JP2011135900A - 香味の安定した飲料の製造のためのオオムギ - Google Patents

香味の安定した飲料の製造のためのオオムギ Download PDF

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Abstract

【課題】ＬＯＸ−１活性を全く有していないかまたは非常に少量しか有していないオオムギ植物を作製するための方法を提供すること。
【解決手段】本発明によって、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギおよびそれから製造された植物製品、例えば脂肪酸変換酵素リポキシゲナーゼ−１の合成に欠陥があるオオムギ穀粒を使用することによって製造される麦芽が提供される。上記酵素は、リノール酸の９−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸（リポキシゲナーゼ経路の代謝産物）への変換に関連した主活性の原因となる。この９−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸はさらなる酵素反応または自発的な反応によってトランス−２−ノネナールの出現をもたらし得る。本発明は、醸造家に飲料の長期保存後でも検出可能なトランス−２−ノネナール特異的異臭のないビールを製造することを可能にさせる。
【選択図】なし

Description

（１．発明の分野）
本発明は、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）酵素ＬＯＸ−１の合成に欠陥のあるオオムギおよび麦芽を開示し、従って工業用の使用のための新規な原料を提供する植物バイオテクノロジーに関する。例えば、上記原料は、異臭化合物トランス−２−ノネナール（Ｔ２Ｎ）を有していないかまたはごく少量有する新規かつ特有の香味安定ビールを製造するために使用され得る。上記Ｔ２Ｎは、ＬＯＸ回路の酵素の連続作用によって形成され、ここで、ＬＯＸ−１は、主活性を示し、リノール酸の二原子酸素添加を与えて９−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸（９−ＨＰＯＤＥ）を生成する。本発明のオオムギおよび植物製品は、９−ＨＰＯＤＥを全く示さないかまたはごくわずかな量の９−ＨＰＯＤＥを示す。さらに、本発明は、上記オオムギおよび／または麦芽を使用して製造される飲料に関する。
（２．発明の背景）
現在のビール製造に関連した研究の目的の１つは、ビールの品質および安定性に関する分子的因子を決定することである。大部分のビールは、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ，Ｌ．）を基にして製造される。オオムギは、ビールのような工業製品の供給源としてその経済的重要性に起因するだけでなく、動物飼料の供給源としても世界の多くの地域で栽培されている単子葉植物作物である。米国は、現在、麦芽用オオムギの主要な生産国の１つであり、世界の作物の約１３％を有する；カナダ、オーストラリアおよびヨーロッパは、合わせて生産量の約７０％を占める（Ｂｉｏｓ Ｉｎｔｅｒｎ．、２００１）。
オオムギ栽培者の継続的な努力は、農学的に堅実である安定した多収穫品種を開発することにある。この目的を達成するために、種々の試みは、目的の形質を改変するために、例えば一般に植物成長および作物生産性に対してばかりではなく、作物から製造された製品に付加された品質を付与する形質に対しても悪影響を有し得る特異的遺伝子の発現を変えるための、化学的処理または照射によるランダム変異誘発を包含する。アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）がオオムギに変異を誘発させるのに有用な化学物質であることが、十分に確立されている。具体的には、ＮａＮ３で誘導される変異誘発は、オオムギにおいて遺伝子の変化を誘発させてアントシアニン類およびプロアントシアニジン類の合成においてブロックされた変異体を生じさせるために使用されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。第２の例は、低フィチン酸変異体を同定する目的で高レベルの遊離リン酸をスクリーニングするための、ＮａＮ３を用いて変異を誘発させたオオムギ穀粒に関し（非特許文献６）；スクリーニングされた２，０００個の穀粒から全部で１０個の変異体が同定された。オオムギ遺伝学の主な欠点は逆遺伝学によって遺伝子機能を具体的に研究することができないことであったが、正方向遺伝子スクリーニング（ｆｏｒｗａｒｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎ）が、例えば、ＮａＮ３で誘導された変異誘発の後に、オオムギおよび麦芽の栄養学的パラメーターおよび製品品質パラメーターに関する改良に関して継続している。
全体的および一般的様式を除いて、栽培者は従来の植物栽培プロセスで発育中の新規な植物系統の結果を予測し得ない。この予測不可能性は、主として細胞レベルで、より詳細には核ＤＮＡのレベルで制御できないことにより生じ、その複雑さは莫大である。多数の他の因子、例えば植物の繁殖の地理的な場所での気候および土壌の質が、植物栽培プロセスの結果に影響を及ぼす。その結果として、従来の技術を使用する種々のオオムギ栽培者は、同じ特性を有する植物を決して育成しない。従来の栽培プロセスにおいて、最も困難な仕事は、目的の形質に関してばかりではなく、植物成長に関連する生理学的問題に関しても遺伝学的に優れている植物の同定である。選択プロセスは、他の混同する特性が目的の特性を遮蔽する場合には特に困難である。現在の植物栽培手順が変異遺伝子のＤＮＡ配列決定を含む場合には、その手順は、例えばシロイヌナズナおよび他の植物において化学的に誘発させた変異のスクリーニングについて最近記載されているように、育種プログラムの後期において、すなわち変異体の特徴付けの後である（非特許文献７）。
これまで、全ゲノム規模での遺伝子インデックス付き機能喪失型変異の作成が酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについて報告されている（非特許文献８）。植物シロイヌナズナについては、約２９，４５４個の予測された遺伝子の中の２１，７００個がアグロバクテリウムＴ−ＤＭＡ配列の挿入によって不活性化されている（非特許文献９）。
これまで、最初の変異誘発または交配から植物または種子の販売までの従来の育種プロセスが１０年以上を要することは珍しいことではない。特に、植物育種家に目的の形質に関連した遺伝子において変異を検出する方法を提供することはすばらしいことである。このような改良は、特に変異体の選択が、目的の遺伝子のタンパク質コード部分にナンセンス変異を有する変異体に向けられる場合には、育種プログラムにおける予測可能性のレベルを高めるであろう。他の場合には、ＤＮＡ変異の早期同定により、例えば目的の遺伝子のプロモーター変異に特徴があるかまたは他のＤＮＡ変異が発現に影響を及ぼす系統についてさらなる育種を中止することが好ましくあり得る。これは、単に環境要因または生理学的要因が、変異原により誘発される形質の復帰を与え得るからである。従って、育種プログラムにおいて目的の変異を早期に検出する別の方法を見出すことに対する要求が存在する。これは、育種プロセス全体をより早くしかつ経済的により目的のものにし、このようにして土地で生産される穀粒の量を最大にすべきである。
生産されるオオムギの大部分は麦芽用品種からなり、その穀粒はオオムギの制御された浸漬、発芽および乾燥のプロセスによって麦芽に変えられる。麦芽の一部は食品産業において成分として使用されるが、これに対して大部分の麦芽は、麦芽から誘導される飲料（ビールおよびウイスキーが挙げられるが、これらに限定されない）の製造の主成分として引き続き使用される。醸造所では、粉砕麦芽が、例えば穀粒ポリマーであるデンプンおよびβ−グルカンの部分的な酵素分解および抽出を与える麦芽−水の懸濁液の温度を段階的に上げる工程を包含するマッシングプロセスに供される。濾過した後に、水性のどろどろにしたものをホップと一緒に煮沸して麦芽汁が得られる。上記麦芽汁を、その後に酵母を用いて発酵させてビール製品を得、これは熟成後に瓶詰めされる。麦芽汁はまた、非発酵麦芽飲料の製造にも使用することができる。
飲料の嗜好性および香味安定性は、オオムギおよび麦芽の組成に関する重要な因子である。これは、上記のオオムギおよび麦芽から誘導される（または上記オオムギおよび麦芽から抽出される酵素の作用によって生じる）天然香味分子が最終製品に望ましくない味覚特性を与え得るからである（非特許文献１０）。この点において、ボール紙様の香味を与える揮発性化合物の形成が、特に生化学的および経済的な関心事であるようである。１９７０年に、ボール紙様の香味の原因である分子が単離され、Ｔ２Ｎ、すなわち炭素９個の（Ｃ９）アルケナールとして同定された（非特許文献１１）。ヒトでのＴ２Ｎの香味閾値レベルは極めて低く、以前に約０．７ｎＭまたは０．１ｐｐｂであると決定されている（非特許文献１２）ので、たとえわずかなレベルでもアルデヒドを有する製品は製品の異臭香味により古くなっているとみなされる。さらに、ビールの貯蔵中のＴ２Ｎ付加物の分解によるＴ２Ｎの遊離は、製品の劣化を生じ得る（非特許文献１３）。
植物組織を用いた放射性標識研究により、ノネナール類はＣ１８脂肪酸であるリノール酸から誘導され、これに対してヘキサナール類およびノナジエナール類はＣ１８脂肪酸であるリノレン酸から形成されることが証明された（非特許文献１４；非特許文献１５）。これらの観察および多数のその後の観察（例えば、非特許文献１６、非特許文献１７および非特許文献１８によって要約されているような観察）は、Ｔ２ＮはＬＯＸ回路特異酵素の連続作用によって形成され、ＬＯＸの作用は初期酵素工程を代表するという証拠として解釈されている。この概念と一致して、Ｋｕｒｏｄｏらは、麦芽が、ＬＯＸによって生成された生成物のＴ２Ｎへの変換に必要な熱安定性酵素因子を含むことを見出した（非特許文献１９）。
オオムギ穀粒は、ＬＯＸ−１、ＬＯＸ−２およびＬＯＸ−３として知られている３種類のＬＯＸ酵素を含有する（非特許文献２０）。ＬＯＸ−１はリノール酸から９−ＨＰＯＤＥ（Ｔ２Ｎおよびトリヒドロキシオクタデセン酸（「ＴＨＯＥ」または単に「ＴＨＡ」と略記される）の前駆物質−の形成を触媒するが、ＬＯＸ−２はリノール酸の１３−ＨＰＯＤＥへの変換を触媒し、１３−ＨＰＯＤＥはヘキサナール、すなわち約０．４ｐｐｍの香味閾値レベルを有するＣ６アルデヒドへさらに代謝される（図１Ｂ）（非特許文献１２、前出）。ＬＯＸ−３の生成物特異性は理解されていないが、ｖａｎ Ｍｅｃｈｅｌｅｎら（前出）によって示されているように、対応する遺伝子の非常に低い発現レベルは、Ｔ２Ｎ形成に対するその寄与がごくわずかであることを示唆している。ＬＯＸ活性がＴ２Ｎ特異的異臭の形成に関連するリノール酸ヒドロペルオキシド前駆物質の生成のための唯一の酵素源であるか否か、または脂肪酸自動酸化のプロセスもまた寄与するか否かを調べるために、研究が進行中である。Ｃ１８ヒドロペルオキシドは、植物の酵素および動物の酵素の７種より多い異なるファミリーによりさらに変換され得ることは、注目すべきであり、全ての反応はまとめてＬＯＸ経路と呼ばれ（非特許文献２１）；この経路はオキシリピン経路ともいわれる。オキシリピンは、その名前が暗示するように、酸素添加脂質由来の分子であり、ＬＯＸ反応による不飽和脂肪酸の酸素添加反応によって生じ、またこのような酸素添加分子から誘導される任意の分子も包含する。
低下した活性に特徴があるＬＯＸ−１タンパク質を有するオオムギ穀粒およびオオムギ植物が、Ｄｏｕｍａらの特許文献１として公開されているＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ０１／００２０７号に開示された。しかし、この出願は、不活性ＬＯＸ−１酵素を用いるオオムギ穀粒の生成および分析を教示していない。
低レベルのＬＯＸを合成する変異植物についてのいくつかの例が知られている。例えば、３種類のダイズ系統が１９８０年代初期に同定されており、それぞれは成熟ダイズ種子において下記の３種類のＬＯＸ酵素の１つを欠いている：
（ｉ）ＬＯＸ−１。ＬＯＸ−１ヌル変異の分子基盤は不確かなままであるが、これは対応する成熟ｍＲＮＡが存在しないことに関連する（非特許文献２２；非特許文献２３）；
（ｉｉ）ＬＯＸ−２。変異遺伝子について転写産物が検出され、またヒスチジンリガンドを活性部位の鉄に置換し、酵素不安定をもたらす１個の塩基の変化が観察された（非特許文献２４；非特許文献２５）；
（ｉｉｉ）ＬＯＸ−３。ＬＯＸ−３ヌル変異体は、おそらくは遺伝子プロモーターにおけるシス−作用要素の結果として、検出可能なレベルの対応する転写産物を示さなかった（非特許文献２６；非特許文献２７）。
エンドウマメの種子では、ヌル−ＬＯＸ−２系統は、大部分のＬＯＸ−２タンパク質の欠失をもたらす欠損を有することが見出された（非特許文献２８）。この系統がＬＯＸ−２についてｍＲＮＡの量の大きな低下を示すので、変異がｍＲＮＡ安定性の劇的な低下を引き起こすことが示唆された。
イネでは、抽出物の免疫ブロットスクリーニングにより、２種類の天然品種Ｄａｗ ＤａｍおよびＣＩ−１１５（それぞれ、３種類のＬＯＸ酵素のうちの１つを欠く）の存在が明らかにされた（非特許文献２９）。３種類のＬＯＸ全てを有する正常なイネにおけるヘキサナール、ペンタナールおよびペンタノールの量が貯蔵中に著しく生じたが、Ｄａｗ ＤａｍおよびＣＩ−１１５では６６％〜８０％の範囲に減少したことが測定された。この結果がイネ穀粒中のＬＯＸ酵素の欠如が酸化劣化を軽減することを示唆するにもかかわらず、Ｄａｗ ＤａｍおよびＣＩ−１１５のＬＯＸが少ないという特性を付与する分子的決定要因は相変わらず理解されていない。
ＬＯＸに関する遺伝子のアンチセンス介在性およびコサプレッション介在性の遺伝子導入の減少は、植物防御シグナル伝達における特異ＬＯＸ酵素およびその対応産物の機能を解明するのに有用であることを証明している。シロイヌナズナでは、例えば、ＬＯＸ酵素の減少はジャスモン酸の損傷誘導性蓄積の低下を生じる（非特許文献３０）。そして、ＬＯＸをコードする遺伝子のアンチセンス介在性の減少の結果は、真菌類病原体に対するタバコ植物の耐性の不適合形質における対応酵素の関与を証明した（非特許文献３１）。遺伝子導入アプローチがＬＯＸ機能を解明するために使用されている第３の例は、ジャガイモ植物の成長および発生におけるジャガイモＬＯＸ（ＬＯＸ−Ｈ１と表す）の役割に関する（非特許文献３２）。ＬＯＸ−Ｈ１の減少が揮発性の脂肪族Ｃ６アルデヒド、すなわち植物防御応答に関与しかつ損傷誘発性遺伝子発現についてシグナル伝達分子としてまたは抗菌性物質として作用する化合物の著しい減少を生じることが示された。さらなる研究により、ＬＯＸ酵素に関する遺伝子の発現において減少した遺伝子導入ジャガイモ植物が異常な塊茎の発育を示すことが示された（非特許文献３３）。しかし、塊茎表現型の原因となる特異的オキシリピンは同定されなかった。別の研究では、ジャガイモＬＯＸ−Ｈ３のアンチセンス介在性の減少は、植物の誘導性防御応答を抑制し、より高い塊茎収量を伴う（非特許文献３４）。集合的に、これらのデータは、ＬＯＸ酵素をコードする遺伝子の発現が植物の発育に重要であり、おそらくはいくつかのＬＯＸ酵素が病原体に対する防衛的役割を果たし、これに対して他のＬＯＸ酵素が細胞の発育を調節するために作用し得る生成物を生成することを示唆する。
２〜２０％減少したレベルの２種類のＬＯＸ酵素を有するトマト果実が、野生型果実と比べた場合に、香味揮発分の著しい変化を示さなかったことに注目することも重要である（非特許文献３５）。この知見は、非常に低いレベルのＬＯＸがアルデヒドおよびアルコールの生成に十分であること、または他のＬＯＸ酵素がこれらの化合物の生成において活性であることのどちらかであることを示唆する。
酸化酵素は、植物由来の製品の香味または色に関連した重要な局面に対するその影響により、食品および飲料産業に対する意識を高めつつある。この点において、ＬＯＸは、これらがフリーラジカルの形成を誘導し得ることにより重要であり、フリーラジカルは、他の成分（例えばビタミン、着色剤、フェノール、タンパク質など）を攻撃し得る。いくつかのフリーラジカルが遊離脂肪酸の自動酸化において役割を果たすと考えられることは注目に値する。いくつかのフリーラジカル生成物質は、加熱処理に耐え得、従って処理された食品中で十分に活性なままであり製品の貯蔵の間の品質変化を起こす。
酸化防止剤はＬＯＸインヒビターとして広く使用され、その中のいくつかはまたＬＯＸ物質の自動酸化を阻害する。しかし、飲料用の香味改善添加剤として有用なＬＯＸインヒビターは同定されていない。
ＬＯＸ酵素の役割はまた、ビールの製造の分野外の問題点、例えばＫｅｌｌｅｒの特許文献２に記載されているように、例えば真菌汚染に感受性の植物においてマイコトキシン形成を阻害するヒドロペルオキシ脂肪酸のＬＯＸに触媒される生成に関する。植物防御応答および植物損傷応答におけるＬＯＸ酵素に関する役割は依然としてあまり明らかでないが、この酵素は損傷および病原体攻撃により誘導される（非特許文献３６；非特許文献３７；非特許文献３８；非特許文献３９）。損傷および植物防御におけるＬＯＸ酵素の役割は、病原体に対して反応性脂肪酸ヒドロペルオキシドを生成することであり得る（非特許文献４０）。あるいは、ＬＯＸは、シグナル分子（例えばジャスモン酸メチル）を生成するためにストレスによって誘導され得る（Ｂｅｌｌら、前出）。
ＬＯＸ酵素の作用によって生成される１３−ＨＰＯＤＥが、ヒドロペルオキシド変換酵素の基質として作用して香味活性アルデヒドを製造する方法もまた記載されている（非特許文献４１、非特許文献４２）。同様のプロセスが、多数の特許（例えばＨａｅａｕｓｌｅｒらの特許文献３およびＨｏｌｔｚらの特許文献４）に開示されている。
また、ＬＯＸ酵素がパンの製造にいくつかの有利な効果を与えることが示されている（非特許文献４３）。さらに、ＨａｎｄａおよびＫａｕｓｃｈの特許文献５は、果実の品質がＬＯＸの産生を阻害することによって、例えば製品により長い寿命を与えることによって高められ得ることを開示している。
国際公開第０２／０５３７２１号パンフレット 米国特許第５，９４２，６６１号明細書 米国特許第６，１５０，１４５号明細書 米国特許第６，２７４，３５８号明細書 米国特許第６，３５５，８６２号明細書
ｖｏｎ Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ，Ｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｕｔａｎｔ ｉｎ ｂａｒｌｅｙ ｒｅｎｄｅｒｓ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｅｒ ｓｕｐｅｒｆｌｕｏｕｓ、「Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ」、１９７７年、第４２巻、ｐ．３４１−３５１ ｖｏｎ Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ，Ｄら、Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ−ｆｒｅｅ ｂａｒｌｅｙ ｆｏｒ ｂｒｅｗｉｎｇ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ ｉｎ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、「Ｔｅｃｈ．Ｑ．ＭＢＡＡ」、１９８５年、第２２巻、ｐ．４１−５２ Ｊｅｎｄｅ−Ｓｔｒｉｄ，Ｂ．、Ｇｅｎｅ−ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｂａｒｌｅｙ．、「Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．」、１９９１年、第８１巻、ｐ．６６８−６７４ Ｊｅｎｄｅ−Ｓｔｒｉｄ，Ｂ．、Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｂａｒｌｅｙ．、「Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ」、１９９３年、第１１９巻、ｐ．１８７−２０４ Ｏｌｓｅｎ，Ｏ．ら、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａ・Ｔ→Ｇ・Ｃ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｒｌｅｙ Ａｎｔ１８ ｇｅｎｅ．、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９９３年、第９０巻、ｐ．８０４３−８０４７ Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｓ．Ｋ．およびＨａｔｚａｋ，Ｆ．、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｌｏｗ−ｐｈｙｔａｔｅ ｂａｒｌｅｙ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．）ｇｒａｉｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｂｙ ＴＬＣ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ．、「Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ」、１９９８年、第１２９巻、ｐ．１０７−１１２ Ｃｏｌｂｅｒｔ，Ｔ．ら、Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．、「Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．」、２００１年、第１２６巻、ｐ．４８０−４８４ Ｇｉａｅｖｅｒ，Ｇ．ら、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ 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ｃｕｃｕｍｂｅｒ．、「Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１９７８年、第１７巻、ｐ．３５５−３５８ Ｔｉｊｅｔ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ｆｒｏｍ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ ｌｙａｓｅ（ＣＹＰ７４Ｃ）ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ９− ａｎｄ １３−ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓ ｏｆ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｎｄ ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄｓ．、「Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．」、２００１年、第３８６巻、ｐ．２８１−２８９ Ｎｏｏｒｄｅｒｍｅｅｒ，Ｍ．Ａ．ら、Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ ｌｙａｓｅ：Ａ ｐｌａｎｔ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ａｎｄ ｐｅｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．、「ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ」、２００１年、第２巻、ｐ．４９４−５０４ Ｍａｔｓｕｉ，Ｋ．ら、Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ９−ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ ｌｙａｓｅ ｉｎ ｔｏｍａｔｏｅｓ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｉｌｌ．）、「Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．」、２００１年、第４９巻、ｐ．５４１８−５４２４ Ｋｕｒｏｄａら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ２（Ｅ）−ｎｏｎｅｎａｌ ｄｕｒｉｎｇ ｍａｓｈｉｎｇ．、「Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、２００３年、第６７巻、ｐ．６９１−６９７ ｖａｎ Ｍｅｃｈｅｌｅｎ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｂａｒｌｅｙ．、「Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」、１９９９年、第３９巻、ｐ．１２８３−１２９８ Ｆｅｕｓｓｎｅｒ，Ｉ．およびＷａｓｔｅｒｎａｃｋ，Ｃ．、Ｔｈｅ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｐａｔｈｗａｙ．、「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ 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Ｌ．）ｓｅｅｄ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２．、「Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」、１９９９年、第３９巻、ｐ．１２０９−１２２０ Ｒａｍｅｚａｎｚａｄｅｈ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｒａｎｃｉｄｉｔｙ ｉｎ ｒｉｃｅ ｂｒａｎ ｄｕｒｉｎｇ ｓｔｏｒａｇｅ．、「Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．」、１９９９年、第４７巻、ｐ．２９９７−３０００ Ｂｅｌｌ，Ｅ．ら、Ａ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｗｏｕｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９９５年、第９２巻、ｐ．