意差（危険率５％水準）が認められなかった（表７Ａ）。
【０１４４】
一方、キレは脂質膜への残存性により評価（キレが劣るほど高い残存性を示す）されるが、ＬＯＸ−Ｆ４はＬＯＸ＋４に比べ約１／４の残存性を示し、危険率１％水準での有意差が認められた（表７Ｂ）。
【０１４５】
【表７】

【０１４６】
これまで、麦芽ＬＯＸ−１活性と仕込工程におけるＴＨＯＤ生成量には相関が見られず（Ｋｏｂａｙｓｈｉ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， （２０００）． Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ． ９０：６９−７３．）、麦芽ＬＯＸ−１の抑制によりどの程度ＴＨＯＤ生成が抑制されるのかは不明であった。また、抑制された結果、果たしてキレを改善できるかは従来技術では予想が付かなかった。しかし、本実施例の官能検査結果と脂質膜センサーを利用した製品の濃醇さとキレの解析結果より、本請求遺伝子を利用した麦芽を利用すれば、製品の濃醇さに影響を与える事無く、製品のキレを改善する事が初めて実証された。
【０１４７】
【発明の効果】
遺伝子操作することなく、香味耐久性や泡持ちを改善された麦芽アルコール飲料を製造するために有用な、ＬＯＸ−１変異遺伝子と、ＬＯＸ−１欠失大麦の選抜方法と、選抜によって得られた大麦に由来する麦芽アルコール飲料用原料と、前記麦芽アルコール飲料用原料を用いた麦芽アルコール飲料の製造方法と、を提供することが可能となる。
【０１４８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】探索試験１におけるＬＯＸ−１活性の結果を示すグラフである。
【図２】証明試験１におけるＬＯＸ−１阻害活性の結果を示すグラフである。
【図３】証明試験２における大麦種子のＬＯＸタンパク質のウェスタン解析の結果を示す電気泳動写真である。ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウェスタン解析の結果を示し、ＢはＩＥＦ後のウェスタン解析の結果を示す。
【図４】証明試験３における大麦種子のＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す電気泳動写真である。
【図５】ＬＯＸ−１遺伝子第５イントロンスプライシング供与部位の構造を示す図である。
【図６】証明試験５におけるＬＯＸ−１変異遺伝子のスプライシングについて解析した結果を示す電気泳動写真である。Ａは第３イントロン〜第５イントロンを含む増幅断片の電気泳動写真であり、ＢはＡと同じ増幅断片をＳｔｕＩで消化した後の電気泳動写真である。
【図７】証明試験６におけるＫｅｎｄａｌｌ×ＳＶ７３の雑種第２世代におけるＤＮＡ多型を示す電気泳動写真である。
【図８】証明試験６におけるＫｅｎｄａｌｌ×ＳＶ７３の雑種第２世代におけるＤＮＡ多型及び雑種第３世代におけるＬＯＸ活性をまとめた図である。
【図９】実施例１における一般大麦品種／系統のＡｆａＩ法による解析の結果を示す電気泳動写真である。
【図１０】実施例２におけるＬＯＸ−１欠失大麦のＡｆａＩ法による解析結果を示す電気泳動写真である。
【図１１】実施例２におけるＬＯＸ−１欠失大麦の種子ＬＯＸ活性の結果を示す図である。Ａは酵素反応時間５分の結果、Ｂは酵素反応時間９０分の結果を示す図である。
【図１２】実施例５におけるＬＯＸ＋Ｆ４集団およびＬＯＸ−Ｆ４集団の種子の麦芽分析の結果を示す図である。
【図１３】実施例５における麦汁中のトランスー２−ネネナール濃度とノネナールポテンシャルを示す図である。

Claims (9)

1. 大麦リポキシゲナーゼ−１遺伝子第５イントロンのスプライシング供与部位（５’−ＧＴ−３’）のグアニンが他の塩基に変異していることを特徴とする大麦リポキシゲナーゼ−１変異遺伝子。
2. 前記他の塩基がアデニンであることを特徴とする請求項１に記載の大麦リポキシゲナーゼ−１変異遺伝子。
3. 大麦リポキシゲナーゼ−１遺伝子第５イントロンのスプライシング供与部位のグアニンが他の塩基に変異しているか否かにより大麦リポキシゲナーゼ−１欠失大麦を判別することを特徴とする大麦リポキシゲナーゼ−１欠失大麦の選抜方法。
4. 前記他の塩基がアデニンであることを特徴とする請求項３に記載の大麦リポキシゲナーゼ−１欠失大麦の選抜方法。
5. 被検対象である大麦からゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工程と、
   抽出したゲノムＤＮＡから大麦リポキシゲナーゼ−１遺伝子第５イントロンのスプライシング供与部位を含むＤＮＡ断片を増幅するＤＮＡ断片増幅工程と、
   前記ＤＮＡ断片増幅工程で増幅された大麦リポキシゲナーゼ−１遺伝子第５イントロンのスプライシング供与部位を含むＤＮＡ断片を制限酵素で切断して所定の塩基数のＤＮＡ断片を検出し、スプライシング供与部位のグアニンが他の塩基に変異しているか否かにより大麦リポキシゲナーゼ−１欠失大麦を判別するＤＮＡ断片検出工程と、
   を含むことを特徴とする請求項３または４に記載の大麦リポキシゲナーゼ−１欠失大麦の選抜方法。
6. 前記ＤＮＡ断片検出工程において使用する制限酵素が塩基配列５’−ＧＴＡＣ−３’を認識するＡｆａＩおよび／またはＲｓａＩであることを特徴とする請求項５に記載の大麦リポキシゲナーゼ−１欠失大麦の選抜方法。
7. 請求項１または２に記載の大麦リポキシゲナーゼ−１変異遺伝子を持つ大麦のみに由来する種子、麦芽、モルトエキス、大麦分解物または大麦加工物であることを特徴とする麦芽アルコール飲料用原料。
8. 請求項３〜６のうちのいずれか１項に記載の選抜方法により選抜された大麦のみに由来する種子、麦芽、モルトエキス、大麦分解物または大麦加工物であることを特徴とする麦芽アルコール飲料用原料。
9. 請求項７または８に記載の麦芽アルコール飲料用原料を用いることを特徴とする麦芽アルコール飲料の製造方法。

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