８６７５−８６７９ Ｒａｎｃｅ，Ｉ．ら、Ｔｈｅ ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ ｒａｃｅ ０ ａｎｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｉｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｖ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９９８年、第９５巻、ｐ．６５５４−６５５９ Ｌｅｏｎ，Ｊ．ら、Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｈ１ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｓｐｅｃｉｆｃ ｒｏｌｅ ｉｎ ｓｕｐｐｌｙｉｎｇ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓ ｆｏｒ ａｌｉｐｈａｔｉｃ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、２００２年、第２７７巻、ｐ．４１６−４２３ Ｋｏｌｏｍｉｅｔｓ，Ｍ．Ｖ．ら、Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｔｕｂｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．、「Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ」、２００１年、第１３巻、ｐ．６１３−６２６ Ｒｏｙｏ，Ｊ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｏｔａｔｏ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｒｅｄｕｃｅｓ ｗｏｕｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｗｅｉｇｈｔ ｇａｉｎ ｏｆ ｉｎｓｅｃｔ ｐｅｓｔｓ．、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９９９年、第９６巻、ｐ．１１４６−１１５１ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．ら、Ｆｒｕｉｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｍａｔｏｅｓ．、「Ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ Ｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」、１９９９年、第１７巻、ｐ．１６３−１７３ Ｂｅｌｌ，Ｅ．およびＭｕｌｌｅｔ，Ｊ．Ｅ．、Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｂｙ ｗａｔｅｒ ｄｅｆｉｃｉｔ，ｗｏｕｎｄｉｎｇ，ａｎｄ ｍｅｔｈｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅ．、「Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．」、１９９１年、第２３０巻、ｐ．４５６−４６２ Ｂｅｌｌ，Ｅ．およびＭｕｌｌｅｔ，Ｊ．Ｅ．、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｏ ｍｅｔｈｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅ ａｎｄ ｗｏｕｎｄｉｎｇ．、「Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．」、１９９３年、第１０３巻、ｐ．１１３３−１１３７ Ｍｅｌａｎ，Ｍ．Ａ．ら、Ａｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｃａｎ ｂｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ，ａｎｄ ｍｅｔｈｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅ．、「Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．」、１９９３年、第１０１巻、ｐ．４４１−４５０ Ｓａｒａｖｉｔｚ，Ｄ．Ｍ．およびＳｉｅｄｏｗ，Ｊ．Ｎ．、Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｗｏｕｎｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｌｅａｖｅｓ．、「Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．」、１９９６年、第１１０巻、ｐ．２８７−２９９， Ｒｏｇｅｒｓ，Ｋ．Ｒ．ら、Ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｅｌｉｃｉｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．、「Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．」、１９８８年、第８６巻、ｐ．５４７−５５３ Ｎｏｏｒｄｅｒｍｅｅｒ，Ｍ．Ａ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ６−ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ｆｒｏｍ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｏｉｌｓ ｂｙ ｓｏｙｂｅａｎ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ ｌｙａｓｅ．、「Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．」、２００２年、第５０巻、ｐ．４２７０−４２７４ Ｈｕｓｓｏｎ，Ｆ．およびＢｅｌｉｎ，Ｊ．Ｍ．、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ ｌｙａｓｅ ｆｒｏｍ ｇｒｅｅｎ ｂｅｌｌ ｐｅｐｐｅｒ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｌ．）ｆｒｕｉｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ６−ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．、「Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．」、２００２年、第５０巻、ｐ．１９９１−１９９５ Ｃａｓｅｙ，Ｒ．、Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒｅａｄｍａｋｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ．、「Ｆｉｒｓｔ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｇｒａｉｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．」、Ａｎｇｅｌｉｎｏ，Ｓ．Ａ．Ｇ．Ｆ．，ｖａｎ Ｈａｍｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ，Ｗ．，Ｈｅｉｄｅｋａｍｐ，Ｆ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｕｇｔ，Ｊ．Ｐ．編、ＴＮＯ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、１９９７年、ｐ．１８８−１９４、ＩＳＢＮ ９０−７５２０２−０４−０
（３．発明の要旨）
従って、ＬＯＸ−１活性を本質的に有していないオオムギ植物に対する未だ満たされていない要求が存在する。なぜならば、このような植物から調製される飲料は非常に低いレベルのＴ２Ｎを有するからである。さらに、本発明は、このような植物から調製される飲料が非常に低いレベルの９，１２，１３−ＴＨＯＥを有することを開示する。さらに、このような植物は他の目的に有用であり得る。
驚くべきことに、本発明は、ＬＯＸ−１活性を全く有していないかまたは非常に少量しか有していないオオムギ植物を作製するための方法を開示する。特に、本発明はＬＯＸ−１の遺伝子におけるヌル変異を開示する。本発明の予期される利点としては、ＬＯＸ経路の対応する分岐からのＴ２Ｎの完全な排除が挙げられ、従って本発明はオオムギ穀粒のＴ２Ｎレベルを制御するための優れた方法を提供し；またこれらの穀粒から製造されるビールは、例え高温であっても長期間貯蔵後に優れた香味安定性を示す。
興味深いことに、本発明はまた早期に変異を検出するための方法を提供し、従って最近の変異体特徴づけの不都合が本発明によって解決されている。これは、変異体群における標的遺伝子の表現型特徴付けおよびＤＮＡ配列決定の連続的な使用を育種プロセスの早い時点で導入して、改良された麦芽用オオムギ品種を作り出すための新しい魅力的な手順を使用する。単離された植物は、種々の植物育種法を使用してさらに改良され得る。
本発明は、オオムギ中の活性なＬＯＸ−１酵素の存在に関連した現在の問題、制限および不都合を解決する。第１に、本発明は、化学的に変異を誘発させたオオムギをスクリーニングするための時間および労力を著しく軽減する新規で効率的なスクリーニング方法を提供する。第２に、本発明は、例えば香味の安定なビールの製造に有用である新規のヌル−ＬＯＸ−１オオムギを包含する。
上記のように植物ＬＯＸ変異体に関する理論的背景は、ＬＯＸ活性レベルの減少した植物に関する。これに対して、本発明は、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物を効率的に作り出す方法を提供することによって低いＬＯＸ活性または残存ＬＯＸ活性に関連した制限および不都合を克服する。具体的な相違としては、以下が挙げられる：
（ｉ）ＤｏｕｍａらのＷＯ０２／０５３７２１Ａ１号として公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＩＢ０１／００２０７号に開示されたオオムギ植物に対して、本発明の植物はＬＯＸ−１活性を本質的に有さず、好ましくは本発明の植物は真のヌル−ＬＯＸ−１植物である、すなわち本発明の植物はＬＯＸ−１タンパク質の完全な機能喪失を示す；
（ｉｉ）本明細書に記載の真のヌル−ＬＯＸ−１の形質は、対応する遺伝子中のナンセンス変異の存在についてスクリーニングすることによって確認され得る。従って、この形質について同型接合オオムギ植物は、成長条件または環境効果に関係なく活性酵素の合成において完全にブロックされる。これは、植物育種の分野における理想的な性質でありかつ背景技術のダイズＬＯＸ変異体における可能な分子シナリオの結果とコントロール的であり、生物的条件または非生物的条件は、細胞の生理学的状態の変化に影響を及ぼし、ＬＯＸのその後の翻訳によりｍＲＮＡ安定化を与え得る；
（ｉｉｉ）ダイズおよびイネのＬＯＸ変異体に関連する形質が、主要食品中の低減されたレベルの臭いの強い化合物ヘキサナールを含む場合には、本発明は飲料中のより低いレベルの香味特異的化合物Ｔ２Ｎおよび飲料中のより低いレベルの９，１２，１３−ＴＨＯＥに関する；
（ｉｖ）ダイズおよびイネのＬＯＸ変異体は１３−ＨＰＯＤＥの下流のＬＯＸ経路の分子に影響を及ぼし、これに対しヌル−ＬＯＸ−１形質は９−ＨＰＯＤＥの下流の分子を含むＬＯＸ経路の分岐に関する；
（ｖ）ダイズ変異体がＬＯＸに関する遺伝子の放射線照射によって誘発された変異を含み、かつＤａｗ ＤａｍおよびＣｌ−１１５がイネ育種系統の選択された天然に存在する品種にを表すのに対して、ヌル−ＬＯＸ−１形質を有するオオムギ植物における変異は化学薬品ＮａＮ３によって誘発された。
従って、本発明の目的は、野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性の５％未満、好ましくは１％未満を有するオオムギ植物またはその一部もしくは断片を提供することである。
本発明の第２の目的は、野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性の５％未満、好ましくは１％未満を有するオオムギ植物由来の穀粒を提供することである。
本発明の第３の目的は、野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性の５％未満、好ましくは１％未満を有するオオムギ植物またはその一部もしくは断片を有する組成物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性の５％未満、好ましくは１％未満を有する加工されたオオムギ植物を含有する麦芽組成物を提供することである。麦芽組成物は好ましくは純粋な麦芽組成物であってもよい。しかし、麦芽組成物はまた、例えば、オオムギと麦芽との混合物であってもよい。
本発明の目的はまた、安定な感覚刺激品質を有する飲料であって、本発明のオオムギ植物またはその一部を使用して製造される飲料を提供することである。特に、上記飲料は、上記の麦芽組成物（例えば純粋な麦芽組成物）またはオオムギと麦芽との混合物を使用して製造されることが好ましい。本発明の好ましい実施形態では、上記飲料はビールからなる。
本発明のさらなる目的は、安定な感覚刺激品質を有する飲料を提供することであり、この飲料は、オオムギ植物を使用して製造されかつこの飲料中の９，１０，１３−トリヒドロキシオクタデセン酸（本明細書では、９，１０，１３−ＴＨＯＥまたは単に９，１０，１３−ＴＨＡと略記する）に対する９，１２，１３−トリヒドロキシオクタデセン酸（本明細書では、９，１２，１３−ＴＨＯＥまたは単に９，１２，１３−ＴＨＡと略記する）の比率が多くても１．８である。上記飲料はビールであることが好ましい。
さらに、本発明の目的は、本発明のオオムギ植物またはその一部を含有する組成物（例えば食品組成物、飼料組成物、または芳香原料組成物）を提供することである。
さらに、本発明の目的は、本発明のオオムギ植物中で組換えタンパク質を発現するための方法を提供することであり、この方法は、作動可能に連結された要素としてオオムギ植物またはその一部中で発現可能なプロモーター、上記組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列、および転写終結領域を有する核酸配列を用いてこの植物を形質転換させ、それによってこのオオムギ植物中でこの組換えタンパク質を発現させる工程を包含する。
さらに、本発明の目的は、本発明のオオムギ植物中のタンパク質のレベルを低下させるための方法を提供することであり、この方法は、作動可能に連結された要素としてオオムギ植物またはその一部中で発現可能なプロモーター、ＤＮＡ配列、および転写終結領域を有する核酸配列を用いてこの植物を形質転換させる工程を包含し、このＤＮＡ配列の発現がこのタンパク質をコードする遺伝子の発現をアンチセンス、またはコサプレッションまたはＲＮＡ干渉によって低下させる。
本発明のさらなる目的は、野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性の５％未満、好ましくは１％未満を有するオオムギ植物を調製する方法を提供することでありこの方法は、以下：
（ｉ）野生型オオムギ穀粒またはその一部におけるＬＯＸ−１活性を測定する工程；および
（ｉｉ）オオムギ植物および／またはオオムギ穀粒および／またはオオムギ胚に変異を誘発させ、それによってＭ０世代のオオムギを得る工程；および
（ｉｉｉ）上記の変異を誘発させたオオムギ植物、穀粒および／または胚を少なくとも２世代栽培し、それによってＭｘ（ここで、ｘは≧２の整数である）世代のオオムギ植物を得る工程；および
（ｉｖ）上記Ｍｘ世代のオオムギ植物から穀粒またはその一部を得る工程；および
（ｖ）上記穀粒またはその一部においてＬＯＸ−１活性を測定する工程；および
（ｖｉ） 変異を誘発させた穀粒またはその一部のＬＯＸ−１活性が野生型穀粒またはその一部のＬＯＸ−１活性の５％未満である植物を選択する工程
を包含し、それによって野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性の５％未満を有するオオムギ植物を得る。
さらにまた、本発明の目的は、安定な感覚刺激品質を有する飲料を製造する方法を提供することであり、この方法は、以下：
（ｉ）本発明の麦芽組成物を提供する工程；
（ｉｉ）上記麦芽組成物を飲料に加工する工程
を包含し、それによって安定な感覚刺激品質を有する飲料を得る。
本発明のさらなる目的は、低いＬＯＸ−１活性を有する麦芽組成物を製造する方法を提供することであり、この方法は、以下：
（ｉ）本発明の穀粒を提供する工程；
（ｉｉ）上記穀粒を浸漬する工程；
（ｉｉｉ）上記浸漬した穀粒を所定の条件下で発芽させる工程；
（ｉｖ）発芽させた穀粒を熱で処理する工程；
を包含し、それによって低いＬＯＸ−１活性を有するかまたはＬＯＸ−１活性を全く有していない麦芽組成物を製造する。
１つの好ましい実施形態において、本発明は、主要な９−ＨＰＯＤＥ生成酵素ＬＯＸ−１に関して完全な機能喪失を示したオオムギ変異体Ｄ１１２（本明細書中では、「変異体Ｄ１１２」または「オオムギＤ１１２」ともいう）の機能研究の予測されなかった成果に基づく。リノール酸のＬＯＸに触媒された変換後の生成物プロフィールを決定するために設計された生化学アッセイにおいて、１０％：９０％の分布の９−ＨＰＯＤＥ：１３−ＨＰＯＤＥを検出することは意外な発見であった。Ｔ２Ｎの極めて低い香味閾値を考えると、変異体Ｄ１１２の穀粒中の残存９−ＨＰＯＤＥなどの分解は、上記穀粒の麦芽から製造されたビール製品の熟成中に、Ｔ２Ｎの非常に少ない遊離（香味閾値レベルよりも十分に低い）を生じただけであることは、さらに意外なことであった。
野生型およびヌル−ＬＯＸ−１の穀粒を使用する分析から得られた結果の調査は、高いＬＯＸ−１活性がＴ２Ｎの古いボール紙臭を強め、従ってアルケナールの生成の制御におけるＬＯＸ経路の重要な役割を確認することができるという明らかな証拠を提供する。この結論を、ＬＯＸ活性のみが一部のＴ２Ｎ前駆物質分子に寄与することを示唆したＬｉｅｇｅｏｉｓら（前出）の概念と対比する。
ヌル−ＬＯＸ−１形質は、任意の他のオオムギ植物（例えば確立されたオオムギ品種、例えば確立された麦芽用オオムギ品種）に導入され得、従って長期貯蔵寿命を有する香味安定飲料の製造を可能にする。このことは、例えば、当業者に周知の従来の育種法によって達成され得る。このアプローチは、変異体Ｄ１１２由来のオオムギが栽培される地理的領域と無関係であるばかりではなく、変異体Ｄ１１２由来のビールが製造され、顧客に販売される場所とも無関係である。変異体Ｄ１１２のオオムギ植物またはその誘導される植物は、潜在的に、作物を栽培する農家にとっておよびそれをビール製造用またはオオムギに基づく他の飲料の製造用の原料として使用する醸造所にとって重要な経済的要因である。９−ＨＰＯＤＥ／９−ＨＰＯＴＥ形成活性を有さない原料に依存する他の適用もまた、オオムギ変異体Ｄ１１２の性質から利益を得ることが予測される。
本発明の１つの実施形態に従って、いくつかの新規な麦芽用オオムギ変異体、例えばオオムギ変異体Ｄ１１２またはオオムギ変異体Ａ６１８（本明細書では「変異体Ａ６１８「または「オオムギＡ６１８「ともいう）が提供される。従って、本発明は、オオムギ変異体Ｄ１１２またはＡ６１８の穀粒、オオムギＤ１１２またはＡ６１８の植物、およびオオムギ変異体Ｄ１１２またはＡ６１８をそれ自体または別のオオムギ系統と交配させることにより誘導されるオオムギ植物の作成方法に関する。さらに、本発明は、オオムギ変異体Ｄ１１２またはＡ６１８の変異誘発または形質転換によって作製されるヌル−ＬＯＸ−１改変体を包含する。従って、オオムギ変異体Ｄ１１２もしくはＡ６１８（またはこれらの誘導体）を親植物として使用して作り出される全ての植物は、本発明の範囲内である。
別の局面において、本発明は、オオムギ変異体植物Ｄ１１２またはＡ６１８の組織培養に使用するための再生可能な細胞を提供する。組織培養は、前述のオオムギ植物の特徴（形態学的特徴および遺伝的特徴を含む）を有する植物の再生に使用されることが好ましい。このような組織培養で再生された細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葯などである。本発明は本発明の組織培養により再生されたオオムギ植物を提供することが理解される。
好ましい実施形態において、本発明は、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ穀粒から誘導される麦芽を包含する。
本発明はまた、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物またはその一部から調製される麦芽汁組成物またはこのようなオオムギ植物から調製された麦芽組成物から調製される麦芽汁組成物に関する。
本発明は、さらに本発明のヌル−ＬＯＸ−１オオムギ穀粒を使用するかまたはこの穀粒から誘導される麦芽のいずれかを使用して製造される飲料（例えばビール）を包含する。
さらに、本発明は、ヌル-ＬＯＸ−１オオムギ植物またはその一部から製造される植物製品に関する。上記植物製品は、上記オオムギ植物またはその一部の処理から生じる任意の製品であり得る。好ましくは、上記植物製品は、麦芽、麦芽汁、発酵飲料（例えばビール）、非発酵飲料、食品（例えばオオムギ粗びき粉）および飼料製品からなる群より選択される。
本発明の目的はまた、野生型オオムギ植物と区別がつかないかまたはさらに向上した耐病性を有するようなレベルの耐病性を示すヌル−ＬＯＸ−１オオムギ穀粒を提供することである。
なおさらに、本発明はヌル−ＬＯＸ−１オオムギ穀粒、およびこの穀粒から誘導される麦芽を包含し、ここで、穀粒および麦芽は両方とも低下したレベルのマイトコトキシンを示す。
また、本発明は、野生型植物と比べて増強された耐病性を有するヌル−ＬＯＸ−１オオムギ品種を包含する。さらに、野生型植物と比べて低下した耐病性を有するヌル−ＬＯＸ−１オオムギが開示されるが、但し、この植物の他の特性は、低減された耐病性の性質よりも重要である利点を提供する。
さらに、本発明は、ＬＯＸ経路由来の芳香（グリーンノート化合物が挙げられる）の製造に有用なヌル−ＬＯＸ−１オオムギ穀粒を提供する。
さらに、本発明は、導入された遺伝子が除草剤抵抗性、昆虫抵抗性、細菌、真菌もしくはウイルスによる病気に対する抵抗性のような形質、増強された栄養価、および工業用の用法を与えるヌル−ＬＯＸ−１オオムギ変異体Ｄ１１２もしくはＡ６１８、またはそれに由来する植物のトランスジェニック植物を提供する。この遺伝子は、内因性オオムギ遺伝子であってもよいし、あるいはまた遺伝子工学技術によって導入された導入遺伝子であってもよい。
最後に、本発明は、ＬＯＸ−１インヒビターを使用することによってＬＯＸ−１活性を低下させる方法を提供する。上記の方法によって得られる植物製品、植物から誘導される製品（飲料およびビールが挙げられる）は、原料としてヌル−ＬＯＸ−１オオムギから製造される製品と同様の特性を有し得る。
本発明は例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性の５％未満を有する、オオムギ植物またはその一部。
（項目２）
前記オオムギ植物の一部が穀粒である、項目１に記載のオオムギ植物またはその一部。
（項目３）
前記植物の胚が野生型オオムギ植物の胚のＬＯＸ−１活性の５％未満を有する、項目１に記載のオオムギ植物またはその一部。
（項目４）
前記植物またはその一部が野生型オオムギ植物と比べて１％未満のＬＯＸ−１タンパク質を含む、項目１〜３のいずれかに記載のオオムギ植物またはその一部。
（項目５）
項目１〜４のいずれかに記載のオオムギ植物またはその一部であって、該植物が、以下：
（ｉ）野生型オオムギ穀粒またはその一部においてＬＯＸ−１活性を測定する工程；および
（ｉｉ）オオムギ植物、および／またはオオムギ穀粒、および／またはオオムギ胚、および／またはオオムギ細胞、および／またはオオムギ組織に変異を誘発させ、それによってＭ０世代のオオムギを得る工程；および
（ｉｉｉ）該変異を誘発させたオオムギ植物、穀粒、細胞、組織および／または胚を、少なくとも２世代栽培し、それによってＭｘ（ここで、ｘは≧２の整数である）世代のオオムギ植物を得る工程；および
（ｉｖ）該Ｍｘ世代のオオムギ植物から穀粒またはその一部を得る工程；および
（ｖ）該穀粒またはその一部においてＬＯＸ−１活性を測定する工程；および
（ｖｉ）変異を誘発させた穀粒またはその一部のＬＯＸ−１活性が野生型穀粒またはその一部のＬＯＸ−１活性の５％未満である植物を選択する工程；
を包含する方法により作り出されているか、または該植物が、該工程を包含する方法により作り出された植物の後代である、オオムギ植物またはその一部。
（項目６）
前記植物のＬＯＸ−１をコードする遺伝子が中途ナンセンスコドンを含む、項目１〜５のいずれかに記載のオオムギ植物またはその一部。
（項目７）
前記植物のＬＯＸ−１をコードする遺伝子がナンセンスコドンを含み、該コドンが配列番号２の塩基番号３５７２−３５７４に対応する、項目６に記載のオオムギ植物またはその一部。
（項目８）
前記植物がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）寄託の受託番号ＰＴＡ−５４８７を有するＤ１１２と命名された植物およびその後代植物からなる群より選択される、項目６に記載のオオムギ植物またはその一部。
（項目９）
前記植物のＬＯＸ−１をコードする遺伝子がスプライス部位内に少なくとも１つの変異を含む、項目１〜５のいずれかに記載のオオムギ植物またはその一部。
（項目１０）
前記植物のＬＯＸ−１をコードする遺伝子がスプライス部位変異を含み、該変異が配列番号６の塩基番号２３１１に対応する、項目９に記載のオオムギ植物またはその一部。
（項目１１）
前記植物がＡＴＣＣ寄託の受託番号ＰＴＡ−５５８４を有するＡ６１８と命名された植物およびその後代植物からなる群より選択される、項目９に記載のオオムギ植物またはその一部。
（項目１２）
前記植物が、以下：
（ｉ）増強された耐病性を有すること；または
（ｉｉ） マイコトキシン類の産生について低減した可能性を有すること；または
（ｉｉｉ）組織培養に使用するための再生可能な細胞を含むこと；または
（ｉｖ） （ｉ）〜（ｉｉｉ）の特性の任意の組み合わせ；
によって特徴付けられる、項目１〜１１のいずれかに記載のオオムギ植物またはその一部。
（項目１３）
さらにＬＯＸ−１をコードする遺伝子の存在によって特徴付けられる項目１２に記載のオオムギ植物またはその一部であって、該遺伝子が、以下：
（ｉ）中途ナンセンスコドン；または
（ｉｉ）スプライス部位変異
を含む、オオムギ植物またはその一部。
（項目１４）
さらにＬＯＸ−１をコードする遺伝子の存在によって特徴付けられる項目１３に記載のオオムギ植物であって、該遺伝子が、以下：
（ｉ）配列番号２の塩基番号３５７２−３５７４に対応するナンセンスコドン；または
（ｉｉ）配列番号６の塩基番号２３１１に対応するスプライス部位変異
を含む、オオムギ植物。
（項目１５）
項目１〜１４のいずれかに記載のオオムギ植物またはその一部を含有する、組成物。
（項目１６）
処理されたオオムギ植物またはその一部を含有する麦芽組成物であって、該オオムギ植物が項目１〜１４のいずれかに記載のオオムギ植物である、麦芽組成物。
（項目１７）
前記オオムギ植物の一部が穀粒である、項目１６に記載の麦芽組成物。
（項目１８）
項目１〜１４のいずれかに記載のオオムギ植物もしくはその一部を使用するかまたは該オオムギ植物もしくはその一部またはこれらの混合物から調製される麦芽組成物を使用して調製される、麦芽汁組成物。
（項目１９）
前記植物の一部が穀粒である、項目１８に記載の麦芽汁組成物。
（項目２０）
前記麦芽組成物が項目１６および１７のいずれかに記載の麦芽組成物である、項目１８に記載の麦芽汁組成物。
（項目２１）
前記組成物が酵素組成物または酵素混合組成物を使用して調製される、項目１８〜２０のいずれかに記載の麦芽汁組成物。
（項目２２）
（ｉ）項目１〜１４のいずれかに記載のオオムギ植物またはその一部を含有する組成物と、（ｉｉ）項目１６および１７のいずれかに記載の麦芽組成物との混合物から調製される、組成物。
（項目２３）
項目２２に記載の組成物から調製される、麦芽汁組成物または飲料。
（項目２４）
安定な感覚刺激品質を有する飲料であって、項目１〜１４のいずれかに記載のオオムギ植物またはその一部を製造することによって得られる、飲料。
（項目２５）
前記飲料がビールである、項目２４に記載の飲料。
（項目２６）
前記飲料が前記オオムギ植物の穀粒から調製される麦芽を使用して調製される、項目２４に記載の飲料。
（項目２７）
前記飲料が、オオムギ植物もしくはその一部から調製される麦芽汁組成物から調製されるか、または該オオムギ植物もしくはその一部から調製される麦芽組成物から調製され、該オオムギ植物が野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性の５％未満を含む、項目２４〜２６のいずれかに記載の飲料。
（項目２８）
前記飲料が麦芽化されていないオオムギ植物またはその一部から調製される、項目２４に記載の飲料。
（項目２９）
前記飲料が非発酵飲料である、項目２４〜２８のいずれかに記載の飲料。
（項目３０）
前記オオムギ植物またはその一部がＬＯＸ−１をコードする遺伝子を含み、該遺伝子が、以下：
（ｉ）ナンセンスコドン；または
（ｉｉ）スプライス部位変異
を含む、項目２４〜２９のいずれかに記載の飲料。
（項目３１）
前記ＬＯＸ−１をコードする遺伝子が、以下：
（ｉ）配列番号２の塩基番号３５７２−３５７４に対応するナンセンスコドン；または
（ｉｉ）配列番号６の塩基番号２３１１に対応するスプライス部位変異；
を含む、項目３０に記載の飲料。

（項目３２）
安定な感覚刺激品質を有する飲料であって、該飲料は、オオムギ植物を使用することによって製造され、該飲料内の９，１０，１３−トリヒドロキシオクタデセン酸に対する９，１２，１３−トリヒドロキシオクタデセン酸の比率が多くても１．８である、安定な感覚刺激品質を有する飲料。
（項目３３）
前記飲料がオオムギ植物もしくはその一部、またはこれらの抽出物の発酵によって調製され、かつ該オオムギ植物が野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性の５％未満を有する、項目３２に記載の飲料。
（項目３４）
前記飲料がビールである項目３２〜３３のいずれかに記載の飲料。
（項目３５）
安定な感覚刺激品質を有する飲料であって、該飲料は、オオムギ植物を使用して製造され、かつ該飲料は、４〜６ｐｐｍの範囲内の亜硫酸塩の存在下で３７℃にて４週間のインキュベーションの後に多くても０．０５ｐｐｂの遊離トランス２−ノネナール（Ｔ２Ｎ）を含有する、飲料。
（項目３６）
前記飲料は、オオムギ植物もしくはその一部、またはこれらの抽出物の発酵によって製造され、かつ該オオムギ植物が野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性の５％未満を含む、項目３５に記載の飲料。
（項目３７）
前記飲料内の９，１０，１３−トリヒドロキシオクタデセン酸に対する９，１２，１３−トリヒドロキシオクタデセン酸の比率が多くても１．８である、項目３５〜３６のいずれかに記載の飲料。
（項目３８）
前記飲料がビールである、項目３５〜３７のいずれに記載の飲料。
（項目３９）
項目１〜１４のいずれかに記載のオオムギ植物またはその一部から製造される、植物製品。
（項目４０）
前記植物製品が飲料である、項目３９に記載の植物製品。
（項目４１）
項目１〜１４のいずれかに記載のオオムギ植物またはその一部を使用して、以下：
（ｉ）食品組成物；もしくは
（ｉｉ）飼料組成物；もしくは
（ｉｉｉ）芳香原料組成物；もしくは
（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせ
を製造する、方法。
（項目４２）
項目１〜１４のいずれかに記載のオオムギ植物またはその一部を含有する、食品組成物、飼料組成物、または芳香原料組成物。
（項目４３）
項目１〜１４のいずれかに記載のオオムギ植物を得るためのオオムギ中での組換えタンパク質の発現方法であって、該方法は、作動可能に連結された構成要素としてオオムギ植物またはその一部中で発現可能なプロモーター、該組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列および転写終結領域を含む核酸配列を用いて該植物を安定的に形質転換させる工程を包含する、方法。
（項目４４）
項目１〜１４のいずれかに記載のオオムギ植物を得るためのオオムギ中のタンパク質のレベルを調節する方法であって、該方法は、作動可能に連結された要素としてオオムギ植物で発現可能なプロモーター、ＤＮＡ配列および転写終結領域を含む核酸配列を用いて該植物を安定的に形質転換させる工程を包含し、ここで、該ＤＮＡ配列の発現が該タンパク質をコードする遺伝子の発現を、以下：
（ｉ）アンチセンスサイレンシング；または
（ｉｉ）コサプレッションサイレンシング；または
（ｉｉｉ）ＲＮＡ干渉
によって低下させる、方法。
（項目４５）
項目１〜１４のいずれかに記載のオオムギ植物を調製する方法であって、該方法は、作動可能に連結された要素として、オオムギ植物で発現可能なプロモーター、ＤＮＡ配列および転写終結領域を含む核酸配列を用いてオオムギ植物を安定的に形質転換させる工程を包含し、ここで、該ＤＮＡ配列の発現がＬＯＸ−１をコードする遺伝子の発現を、以下：
（ｉ）アンチセンスサイレンシング；または
（ｉｉ）コサプレッションサイレンシング；または
（ｉｉｉ）ＲＮＡ干渉
によって低下させる、方法。
（項目４６）
安定な感覚刺激品質を有する飲料を製造する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）項目１に記載のオオムギ植物またはその一部を含有する組成物を調製する工程；
（ｉｉ）（ｉ）の組成物を飲料に加工する工程；
を包含し、それによって安定な感覚刺激品質を有する飲料を得る、方法。
（項目４７）
工程（ｉ）が麦芽組成物を前記オオムギ植物またはその一部の穀粒から調製する工程を包含する、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記方法がさらにＬＯＸインヒビターを用いたインキュベーションを包含する、項目４６および４７のいずれかに記載の方法。
（項目４９）
前記組成物の飲料への加工がマッシング工程を包含する、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
ＬＯＸインヒビターが、前記マッシング工程中に添加される、項目４６に記載の方法。
（項目５１）
低いＬＯＸ−１活性を有するかまたはＬＯＸ−１活性を有さない麦芽組成物を製造する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）項目２に記載の穀粒を提供する工程；
（ｉｉ）該穀粒を浸漬する工程；
（ｉｉｉ）該浸漬した穀粒を所定の条件下で発芽させる工程；
（ｉｖ）発芽させた穀粒を熱で処理する工程；
を包含し、それによって低いＬＯＸ−１活性を有するかまたはＬＯＸ−１活性を有さない麦芽組成物を製造する、方法。
（項目５２）
野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性の５％未満を有するオオムギ植物を調製する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）野生型オオムギ穀粒またはその一部のＬＯＸ−１活性を測定する工程；および
（ｉｉ）オオムギ植物および／またはオオムギ穀粒および／またはオオムギ胚および／またはオオムギ細胞および／またはオオムギ組織に変異を誘発させ、それによってＭ０世代のオオムギを得る工程；および
（ｉｉｉ）該変異を誘発させたオオムギ植物、穀粒、細胞、組織および／または胚を少なくとも２世代栽培し、それによってＭｘ世代のオオムギ植物（ここで、ｘは≧２の整数である）を得る工程；および
（ｉｖ）穀粒またはその一部を該Ｍｘ世代のオオムギ植物から得る工程；および
（ｖ）該穀粒またはその一部におけるＬＯＸ−１活性を測定する工程；および
（ｖｉ）変異を誘発させた穀粒またはその一部のＬＯＸ−１活性が野生型穀粒またはその一部のＬＯＸ−１活性の５％未満である植物を選択する工程；
を包含し、それによって野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性の５％未満を有するオオムギ植物を得る、方法。
（項目５３）
野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性の５％未満を有するオオムギ植物を調製する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）オオムギ植物、および／またはオオムギ穀粒および／またはオオムギ胚に変異を誘発させる工程；および
（ｉｉ） 必要に応じて、該変異を誘発させたオオムギ植物／オオムギ穀粒／オオムギ胚を栽培する工程；および
（ｉｉｉ）ＬＯＸ−１をコードするオオムギ遺伝子中の変異の有無を決定する工程であって、該変異が、配列番号３に示す配列の７００個未満の連続アミノ酸を含むＬＯＸ−１のポリペプチド形態をコードする遺伝子を生じる工程；および
（ｉｖ）（ｉｉ）で提供された変異を有する植物を選択する工程；
を包含する、方法。
（項目５４）
オオムギＬＯＸの活性を低下させる方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）オオムギ植物もしくはその一部またはオオムギから調製される植物製品を提供する工程；
（ｉｉ）ＬＯＸインヒビターを提供する工程であって、該ＬＯＸインヒビターが没食子酸塩である、工程；
（ｉｉｉ）該オオムギ植物もしくはその一部またはオオムギから調製される植物製品を該ＬＯＸインヒビターと共にインキュベートし、それによってオオムギＬＯＸ（好ましくはＬＯＸ−１）の活性を低下させる工程；
を包含する、方法。
（項目５５）
前記インヒビターが没食子酸オクチルである、項目５４に記載の方法。
本発明のこれらの特徴および他の特徴、局面、ならびに利点は、以下の定義、記載、実施例、添付の特許請求の範囲ならびに添付の配列表および図面に関連付けた場合によりよく理解される。
（３．１ 定義）
以下の記載、図および表において、多数の用語が使用される。明細書および特許請求の範囲を提供するために、このような用語に与えられるべき範囲を含む以下の定義が提供される。
本明細書で使用される場合、「ａ」は、それが使用される文脈に応じて１つ以上を意味し得る。
用語「作物学的形質」は、植物の性能または経済価値に寄与する植物の表現型形質を説明する。このような形質としては、耐病性、昆虫抵抗性、ウイルス抵抗性、線虫抵抗性、耐乾燥性、耐高塩性、収量、草高、成熟までの日数、穀粒粒度（すなわち穀粒サイズ分別）、穀粒窒素含有量などが挙げられる。
「アンチセンスヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチド配列の標準的な５’から３’への向きのコーディングに対して逆の向きである配列を意図する。植物細胞中に存在する場合、アンチセンスＤＮＡ配列は、好ましくは内因性遺伝子に関するヌクレオチド配列の正常な発現を抑制し、対応する天然タンパク質の産生を破壊させ得る。
ビールの製造プロセスに関連して、用語「オオムギ」は、特に麦芽製造プロセスを説明するために使用される場合、オオムギ穀粒を意味する。他の全ての場合において、特に明記しない限り、「オオムギ」とは、任意の品種を含むオオムギ植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ，Ｌ）を意味する。
「耐病性」とは、植物が植物−病原体の相互作用の結果である病徴を回避することを意図する。このようにして、病原体が植物病害および関連する病徴、あるいはまた病徴を引き起こすことが防止される。また、病原体によって引き起こされる病徴は最小限抑えられるかまたは軽減される。
本出願明細書で定義される「穀物」植物は、主としてデンプン含有種子用に栽培されるイネ科植物群の一員である。穀物植物としては、オオムギ、コムギ（パンコムギ）、イネ、トウモロコシ、ライムギ、カラスムギ、モロコシおよびライコムギ（Ｔｒｉｔｉｃａｌｅ）、すなわちライムギ−コムギハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の核酸との関連で「コードする」または「コードされる」とは、特定のタンパク質への翻訳に関する情報を包含することを意味する。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳された領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン）を含んでいてもよいし、またはこのような介在非翻訳配列を欠いていてもよい（例えば、ｃＤＮＡにおいて）。タンパク質がコードされる情報は、コドンの使用により特定される。
本明細書で使用される場合、核酸との関連で「発現」とは、核酸断片から誘導されるセンスｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡの転写および蓄積として理解されるべきである。タンパク質との関連で使用される「発現」とは、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳をいう。
「香味分子」とは、植物中で生成され、臭気および／または香味の構成成分であるアルデヒドおよび／またはアルコールを意図する。特に、香味分子としては、特定の揮発性のアルコールおよびアルデヒドが挙げられる。揮発性の香味分子の例としては、ヘキサナール、（３Ｚ）−ヘキセナール、（２Ｅ）−ヘキセナール、（２Ｅ）−ヘキセノール、（３Ｚ）−ノネナール、（２Ｅ）−ノネナールが挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、植物中の香味分子のレベルを調節するために使用され得る。
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の生成に関わるＤＮＡのセグメントを意味する；セグメントとしては、コード領域の前および後の領域（プロモーターおよびターミネーター）が挙げられる。真核生物遺伝子は、それによってコードされるタンパク質に関して非連続的であり、イントロンによって中断されたエキソンからなる。ＲＮＡへの転写後に、イントロンはスプライシングによって除去されて成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を生じる。エキソン間の「スプライス部位」は、代表的には一次ＲＮＡ転写産物からのイントロンの欠失および切除されたイントロンのいずれかの側に残っているＲＮＡの両端の結合または融合からなるスプライシングプロセスのためのスプライスシグナルとして作用する共通配列によって決定される。いくつかの場合には、交互または異なるパターンのスプライシングは、同じ単一の長さのＤＮＡから種々のタンパク質を生じ得る。ネイティブの遺伝子は、内因性遺伝子と呼ばれ得る。
「遺伝子サイレンシング」は、遺伝子の発現を変えるための方法である。それは、種々の生物間で保存される転写後遺伝子サイレンシング機構であるＲＮＡサイレンシングをいう。この方法としては、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が挙げられる。ＰＴＧＳは、内因性および外因性の相同性遺伝子の遺伝子サイレンシング現象である。ＰＴＧＳに関する大部分の例は、コサプレッション構築物またはアンチセンス配向の導入遺伝子の発現によって生じる効果に関するものであるが、従来の育種プログラム（例えばイネでのＬｇｃ１変異）の植物でも認められている（Ｋｕｓａｂａ ら、２００３）。この変異は、ＲＮＡサイレンシングによってグルテリン発現を抑制することが見出され、これはおそらくは二本鎖ＲＮＡ分子、従ってＲＮＡサイレンシングの強力な誘発物質を生成し得る尾部対尾部（ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ）の逆方向反復を形成するグルテリンに対する２つの高度に類似する遺伝子の間の３．５ｋｂｐの欠失に起因する。ＲＮＡサイレンシングの第２の型は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られており、根本的な前提は、細胞中に注入されるかまたは取り込まれた場合に、二本鎖のＲＮＡがその相同な遺伝子の発現を特異的にブロックし得ることである（Ｇｏｅｎｃｚｙら、２０００）。
本明細書で使用される場合、核酸との関連で「異種」とは、外来種が起源である核酸であるか、または同種から生じる場合には組成および／またはゲノム遺伝子座におけるそのネイティブの形態から意図的なヒトの介入によって実質的に修飾される核酸である。
本明細書で使用される場合、用語「発芽」とは、種々の組成物（例えば天然に見出される標準的な土壌でのオオムギ穀粒による成長の開始または続行を意味する。発芽はまた、グロースチャンバなどに置かれた鉢の土壌で行なうこともできるし、あるいは例えば、標準的な実験用ペトリ皿に置かれた湿潤濾紙上で行なうこともできる。発芽は、一般に穀粒の水和、穀粒の膨張および胚の成長の誘導を包含すると理解される。発芽に影響を及ぼす環境要因としては、湿度、温度および酸素レベルが挙げられる。根および苗条の発育が観察される。
「グリーンノート」とは、多数の植物中に存在する揮発性の香味および芳香分子を説明する用語であり、感応用語においてフレッシュグリーンおよびグラッシー（ｆｒｅｓｈ ｇｒｅｅｎ ａｎｄ ｇｒａｓｓｙ）として特徴付けられる。これらの分子は、植物によって脂質および遊離脂肪酸（例えばリノール酸およびリノレン酸）の分解から生成される。
本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、物質がその本来の環境から取り出されることを意味する。例えば、生物中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、自然系に共存する物質のいくつかまたは全てから分離される同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離される。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部分であり得るか、そして／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得、さらにこのようなベクターまたは組成物はその天然環境の部分ではないので、単離することができる。
用語「穀粒」とは、穀物穎果を包含することが定義され、内部種子、外花穎および内花穎も表す。大部分のオオムギ品種において、外花穎および内花穎は、穎果に付着し、また脱穀の後の穀粒の一部である。しかし、ハダカムギ品種も存在する。これらにおいて、穎果は外花穎および内花穎がなく、コムギのように自由に脱穀される。用語「穀粒」および「穀類」は、本明細書では交換可能に使用される。
「穀粒熟成」または「穀類発育」とは、受精によって開始し、代謝蓄積物（例えば糖、オリゴ糖、デンプン、フェノール、アミノ酸およびタンパク質）が液胞を標的するかまたは標的せずに穀粒（穀類）の種々の組織（例えば胚乳、種皮、糊粉および胚盤に蓄積し、穀粒（穀類）の拡大、穀粒（穀類）の充填をもたらし、そして穀粒（穀類）の乾燥により終結する期間をいう。
用語「ＬＯＸ−１活性」とは、オオムギＬＯＸ−１酵素の酵素活性をいう。特に、本発明との関連で、「ＬＯＸ−１活性」とは、リノール酸の９−ＨＰＯＤＥへの酵素触媒二原子酸素添加である。ＬＯＸ−１酵素が他の反応を触媒することができるとしても、本発明のＬＯＸ−１の活性を測定するためには、９−ＨＰＯＤＥ形成活性のみが考慮されるべきである。図１Ｂは、リノール酸がＴ２Ｎに変換される生化学的経路を概説する。
用語「低ＬＯＸ」とは、好ましくは酵素活性（これに限定されない）に関して、部分的機能喪失型の特定のＬＯＸ酵素を生じる１個または数個の内因性遺伝子における１つまたは数個の変異の存在をいう。例えば、ＤｏｕｍａらのＷＯ０２／０５３７２１Ａ１号として公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＩＢ０１／００２０７号に開示されたオオムギ植物は、対応する野生型酵素と比べて１０％の残留活性を有する変異ＬＯＸ−１酵素を生成する。植物との関連で「低ＬＯＸ」とは、部分的機能喪失型の特定のＬＯＸ酵素を有する植物をいう。
「麦芽製造」とは、制御された環境条件（例えば麦芽浸漬タンクおよび発芽箱が挙げられるが、これらに限定されない）の下で行うオオムギ穀粒の特殊な形態の発芽である。本発明のプロセスに従って、麦芽製造はオオムギ穀粒が浸漬されている間および／またはその後に生じ始める。麦芽製造プロセスは、オオムギ穀粒の乾燥によって停止させ得る。ヌル−ＬＯＸ−１オオムギから調製された麦芽組成物は、ヌル−ＬＯＸ−１麦芽（例えば純粋なヌル−ＬＯＸ−１麦芽）またはヌル−ＬＯＸ−１麦芽を含有する任意の麦芽混合物を含有すると理解される。
「マッシング」は、粉砕した麦芽の水中でのインキュベーションである。マッシングは、特定の温度および特定の体積の水で行うことが好ましい。上記温度および水の体積は、麦芽由来の酵素活性の低下の度合い、従って特に、生じ得るデンプン加水分解の量に影響及ぼすので重要である。マッシングは、添加物の存在下で行い得る。これは、主に抽出物のさらなる供給源として使用される麦芽以外の任意の炭水化物源（例えばオオムギ（ヌル−ＬＯＸ−１オオムギが挙げられる）、トウモロコシまたはイネの添加物を含むと理解される。醸造所における添加物の処理についての要件は、使用される添加物の状態および種類、特にデンプン糊化または液化温度に依存する。糊化温度が標準麦芽糖化温度よりも高い場合、デンプンはマッシュに添加する前に糊化され、液状化される。
「変異」は、遺伝子のコード領域および非コード領域の欠失、挿入、トランスバージョンおよび点変異を包含する。欠失は、遺伝子全体についてまたは遺伝子の一部だけについてのものであり得る。点変異は、終止コドン、フレームシフト変異またはアミノ酸置換を生じ得る。体細胞変異は、植物の特定の細胞または組織においてのみ生じる変異であり、次の世代には遺伝しない。生殖細胞系統の変異は、任意の植物の細胞において見出され得、遺伝する。
用語「ヌル−ＬＯＸ」とは、完全機能喪失型のコードされたＬＯＸ酵素を生じるＬＯＸコード遺伝子中の変異の存在をいう。ＬＯＸをコードする遺伝子において未成熟終止（ナンセンス）コドンを生じる変異は、完全機能喪失型を得ることができる唯１つのメカニズムに相当する。完全機能喪失型のＬＯＸ酵素を得るための分子アプローチは、上記酵素について転写産物の完全欠損を生じる変異、またはコードされた酵素を完全に不活性化する変異の発生を含む。植物との関連で、「ヌル−ＬＯＸ」とは、完全機能喪失型の特定のＬＯＸ酵素を有する植物をいう。
「作動可能に連結された」とは、一方の機能が他方の機能によって影響されるように１つのポリヌクレオチドに対する２個以上の核酸断片の会合を示すために使用される用語である。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現に影響を及ぼし得る場合にはコード化配列と作動可能に連結される（すなわちコード配列はプロモーターの転写調節下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンスの配向で調節配列に作動可能に連結させることができる。
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特異的ＤＮＡセグメントの増幅に使用される技術として当業者には周知である（Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，８００，１５９号）。
「植物」または「植物材料」としては、植物細胞、植物プロトプラスト、オオムギ植物を再生することができる植物細胞組織培養物、植物カルス、および植物細胞であって植物または植物部分（例えば胚、花粉、胚珠、花、穀粒、葉、根、根端、葯内のインタクトな植物細胞）あるいは植物の任意の部分または製品が挙げられる。
用語「植物製品」とは、植物または植物部分の加工により得られる製品を意味する。従って、上記植物製品は、例えば、麦芽、麦芽汁、発酵または非発酵の飲料、食品あるいは飼料製品であり得る。
本明細書で使用される場合、タンパク質との関連で「組換え体」とは、外来種が起源であるタンパク質であるか、または同じ種から生じる場合には、組成においてその固有の形から意図的なヒトの介入によって実質的に修飾されているタンパク質である。
「ＲＮＡ転写産物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写により生じる生成物をいう。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、ＲＮＡ転写産物は一次転写産物と呼ばれる。ＲＮＡ配列が一次転写産物の翻訳後処理により誘導される場合には、それは成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とは、イントロンが存在せずかつ細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡをいう。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡテンプレートに相補的でありかつｍＲＮＡテンプレートから得られるＤＮＡをいう。ｃＤＮＡは、一本鎖の形であり得るか、または例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を使用して二本鎖の形に転換され得る。「センスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡを含み、従って細胞によってポリペプチドに転写され得るＲＮＡ転写産物をいう。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写産物またはｍＲＮＡの全体または一部に相補的でありかつ標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写産物をいう。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定のヌクレオチド配列（すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン、またはタンパク質コード配列の任意の部分に対するものであり得る。「機能的ＲＮＡ」とは、タンパク質へ翻訳され得ないが細胞プロセスに対してはなお影響を及ぼすセンスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはその他のＲＮＡをいう。
他に明記しない限りは、「Ｔ２Ｎ」とは、遊離の形態のＴ２Ｎを意味する。「Ｔ２Ｎポテンシャル」という用語は、Ｔ２Ｎを放出する能力を有するか、または１つ以上の反応においてＴ２Ｎに変換され得る化学物質を説明する。Ｔ２Ｎポテンシャルは、高温（例えば１００℃）および低い酸性度（例えばｐＨ４．０）でインキュベーション（例えば２時間）の後の溶液（例えば麦芽汁またはビール）中のＴ２Ｎの濃度として測定することができる。この試料処理は、Ｔ２Ｎポテンシャルから、例えば「Ｔ２Ｎ付加物」（１種以上の物質（例えばタンパク質、亜硫酸塩、細胞砕片、細胞壁などが挙げられるが、これらに限定されない）に結合体化したＴ２Ｎを説明するのに使用される用語）からＴ２Ｎの遊離を生じる。一般的に、Ｔ２Ｎ付加物それ自体は、ヒトによって異臭として感じられない。しかし、上記Ｔ２Ｎ付加物から、例えば熱または酸によって放出されるＴ２Ｎは、異臭を生じ得る。
「組織培養物」とは、同じ種類または異なる種類の単離細胞、あるいは植物の部分（例えばプロトプラスト、カルス、胚、花粉、葯など）に組織化された細胞の集合を含有する組成物を示す。
「形質転換」とは、ＤＮＡが染色体外要素（組み込みおよび安定な遺伝なしに）としてまたは染色体組込み体（遺伝学的に安定な遺伝）のどちらかとして維持されるように生物内にＤＮＡを導入することを意味する。他に明記しない限りは、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換について本明細書で使用した方法はＣａＣｌ２法であった（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、前出）。オオムギの形質転換については、アグロバクテリウム介在形質転換は、品種Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｒｏｍｉｓｅなどの別の品種を宿主として使用し得ることを除いて、Ｔｉｎｇａｙら（１９９７年）およびＷａｎｇら（２００１年）によって記載されているようにして基本的に行われ得る。
「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノムに導入されている遺伝子である。
本明細書で使用される場合、「トランスジェニック」とは、異種核酸の導入によって改変されている細胞についての言及または細胞がそのように改変された細胞から誘導されることについての言及を包含する。従って、例えば、トランスジェニック細胞は、天然型の細胞内で同じ型で見出されない遺伝子を発現するか、または、意図的なヒトの介入の結果として別の方法で異常に発現されるか、過少発現されるか、または全く発現されない天然の遺伝子を発現する。本明細書で使用される場合、植物、特にオオムギ植物との関連で「トランスジェニック」という用語は、伝統的な植物育種法（例えばＮａＮ３で誘導される変異誘発）による細胞の変性、および自然に生じる事象（例えば意図的なヒトの介入なしで生じる事象）による細胞の変性を包含しない。
用語「野生型オオムギ植物」とは従来のオオムギ植物をいい、好ましくは、この用語は本発明のオオムギ植物が誘導されるオオムギ植物、すなわち親植物をいう。本発明の１つの好ましい実施形態においては、「野生型オオムギ植物」は、品種Ｃｅｌｅｓｔｅ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、ＳａｌｏｏｎおよびＮｅｒｕｄａからなる群より選択される。より好ましくは、「野生型オオムギ植物」は品種Ｂａｒｋｅである。野生型オオムギ品種またはその種子は、一般的には例えば一般の種子会社から入手可能である。
（４．配列表の簡単な説明）
本発明は、以下の詳細な説明および本出願の一部を構成する添付の配列表（表９に要約する）からさらに十分に理解され得る。上記表は、本明細書に記載の核酸およびポリペプチド、これらのポリペプチドの全部またはかなりの部分に相当するポリペプチドをコードする核酸断片を含むｃＤＮＡクローンの指定、および対応する識別子（配列番号）を列挙する。配列の説明およびそれに添付された配列表は、特許出願のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示を規定する規則に従う。
配列表は、標準化された勧告（Ｃｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎ，１９８５；ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，１９８４）（これらは本明細書中に参考として援用される）に準拠して定義されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列文字に関する一文字コードを含む。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データについて使用される記号および書式は、特許出願の配列の開示を規定する規則に従う。
図１は、３つのフローダイアグラムＡ、ＢおよびＣに分けられる。図１Ａは、ＮａＮ３で変異を誘発させたオオムギ穀粒がどのようにして増殖し得るかを表す。Ｍ０世代の穀粒は、Ｍ１世代の穀粒を生み出す植物に生育する。Ｍ１世代の穀粒は播種され、Ｍ２世代の新しい穀粒を産生するＭ１植物に成長し得る。次に、Ｍ２植物が生育し、そしてＭ３世代の穀粒をつけ、これらの穀粒は収穫され、スクリーニング分析に使用され得る。Ｍ３種子もまた播種され得、対応する植物の花がＭ４世代の植物を得るために交配に使用される。 図１は、３つのフローダイアグラムＡ、ＢおよびＣに分けられる。図１Ｂは、リノール酸を分解し、最終的にＴ２Ｎを生じるために生化学的ＬＯＸ経路がどのように作動するかを簡単に表した図である。 図１は、３つのフローダイアグラムＡ、ＢおよびＣに分けられる。図１Ｃは、どのようにしてリノール酸がＬＯＸ−１の作用によって対応する９−ヒドロペルオキシ酸（９−ＨＰＯＤＥ）に変換され、次いでエポキシアルコールシンターゼおよびエポキシドヒドロラーゼによるさらなる酵素転換によって９，１２，１３−トリヒドロキシ−１０−オクタデセン酸（９，１２，１３−ＴＨＯＥ）に変換され得るかを説明する。 図２は、品種Ｂａｒｋｅの胚抽出物、変異体Ｄ１１２の胚抽出物、および品種Ｂａｒｋｅの胚の加熱不活性化抽出物を含有するコントロール試料において測定された全ＬＯＸ活性の比較のグラフである。 図３は、変異体Ａ６１８の胚抽出物、品種Ｎｅｒｕｄａの胚抽出物、および品種Ｂａｒｋｅの胚の加熱不活性化抽出物を含有するコントロール試料において測定された全ＬＯＸ活性の比較のグラフである。 図４は、変異体Ｄ１１２の１２の個々のＭ４後代系統の穀粒で測定された全ＬＯＸ活性の比較を表す。品種Ｂａｒｋｅの穀粒抽出物からなるコントロール試料、および品種Ｂａｒｋｅの加熱不活性化穀粒抽出物からなるコントロール試料の活性が比較に含まれる。 図５は、変異体Ｄ１１２のＭ５後代系統の９０の個々の穀粒抽出物の全ＬＯＸ活性についての分析の結果を要約する。品種Ｂａｒｋｅのコントロール穀粒抽出物、および品種Ｂａｒｋｅの加熱不活性化穀粒抽出物の活性が比較に含まれる。 図６は、変異体Ａ６１８のＭ４後代系統の４０の個々の穀粒抽出物で測定された全ＬＯＸ活性の比較の要約を示す。品種Ｂａｒｋｅの穀粒抽出物を用いたコントロール試料および品種Ｂａｒｋｅの加熱不活性化穀粒抽出物を用いたコントロール試料の活性が比較に含まれる。 図７は、２つの別々の免疫ブロットからなり、免疫反応性ＬＯＸ−１タンパク質が変異体Ｄ１１２、Ｍ３世代の穀粒抽出物において検出できないことを表す。それぞれの免疫ブロットは、オオムギＬＯＸ−１に対する抗体を用いて精査し、試料は組換え体ＬＯＸ−１を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の抽出物（レーン１）、品種Ｖｉｎｔａｇｅの穀粒抽出物（レーン２）、変異体系統Ｇ（レーン３および７）、品種Ｂａｒｋｅ（レーン６および８）、および変異体Ｄ１１２、Ｍ３世代の個々の系統（レーン４〜５および９〜１６）からなる。免疫反応性ＬＯＸ−１タンパク質の位置が示される。 図８は、変異体Ａ６１８、Ｍ３世代およびＭ４世代の穀粒抽出物中にＬＯＸ−１が存在しないことを詳述する２つの個々の免疫ブロットを示す。それぞれの免疫ブロットは、オオムギＬＯＸ−１に対する抗体を用いて精査し、また試料は変異体系統Ｇ（レーン１）、品種Ｎｅｒｕｄａ（レーン６および１６）の穀粒抽出物からなる。ＬＯＸ選択手順によるものではなかった無作為に選択されたＭ３およびＭ４の穀粒の抽出物は、レーン２〜５および８〜１２それぞれで分離された；これらの抽出物の全部がＬＯＸ−１免疫反応性タンパク質を含有していた。変異体Ａ６１８、世代Ｍ３（レーン７）の穀粒抽出物のヌル−ＬＯＸ−１表現型は、変異体Ａ６１８−８２（レーン８〜１２）の個々のＭ４後代系統に遺伝していた。免疫反応性ＬＯＸ−１タンパク質の位置が示される。 図９は、品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅに対する変異体Ｄ１１２についての戻し交配プログラムの遺伝学を模式的に説明する。野生型ＬＯＸ−１形質にＮＮを割り当て、これに対してヌル−ＬＯＸ−１変異体形質にはｎｎを割り当てる。下線を付した遺伝子型を有する植物が交配に供される。 図１０は、７つの個々の免疫ブロットの例を提供し、それぞれはオオムギＬＯＸ−１に対する抗体を用いて精査した。免疫ブロットは、品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅに対する変異体Ｄ１１２の一次戻し交配世代の個々の植物の穀粒中の免疫反応性ＬＯＸ−１タンパク質の有無（レーン１〜６およびレーン９〜１４）、ならびに品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅに対する変異体Ｄ１１２の二次戻し交配世代の穀粒中の免疫反応性ＬＯＸ−１タンパク質の有無（レーン１７〜２２、レーン２５〜３０、レーン３３〜３８、レーン４１〜４５およびレーン４８〜５２）を示す。免疫反応性ＬＯＸ−１を欠いている変異体Ｄ１１２（レーン７、１５、２３、３１、３９、４６、５３）、および免疫反応性ＬＯＸ−１を含む品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅ（レーン８，１６、２４、３２、４０、４７、５４）のコントロール穀粒抽出物を、コントロールとして使用した。免疫反応性ＬＯＸ−１タンパク質の位置が示される。 図１１は、添加物を使用しないビール製造プロセスの簡略化した概略図であるが、オオムギ穀粒の浸漬（１）、麦芽製造（２）、キルン乾燥（３）、乾燥麦芽の粉砕（４）、マッシング（５）、濾過（６）、添加ホップの存在下での麦芽汁煮沸（７）、酵母の存在下での発酵（８）、ビール熟成（９）、ビール濾過（１０）、パッケージング（例えばビン、缶などへのパッケージングが挙げられるが、これらに限定されない）（１１）、およびラベリング（１２）を含む。個々のプロセスは、麦芽製造（１〜３）、麦芽汁製造（４〜７）、発酵（８〜９）、および完成ビールの調製（１０〜１２）を含む部分にグループ分けすることができる。 図１２は、ヌル−ＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２のオオムギから誘導される麦芽を使用して製造されたビールの特性に焦点を合わせている。図１２Ａは、３７℃で４週間強制熟成中の遊離Ｔ２Ｎの蓄積を例示する。このアルデヒドは、ヌル−ＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２の麦芽から製造されたビール（黒三角）および品種Ｂａｒｋｅのコントロール麦芽から製造されたビール（黒丸）で測定した。ビール中のＴ２Ｎの香味閾値レベルは約０．０５ｐｐｂである。 図１２は、ヌル−ＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２のオオムギから誘導される麦芽を使用して製造されたビールの特性に焦点を合わせている。図１２Ｂは、２０℃で１２ヶ月間インキュベートしたビールの個々の香味特性に関するビール味覚官能評価集団の評価に従ったデータのグラフ表示を提供する。ビールは、品種Ｂａｒｋｅのオオムギ（黒塗りの棒グラフ）またはヌル−ＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２のオオムギ（白抜きの棒グラフ）のどちらかから誘導された麦芽で製造した。 図１３は、オオムギ組織中の９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの生成についてアッセイするのに使用したＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを表す。ＨＰＯＤＥのレベルは、２３４ｎｍで吸光度を測定することによって分析した。結果は、ミリ吸光度単位（ｍＡＵ）で示した。９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥに対応する溶出プロフィールのピークを矢印で示す。図１３Ａは、９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥ標準のクロマトグラムを表す。 図１３は、オオムギ組織中の９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの生成についてアッセイするのに使用したＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを表す。ＨＰＯＤＥのレベルは、２３４ｎｍで吸光度を測定することによって分析した。結果は、ミリ吸光度単位（ｍＡＵ）で示した。９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥに対応する溶出プロフィールのピークを矢印で示す。図１３Ｂは、品種Ｂａｒｋｅの成熟胚から調製した抽出物中で形成されたＨＰＯＤＥのクロマトグラムである。 図１３は、オオムギ組織中の９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの生成についてアッセイするのに使用したＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを表す。ＨＰＯＤＥのレベルは、２３４ｎｍで吸光度を測定することによって分析した。結果は、ミリ吸光度単位（ｍＡＵ）で示した。９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥに対応する溶出プロフィールのピークを矢印で示す。図１３Ｃは、低ＬＯＸ穀粒の成熟胚から調製した抽出物中で形成されたＨＰＯＤＥのクロマトグラムである。 図１３は、オオムギ組織中の９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの生成についてアッセイするのに使用したＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを表す。ＨＰＯＤＥのレベルは、２３４ｎｍで吸光度を測定することによって分析した。結果は、ミリ吸光度単位（ｍＡＵ）で示した。９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥに対応する溶出プロフィールのピークを矢印で示す。図１３Ｄは、ヌル−ＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２の成熟胚の抽出物中で形成されたＨＰＯＤＥのクロマトグラムである。 図１４は、麦芽中の９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの形成についてアッセイするのに使用したＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを表す。上記ＨＰＯＤＥのレベルは、２３４ｎｍで吸光度を測定することによって分析した。結果は、ミリ吸光度単位（ｍＡＵ）で示した。９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥに対応する溶出プロフィールのピークを矢印で示す。図１４Ａは、９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの標準のクロマトグラムを示す。９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥに対応するクロマトグラムのピークを矢印で示す。 図１４は、麦芽中の９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの形成についてアッセイするのに使用したＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを表す。上記ＨＰＯＤＥのレベルは、２３４ｎｍで吸光度を測定することによって分析した。結果は、ミリ吸光度単位（ｍＡＵ）で示した。９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥに対応する溶出プロフィールのピークを矢印で示す。図１４Ｂは、品種Ｂａｒｋｅ由来の麦芽の抽出物中で形成されたＨＰＯＤＥのクロマトグラムである。 図１４は、麦芽中の９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの形成についてアッセイするのに使用したＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを表す。上記ＨＰＯＤＥのレベルは、２３４ｎｍで吸光度を測定することによって分析した。結果は、ミリ吸光度単位（ｍＡＵ）で示した。９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥに対応する溶出プロフィールのピークを矢印で示す。図１４Ｃは、低ＬＯＸオオムギ由来の麦芽の抽出物中で形成されたＨＰＯＤＥのクロマトグラムである。 図１４は、麦芽中の９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの形成についてアッセイするのに使用したＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを表す。上記ＨＰＯＤＥのレベルは、２３４ｎｍで吸光度を測定することによって分析した。結果は、ミリ吸光度単位（ｍＡＵ）で示した。９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥに対応する溶出プロフィールのピークを矢印で示す。図１４Ｄは、ヌル−ＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２由来の麦芽の抽出物中で形成されたＨＰＯＤＥのクロマトグラムである。 図１５は、開始コドン（ＡＴＧ）と終止コドン（ＴＡＡ）とにおよぶオオムギＬＯＸ−１に対する遺伝子の構成を示す地図である。４，１６５ｂｐ長の配列の概略図は、７個のエキソン（黒塗り長方形）および６個のイントロン（直線）を示す。ＬＯＸ−１に関する遺伝子において同定された変異の位置（すなわち、変異体系統Ｇ（低ＬＯＸ）、変異体Ａ６１８および変異体Ｄ１１２に特異的）を矢印で示す。 図１６は、野生型、変異体Ａ６１８および変異体Ｄ１１２のオオムギ植物のＬＯＸ−１に対する遺伝子に関連した予測される分子の相違を要約する。「結果」、「アミノ酸長」および「質量（ｋＤａ）」と示された欄に列挙した情報は、ＤＮＡ配列から予測される。 図１７は、ＬＯＸ−１をコードするオオムギ遺伝子に関連したＲＴ−ＰＣＲ変異体分析および転写産物確認を行うのに使用した方法を提供する。Ａには、品種Ｖｉｎｔａｇｅおよび低ＬＯＸ−１変異体系統Ｇの発生中の胚の中のＬＯＸ−１をコードする遺伝子に特異的な転写産物のＲＴ−ＰＣＲ検出についての原理を概略的に示す。プライマーはＦＬ８２１配列番号１１およびＦＬ８５２配列番号１２からなる（これらは、８３ｂｐ長のイントロン５に隣接する複数のエキソンにおいてアニーリングする）；ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡテンプレートのいずれかを使用するＰＣＲ産物の相違が示される。Ｂには、ＲＴ−ＰＣＲアガロースゲル分析の結果を示し、これはオオムギ、品種Ｖｉｎｔａｇｅおよび変異体系統Ｇの発生中の胚の中のＬＯＸ−１をコードする遺伝子に関連した特異的転写産物の検出に焦点を当てた。レーン１およびレーン５はマーカー断片を含み、レーン２、３および４は開花後（ＤＡＦ）２０日、４０日および６０日それぞれの後の品種Ｖｉｎｔａｇｅの胚組織から誘導されたＰＣＲ産物を含んでいた。レーン６、７および８は、２０ＤＡＦ、４０ＤＡＦおよび６０ＤＡＦそれぞれの後の変異体系統Ｇの胚組織から誘導されたＰＣＲ産物を含む。Ｃでは、レーン１〜５は、Ｂにおけるレーン１〜５について詳述した実験と同様の実験の結果を示し、これに対しレーン６、７および８は、２０ＤＡＦ、４０ＤＡＦおよび６０ＤＡＦそれぞれの後のＬＯＸ−１に対する遺伝子の変異体Ｄ１１２胚特異的転写産物のＲＴ−ＰＣＲ検出から誘導された産物を含む。Ｄには、ＬＯＸ−１に対する遺伝子に特異的なＲＴ−ＰＣＲ断片の配列決定反応から得られた電気泳動図を示す。配列分析により、ＲＴ−ＰＣＲ標的ＲＮＡがＤＮＡを含有していないことが明らかにされた。黒色の三角は、スプライシング点を示し、転写産物の正確なスプライシングを示す。 図１８は、オオムギ変異体Ｄ１１２のＳＮＰ支援検出の結果を詳述する。分析は、Ａで概略的に説明したように、試料当たり２組のＰＣＲ反応を使用する特異的ＰＣＲ断片パターンの生成に基づいていた（プライマー対１はＦＬ８２０配列番号１３およびプライマーＦＬ８２３配列番号１５からなり、プライマー対２はＦＬ８２０配列番号１３およびＦＬ８２５配列番号１４からなる）。Ｂには、選択した育種材料のＰＣＲパターン分析の結果を示す。植物のゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ分析に供した。レーン２〜３（植物１）、４〜５（植物２）、６〜７、（植物３）、８〜９（植物４）、１０〜１１（植物５）、１２〜１３（植物６）、１４〜１５（植物７）、１６〜１７（植物８）、および１８〜１９（植物９）に示した結果は、プライマーの組み合わせ１（偶数番号を付したレーン）またはプライマーの組み合わせ２（奇数番号を付したレーン）を使用した。得られたバンドパターンとＡに示したバンドパターンとの比較により、植物１、２、４、５、７、および８が同型接合変異体であり、これに対して植物３、６および９の遺伝子型は同型接合の野生型として分類することができることが明らかにされた。マーカーＤＮＡはレーン１および２０で分離された。 図１９は、変異体Ｇまたは変異体Ｄ１１２の物質を含むオオムギ試料の多重ＳＮＰ分析の原理を実証する。分析は、増幅された断片の長さが加えられた物質の遺伝子型に関係し得るように多重ＰＣＲ反応を利用した。３７０ｂｐ断片の増幅は、麦芽試料が変異体系統Ｇから誘導される物質を含有することを示し、これに対して１６６ｂｐ断片の増幅は変異体Ｄ１１２から誘導される物質の存在を示す。パネルＡは、どのように特異的プライマーが対合するかを詳述する概略図であり、それぞれは目的の変異体に特異的な配列を含む１つのプライマーを有する（星印；ＬＯＸ−１についてのゲノムクローン中の変異体系統Ｇヌクレオチド番号２２７９、および変異体Ｄ１１２位置３５７４を示す）。プライマーの組み合わせＦＬ９１８配列番号１６およびＦＬ９２０配列番号１７を、変異体系統Ｇ特異的変異の検出に使用した；これに対してＦＬ８２０配列番号１３およびＦＬ８２３配列番号１５を、変異体Ｄ１１２特異的塩基変化の検出に利用した。Ｂには、どのようにして試料中の変異体特異的物質（レーン２〜７：変異体系統Ｇ；レーン８〜１３：変異体Ｄ１１２）の相対量が特異的ＰＣＲ断片の合成を増強し得るかを示す（レーン２および８：変異体物質の添加なし；レーン３および９：２０％変異体物質添加；レーン４および１０：４０％変異体物質添加；レーン５および１１：６０％変異体物質添加；レーン６および１２：８０％変異体物質添加；レーン７および１３：１００％変異体物質）。レーン１はマーカー断片からなる。 図２０は、ベクタープラスミドｐＥＴ１９ｂ（レーン２〜５）、発現プラスミドｐＥＴＬ１（レーン６〜１０）、および発現プラスミドｐＥＴＬ２（レーン１１〜１５）によって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞由来のアフィニティー精製されたＨｉｓ標識ＬＯＸ−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。未結合タンパク質（レーン２、６、１１）を含有する画分由来のタンパク質；一次洗浄液（レーン３、７，１２）；二次洗浄液（レーン４、８、１３）；一次溶出液（レーン５、９，１４）；および二次溶出液（レーン１０および１５）を分析した。上方の矢印は、組換え体ＬＯＸ−１（野生型ＬＯＸ−１に対応する）の位置を示し、これに対し下方の矢印は、短縮組換え体ＬＯＸ−１（オオムギ変異体Ｄ１１２におけるＬＯＸ−１に対応する）の位置を示す。レーン１は分離された標識タンパク質を含む。 図２１は、オオムギを形質転換するためのプラスミド挿入物を図示する。Ａには、選択可能なマーカーホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするｂａｒ遺伝子（ＢＡＲ）の構成的発現を導くトウモロコシユビキチン−１プロモーターおよびイントロン１（まとめてＵＢＩプロモーターと示す）からなる発現カセットを図示する。転写終結は、ＮＯＳターミネーター配列（Ｎ）によって提供される。Ｂには、ここではセンスまたはアンチセンス向きでのＬＯＸ−１についてのオオムギｃＤＮＡ配列の構成的発現を導く前述のＵＢＩプロモーターからなる発現カセットを図示する。Ｃには、イントロン含有ヘアピン構築物の構成的発現を導くＵＢＩプロモーターからなる発現カセットを図示し、ここで、脂肪酸デサチュラーゼＦＡＤ２イントロン１（Ｉｎｔ）に対するシロイヌナズナ遺伝子のイントロン１の配列は、その両端にＬＯＸ−１の遺伝子の約２００ｂｐ長の断片のセンスアーム（→）およびアンチセンスアーム（←）が配置される。転写終結は、ＮＯＳターミネーター配列（Ｎ）によって提供される。ＬＯＸ−１に関する遺伝子のコサプレッションを示すオオムギ植物の作成については、ＡおよびＢに詳述した挿入物を含む発現プラスミドを等量で含むプラスミド混合物が使用される。ＬＯＸ−１に対する遺伝子の全てのサイレンシングを示すオオムギ植物の作成については、ＡおよびＣにおける挿入物を含む発現プラスミドを等量で含む混合物が使用される。 図２２は、ＬＯＸ−１活性を低下させるインヒビターに関する実験結果を詳述する。Ａには、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでのタンパク質の電気泳動の分離を示し、個々のレーンはＥ．ｃｏｌｉ細胞由来のＨｉｓ標識ＬＯＸ−１の段階的精製の結果を示す（実施例１８参照）。ベクターｐＥＴ１９ｂおよびプラスミドｐＥＴＬ１による形質転換体の粗製抽出物中のタンパク質を、レーン１および２にそれぞれ示し、一方、レーン３〜５は洗浄溶液２、３および４の分離タンパク質を含む。アフィニティーカラムの溶出液１ｍｌからの３μｌの試料のアリコートが、レーン６（溶出液１）、レーン７（溶出液２）、レーン８（溶出液３）、およびレーン９（溶出液４）で分離された。水平の矢印は、組換え体ＬＯＸ−１の位置を示す。溶出液２からのＬＯＸ−１のアリコートを、Ｂに要約するように、インヒビターの研究に使用した。ここでは、残留ＬＯＸ−１活性を、インヒビター（ＮＤＧＡ（黒丸）または没食子酸オクチル（黒三角）のどちらか）の存在下で５μｌのＬＯＸ−１（溶出液２）と共にインキュベーションした後に測定した。 図２３は、添加インヒビターなしで（白抜きの棒グラフ）、または０．５ｍＭのＬＯＸ−１インヒビター 没食子酸オクチルの存在下（黒塗りの棒グラフ）でのマッシングにより調製した麦芽汁試料中のＴ２Ｎのレベルを詳述する要約を提供する。（３７℃）でマッシングした後（ｍａｓｈｉｎｇ−ｉｎ）に採取した試料または煮沸後に採取した試料（煮沸麦芽汁）は、オオムギ品種Ｂａｒｋｅまたはヌル−ＬＯＸ−１オオムギ変異体Ｄ１１２の麦芽を用いたマッシングして混ぜたものの麦芽汁を含む。
（６．発明の詳細な説明）
記載を明確にするためにおよび限定しないために、発明の詳細な説明を以下の小節に分ける：
（ｉ） オオムギ植物；
（ｉｉ） ヌル−ＬＯＸ−１オオムギの調製；
（ｉｉｉ） 組成物；
（ｉｖ） 化学的変異誘発；
（ｖ） オオムギ変異体の選択；
（ｖｉ） 植物育種；
（ｖｉｉ） オオムギの交配；
（ｖｉｉｉ）ＬＯＸ酵素；
（ｉｘ） ＬＯＸ経路生成物；
（ｘ） Ｔ２Ｎポテンシャル；
（ｘｉ） 耐病性；
（ｘｉｉ） マイコトキシン類；
（ｘｉｉｉ） 芳香；
（ｘｉｖ） ＬＯＸをコードする遺伝子の異種発現；
（ｘｖ） ＬＯＸインヒビター。
（６．１ オオムギ植物）
「野生型オオムギ」、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ ｓｓｐ．ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｍは、現在の栽培型のオオムギの祖先と考えられる。この穀物の開発は肥沃な三日月帯で穀類栽培の開始を説明するための手がかりを提供すると長い間認められている。ヒトが長い夏季を通じて穀類を集めることができたという事実は、穀類を栽培化に予め適応させた候補とした。初期の栽培化は、おそらくは遺伝学的に非常に多様性があり、これは、イスラエル、トルコおよびイランの野生型オオムギの研究によって支持された概念であった（Ｎｅｖｏ，１９９２）。野生型オオムギ群はこれらの対立遺伝子含有量において相当に異なることが見出された。２７個の共有遺伝子座での１２７個の対立遺伝子の中から、６５個の対立遺伝子が固有であることが見出された、すなわちこれらは一つの国のみで生じた。
オオムギの野生状態から栽培状態への移行は、多数の遺伝子座での対立遺伝子頻度の急激な変化と一致すると考えられる。希少な対立遺伝子および新しい変異事象が、栽培化植物群（「オオムギ在来種」を意味する）において新しい形質を早く確認した農業者によって積極的に選択された。これらは、遺伝学的に野生型オオムギよりも現在の品種により密接に関連し、さらなる育種努力のための有用な対立遺伝子源に相当する（Ｅｌｌｉｓら、１９９８）。１９世紀後半まで、オオムギ在来種は、近交系とハイブリッド分離物との高度に異質の混合物（初期世代においてランダム交配により誘導された数種の植物が挙げられる）として存在した。在来種の大部分は、先進的農業において純系品種によって置き換えられた。中間レベルまたは高レベルの遺伝子多様性が、残りの在来種を特徴付けている。
最初に、「現在のオオムギ」品種は、在来種から選ばれた品種に相当した。これらの品種は、その後、確立された純系（例えば多様な地理的起源の純系）の間での交配の連続サイクルに由来した。最終的には、これは、多くの、おそらくは全ての先進的農業において遺伝な基盤の著しい狭さをもたらした。在来種と比較すると、現在のオオムギ品種は、多数の改良された性質を有する（Ｎｅｖｏ，１９９２およびｖｏｎ Ｂｏｔｈｍｅｒら、２００３）。これらとしては、例えば以下：
（ｉ） 殻付きおよび裸の穀粒
（ｉｉ） 種子休眠
（ｉｉｉ） 耐病性
（ｉｖ） リシンおよび他のアミノ酸の割合
（ｖ） タンパク質含有量
（ｖｉ） 窒素含有量
（ｖｉｉ） 炭水化物組成
（ｖｉｉｉ）ホルデインパターン
が挙げられるが、これらに限定されない。
従って、本発明の１つの実施形態において、オオムギ植物は、対応する野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性の１％未満を含有するように改変された最新のオオムギ品種である。従って、この実施形態においては、オオムギ植物はオオムギ在来種でないことが好ましい。
本発明は、野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性を５％未満、好ましくは４％未満、より好ましくは３％未満、さらにより好ましくは２％未満、なおより好ましくは１％未満有するオオムギ植物およびその一部に関する。１％未満のＬＯＸ−１活性を有する本発明のオオムギ植物は、本明細書では「ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物」とも呼ばれる。
オオムギ植物は、任意の適当な形態であり得る。例えば、本発明のオオムギ植物は、生存オオムギ植物、乾燥植物、均質化された植物（例えば粉砕オオムギ穀粒）であり得る。この植物は成熟植物、胚、発芽穀粒、麦芽穀粒などであり得る。
オオムギ植物の一部は、植物の任意の適切な部分（例えば穀粒、胚、葉、茎、根、花またはこれらの部分）であり得る。部分は、例えば、穀粒、胚、葉、茎、根または花の切片であり得る。オオムギ植物の部分はまた、ホモジネートもしくは粉砕オオムギ植物または穀粒の部分であり得る。
本発明の１つの実施形態において、オオムギ植物の一部は、このオオムギ植物の細胞、好ましくはインビトロ組織培養で増殖させ得る生存細胞であり得る。
本発明の好ましい１つの実施形態において、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物は、野生型オオムギ植物の活性の５％未満、好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満、好ましくは０．５％未満、さらにより好ましくは０．１％未満を有する。この活性は、任意の適切な方法で測定され得るが、活性は以下の実施例１の方法を使用して測定することが好ましい。本発明の非常に好ましい実施形態において、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物は、本質的にＬＯＸ−１活性を有さず、より好ましくは全くＬＯＸ−１活性を有さない。「本質的にＬＯＸ−１活性を有さない」とは、以下に記載のようなＬＯＸ−１活性のアッセイを使用してＬＯＸ−１活性が検出できないことを意味する。
ヌル−ＬＯＸ−１オオムギのＬＯＸ−１活性がほとんどないことは、例えば、上記オオムギが正常に機能しないＬＯＸ−１タンパク質（例えば変異体ＬＯＸ−１タンパク質）を含むという結果であり得る。しかし、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギは、野生型オオムギ植物に比べて、ＬＯＸ−１タンパク質をごく少量しか有さないかまたはより好ましくはＬＯＸ−１タンパク質を有さない（例えばＬＯＸ−１タンパク質を５％未満、好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満、好ましくは０．５％未満、より好ましくは０．１％未満有する）。より好ましくは、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギは、本質的にＬＯＸ−１タンパク質を有さず、最も好ましくは全くＬＯＸ−１タンパク質を有していない。「本質的にＬＯＸ−１タンパク質がない」とは、検出可能なＬＯＸ−１タンパク質がないことを包含することを意味する。ＬＯＸ−１タンパク質は当業者に知られている任意の適切な手段で検出され得るが、上記タンパク質はＬＯＸ−１タンパク質をＬＯＸ−１に特異的な抗体で検出する技術により検出することが好ましい。上記技術は、例えば、ウエスタンブロッティング法またはＥＬＩＳＡ法であり得る。上記特異的抗体は、モノクロナールまたはポリクロナールであり得るが、上記抗体はＬＯＸ−１タンパク質内の数種の異なるエピトープを認識するポリクロナールであることが好ましい。ＬＯＸ−１タンパク質はまた、例えばＬＯＸ−１活性を測定する方法、ＬＯＸ−１をコードする遺伝子中の変異を検出する方法、またはＬＯＸ−１遺伝子の発現を検出する方法によって間接的に検出され得る。ＬＯＸ−１をコードする遺伝子の変異は、例えばこの遺伝子を配列決定することによって検出し得る。ＬＯＸ−１に対する遺伝子の発現は、例えばノーザンブロッティングまたはＲＴ−ＰＣＲにより検出され得る。本発明の１つの好ましい実施形態では、ＬＯＸ−１タンパク質は、本明細書の実施例４に概説した方法を使用して検出される。
用語ＬＯＸ−１タンパク質とは、配列番号３または配列番号７に示すようなオオムギの全長ＬＯＸ−１タンパク質またはその機能的ホモログを包含することを意味する。ＬＯＸ−１の活性部位は、ＬＯＸ−１のＣ末端部分に位置する。具体的にはアミノ酸残基５２０−８６２またはＬＯＸ−１活性に関係のあるその部分に及ぶ領域である。従って、１つの実施形態では、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギは、好ましくはＬＯＸ−１のアミノ酸５２０−８６２のいくつかまたは全てを欠いているＬＯＸ−１の変異体型をコードする遺伝子を含む。上記変異体ＬＯＸ−１はまた、野生型ＬＯＸ−１に存在する他のアミノ酸残基を欠いていてもよい。
従って、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギは、ＬＯＸ−１の短縮型（これは機能的でない、例えばＮ末端短縮型またはＣ末端短縮型）を含み得る。好ましくは、この短縮型は、ＬＯＸ−１の８００個以下、より好ましくは７５０個以下、さらにより好ましくは７００個以下、なおより好ましくは６９０個以下、さらにより好ましくは６８０個以下、なおより好ましくは６７０個以下の連続するアミノ酸（例えば配列番号３のＬＯＸ−１の６６５個以下、例えば６５０個以下、例えば６００個以下、例えば５５０個以下、例えば５００個以下、例えば４５０個以下、例えば４２５個以下、例えば３９９個以下の連続するアミノ酸）を有する。好ましくは、上記短縮型は、ＬＯＸ−１のＮ末端断片のみを有。従って、好ましくは、上記短縮型は、配列番号３の多くて８００個、より好ましくは多くて７５０個、なおより好ましくは多くて７００個、なおより好ましくは多くて６９０個、なおより好ましくは多くて６８０個、なおより好ましくは多くて６７０個、なおより好ましくは多くて６６５個のＮ末端アミノ酸（例えば配列番号３の６６５個以下、例えば６５０個以下、例えば６００個以下、例えば多くとも５５０個、例えば多くとも５００個、例えば多くとも４５０個、例えば多くとも４２５個、例えば多くとも３９９個のＮ末端アミノ酸）を有する。
１つの非常に好ましい実施形態では、上記短縮型は配列番号３のアミノ酸１−６６５からなり得る。
本発明の好ましい実施形態では、オオムギ植物は、ＬＯＸ−１をコードするｍＲＮＡ中に転写される遺伝子を有し、このｍＲＮＡは野生型ＬＯＸ−１ ｍＲＮＡの終止コドンの上流にナンセンスコドンまたは終止コドンを有する。このようなナンセンスコドンは、本明細書では中途ナンセンスコドンと呼ぶ。好ましくは、上記植物のＬＯＸ−１をコードするｍＲＮＡ中に転写される全ての遺伝子は、中途ナンセンスコドンまたは終止コドンを有する。上記ナンセンスコドンまたは終止コドンは、開始コドンの下流に多くて８００個、より好ましくは多くて７５０個、さらにより好ましくは多くて７００個、なおより好ましくは多くて６９０個、さらにより好ましくは多くて６８０個、なおより好ましくは多くて６７０個、さらによりさらに好ましくは多くて６６５個のコドンで配置される。ＬＯＸ−１をコードする野生型ゲノムＤＮＡ配列を、配列番号１または配列番号５に示す。
１つの好ましい実施形態では、オオムギ植物は、ＬＯＸ−１をコードする遺伝子を有し、この遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体は配列番号２に対応するリボ核酸配列を有する。
本発明の別の好ましい実施形態では、オオムギ植物は、変異体ＬＯＸ−１をコードする遺伝子を有し、この遺伝子は、少なくとも１個、例えば１個、例えば２個、例えば３個のスプライス部位に少なくとも１個、例えば１個、例えば２個、例えば３個、例えば４個、例えば５個の変異を有する。好ましくは、この変異（１個または複数）は、上記少なくとも１個のスプライス部位が非機能的であることをもたらす。従って、このような遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、異常なスプライシングに起因して異常である。従って、本発明のヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物のＬＯＸ−１遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、タンパク質をコードしないかまたはＬＯＸ−１のＮ−末端のみを有するタンパク質をコードすることが好ましい。上記タンパク質は、異常ｍＲＮＡによってコードされる他の配列であって、ＬＯＸ−１の遺伝子から誘導されていない配列を有し得る。これに関して、ＬＯＸ−１のＮ−末端は、アミノ酸１〜アミノ酸Ｎを有し、Ｎは、２〜８００の範囲、より好ましくは２〜７５０の範囲、なおより好ましくは２〜７００の範囲、さらにより好ましくは２〜６５０の範囲、なおより好ましくは２〜６００の範囲、なおより好ましくは２〜５５０の範囲、なおより好ましくは２〜５００の範囲、なおより好ましくは２〜４５０の範囲、さらにより好ましくは２〜４００の範囲、なおより好ましくは２〜３７８の範囲内の整数である。
本発明の１つの実施形態では、オオムギ植物は、変異体ＬＯＸ−１をコードする遺伝子を有し、上記遺伝子は、配列番号３のアミノ酸１〜３７８およびＬＯＸ−１から誘導されていないさらなるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするｍＲＮＡを生じるスプライス部位中に変異を有する。好ましくは、上記変異体ＬＯＸ−１は配列番号８に概要を示した配列からなる。
本発明の非常に好ましい実施形態では、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物の変異体ＬＯＸ−１をコードする遺伝子はナンセンス変異を有し、この変異は配列番号１の３５７４位のＧ→Ａ置換に対応する。より好ましくは、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）寄託の受託番号ＰＴＡ−５４８７を有するＤ１１２と命名される植物である。
本発明の別の非常に好ましい実施形態では、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物のＬＯＸ−１をコードする遺伝子は、非機能的イントロン３供与スプライス部位を有する。従って、上記植物のＬＯＸ−１ ｍＲＮＡは、配列番号８に含まれる、ＬＯＸ−１のアミノ酸１−３７８およびイントロン３由来のさらなるアミノ酸を有するタンパク質をコードする。より好ましくは、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）寄託の受託番号ＰＴＡ−５５８４を有するＡ６１８と命名される植物である。
本発明のオオムギ植物はまた、ヌル−ＬＯＸオオムギ植物の後代であり得る。従って、本発明のオオムギ植物は、ＡＴＣＣ寄託の受託番号ＰＴＡ−５４８７を有するＤ１１２と命名される植物またはＡＴＣＣ寄託の受託番号ＰＴＡ−５５８４を有するＡ６１８と命名される植物の後代であり得る。
本発明のオオムギ植物は、当業者に公知の任意の適当な方法で、好ましくは本明細書の以下に概説する方法の１つ（例えば、６．２節「ヌル−ＬＯＸ−１オオムギの調製」を参照）で調製され得る。
本発明の１つの実施形態では、本発明のヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物は、野生型オオムギに匹敵する植物成長生理機能および種子発生を有することが好ましい。従って、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物は、草高、植物当たりの分げつの個数、開花の開始および／または穂状花序当たりの種子の数について野生型オオムギと同様であることが好ましい。
本発明の局面はまた、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物を提供することであり、この植物は、以下：、
（ｉ） 増強された耐病性を有すること；または
（ｉｉ） マイコトキシンの産生について低下した潜在能力を有すること；または
（ｉｉｉ）組織培養に使用される再生可能な細胞を有すること；または
（ｉｖ） 上記の特性（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせ
を特徴とする。
本発明の１つの実施形態では、オオムギ植物は、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物である（但し、このオオムギ植物はイントロン５のスプライス供与部位にＧの変異を保有しない）。この実施形態では、本発明はまた、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物またはその一部から調製される植物製品（例えば麦芽、麦芽汁、発酵飲料もしくは非発酵飲料、ビール、食品または飼料製品）に関する（但し、このオオムギ植物はイントロン５のスプライス供与部位にＧの変異を保有しない）。上記Ｇは、例えば、配列番号１の位置２９６８のＧに対応する。植物製品が所定の変異を有するオオムギ植物から調製されるか否かは、上記植物製品からＤＮＡを単離し、上記変異の有無を当業者に公知の従来の方法により同定することによって決定し得る。ＤＮＡは、例えば、麦芽汁、ビールまたは別の飲料から凍結乾燥、水性緩衝液への再懸濁、クロロホルム／イソアミルアルコールを用いた抽出、次いでアルコール沈殿によって単離され得る。例えば、イントロン５のスプライス供与部位のＧの変異は、ＨｉｒｏｔａらのＷＯ２００４／０８５６５２に記載の方法と同様の方法で同定され得る。
（６．２ ヌル−ＬＯＸ−１オオムギの調製）
本発明のオオムギ植物は、当業者に公知の任意の適切な方法で調製され得る。好ましくは、本発明のオオムギ植物は、オオムギ植物またはその一部（例えばオオムギ穀粒）に変異を誘発させ、次いでオオムギ植物を５％未満のＬＯＸ−１活性を有する植物についてスクリーニングし、選択する工程を包含する方法によって作製される。興味深いことに、１つの局面の本発明は、例えばＤｏｕｍａらのＷＯ０２／０５３７２１に記載のスクリーニング方法よりも著しく優れた新規かつ極めて効率的なスクリーニング方法に関する。上記の新規スクリーニング方法は、ＬＯＸ−１活性を全くまたはほとんど有さないオオムギ植物を再現可能に同定すること可能にさせる。この新規スクリーニング方法は、変異を誘発させたオオムギから穀粒またはその一部（例えば胚）を得、この穀粒またはその一部のＬＯＸ−１活性を測定する工程を包含する。
従って、本発明の目的は、野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性を５％未満有するオオムギ植物を作製する方法を提供することであって、この方法は、以下：
（ｉ） 野生型オオムギ穀粒またはその一部のＬＯＸ−１活性を測定する工程；および
（ｉｉ） オオムギ植物および／またはオオムギ細胞および／またはオオムギ組織および／またはオオムギ穀粒および／またはオオムギ胚に変異を誘発させ、それによってＭ０世代のオオムギを得る工程；および
（ｉｉｉ）上記変異を誘発させたオオムギ植物、穀粒および／または胚を、少なくとも２世代栽培し、それによってＭｘ（ここで、ｘは≧２の整数である）世代のオオムギ植物を得る工程；および
（ｉｖ） 上記Ｍｘ世代のオオムギ植物から穀粒またはその一部を得る工程；および
（ｖ） 上記穀粒またはその一部においてＬＯＸ−１活性を測定する工程；および
（ｖｉ） 変異を誘発させた穀粒またはその一部のＬＯＸ−１活性が野生型穀粒またはその一部のＬＯＸ−１活性の５％未満である植物を選択する工程、
を包含し、それによって野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性の５％未満を有するオオムギ植物を得る。
上記の工程（ｉｉ）は、オオムギ植物、オオムギ細胞、オオムギ組織、オオムギ穀粒およびオオムギ胚からなる群より選択される生体物質、好ましくはオオムギ植物、オオムギ穀粒およびオオムギ胚からなる群より選択される生体物質、より好ましくはオオムギ穀粒である生体物質に変異を誘発させることを包含し得る。変異を誘発させた穀粒のＬＯＸ−１活性は、野生型オオムギ穀粒のＬＯＸ−１活性の測定に使用される物質と同じ種類の物質を使用して測定することが好ましい、すなわち、工程（ｉ）のオオムギ穀粒またはその一部は、工程（ｉｖ）に述べたものと同じ種類のオオムギ穀粒またはその一部であることが好ましい。例として、野生型オオムギのＬＯＸ−１活性が野生型オオムギの胚で測定される場合には、工程（ｉｖ）は変異を誘発させたオオムギ植物の胚のＬＯＸ−１活性を測定することを包含することが好ましい。
変異誘発は、任意の適切な方法で行い得る。１つの実施形態では、変異誘発は、オオムギ植物またはその一部（例えばオオムギ穀粒またはオオムギ由来の個々の細胞）を変異誘発剤と共にインキュベートすることによって行われる。上記変異誘発剤は当業者には公知であり、例えばアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、アジドグリセロール（ＡＧ、３−アジド−１，２−プロパンジオール）、メチルニトロソ尿素（ＭＮＵ）、およびマレイン酸ヒドラジド（ＭＨ）であるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、変異誘発は、オオムギ植物またはその一部（例えば穀粒）に照射（例えばＵＶを）することによって行われる。本発明の好ましい実施形態では、変異誘発は、以下の６．４節「化学的変異誘発」に概説した方法のいずれかに従って行われる。適切な変異誘発プロトコールの非限定的な例を、実施例１に示す。
変異誘発は、Ｍ３オオムギをスクリーニングする場合には、所望の変異体の期待される頻度が種子１０，０００個当たり少なくとも０．５、例えば０．５〜５の範囲、例えば０．９〜２．３の範囲内にあるような方法で行われることが好ましい。
好ましい実施形態では、変異誘発は、オオムギ穀粒に対して行われる。変異を誘発させた穀粒は、Ｍ０世代と呼ばれる（図１Ａも参照）。
変異誘発の後で、ＬＯＸ−１活性を５％未満、好ましくは１％未満有するオオムギ植物またはその一部が選択される。選択は、当業者に公知の任意の適当な方法に従って行われ得る。好ましくは、選択は、試料をオオムギ植物（例えばオオムギ穀粒）から得、この試料中のＬＯＸ−１の活性を測定し、そして植物を選択する工程を包含し、この試料は野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性を５％未満、好ましくは１％未満有する。
試料は上記植物の任意の適切な部分から採取され得る。しかし、好ましくは、試料は穀粒から採取され、より好ましくは試料は穀粒の胚組織から採取され、なおより好ましくは試料は穀粒の胚組織からなる。一般的に、試料は、ＬＯＸ−１活性を測定する前に任意の適切な方法を使用してホモジナイズしなければならない。
好ましい実施形態では、試料はＭｘ世代の穀粒から採取され、ここで、ｘは≧２の整数であり、好ましくはｘは２〜１０の範囲内の整数であり、より好ましくは３〜８の範囲内の整数である。非常に好ましい実施形態では、ＬＯＸ−１活性は、Ｍ３穀粒または穀粒から誘導される試料について測定される。この実施形態では、変異誘発されたオオムギ穀粒（Ｍ０世代）を育ててオオムギ植物を得、これを交配させてＭ１穀粒を得ることが好ましい。この手順は、Ｍ３穀粒が入手できるまで反復される（図１Ａも参照）。
ＬＯＸ−１活性の測定は、任意の適切なアッセイを使用して、好ましくは以下に概説する方法の１つで実施され得る。特に、上記アッセイは、ＬＯＸ−１によるリノール酸の９−ＨＰＯＤＥへの二原子酸素添加をモニタリングすることが好ましい。従って、一般的に、アッセイは、以下：
（ｉ） オオムギ穀粒またはその一部から調製した試料を提供する工程；および
（ｉｉ） リノール酸を提供する工程；および
（ｉｉｉ）上記試料を上記リノール酸と共にインキュベートする工程；および
（ｉｖ） リノール酸の９−ＨＰＯＤＥへの二原子酸素添加を検出する工程；
を包含する。
検出は、直接的または間接的に行い得る。任意の適切な検出方法を本発明について使用し得る。本発明の１つの実施形態では、リノール酸ヒドロペルオキシドが検出される。リノール酸ヒドロペルオキシドは、例えば、上記リノール酸ヒドロペルオキシドの分解を検出可能な化合物を生じる酸化反応と結びつけることによって検出され得る。例えば、これは実施例１に記載のようにして行われ得る。別の実施形態では、９−ＨＰＯＤＥは、例えば、分光光度法（例えば実施例９に記載されるＨＰＬＣ）で直接的に検出される。本発明の１つの実施形態では、ＬＯＸ−１活性は、オオムギ穀粒由来の試料中の９−ＨＰＯＤＥの量を測定することによって簡単に決定される。これは、例えば、実施例９に概説したような当業者に公知の任意の適切な方法で行われ得る。
どのようなｐＨでＬＯＸ−１活性の測定を行うかが重要である。好ましくは、上記測定は、ＬＯＸ−１の高い活性を可能にするが、ＬＯＸ−２の低い活性のみを可能にするｐＨで行われる。従って、ＬＯＸ活性の測定は、好ましくは３〜６．５の範囲内、例えば３〜４の範囲内、例えば４〜５の範囲内、例えば５〜６の範囲内、例えば６〜６．５の範囲内のｐＨで行うことが好ましい。好ましくは、ｐＨは、約３、例えば約３．５、例えば約４、例えば約４．５、例えば約５、例えば約５．５、例えば約６、例えば約６．５、例えば約７である。また、上記試料は適当なｐＨで、例えば３〜６．５の範囲内、例えば３〜４の範囲内、例えば４〜５の範囲内、例えば５〜６の範囲内、例えば６〜６．５の範囲内のｐＨで調製されることが好ましい。好ましくは、ｐＨは約３、例えば約３．５、例えば約４、例えば約４．５、例えば約５、例えば約５．５、例えば約６、例えば約６．５、例えば約７である。
本発明のオオムギ植物を選択するために好ましい方法は、以下の６．５節「オオムギ変異体の選択」で記載する。
ＬＯＸ−１活性を測定するための方法の好ましい例を、実施例１に示す。
上記選択手順は、マイクロタイタープレートアッセイ手順または他の公知の多数の試料の迅速なスクリーニングを可能にする反復高速処理アッセイフォーマットに適合させ得る。少なくとも５，０００個、例えば少なくとも７，５００個、例えば少なくとも１０，０００個、例えば少なくとも１５，０００個の変異誘発オオムギ植物をＬＯＸ−１活性について分析することが好ましい。
５％未満のＬＯＸ−１活性を有する有用なオオムギ植物の選択の後に、必要に応じて１回以上のさらなるスクリーニングを行ってもよい。例えば、選択された変異体を、さらに繁殖させてもよいし、またその後の世代をＬＯＸ−１活性について再度スクリーニングしてもよい。
有用なオオムギ植物の選択の後に、これらの植物を育種（例えば従来の育種）に供し得る。育種の方法は、以下に記載する（６．６節「植物育種」および６．７節「オオムギの交配」）。
しかし、本発明のオオムギ植物は、他の方法、例えば、ＬＯＸ−１の減少した転写および／または翻訳を生じる方法により調製してもよい。従って、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物は、作動可能に連結された要素として、オオムギ植物の中で発現可能なプロモーター、ＤＮＡ配列、および転写終結領域を有する核酸配列を用いてオオムギ植物を形質転換させることによって調製してもよい。ここで、このＤＮＡ配列の発現は、ＬＯＸ−１をコードする遺伝子の発現を、以下：
（ｉ） アンチセンスサイレンシング；または
（ｉｉ） コサプレッションサイレンシング；または
（ｉｉｉ）ＲＮＡ干渉
によって減少させる。
１つの実施形態では、オオムギ植物は、オオムギ植物を、ＬＯＸ−１をコードする遺伝子の転写または翻訳を減少することができる核酸配列（例えばアンチセンスＬＯＸ−１配列を有する核酸配列）を用いて形質転換させる工程を包含する方法によって調製される。上記アンチセンス配列は、例えば、配列番号１のアンチセンス配列、またはその断片であり得る。上記アンチセンス配列は、オオムギ植物中で発現される遺伝子由来のプロモーター配列に作動可能に連結されるべきである。このような方法の非限定的な例を以下の実施例１６に概説する。
オオムギ植物は、任意の有用な方法（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介移入法または微粒子銃媒介ＤＮＡ取り込み法）によって形質転換され得る。
ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物が、以下：
（ｉ） オオムギ植物および／またはオオムギ穀粒および／またはオオムギ胚に変異を誘発させる工程；および
（ｉｉ） ＬＯＸ−１に関する遺伝子内の変異の有無を測定する工程であって、ここで、上記変異は、配列番号３に示した配列の７００未満の連続するアミノ酸を含むＬＯＸ−１のポリペプチド形態をコードするＬＯＸ−１の遺伝子を生じ、好ましくは上記ポリペプチドは配列番号３の多くとも７００個のＮ末端アミノ酸を含むＬＯＸ−１のＮ末端断片である、工程；
（ｉｉｉ）上記変異を有する植物を選択し、それによって野生型オオムギ植物の５％未満のＬＯＸ−１活性を有するオオムギ植物を得る工程；
を包含する方法により調製されることもまた、本発明の範囲である。
より好ましくは、上記変異は、上記のＮ末端ＬＯＸ−１断片のいずれかをコードするＬＯＸ−１の遺伝子を生じ得る。
上記変異は、任意の適切な方法（例えばＬＯＸ−１遺伝子の配列決定法または一塩基多型（ＳＮＰ）分析）を使用して検出され得る。どのようにＳＮＰ分析を行うかについての一例を、以下の実施例１３および実施例１４に記載する。
一旦、ＬＯＸ−１遺伝子中に特定の変異（例えば、上記変異のいずれか）を有するヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物が作製されると、同じ変異を有するさらなるオオムギ植物は、当業者に周知の従来の育種法で生じさせ得る。例えば、上記ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物は、別のオオムギ品種バックグラウンドに戻し交配され得る。図９に、このような戻し交配のスキームの例を開示する。
（６．３ 組成物）
本発明はまた、上記のオオムギ植物もしくはその一部を含有する組成物、または上記オオムギ植物もしくはその一部から調製される組成物に関する。上記オオムギ植物は５％未満、好ましくは１％未満のＬＯＸ−１活性を有するので、上記オオムギ植物もしくはその一部を含有する組成物、または上記オオムギ植物もしくはその一部から調製された組成物は、一般的に、非常に低いレベルのＴ２ＮおよびＴ２Ｎポテンシャルを含有する。ヌル−ＬＯＸ−１オオムギを含有するかまたはそれから調製される有用な組成物の例を、以下に記載する。
上記組成物は、野生型オオムギ植物を含有するか野生型オオムギ植物から調製される同様の組成物と比べて、
（ｉ） ３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、さらにより好ましくは５％未満、例えば２％未満、例えば１％未満のＴ２Ｎ；および／または
（ｉｉ）３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、さらにより好ましくは５％未満、例えば２％未満、例えば１％未満のＴ２Ｎポテンシャル；
を有することが好ましい。
本発明は、１つの局面において、野生型穀粒と比べて１％未満のＬＯＸ−１活性を有するオオムギ穀粒に関する。上記穀粒はＬＯＸ−１活性を有していないことが好ましい。本発明はまた、上記穀粒を含有する組成物および上記穀粒から調製される組成物に関する。
１つの局面では、本発明は、ヌル−ＬＯＸ−１穀粒から麦芽製造によって調製される麦芽組成物に関する。用語「麦芽製造」は、（例えば、図１１、工程２および３に例示するような）制御された環境条件下で行う浸漬されたオオムギ穀粒の発芽であると理解されるべきである。
麦芽製造は、オオムギ種子の制御された浸漬および発芽、その後の乾燥のプロセスである。この事象の順序は、種子の改変、すなわち主に死滅した胚乳細胞壁を脱重合させ、穀類栄養素を移動させるプロセスを生じる多数の酵素の合成に重要である。その後の乾燥プロセスにおいて、化学的褐変反応により香味および着色が生じる。麦芽の主な用途は飲料製造であるが、麦芽は他の工業プロセス（例えば、製パン産業において酵素源として、または食品産業において着香剤および着色剤として、例えば麦芽としてまたは麦芽粉として、あるいは間接的に麦芽シロップなどとして）において利用することもできる。
１つの局面では、本発明は、上記麦芽組成物の製造方法に関する。この方法は、好ましくは、以下：
（ｉ） ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ穀粒を提供する工程；
（ｉｉ） 上記穀粒を浸漬する工程；
（ｉｉｉ）浸漬した穀粒を所定の条件下で発芽させる工程；
（ｉｖ） 上記の発芽させた穀粒を乾燥する工程；
を包含し、それによって低いＬＯＸ−１活性を有するかまたはＬＯＸ−１活性を全く有していない麦芽組成物を製造する。例えば、麦芽は、Ｈｏｓｅｎｅｙ（１９９４）に記載の方法のいずれかで製造し得る。しかし、任意の他の適切な麦芽製造方法、例えば特殊な麦芽の製造方法（例えば麦芽を焙煎する方法が挙げられるが、これに限定されない）も本発明と共に使用してもよい。１つの非限定的な例を実施例６に記載する。
別の局面では、本発明は、ヌル−ＬＯＸ−１穀粒から調製された麦芽組成物から調製される麦芽汁組成物に関する。上記麦芽は、ヌル−ＬＯＸ−１穀粒のみから調製されていてもよいしまたは他の穀粒を含む混合物から調製されていてもよい。本発明はまた、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギまたはその一部を単独であるいは他の成分と混合して使用して調製された麦芽汁組成物に関する。上記麦芽汁は、一次麦芽汁および／または二次麦芽汁および／またはさらなる麦芽汁であってもよい。一般的に、麦芽汁組成物は、高含有量のアミノ窒素および発酵可能な炭化水素（主としてマルトース）を有する。図１１において、工程４および６は、麦芽からの麦芽汁の一般的な製造方法を説明する。一般的に、麦芽汁は、麦芽を水と共にインキュベートすることによって、すなわちマッシングによって調製される。マッシングの間に、麦芽／水の組成物は、さらなる炭水化物に富む組成物（例えばオオムギ添加物、トウモロコシ添加物またはコメ添加物）を補充されてもよい。麦芽化されていない穀物添加物は、通常は活性酵素を含有しておらず、従って麦芽または外因性酵素に応じて糖の変換に必要な酵素を提供する。
一般的に、麦芽汁製造プロセスの最初の工程は、水を、マッシングの間に穀類の粒に接近させ得ることを目的とした麦芽の粉砕であり、これは基本的には基質の酵素解重合を伴った麦芽製造プロセスの拡張である。マッシングの間に、粉砕された麦芽は、液体部分（例えば水）と共にインキュベートされる。その温度は、一定に保たれる（等温でのマッシング）かまたは徐々に上げられる。いずれの場合にも、麦芽製造およびマッシング工程で製造された可溶性物質は、上記液体画分に抽出され、その後に濾過により麦芽汁と、使用済み種子と呼ばれる残留固体粒子とに分離される。この麦芽汁はまた、一次麦芽汁とも呼ばれる。濾過後に、二次麦芽汁が得られる。さらなる麦芽汁は、上記手順を反復することによって調製してもよい。麦芽汁を調製するのに適当な手順の非限定的な例は、Ｈｏｓｅｎｅｙ（前出）に記載されている。
麦芽汁組成物はまた、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物またはその一部（例えば麦芽化されていないヌル−ＬＯＸ−１植物またはその一部）を、１種以上の適当な酵素、例えば酵素組成物または酵素混合組成物（例えばＵｌｔｒａｆｌｏまたはＣｅｒｅｆｌｏ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ））と共にインキュベートすることによって調製され得る。麦芽汁組成物はまた、麦芽および麦芽化されていないオオムギ植物またはその一部の混合物を使用して、必要に応じて上記調製中に１種以上の適当な酵素を加えて調製され得る。
本発明はまた、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物またはその一部を含有する食品組成物、飼料組成物、および芳香原料組成物に関する。食品組成物は、例えば、麦芽化されたオオムギ穀粒および麦芽化されていないオオムギ穀粒、オオムギ粗びき粉、パン、ポリッジ、オオムギを含有する穀物混合物、健康製品（例えばオオムギ、オオムギシロップを含有する飲料）、およびフレーク化、粉砕化または押出し成形したオオムギ組成物であり得るが、これらに限定されない。飼料組成物はとしては、例えば、オオムギ穀粒および／または粗びき粉を含有する組成物が挙げられる。芳香原料組成物を、以下に記載する。
本発明はまた本発明の組成物の混合物に関する。例えば、本発明は、１つの局面では、（ｉ）オオムギ植物またはその一部を含有し、野生型オオムギ植物のＬＯＸ−１活性を５％未満有する組成物と、（ｉｉ）ヌル−ＬＯＸ−１穀粒から調製される麦芽組成物との混合物によって調製される組成物に関する。
好ましい局面では、本発明は、飲料、より好ましくは麦芽から誘導される飲料、さらにより好ましくはアルコール飲料、例えば安定な感覚刺激品質を有するビールに関し、この飲料はヌル−ＬＯＸ−１オオムギまたはその一部を使用して調製される。従って、発明の１つの好ましい実施形態では、飲料は好ましくはヌル−ＬＯＸ−１オオムギまたはその一部あるいはこれらの抽出物の発酵によって（例えばヌル−ＬＯＸ−１オオムギ単独、または他の成分との組み合わせから製造される麦芽を使用して製造される麦芽汁の発酵によって）調製される。
しかし、本発明の他の実施形態では、上記飲料は非発酵飲料（例えば麦芽汁）である。上記飲料が麦芽化されていないオオムギ植物またはその一部から調製され得ることも、本発明の範囲内に包含される。
しかし、好ましくは、上記飲料は、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ穀粒から調製される麦芽組成物から調製される。より好ましくは、上記飲料はビールである。これは、当業者に公知の任意の種類のビールであり得る。１つの実施形態では、上記ビールは、例えばラガービールである。上記ビールは、好ましくは発芽ヌル−ＬＯＸ−１オオムギを含有する麦芽組成物を使用して醸造される。しかし、麦芽組成物はまた、他の成分、例えば他の発芽穀類または未発芽穀類（例えば野生型オオムギ、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ、コムギおよび／またはライムギ）、あるいは糖類または麦芽化されているかもしくは麦芽化されていない原料から誘導される組成物（例えばシロップ組成物）を含有する未発芽原料を含有し得る。
「感覚刺激品質」とは、嗅覚および味覚に訴える特性を意味する。この特性は、例えば、訓練された味覚感応評価集団によって分析される。好ましくは、上記の訓練された味覚感応評価集団は、アルデヒド異臭、例えばＴ２Ｎの認識について特別に訓練される。一般的に、上記味覚感応評価集団は、３〜３０名の範囲内、例えば５〜１５名の範囲内からなる。上記味覚感応評価集団は、種々の香味、例えば異臭、例えば紙臭（ｐａｐｅｒｙ ｆｌａｖｏｒ）、酸化臭、熟成臭およびパン臭の存在を評価し得る。飲料の「感覚刺激品質」を調べる方法は、以下の実施例６に記載される。好ましい実施形態では、安定な感覚刺激品質は、少なくとも部分的にはＴ２ＮまたはＴ２Ｎポテンシャルの生成が少ないという結果である。
従って、本発明の目的は、オオムギ植物を使用して製造され、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも２週間、さらに好ましくは少なくとも３週間、さらにより好ましくは少なくとも４週間、例えば１〜３ヶ月の範囲、例えば３〜６ヶ月の範囲、例えば６〜１２ヶ月の範囲、例えば１年を越える貯蔵の後に、野生型オオムギから調製される飲料と比べて、Ｔ２Ｎおよび／またはＴ２Ｎポテンシャルを５０％未満、好ましくは４０％未満、さらに好ましくは３５％未満、例えば３０％未満、例えば２０％未満、例えば１０％未満、例えば好ましくは５％未満、例えば２％未満、例えば１％未満含有することが好ましい飲料（例えばビール）を提供することにある。貯蔵は、１５℃〜４０℃の範囲の温度、好ましくは３０℃〜３７℃の範囲の温度、さらに好ましくは３７℃で行われる。本発明の飲料は、１５℃〜４０℃の範囲内の温度、好ましくは３０℃〜３７℃の範囲内の温度、さらに好ましくは３７℃で、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも２週間、さらに好ましくは少なくとも３週間、さらにより好ましくは少なくとも４週間、例えば１〜３ヶ月の範囲、例えば３〜６ヶ月の範囲、例えば６〜１２ヶ月の範囲、例えば１年を越えて貯蔵した後に、遊離Ｔ２Ｎを多くて０．０７ｐｐｂ（パーツ パー ビリオン）、好ましくは多くて０．０６ｐｐｂ、さらに好ましくは多くて０．０５ｐｐｂ、さらにより好ましくは多くて０．０４ｐｐｂ、例えば多くて０．０３ｐｐｂ含有することが好ましい。好ましくは、上記飲料はまた、１〜１０ｐｐｍ（パーツ パー ミリオン）の範囲内の亜硫酸塩、さらに好ましくは２〜８ｐｐｍの範囲内、さらに好ましくは３〜７ｐｐｍの範囲、さらにより好ましくは４〜６ｐｐｍの範囲内の亜硫酸塩を含有する。１つの好ましい実施形態では、本発明の飲料は、３７℃で２週間貯蔵した後に、遊離Ｔ２Ｎを多くて０．０４ｐｐｂ、さらに好ましくは多くて０．０３ｐｐｂ、例えば多くて０．０２５ｐｐｂ含有する。本発明の別の好ましい実施形態では、本発明の飲料は、４〜６ｐｐｍの範囲の亜硫酸塩の存在下に３７℃で４週間貯蔵した後に、遊離Ｔ２Ｎを多くて０．０７ｐｐｂ（パーツ パー ビリオン）、好ましくは多くて０．０６ｐｐｂ、さらに好ましくは多くて０．０５ｐｐｂ、さらにより好ましくは多くて０．０４ｐｐｂ、例えば多くて０．０３ｐｐｂ含有する。
本発明の飲料は、１５〜２５℃の範囲内で、例えば約２０℃で少なくとも１０ヶ月間貯蔵した後に、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ以外の異なるオオムギから調製された類似の飲料と比べて紙臭が少ない。好ましくは、上記の紙臭は、訓練された香味感応評価集団によって評価されるように、９０％未満、さらに好ましくは８０％未満、例えば７０％未満である。
１つの実施形態では、本発明は、低レベルのある種のトリヒドロキシオクタデセン酸を有する飲料（例えばビール）、特に低レベルの９，１２，１３−ＴＨＯＥを有する飲料に関する。トリヒドロキシオクタデセン酸は、苦味を有する（ＢａｕｒおよびＧｒｏｓｃｈ，１９７７ならびにＢａｕｒら，１９７７）ので好ましくない。
従って、９，１２，１３−ＴＨＯＥのレベルはできる限り低い、好ましくは１．３ｐｐｍよりも低い、例えば１ｐｐｍよりも低いことが望ましい。しかし、麦芽から誘導される飲料（例えばビール）中の９，１２，１３−ＴＨＯＥの全濃度はまた、上記の特定の飲料の調製に使用される麦芽の量に依存する。従って、一般的に、強いビールは、より軽いビールよりも多い９，１２，１３−ＴＨＯＥを含有し、そして９，１２，１３−ＴＨＯＥのさらに高い全体レベルは、強いビールでは受容可能である。従って本発明の飲料は、同じ種類の標準的ビールよりも少ないレベルの９，１２，１３−ＴＨＯＥを含有することが好ましい。このような飲料は、上記飲料の調製にヌル−ＬＯＸ−１オオムギを使用することによって得られ得る。従って、本発明の好ましい飲料は、上記飲料の調製に使用される麦芽の量を補正する内部標準に比べて低い割合の９，１２，１３−ＴＨＯＥを含有する。上記標準は、例えば、別のトリヒドロキシオクタデセン酸であり得る。
従って、種々のトリヒドロキシオクタデセン酸（ＴＨＡ）の割合が特定の範囲内で保たれることが、飲料（例えば、ビール）の質にとって重要である。意外にも、低レベルのＴ２ＮであるＬＯＸ−１経路の生成物（図１Ｂを参照のこと）に加えて、本発明のヌル−ＬＯＸ−１オオムギから調製される飲料はまた、極めて少ないレベルの９，１２，１３−ＴＨＯＥ（図１Ｃを参照のこと）を有し、従って、９，１０，１３−ＴＨＡに対して極めて低い比率の９，１２，１３−ＴＨＡを有する。従って、１つの局面では、本発明は、安定な感覚刺激品質を有する飲料（例えば、ビール）に関し、この場合の上記飲料はオオムギ植物またはその一部、好ましくはヌル−ＬＯＸ−１オオムギを使用して製造され、そして上記飲料中の９，１０，１３−ＴＨＡに対する９，１２，１３−ＴＨＡの比率は多くて１．８、好ましくは多くて１．７、さらに好ましくは多くて１．６、さらにより好ましくは多くて１．５、さらにより好ましくは多くて１．４である。従って、上記の比率は０〜１．８の範囲（好ましくは、０〜１．６の範囲、例えば０〜１．４の範囲）内にあることが極めて好ましい。１つの実施形態では、上記比率は約１．３である。飲料中の９，１２，１３−ＴＨＯＥと９，１０，１３−ＴＨＯＥの量は、標準法（例えば、Ｈａｍｂｅｒ，１９９１に記載のように例えばガスクロマトグラフィー−質量分析で測定され得る。
好ましくは、上記ＴＨＡは、リノール酸転化のオキシリピン（ｏｘｙｌｉｐｉｎ）である。興味深いことには、このようなＴＨＡ比率を有する飲料は、本発明のオオムギ植物を使用して調製され得る。好ましくは、上記飲料は、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ以外のオオムギを使用せずに、例えばヌル−ＬＯＸ−１オオムギから調製される麦芽以外の他の麦芽を使用せずに調製される。本発明の１つの好ましい実施形態では、飲料は、
（ｉ）上記の９，１０，１３−ＴＨＡに対する９，１２，１３−ＴＨＡの比率；および
（ｉｉ）上記の貯蔵後の遊離Ｔ２Ｎのレベル
を含む。
１つの実施形態では、本発明は、同様の従来の飲料と比べて改良された泡安定性を有する飲料（例えば、ビール）に関する。このような飲料は、例えばヌル−ＬＯＸ−１オオムギまたはその部分、例えば麦芽から調製される。泡安定性は、例えば、Ｂｒａｕｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ａｎａｌｙｓｅｎｍｅｔｏｄｅｎ，２００２に記載のようにして測定され得る。
本発明はまた、上記飲料の製造方法に関する。この方法は、好ましくは、
（ｉ）発芽ヌル−ＬＯＸ−１穀粒を含有する麦芽組成物を提供する工程；
（ｉｉ）上記麦芽組成物を飲料に加工する工程；
を包含し、それによって安定な感覚刺激品質を有する飲料を得る工程からなる。
１つの好ましい実施形態では、飲料はビールである。この場合に、加工工程は、好ましくは、上記麦芽組成物から麦芽汁を、例えば上記の方法のいずれかによって製造し調製する工程、および上記麦芽汁を発酵させる工程を包含する。
一般論として、アルコール飲料、例えばビールは、麦芽化されたおよび／または麦芽化されていないオオムギ穀類から製造され得る。麦芽は、ホップおよび酵母に加えて、ビールの香味または色に寄与する。さらに、麦芽は、醗酵性の糖および酵素の供給源として機能する。ビール製造の一般的なプロセスの概略図を図１１に示す。一方、麦芽製造および醸造に適した方法の例の詳細な説明は、例えばＨｏｓｅｎｅｙ（前出）による最近の刊行物に見出され得る。オオムギ、麦芽およびビール製品の多数の規則的に更新される分析方法が利用できる〔例えば、以下に限定されないがＡｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ（１９９５）； Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（１９９２）； Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｒｅｗｅｒｙ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ（１９９８）；Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ（１９９７）〕。最も重要な変化は、地元の顧客の嗜好に関する点を除けば、多数の具体的手順が所定のビール醸造に用いられることが認められる。このようなビールの製造方法が本発明について使用され得る。１つの非限定的な例が実施例６に記載される。
上記飲料、例えばビール、麦芽飲料または非発酵麦芽汁用の麦芽組成物は、例えば上記の方法のいずれかの方法で得ることが可能である。麦芽汁は、上記の上記麦芽組成物から調製され得る。
麦芽汁からビールを製造する最初の工程は、好ましくは上記麦芽汁を煮沸する工程を伴う。煮沸中に、その他の成分（例えば、典型的な苦味と芳香性ビール特性とを提供するホップ）が、添加され得る。麦芽汁の煮沸はまた、ポリフェノールと変性タンパク質との間で凝集を生じ、これは主としてその後の麦芽汁冷却の工程の間に沈殿する。冷却された後に、麦芽汁は、酵母を入れた醗酵タンクに移される。好ましくは、上記酵母は、ビール醸造酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓである。麦芽汁は、任意の適当な期間（一般的に、１日〜１００日の範囲内の期間）醗酵される。数日の長さの醗酵中に、糖が、ある種の香味物質の発生と同時にアルコールとＣＯ２とに転化される。
その後に、ビールはさらに処理され得る。一般的に、ビールは冷却される。ビールはまた、濾過されてもよいし、そして／または熟成（ｌａｇｅｒ）（心地よい香りと酵母の少ない香味を発生するプロセス）させてもよい。最後に、ビールは包装（例えば、瓶詰めまたは缶詰め）される前に低温殺菌されてもよいし、または濾過されていてもよい。
ビール製造の分野でなされている進歩にもかかわらず、ビール中のＴ２Ｎ、その前駆物質、およびＴ２Ｎポテンシャルのレベルを減らすことは有益である。従って、少ない異臭により完成ビールに寄与する新規な原料、特にオオムギおよび麦芽に対する要求が未だに存在する。従って、本発明の目的は、このようなオオムギおよび麦芽を提供することにある。
（６．４ 化学的変異誘発）
１つの局面では、本発明は、少なくとも部分的に、オオムギ穀粒の化学的変異誘発（ランダムに変異を誘発させることが知られている方法）の使用に基づいている。オオムギの変異誘発は、いずれの変異誘発化学物質を使用して行ってもよいが、好ましくは穀粒をＮａＮ３で処理し、生存している穀粒を発芽させ、次いで子孫植物を分析することによって行われる。変異を誘発させた穀粒から成長する植物世代（Ｍ０と呼ばれる）は、任意の所定の変異について異型接合キメラを含有する。自家受粉後に収集された後代は、Ｍ１世代と呼ばれ、所定の変異について異型接合体と同型接合体の両方を分離する（図１Ａおよび図９を参照のこと）。
穀粒をＮａＮ３で処理することは、単一の細胞を処理することと等しくはない。なぜならば、処理後の穀粒がある種の非変異体細胞およびＤＮＡ変異を有する種々の細胞を含有するからである。生殖細胞系をもたらさない細胞系の変異が消滅するから、目的は、Ｍ１世代の発生に寄与する再生組織に成長する数個の細胞に対する変異原を標的とすることである。
全体的変異効率を評価するために、アルビノキメラおよびアルビノ植物の数が、世代Ｍ０およびＭ１それぞれにおいて数えられた。変異体の数を生存植物の関数として記録すると、変異効率について評価が得られ、一方、変異体の数を処理した種子の関数として記録して変異効率と穀粒の死滅の両方の組み合わせを評価する。
細胞は、おそらくは損傷を与える変異の効果を抑えるために、遺伝子発現の実質的に全ての段階で品質保証メカニズムを有することが注意されるべきである。真核生物において１つのよく研究された例は、ナンセンス介在ｍＲＮＡ崩壊（ＮＭＤと表される）であり、これは潜在的に有害な早期に切断されたタンパク質の合成を抑制する（ＭａｑｕａｔおよびＣａｒｍｉｃｈａｅｌ、２００１）。ＮＭＤにおいては、終止コドンは下流の不安定要素に対するその位置により未成熟と同定される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、これらは大まかに規定されたｍＲＮＡ配列であり、そして哺乳動物細胞では、これらはプレｍＲＮＡスプライシング中にエキソン−エキソン接合部に置かれるタンパク質複合体である。これらが生成するナンセンスｍＲＮＡおよびタンパク質の分解がどのように調整されるかは、将来の研究の領域である。
未成熟終止（ナンセンス）コドン（ＰＴＣ）を生じる変異は、ある場合には、原因となる変異をスキップする交互にスプライスされた転写産物のレベルを増やし、それによって潜在的にタンパク質機能を確保する（ＭｅｎｄｅｌｌおよびＤｉｅｔｚ、２００１）。翻訳およびＲＮＡスプライシングは種々の細胞内コンパートメントで生じると考えられることから、哺乳動物細胞においてスプライシングエンハンサーの破壊に関係なく機能するナンセンスコドン特異的ｍＲＮＡ上方調節メカニズムを見出すことは逆説的であった（Ｗａｎｇら，２００２）。しかし、このようなメカニズムは、本発明のオオムギ植物でも、その他の植物でも認められなかった。
このような現象が目的の新しい形質を同定するためにスクリーニングされる選択すべき穀粒または穀類の数を高めることから、ＮＭＤ、ＰＣＴなどは植物育種との関連で特に興味深い。
（６．５ オオムギの変異体の選択）
本発明の１つの局面は、ＬＯＸ−２由来の活性を弱めるＬＯＸ−１活性のスクリーニング条件を提供することである。この方法は、スクリーニングすべきオオムギ組織の性質および反応条件が酵素ＬＯＸ−１由来のＬＯＸ活性を高めかつ酵素ＬＯＸ−２由来のＬＯＸ活性を弱めることができるという驚くべき知見に基づいている。Ｄｏｕｍａらの国際公開第ＷＯ０２／０５３７２１Ａ１号として公開されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ０１／００２０７号に詳述されているような低ＬＯＸ変異体のスクリーニングは、ｐＨ７．５での酵素活性の測定についてオオムギ葉頂のタンパク質様抽出物を利用したが、本明細書では再現可能にヌル−ＬＯＸオオムギ変異体を同定することを可能にする都合のよいスクリーニングパラメーターを詳述する。第１に、ＬＯＸ−１活性をスクリーニングする場合には、オオムギ植物の特異組織を使用することが重要である。好ましくは、上記組織は、オオムギ穀粒、さらに好ましくはオオムギ穀粒の胚を含む。一般的に、このスクリーニングは、上記組織の抽出物、すなわちオオムギの穀粒またはオオムギ胚の抽出物について行われる。さらに好ましくは、ＬＯＸ−１活性測定用の抽出物は、乾燥オオムギ穀粒のホモジナイズ胚組織を含むか、または最も好ましくはそれのみからなる。このようにして、ＬＯＸ−２由来の限界活性（ｍａｒｇｉｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）のみが活性測定に寄与する。第２に、ＬＯＸ−１活性のアッセイは、アレンオキシドシンターゼ酵素を不活性化することが好ましいｐＨ、従ってＨＰＯＤＥを良好な収率で生成するｐＨで行われる。
（６．６ 植物育種）
本発明の１つの実施形態では、その目的はヌル−ＬＯＸ−１形質を含有する作物学的に有用なオオムギ植物を提供することにある。作物の発育は、新しい特性の導入で開始するだけである長期にわたるプロセスとしてみなされ得る。植物育種家の見方から、この工程は、ほとんどの場合、現在市販の品種よりも農業形質についてあまり望ましくない全体的プロフィールを有する植物をもたらす。
ヌル−ＬＯＸ−１形質に加えて、市販の麦芽用オオムギ品種を生成する技術で考慮されるべき他の重要な因子、例えば穀粒収量、穀粒サイズおよび麦芽製造性能に関連するその他のパラメーターが存在する。多数の（全部ではないが）このような特性は遺伝子制御下にあることが明らかにされていることから、本明細書に開示されるヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物との交配から得られる最新の同型接合の高収量麦芽製造用品種を提供することが極めて望ましい。このようなオオムギ植物の穀粒は、リノール酸の９−ＨＰＯＤＥへの転化について限界容量を全くもたないかまたは僅かしかもたない新規な優れた原料を提供する。従って、オオムギ栽培者は、ＬＯＸ−１機能喪失型を有する優れた品種をもたらす形質を有するオオムギ植物を選択し、育てなければならない。あるいは、オオムギ栽培者は、更なる変異誘発がヌル−ＬＯＸ−１オオムギから誘導される新規品種を作り出すために本発明の植物を利用し得る。
本発明のオオムギ植物は、任意の適当なスキームに従って育てられ得る。
（６．７ オオムギの交配）
本発明の別の目的は、ヌル−ＬＯＸ−１形質を含有する作物学的に選りすぐりのオオムギ植物を提供することにある。従って、本発明はまた、第一の親オオムギ植物を第二の親オオムギ植物と交配する（この場合に、第一の植物または第二の植物はヌル−ＬＯＸ−１オオムギである）ことによる新規ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物の製造方法に関する。さらに、第一の親オオムギ植物および第二の親オオムギ植物は、両方共にヌル−ＬＯＸ−１オオムギ品種から生じ得る。従って、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ品種を使用する任意のこのような方法：自家受粉、戻し交配、母集団に対する交配などは本発明の一部である。ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ品種を親として使用して作り出される全ての植物、例えばヌル−ＬＯＸ−１オオムギ品種から誘導される品種から育てられる植物は、本発明の範囲内にある。ヌル−ＬＯＸ−１オオムギはまた、外因性ＤＮＡがヌル−ＬＯＸ−１植物または植物組織内に導入され、発現されるような場合において遺伝子形質転換に使用され得る。
戻し交配法は、変異したオオムギ植物のヌル−ＬＯＸ特性を別の品種、例えば品種Ｓｃａｒｌｅｔｔまたは品種Ｊｅｒｓｅｙ（これらは両方共に、同時期に存在する高収量の麦芽用オオムギ品種である）に導入するために本発明と共に使用され得る。標準戻し交配プロトコールにおいては、目的の元の品種（反復親）が、移入されるべき目的の単一遺伝子を有する二次品種（非反復親）に交配される。この交配から得られるヌル−ＬＯＸ−１後代は、次いで反復親に再度交配される。但し、このプロセスはオオムギ植物が得られるまで反復され、非反復親のヌル−ＬＯＸ−１形質に関する移入遺伝子構成に加えて、反復親によって特定される特徴の本質的に全部が転換植物において回復される。次いで、最後の戻し交配世代が、ヌル−ＬＯＸ−１形質について純粋育種後代を得るために自家受粉される（図９を参照のこと）。
適当な反復親を持つことは、首尾よい戻し交配手順に重要であり、その目的はヌル−ＬＯＸ−１形質を元の品種に導入することにある。これを達成するために、上記反復品種の遺伝子構成が、元の品種由来の形質の残りの本質的に全部を保持有しながら、非反復親由来の低ＬＯＸ−１形質に関する遺伝子構成を用いて改変される。戻し交配法は、移入される特性が優性対立遺伝子である場合には簡略化されるが、劣性ヌル−ＬＯＸ−１形質の特性を戻し交配することが可能であった。しかし、この場合には、所望の特性が移入されたか否かを評価するために生化学分析を導入することが必要であった。
植物育種のプロセスを促進する方法は、組織培養および再生技術を適用することによる生成変異体の初期増殖を包含する。従って、本発明の別の局面は、成長および分化するとヌル−ＬＯＸ−１形質を有するオオムギ植物を生成する細胞を提供することにある。例えば、育種は、伝統的な交配、稔性葯（ｆｅｒｔｉｌｅ ａｎｔｈｅｒ）由来の植物を調製することまたは小胞子培養を使用することを含み得る。
（６．８ ＬＯＸ酵素）
本発明の重要な目的は、活性ＬＯＸ−１酵素を合成する能力を欠くオオムギ植物を提供することにある。ＬＯＸは、単一の非ヘム鉄因子を有する大きなモノマータンパク質である。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂでのタンパク質データバンクの調査により、数種のＬＯＸ酵素の構造がＸ線結晶学によって解明されていることが明らかにされた。上記タンパク質は、全体的な折りたたみおよびドメイン組織を共有し、タンパク質それぞれは小さなＮ末端８本鎖β−バレルドメインと、主として長いα−ヘリックスからなる大きなＣ末端ドメインを有する。鉄原子がＣ末端ドメインに配置されており、そこでは鉄原子がヒスチジン残基に、そして独特にはポリペプチドのカルボキシル末端（これはイソロイシンに起こる）に配位する。数個のチャンネルがタンパク質の表面から鉄部位の近くに通じ、これらのチャンネルはおそらくは基質、ポリ不飽和脂肪酸および分子状酸素が活性部位に接近することを与える。キュウリ脂質体ＬＯＸのリポソームおよび脂質体結合がＮ末端β−バレルの存在に依存し（Ｍａｙら，２０００）かつダイズＬＯＸ−１がカルシウムイオンによって高められるプロセスにおいて二層膜に結合する（ＴａｔｕｌｉａｎおよびＳｔｅｃｚｋｏ，１９９８）ことから、ＬＯＸ酵素が脂質二重層膜に結合すること、およびこれはおそらくはＮ末端ドメインの機能であることを推測することができる。ＬＯＸ活性の決定方法、ならびにＬＯＸ触媒作用の直接生成物および下流生成物の単離、特徴付けおよび定量のための方法は、当業者には容易に利用可能である。
（６．９ ＬＯＸ経路生成物）
種々の実施形態において、本発明は、アルケナール（ａｌｋｅｎａｌ）Ｔ２Ｎを形成する能力においてブロックされたオオムギ植物、またはその産物に関する。ＬＯＸ酵素は、シス−１，シス−４ペンタジエン系を有するポリ不飽和脂肪酸の二原子酸素添加を触媒する。植物では、Ｃ１８ポリ不飽和脂肪酸であるリノール酸（１８：３Δ９，１２）およびα−リノレン酸（１８：３Δ９，１２，１５）が主要なＬＯＸ基質である。脂肪酸代謝のリポキシゲナーゼ経路は、対応する９−リノールおよび１３−リノールまたはリノレン酸ヒドロペルオキシドを生成するアシル鎖のＣ−９位またはＣ−１３位での分子状酸素の添加によって開始される。リノール酸を基質として用いると、９−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸または１３−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸（ＨＰＯＤＥ）を形成し得、これに対して９−ヒドロペルオキシオクダデカトリエン酸または１３−ヒドロペルオキシオクダデカトリエン酸（ＨＰＯＴＥ）は基質がα−リノレン酸である場合の生成物である。ＬＯＸ経路のヒドロペルオキシドリアーゼ分岐では、９−ヒドロペルオキシドと１３−ヒドロペルオキシドの両方は、その後に短鎖オキソ酸およびアルデヒドに切断され得る（図１Ｂを参照のこと）。
９−ＨＰＯＤＥが９，１２，１３−ＴＨＯＥにさらに代謝され得ることは注目に値する（図１Ｃを参照のこと）。ＴＨＯＥは苦味を有する（Ｂａｕｒら，１９７７；ＢａｕｒおよびＧｒｏｓｃｈ，１９７７）。従って、不活性化されたＬＯＸ−１を有する植物は、野生型植物で観察された比率と異なる比率でＴＨＯＥを形成する。
本発明は、ＬＯＸ−１触媒作用の下流代謝産物の生成に影響を及ぼすことを包含することが認められる。上記下流代謝産物は、ＬＯＸ−１−触媒反応の直接生成物としてではなく、その後の一連の反応物の反応の結果として生じ、ＬＯＸ−１触媒作用の生成物を含む。これらの反応としては、自然発生の因子誘導または酵素触媒異性化が挙げられる。従って、これらの下流代謝産物の生成は、ヒドロペルオキシドリアーゼ（ＨＰＬ）の発現を調節することによって影響され得る。
リノール酸の自動酸化はＴ２Ｎの形成に関連する前駆体分子を生成し得ると仮定すると、アルケナールのレベルをさらに減らすことが可能であり得る。具体的には、Δ９−デサチュラーゼ（ステアリン酸をオレイン酸に転化させる）またはΔ１２−デサチュラーゼ（オレイン酸をリノール酸に転化させる）をコードする遺伝子のダウンレギュレーションは、関連酵素の下流の脂肪酸のレベルを減少させかつ中間体脂肪酸基質のレベルを増大させることによって、Ｃ１８脂肪酸（ステアリン酸、オレイン酸およびリノール酸）の相対割合を変化させることが予想される。天然改変体または誘発した変異を利用する選択的育種を使用してナタネ作物中の改良された油の範囲を作り出す例としては、高ステアリン酸（ＨＳ）ダイズ（Ｇｒａｅｆら，１９８５）、高オレイン酸（ＨＯ）アブラナ（Ａｕｌｄら，１９９２）、ならびにＯｓｏｒｉｏら（１９９５）およびＳｏｌｄａｔｏｖ（１９７６）によるＨＳおよびＨＯヒマワリそれぞれが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明がＬＯＸ−１作用の直接生成物ではないが、ＬＯＸ経路の酵素の作用によって製造されるかまたは図１Ｂに示されるようなアルデヒドの異性化（例えば、（３Ｚ）−ノネナールの（２Ｅ）−ノネナールへの異性化）によって製造されるアルデヒド製造を包含することは、特に重要である。本発明が、ＬＯＸ経路の酵素によって製造されるアルデヒドに対応するおよび／または上記異性化の結果として製造されるアルデヒドに対応するこのようなアルコールの製造を包含することも認められる。上記アルコールは、典型的にはアルド−ケトレダクターゼスーパーファミリーの酵素メンバーの作用によって（例えば（２Ｅ）−ノネナールの（２Ｅ）−ノネノールへの酵素的転化）製造される（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら，１９９９）によって製造される。
（６．１０ Ｔ２Ｎポテンシャル）
本発明のさらに別の目的は、Ｔ２Ｎの形成、例えばＴ２Ｎ前駆物質およびアルデヒド付加物の形成に関連する分子を減らすかまたは排除することにある。ビールの香味熟成（ｓｔａｌｉｎｇ）に関連したいくつかの化学反応は相変わらずつかみどころがないが、酸化プロセスはビール製品の熟成香味の発生の主原因として認められる（Ｎａｒｚｉｓｓ、１９８６；Ｏｈｔｓｕら，１９８６）。２節（「発明の背景」）で詳しく説明したように、熟成香味に寄与する主な分子がＴ２Ｎであることは周知である。このアルデヒドがビールの製造プロセスにおいて醗酵前の製造段階で生じると、このアルデヒドは、例えばアミノ酸およびタンパク質への結合による付加物の形成に関与し得（ＮｏｅｌおよびＣｏｌｌｉｎ、１９９５）（しかし、おそらくは核酸、グルタチオンなども）、その後に酵母を醗酵させることによる還元または酸化から保護され得る（Ｌｅｒｍｕｓｉｅａｕら，１９９９）。しかし、Ｔ２Ｎ付加物もまた、醗酵中に亜硫酸塩と共に形成され得、アルデヒド臭を不活性化することができる（Ｎｙｂｏｒｇら，前出）。
Ｔ２Ｎ付加物の大部分が完成ビールに移り、その中で遊離のＴ２Ｎが放出され（Ｌｉｅｇｅｏｉｓら，２００２）、酸性および温度の条件がこのプロセスで重要な因子である。Ｔ２Ｎ付加物は、Ｔ２Ｎポテンシャル、すなわち規定された反応条件下（例えば、１００℃、ｐＨ４．０で２時間のインキュベーション下）でＴ２Ｎ付加物の遊離Ｔ２Ｎへの分解についての尺度の一部を含有する。当業者は、例えば、Ｄｒｏｓｔら（前出）によって記載されているように、どのようにビールが貯蔵中にＴ２Ｎを放出するかについての指標としてＴ２Ｎポテンシャルがどのように関連するかを知っている。
本発明のオオムギ穀粒は、９−ＨＰＯＤＥ（Ｔ２Ｎを生成するＬＯＸ経路分岐において前駆物質として正常に機能する分子）のＬＯＸ−１触媒による形成において制約される。従って、ヌル−ＬＯＸオオムギ穀粒を使用して製造されるビールは、極めて少ないレベルのＴ２Ｎを有するばかりではなく、極めて低いレベルのＴ２Ｎポテンシャルも有する。本発明の範囲には、Ｔ２Ｎを全く欠いているか、またはほんの僅かなレベルのＴ２Ｎポテンシャル（Ｔ２Ｎ付加物を含む）を含有するビールを生成するヌル−ＬＯＸ−１オオムギ穀粒がある。その結果、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギを使用して製造されたビールの貯蔵中には、Ｔ２Ｎに特異的な異臭の発生は本質的にないか、またはごく僅かしかない。
（６．１１ 耐病性）
本発明はさらにまた、耐病性オオムギに関する。植物ＬＯＸは、まとめて、過敏性反応（ＨＲ）として知られている活性な耐病性メカニズムの発達、プログラムされた細胞死の形態の進行に関与すると考えられる（Ｒｕｓｔｅｒｕｃｃｉら，１９９９）。ＨＲでは、感染事象の後に感染部位の周囲に局在する植物細胞の急速な細胞死が続き、これが壊死病斑の形成を招く。このようにして、病原体の蔓延が制限され、植物器官の残りに対するさらなる被害を防止する。いくつかの植物−病原体系では、ＨＲは９−ＨＰＯＤＥおよび９−ＨＰＯＴＥの生成について特異性を有するＬＯＸの発現に関係する（Ｒｕｓｔｅｒｕｃｃｉら，前述；Ｊａｌｌｏｕｌら，２００２）。なぜならば、おそらくはヒドロペルオキシ脂肪酸の大量生成が組織の壊死を与えるからである。
ＬＯＸ−１をコードする遺伝子は主としてオオムギ穀粒で発現され、これに対して多数の別のＬＯＸ酵素は植物の葉で発現される。従って、９−ＨＰＯＤＥ、１３−ＨＰＯＤＥ、９−ＨＰＯＴＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの形成をもたらすＬＯＸ経路分岐は、オオムギの葉で機能し、オキシリピンの種々の組が別々の感染および損傷事象を反映する。同様の分子シナリオがジャガイモの葉について記載されている（Ｗｅｂｅｒら，１９９９）。
天然に存在する揮発性アルデヒドは、植物のある種の病原体の成長を阻害し、また特定の病原体に対するある種の植物の自然抵抗性は揮発性アルデヒドの生成に起因すると考えられ得る（Ｃｒｏｆｔら，１９９３；ＢｌｅｅおよびＪｏｙａｒｄ，１９９６；Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔら，２００１）。従って、野生型植物に比べて、本発明のヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物の変性されたオキシリピンプロフィールは、病原体の存在、病原体の産物、または植物−病原体相互作用の産物を抑制、低減、改善または排除し得る。病原体の１つの非限定的な例は、アスペルギルス属である（以下を参照のこと）。
従って、１つの実施形態においては、本発明は、高められた耐病性を示すヌル−ＬＯＸ−１オオムギ植物に関する。
（６．１２ マイコトキシン）
本発明はまた、アスペルギルス属の定着に対して低下した感受性を有するオオムギの植物の使用を開示する。アスペルギルス属は、発癌性マイコトキシンであるアフラトキシンおよびステリグマトシスチンによる混入を生じる場合があるオオムギの穀粒の厄介なコロナイザー（ｃｏｌｏｎｉｚｅｒ）である。真菌によるアフラトキシン産生は高レベルの９−ＨＰＯＤＥ、９−ＨＰＯＴＥ、１３−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＴＥによって影響を受けることから、Ｋｅｌｌｅｒの米国特許第５，９４２，６６１号は、真菌性マイコトキシンの産生を阻害するのに十分な量の上記ヒドロペルオキシ脂肪酸を産生するトランスジェニック作物植物を特許請求している。さらに、上記米国特許およびＢｕｒｏｗらによるデータ（２０００年）は、１３−ＨＰＯＤＥがアフラトキシンの産生を阻害し、これに対して９−ＨＰＯＤＥはアフラトキシンの産生を促進することを明記している。
ヌル−ＬＯＸ−１穀粒は活性ＬＯＸ−１酵素がないことから、上記穀粒は野生型植物よりも幾分多いレベルの１３−ＨＰＯＤＥを含有するが、その遺伝的に改変されていない親植物の組織に比べてそれよりも少ないレベルの９−ＨＰＯＤＥを含有する。従って、野生型穀粒と比べて、ヌル−ＬＯＸ−１穀粒はアスペルギルス属が定着することを防ぐことができるか、またはアスペルギルス属による混入の後に低下したマイコトキシンレベルを示し得る。
従って、本発明は、野生型オオムギ植物と比べて低下したレベルのマイコトキシンを有するオオムギ植物に関する。
（６．１３ 芳香）
本発明の局面はまた、芳香剤およびグリーンノート（ｇｒｅｅｎ ｎｏｔｅ）化合物を製造するためのヌル−ＬＯＸ−１オオムギの使用に関する。現在まで、オオムギにおけるＬＯＸ経路の種々の分岐に関連する大部分の研究努力は、１３−ＨＰＯＴＥからジャスモン酸生成の局面（Ｔｕｒｎｅｒら，２００２）、および上記の耐病性に集中している。別の商業目的のオオムギヒドロペルオキシ脂肪酸にはあまり注意が払われていない。しかし、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ穀粒における活性ＬＯＸ−１の完全な欠損が上記穀粒において１３−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＴＥを富ませることが予期されることは注目に値する。この新規な性質に基づいて、新規用途が、オオムギ作物の工業使用に関して、例えば短鎖脂肪族アルデヒドおよびアルコール（例えば、グリーンノート化合物 ヘキサナール／ヘキセナールおよびヘキサノール／ヘキセノール）の製造にあるように思われる。
グリーンノートの製造に関連するいくつかの局面は、論じられている特許明細書、例えば米国特許第６，００８，０３４号、同第６，１５０，１４５号および同第６，２７４，３５８号（これらに限定されない）に開示されている。Ｈａｅｕｓｌｅｒらの米国特許第６，００８，０３４号には、グリーンノート化合物の製造用の特異的ヒドロペルオキシドリアーゼの使用が開示され、Ｈａｅｕｓｌｅｒらの米国特許第６，１５０，１４５号およびＨｏｌｔｚらの米国特許第６，２７４，３５８号には、このようなプロセスのための標準植物物質の使用が記載されている。グリーンノート化合物の製造にヌル−ＬＯＸ−１穀粒を使用することは、上記製造用の新規原料の使用を含む。本発明のヌル−ＬＯＸ−１オオムギ穀粒由来の新規な原料は、本明細書の６．４〜６．７節に詳述したような変異誘発プロトコールの後に選択されている穀粒から誘導されることから、標準的な植物物質とみなすことはできない。ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ穀粒の工業使用は、上記のパラグラフに記載の特許明細書に列挙されている特許請求の範囲の範囲外であると考えられる。なぜならば、主として本発明のヌル−ＬＯＸ−１穀粒から製造された新規な原料は、９−ＨＰＯＤＥおよび９−ＨＰＯＴＥ（すなわち、グリーンノートであるシス−３−ヘキセナールおよびシス−３−ヘキセノールの酵素的生成のための前駆体分子として機能することができない２種類のヒドロペルオキシ脂肪酸）のＬＯＸ−１によって触媒される生成によって課される正常限界（ｎｏｒｍａｌ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ）を大きく改善するという理由からである。
（６．１４ ＬＯＸをコードする遺伝子の異種発現）
種々の実施形態において、本発明は、ヌル−ＬＯＸ−１形質を有するトランスジェニックオオムギ植物に関する。植物の遺伝子工学の将来の進歩が、ＬＯＸ−１の合成が抑制されたオオムギの植物の生成をもたらすと想像される。この概念は、異臭の生成を制御するための手段として提案されているが、このようなアプローチの結果は報告されていない（ＭｃＥｌｒｏｙおよびＪａｃｏｂｓｅｎ，１９９５）。本明細書に記載の発明は、このような今後の改良と共に使用して、組立てられることができるＬＯＸ−１配列に対するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の少なくとも一部に相補的なアンチセンス構築物を有するアンチセンスＬＯＸ−１植物を生成させ得る。アンチセンスヌクレオチドは、例えば、トランスジェニックオオムギにおいてアンチセンスＳｎＲＫ１プロテインキナーゼ配列の発現について記載されているアンチセンスヌクレオチド（Ｚｈａｎｇら，２００１）と同様に、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズさせるために組立てられる。アンチセンス配列の改変は、該配列が対応するｍＲＮＡの発現にハイブリダイズしかつ対応するｍＲＮＡの発現を干渉する限りは、行い得る。このようにして、対応するアンチセンス配列に対して７０％、好ましくは８０％、さらに好ましくは８５％の配列同一性を有するアンチセンス構築物を使用し得る。また、アンチセンスヌクレオチドの一部分は、標的遺伝子の発現を破壊させるのに使用し得る。一般に、少なくとも５０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチドまたはそれ以上を有する配列を使用し得る。従って、本発明の適用は、従来の変異誘発法によって産生される植物だけに限定されない。
相同的組換えによる標的遺伝子置換は酵母では極めて容易であるが、大部分の多細胞真核生物でのその効率は未だ限定されており、かつこのようなオオムギ植物の生成、および一組のゲノム幅の遺伝子崩壊の発生を未だ考慮に入れていない（ＰａｒｉｎｏｖおよびＳｕｎｄａｒｅｓａｎ、２０００）。遺伝子サイレンシングが、近年、いくつかの発生プロセスにおけるＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓゲノムの予測遺伝子の約８６％の役割を研究するのに使用されている（Ａｓｈｒａｆｉら，２００３；Ｋａｍａｔｈら，２００３）。完全機能喪失型の特異的遺伝子（例えば、ＬＯＸ−１をコードする遺伝子）を用いたオオムギの植物の生成については、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法の使用は、いくつかの欠点を有する。これらの欠点としては、表現型の安定な遺伝率を欠くこと、可変レベルの残存遺伝子活性（Ｈａｎｎｏｎ，２００２；Ｂａｒｇｍａｎ，２００１；Ｗｅｓｌｅｙら，２００１）、およびいくつかの非関連遺伝子を同時に沈黙させることができないこと（Ｋａｍａｔｈら，２０００）が挙げられる。
本発明のヌクレオチド配列はまた、植物においてＬＯＸ酵素をコードする内因性遺伝子の発現を抑制するためにセンス配向で使用し得る。ヌクレオチド配列をセンス配向で使用して植物において遺伝子発現を抑制するための方法は、当該技術では公知である（例えば、ＪｏｒｇｅｎｓｅｎおよびＮａｐｏｌｉに対する米国特許第５，２８３，１８４号を参照のこと）。この方法は、一般に、内因性遺伝子の転写産物に対応するヌクレオチド配列の少なくとも一部分に作動可能に連結された植物において発現を駆動するプロモーターを含有するＤＮＡ構築物を用いて植物を形質転換する工程を包含する。典型的には、このようなヌクレオチド配列は、内因性遺伝子の転写産物の配列と実質的な配列同一性、好ましくは約６５％を越える配列同一性、さらに好ましくは約８５％を越える配列同一性、最も好ましくは約９５％を越える配列同一性を有する。
ＬＯＸ酵素をコードする遺伝子の異種発現に関連する種々の局面がＣａｈｏｏｎらの米国特許出願公開第２００３／００７４６９３Ａ１号に記載および開示されていることは、注目に値する。上記特許出願明細書は、オオムギＬＯＸ酵素に関して従来技術を挙げ、多数のＬＯＸをコードする遺伝子配列を開示しているが、ＬＯＸ−１、ＬＯＸ−２およびＬＯＸ−３をコードするオオムギ遺伝子のいずれも、Ｃａｈｏｏｎらの米国特許出願公開第２００３／００７４６９３Ａ１号に挙げられた特許請求の範囲に含まれるのに十分な程度の同一性を示していない。
本発明は上記の記載に詳述されているが、本発明は例示でありかつその性質において限定されないと考えられ、本発明の精神の範囲に入る全ての変化および改変が保護されることが望ましいことが理解される。従って、ある種の変化および改変、例えば単一遺伝子の修飾および変異、体細胞繁殖系変異体、この品種の植物の大集団から選択される個々の改変体などは、添付の特許請求の範囲の範囲によってのみ限定されるような本発明の範囲内で実施され得ることは明らかである。本発明は、以下の具体的な実施例を参照してさらに説明される；これらの実施例は、本発明をさらに例証するために提供されるが、本発明の範囲を限定するとは解釈されない。
（６．１５ ＬＯＸインヒビター）
本発明はまた、オオムギＬＯＸ−１の活性を低下または抑制する方法に関する。いくつかのＬＯＸインヒビターは、酸化還元インヒビターおよび非酸化還元インヒビター、酸化防止剤、鉄キレート剤、イミダゾール含有化合物、ベンゾピラン誘導体などの分類から選択され得る。
従って、本発明は、１つの実施形態において、オオムギＬＯＸ（好ましくは、ＬＯＸ−１）の活性を低下させる方法に関し、この方法は、
（ｉ） オオムギ植物またはその一部あるいはオオムギから調製される植物製品を提供する工程、
（ｉｉ） ＬＯＸインヒビターを提供する工程、
（ｉｉｉ）上記オオムギ植物またはその一部あるいはオオムギから調製される植物製品を上記ＬＯＸインヒビターと共にインキュベートし、それによってオオムギＬＯＸ（好ましくは、ＬＯＸ−１）の活性を低下させる工程
を包含する。
１つの実施形態では、上記植物製品は麦芽であり、そして上記ＬＯＸインヒビターはマッシングプロセス中に上記麦芽に加えられる。これは、好ましくは、上記マッシングプロセスで生成した麦芽汁中により少ないレベルのＴ２Ｎをもたらす。
上記オオムギ植物またはその一部、あるいはオオムギから調製される植物製品は、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギまたはその部分、あるいはヌル−ＬＯＸ−１オオムギから調製される植物製品であり得る。しかし、他のオオムギは、好ましくは上記方法で使用され得る。
種々のＬＯＸインヒビターの中で、酸化還元ＬＯＸインヒビターは、カテコールブタン誘導体、例えばＪｏｒｄａｎらの米国特許第５，００８，２９４号、Ａｌｌｅｎの米国特許第４，７０８，９６４号およびＪｏｒｄａｎの米国特許第４，８８０，６３７号に記載のカテコールブタン誘導体のいずれか、例えばノルジヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）またはその鏡像異性体の１つから選択され得る。
酸化防止剤ＬＯＸインヒビターは、フェノール、フラボノイドなどの中から都合よく選択される。酸化防止剤ＬＯＸインヒビターはまた、没食子酸塩（没食子酸オクチルが挙げられる）から選択され得る。化合物は、実際ＬＯＸインヒビターであることが、以下の実施例１８に記載のアッセイによって確認され得る。
工業用には、没食子酸オクチルは、ダイズリポキシゲナーゼの公知のインヒビターであり（Ｈａら，２００４）、現在、食品において酸化防止添加剤として使用が認められているように、特に重要である（Ａｒｕｏｍａら，１９９３）。この性質は、推定されるインヒビターの没食子酸オクチルの存在下での活性について精製オオムギＬＯＸ−１を試験することを興味深いものにする。興味深いことには、マッシングの間に没食子酸オクチルが存在することは、より少ないレベルのＴ２Ｎをもたらす。
従って、本発明の実施形態は、マッシュに加えた後に低減されたレベルのＴ２Ｎを与えるＬＯＸ−１のインヒビターおよびその使用を提供することである。
（７ 実施例）
本明細書の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例証し、かつ本発明に関する限定と考えられるべきではない。
特に示さない限りは、基本的な分子生物学技術をＳａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）に記載のようにして核酸および細菌を操作するために行った。
記載を明確にするためにおよび限定を目的とせずに、この実施例の節を、以下の見出しに分けた：
（ｉ） スクリーニングおよび変異体の選択
（ｉｉ） オオムギ変異体Ｄ１１２およびＡ６１８
（ｉｉｉ） オオムギの変異体Ｄ１１２およびＡ６１８の生理学的性質
（ｉｖ） 変異体Ｄ１１２およびＡ６１８はヌル−ＬＯＸ−１植物である
（ｖ） マッシング
（ｖｉ） 麦芽製造ならびに野生型オオムギおよび変異体オオムギの麦芽を使用するビール製造
（ｖｉｉ） ヌル−ＬＯＸ−１麦芽のビール中のトリヒドロキシオクタデセン酸
（ｖｉｉｉ） ビール中のトリヒドロキシオクタデセン酸
（ｉｘ） オオムギにおけるＬＯＸ作用による酵素生成物の生化学的特徴
（ｘ） オオムギ変異体Ｄ１１２のＬＯＸ−１の遺伝子を変異させる
（ｘｉ） オオムギ変異体Ａ６１８のＬＯＸ−１の遺伝子を変異させる
（ｘｉｉ） ＬＯＸ−１についての転写産物のＲＴ−ＰＣＲ検出
（ｘｉｉｉ） Ｄ１１２変異を有するオオムギ変異体の遺伝子検出
（ｘｉｖ） 試料混合物中の変異体の検出
（ｘｖ） 変異体Ｄ１１２の組換えＬＯＸ−１は不活性である
（ｘｖｉ） トランスジェニックオオムギ植物
（ｘｖｉｉ） グリーンノート化合物
（ｘｖｉｉｉ）ＬＯＸ−１インヒビター
（ｘｉｘ） 没食子酸オクチルを用いてマッシングする。
（実施例１）
（スクリーニングおよび変異体選択）
オオムギ変異誘発：品種Ｂａｒｋｅ、Ｃｅｌｅｓｔｅ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、ＳａｌｏｏｎおよびＮｅｒｕｄａのオオムギ植物から採取した穀粒を、Ｋｌｅｉｎｈｏｆｓら（１９７８年）によって提供された詳細に従って変異原ＮａＮ３と共に別々にインキュベートした。この手順は、オオムギゲノムＤＮＡにおいて点変異を誘発させかつ変異を誘発したＤＮＡによってコードされるこれらのタンパク質においてアミノ酸の置換または切断を与えることが知られていることから選択された。
本明細書の変異誘発実験では、上記方法は、Ｍ１世代の変異穀類を野外区画中で２つのその後の世代を経て繁殖させ、最終的にスクリーニングを目的とした高い割合の同型接合植物を得るために選択された（図１Ａ）。得られたＭ３世代の変異体穀類は、穀類１０，０００個当たり０．９〜２．３の頻度で生じることが予想された（Ｋｌｅｉｎｈｏｆｓら，前出）。Ｍ２穀類が、主としてこれらが比較的高い割合の異型接合点変異を含むという理由で選択されなかったことは、注目に値する。
スクリーニング：ＬＯＸ−１活性を欠くＭ３変異体オオムギ穀類を検出するための迅速高性能スクリーニング手順を開発し、いくつかのＬＯＸ活性を含むことが知られている葉頂を使用する厄介なスクリーニング手順（Ｄｏｕｍａらの国際公開第ＷＯ０２／０５３７２１Ａ１号として公開されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ０１／００２０７号に開示されている）を回避することが、目的であった。中心は、成熟オオムギ穀粒の胚（例えば、胚盤組織など胚）におけるＬＯＸ活性の測定に関するものであった。一般的に、アッセイ条件は、ＡｎｔｈｏｎおよびＢａｒｒｅｔｔ（２００１年）によって記載された条件と同様であった。アッセイは、リノール酸ヒドロペルオキシド（これは、ヘモグロビン触媒反応において３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンを３−（ジメチルアミノ）安息香酸と酸化的に結合し、分光光度法で測定することができる青色の形成をもたらす）のＬＯＸ触媒生成に基づいていた。
実際面で、１つのアッセイシリーズを、９６個のオオムギ胚組織（例えば、胚盤）の微細粉末組成物への別個のホモジナイゼーションによって開始した。これら微細粉末組成物を氷冷保存プレート（ＡＢｇｅｎｅ）に移した。その１．２ｍｌの９６ウェルのそれぞれには円形５ｍｍガラスビーズと２００μｌのＨ２Ｏを入れておいた。次いで、プレートを、２７ｓｅｃ−１の振動数で振盪するために電気的に調節したＭＭ３００ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｉｌｌ（Ｒｅｔｓｃｈ）中で３５秒間インキュベートした。その後に、プレートをＡｌｌｅｇｒａ ６Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）で、４，０００ｒｐｍで４℃で１５分間遠心分離して不溶物を沈降させ、その後にさらに処理するまで氷上で最大１２０分間保持した。
上記９６ウェルプレートをＢｉｏｍｅｋ２０００ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｍａａｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）に移した。これは、ＡｎｔｈｏｎおよびＢａｒｒｅｔｔ（前出）によって記載されているようなＬＯＸアッセイに従って分注するためにプログラムされたものである。最終的に、９６×２６μｌ胚抽出物を標準９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）に移し、次いで９０μｌの試薬Ａ［１２．５ｍＭ ３−（ジメチルアミノ）安息香酸、０．６２５ｍＭリノール酸（実施例９に詳述したようにして調製した）］と、９０μｌの試薬Ｂ（０．２５ｍＭ ３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン、０．１２５ｍｇ／ｍｌヘモグロビン）を加えた；試薬Ａは、１３４ｍｇの遊離酸に相当する１５５μｌのリノール酸（Ｓｉｇｍａ、Ｌ−１３７６）と２５７μｌのＴｗｅｅｎ−２０とを最初に混合し、次いでＨ２Ｏを加えて５ｍｌの容量を得、次いで６００μｌの１Ｍ ＮａＯＨを加えることによって調製し、得られた溶液が透明になる場合にはさらにＨ２Ｏで２０ｍｌに調整した。プレートの９６ウェルのそれぞれにおいてＡ５９５を、Ｆｌｏｕｒｏｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。この場合、ヒドロペルオキシド生成物の色の生成が、存在する全ＬＯＸ活性の尺度である［従って、活性はＡ５９５単位（Ａ５９５Ｕ）で示される］。
可能な変異体の同定：オオムギの品種Ｂａｒｋｅ（合計２，１６０株に由来）、品種Ｃｅｌｅｓｔｅ（２，８６７株）、品種Ｌｕｘ（２，６２５株）、品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅ（１，３７９株）、品種Ｓａｌｏｏｎ（１，７４３株）、および品種Ｎｅｒｕｄａ（３，７８０株）の穀類を、ＬＯＸ活性について、野生型穀類と比べた場合に上記活性が大きく低下した穀類を同定することを目的としてスクリーニングした。全体で９０個の可能な未精製（ｒａｗ）変異体をＭ３世代において同定した［品種Ｂａｒｋｅ（１２株）、品種Ｃｅｌｅｓｔｅ（３８株）、品種Ｌｕｘ（９株）、品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅ（１６株）、品種Ｓａｌｏｏｎ（１２株）、および品種Ｎｅｒｕｄａ（３株）］。これらの変異体のそれぞれからの穀類を、Ｍ４世代まで繁殖させ、収穫し、次いできわめて低いＬＯＸ活性に関連した形質について再度スクリーニングした。最終的に、品種Ｂａｒｋｅのわずか１つの株（変異体Ｄ１１２と表す）および品種Ｎｅｒｕｄａの１つの株（変異体Ａ６１８と表す）が、上記の極めて低い全ＬＯＸ活性を示すことを示した。
ＬＯＸ活性の詳細な測定は、ＬＯＸ活性がＬＯＸ−１によってほぼ例外なく付与されている成熟した休止穀類の抽出物を用いて行った（Ｓｃｈｍｉｔｔおよびｖａｎ Ｍｅｃｈｅｌｅｎ，１９９７）。変異体Ｄ１１２の乾燥成熟Ｍ３穀類の胚について、全ＬＯＸ活性は、上記のように比色定量ＬＯＸアッセイによって測定した（図２；表１参照）ように、０．４０７±５．８％Ａ５９５Ｕ／胚であり、これに対して品種Ｂａｒｋｅの全ＬＯＸ活性は１．２４５±７．６％Ａ５９５Ｕ／胚であった。第２の組の実験では、変異体Ａ６１８のＭ３世代の成熟乾燥穀類の胚抽出物のＬＯＸ活性は、０．２２１±２．６％Ａ５９５Ｕ／胚であると認められ、これに対して野生型品種Ｎｅｒｕｄａの抽出物では０．７２１±３．６％Ａ５９５Ｕ／胚が認められた（図３；表１）。
（実施例２）
（オオムギ変異体Ｄ１１２およびＡ６１８）
Ｍ４世代およびＭ５世代のヌル−ＬＯＸ−１植物が対応する変異体表現型について同型接合性であるか否かを確認するために分析を行った。この種の分析は、Ｍ３世代の目的の変異の劣性性質または優性性質の決定に有用である。すなわち、Ｍ３世代の植物が優性変異について異種接合性であった場合には、その後の世代はその表現型について分離する。
全ＬＯＸ活性をオオムギ変異体Ｄ１１２およびＡ６１８のＭ３、Ｍ４およびＭ５世代の胚で測定し、得られた活性を品種Ｂａｒｋｅおよび品種Ｎｅｒｕｄａそれぞれから得られた胚の活性と比較した。ＬＯＸ活性の測定は、本明細書の実施例１に記載の通りであった。実験の全てにおいて、品種Ｂａｒｋｅの胚から得られた標準抽出物および品種Ｂａｒｋｅの胚から得られた熱不活性化標準抽出物をコントロール試料として使用した。
変異体Ｄ１１２のＭ４世代の穀類の胚については、平均全ＬＯＸ活性は０．３３４±１．５％Ａ５９５Ｕ（ｎ＝１２）であり、変異体Ｄ１１２のＭ５世代の穀類の胚の平均全ＬＯＸ活性は０．２９４±４．１％Ａ５９５Ｕ（ｎ＝９０）であった。比較のために、Ｍ４世代およびＭ５世代の野生型品種Ｂａｒｋｅの胚は、０．７３８±３．２％Ａ５９５Ｕ（ｎ＝２）および０．９６３±７．５％Ａ５９５Ｕ（ｎ＝９０）それぞれを生じた（図４；図５；表１、実験１を参照のこと）。
オオムギ変異体Ａ６１８のＭ４世代の胚は、０．２２２±２．１％Ａ５９５Ｕ（ｎ＝４）の平均ＬＯＸ活性を生じた。この実験の他の結果から、品種Ｎｅｒｕｄａの胚のＬＯＸ活性が０．６８４±５．８％Ａ５９５Ｕ（ｎ＝９０）であることが明らかにされた。結果を図６および表１、実験２に要約する。
要約すれば、実験データにより、変異体Ｄ１１２のＭ４世代およびＭ５世代の穀類が、極めて低い全ＬＯＸ活性に特異的な遺伝形質について同型接合性であることが確認された。同じ性質は、変異体Ａ６１８のＭ４世代の穀類について示された。
（実施例３）
（オオムギの変異体Ｄ１１２およびＡ６１８の生理学的性質）
温室での植物の繁殖：品種ＢａｒｋｅおよびＤ１１２変異体の穀類（Ｍ４世代およびＭ５世代）を発芽させ、相対湿度６５％で１２℃で２０時間照明下の温室で育てた。変異体Ｄ１１２および野生型品種Ｂａｒｋｅ植物の成育特性は、草丈、植物当たりの分げつの数、開花の開始および穂状花序当たりの穀類の数について同様であった。従って、変異体Ｄ１１２は野生型植物の生育生理機能を有すると結論付けることが可能なばかりではなく、正常な穀類発育も有すると結論付けることも可能である。
世代Ｍ４の変異体Ａ６１８穀類および品種Ｎｅｒｕｄａの穀類を発芽させ、１２℃および相対湿度６５％で２０時間／４時間の明／暗条件下の温室で育てた。変異体Ａ６１８と品種Ｎｅｒｕｄａとを比較することによって、草丈、植物当たりの分げつの数、開花の開始および穂状花序当たりの穀類の数について差は認められなかった。しかし、変異体Ａ６１８の背面側穀類は、異常穴様構造によって母品種Ｎｅｒｕｄａと異なっていた。要約すると、変異体Ａ６１８は野生型様植物成育生理機能を示すが、異常な穀類生育を示すと結論付けることができる。
圃場条件下の変異体Ｄ１１２の作物学的性能：変異体Ｄ１１２と品種Ｂａｒｋｅ植物とを、草高、出穂日、耐病性、倒伏、穂破損、成熟時間および収量に関して可能な相違を確認するために圃場試験で比較した（表２を参照のこと）。
試験は、圃場試験に関する標準手順に従って行った。従って、変異体Ｄ１１２および品種Ｂａｒｋｅの等量の穀粒を、２箇所の７．８８ｍ２の区画に植えた。それぞれは３反復試験からなる。上記の特性に重点をおいた作物学的データの特徴を、成育期全体を通じて注意深く観察した。作物学的特性に関する相違は、変異体Ｄ１１２についても、品種Ｂａｒｋｅについても観察されなかった。
（実施例４）
（変異体Ｄ１１２およびＡ６１８はヌル−ＬＯＸ−１植物である）
タンパク質の分析：変異体Ｄ１１２およびＡ６１８の変異体表現型を特定するために以下の分析を行った。休眠オオムギ穀類から取り出した胚の抽出物のウェスタンブロット分析を行った。１つの胚を、乳鉢（ｍａｔａｒ）中で３００μｌの氷冷水に抽出し、抽出物を微小遠心管に移し、１０，０００×ｇで遠心分離した。１０μｌの粗製抽出物を含有する試料アリコートを、Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０年）によって提供された記載に従ってドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した。その後に、分離したタンパク質を、Ｔｏｗｂｉｎら（１９７９年）によって詳述されたような半乾燥ブロッテイングによりニトロセルロース膜に移した。得られたブロットを、ＬＯＸ−１−特異的モノクロナール抗体５Ｄ２の１：５００希釈物を用いてプローブし（Ｈｏｌｔｍａｎら，１９９６）、次いでアルカリ性ホスファターゼに連結されたヤギ抗マウス抗体と共にインキュベートし、Ｈｏｌｔｍａｎら（前出）によって記載されたようにしてアルカリ性ホスファターゼ基質ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェートを用いて検出した。ＬＯＸ−１は、品種Ｂａｒｋｅの胚に抽出物中で５Ｄ２抗体によって認識され、上記タンパク質は品種Ｖｉｎｔａｇｅ由来のＬＯＸ−１のタンパク質と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥで移動した。
免疫検出可能なＬＯＸ−１は、変異体Ｄ１１２の試料中に存在しなかったが、上記タンパク質は品種Ｂａｒｋｅ、変異体株Ｇおよび品種Ｖｉｎｔａｇｅの抽出物中に確認することができた。Ｍ４世代の品種Ｂａｒｋｅおよび変異体Ｄ１１２後代株のウェスタン分析により、ＬＯＸ−１タンパク質は品種Ｂａｒｋｅの胚由来の穀類に存在したが、変異体Ｄ１１２の後代穀類のいずれにも存在しなかったことが明らかにされ（図７）、従ってヌル−ＬＯＸ−１形質が遺伝学的に安定であることが確認された。得られたデータは、カイ二乗試験で測定されるように統計学的に有意であった（ｐ＜３．８４）。
変異体Ａ６１８および品種Ｎｅｒｕｄａを、上記のＭ３世代およびＭ４世代の胚中のＬＯＸ−１タンパク質について分析した。ＬＯＸ−１タンパク質は、両方の世代の品種Ｎｅｒｕｄａの胚抽出物では検出できなかった。しかし、非常に弱いＬＯＸ−１タンパク質バンドが未精製変異体Ａ６１８で観察され、後代株の胚でも観察された（図８）。これはおそらくは他のＬＯＸ酵素との交差反応のためであると思われる。
戻し交配：反復戻し交配を使用して、本明細書の品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅにおいて、ヌル−ＬＯＸ−１表現型を変異体Ｄ１１２から反復親に移入した（図９参照）。戻し交配プログラムは、目的の形質に関する選択と組み合わせて、図９に例示するように計画した。その目的は、変異体Ｄ１１２のゲノムを反復親のゲノムと徐々に置換することにあった。このようにして、ＮａＮ３変異誘発処理中に変異体Ｄ１１２のゲノムに導入された他の可能な不都合な変異を排除し得る。
同型接合ヌル−ＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２（遺伝子型ｎｎと表される）の品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅ（遺伝子型ＮＮと表される）に対する一次戻し交配において、後代株は異型接合遺伝子型（遺伝子型Ｎｎと表される）を含むことが予想された。低ＬＯＸ表現型が、その劣性性質により、変異について異型接合性である株において検出を免れることは注目に値する。自家受粉後代植物は、標準メンデルパターンで、すなわち１ＮＮ：２Ｎｎ：１ｎｎの比率で分離する植物の集団を生じることが予想された。ヌル−ＬＯＸ−１遺伝子型を含みかつ一次戻し交配から得られる同型接合ｎｎ遺伝子型は、品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅの遺伝的背景の５０％を含むことが期待された。１０回の戻し交配の後に、反復親背のバックグラウンドは約９９．９％に達することが予想された。
品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅおよびヌル−ＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２のオオムギ植物は、戻し交配プログラム全体を通して温室で繁殖させた。戻し交配後代穀類を、実施例１に記載のようにして、胚の抽出物中のＬＯＸ−１タンパク質の存在について分析した。一次および二次戻し交配世代の分離後代におけるヌル−ＬＯＸ−１表現型の期待される頻度は、劣性変異について２５％であった（図１０）。ＬＯＸ−１タンパク質バンドを欠くオオムギ変異体株の検出の基礎としてウェスタンブロット分析を使用すると、一次戻し交配世代の頻度は、１２の戻し交配株の全体の中からの３株に対応していた。二次戻し交配世代では、２８の戻し交配株の全体中からの９株がウェスタンブロット分析においてＬＯＸ−１タンパク質バンドを欠いていた（図１０）。反復親バックグラウンドは二次戻し交配後代において約７５％に達することから、ＬＯＸ−１に関する変異遺伝子および対応するヌル−ＬＯＸ−１表現型の同時遺伝は、これらの遺伝子連鎖について確認を与えた。カイ二乗試験により、観察データは統計学的に有意であると分類できることが明らかにされた。ｐ値は低く（＜３．８４）、一次、二次、三次および四次の戻し交配世代について有意性を示す特性であった。
戻し交配プログラムにより、ヌル−ＬＯＸ−１表現型を与える変異対立遺伝子が代替的な遺伝的バックグラウンドに移入することができることおよびメンデル型分離の後の劣性モノ階乗（ｍｏｎｏｆａｃｔｏｒｉａｌ）様式で遺伝することが実証された。
（実施例５）
（マッシング）
麦芽汁の調製：新規オオムギ品種の性質を試験するために、麦芽試料２５〜２２５ｇを製造した（図１１を参照のこと）。外部攪拌機と、温度を十分に規定された勾配で温度勾配をつけることができるサーモスタットを備えた水浴とから構成される実験室用マッシュシステム（ｍａｓｈｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、マッシング工程を小規模で行った。最終マッシュを、濾紙を使用して濾過した。麦芽汁煮沸を、実験室規模で加熱マントルおよび還流冷却管に接続した丸底フラスコを使用して行った。
（実施例６）
（麦芽製造ならびに野生型オオムギおよび変異体オオムギの麦芽を使用するビール製造）
品種Ｂａｒｋｅおよび変異体Ｄ１１２のオオムギを、麦芽製造および醸造用の十分な穀類材料を得るために圃場で数シーズン繁殖させた。完成ビールのＴ２Ｎについての分析および感覚刺激分析により、変異体Ｄ１１２の麦芽を用いて醸造したビールの改善された香味安定性を実証した。
変異体Ｄ１１２および品種Ｂａｒｋｅから得られた穀粒の麦芽製造：麦芽製造は２０ｋｇ規模で麦芽製造室で次の通りに行った：変異体Ｄ１１２オオムギ穀類（２００３年に収穫したもの）、品種Ｂａｒｋｅ穀類（２００２年に収穫したもの）。浸漬条件は：浸漬水中で１６℃で８時間湿潤；１４時間乾燥；８時間湿潤；１０時間乾燥；４時間湿潤であった。麦芽製造条件は：１８℃で１２時間；１６℃で２４時間；１４℃で２４時間；１２℃で６０時間であった。乾燥条件は：６０℃で１２時間；６８℃で３時間；７４℃で４時間；８０℃で３時間であった。
変異体Ｄ１１２および品種Ｂａｒｋｅ麦芽から誘導された麦芽試料を使用する麦芽製造分析データを表３で比較する。結果は、変異体Ｄ１１２および品種Ｂａｒｋｅの麦芽が麦芽規格を満たすことを実証しかつ麦芽が醸造に適していることを確認した。変異体Ｄ１１２から得られた麦芽において、品種Ｂａｒｋｅの麦芽と比べると、約６４％の低下に相当するＴ２Ｎレベルの著しい低下を観察した（表４）。
変異体Ｄ１１２および品種Ｂａｒｋｅの麦芽を用いた醸造：醸造は、５０リットル規模で行い、次の工程を包含した：（ｉ）麦芽汁調製；（ｉｉ）麦芽汁分離；（ｉｉｉ）麦芽汁煮沸；（ｉｖ）醗酵；（ｖ）貯酒（ｌａｇｅｒｉｎｇ）；（ｖｉ）ブライトビール濾過；および（ｖ）瓶詰め。麦芽汁を、変異体Ｄ１１２の麦芽、または品種Ｂａｒｋｅの麦芽を使用して調製し、後者を比較試料として使用した。それぞれの醸造について、全体で１３．５ｋｇの麦芽を使用した。マッシング工程は、４７℃で２０分間、次いで１８分の加熱であり、この温度を４８℃から６７℃に上げ；６７℃で３０分休止し；次いで７２℃で５分間加熱し；７２℃で１５分休止し；７８℃まで６分間加熱し；７８℃で５分休止した。麦芽汁濾過および煮沸、ワールプール分離、醗酵、貯酒および緑色ガラス瓶への包装の醸造工程は、標準醸造実施の仕様に従った。全部で３３リットルのビールを瓶詰めした。
香味安定性およびＴ２Ｎ分析：ビールを、上記の変異体Ｄ１１２および品種Ｂａｒｋｅの麦芽を使用して製造した。新たに瓶詰めしたビールを５℃で貯蔵し、製造の２ヵ月以内に分析した。製造したてのビールと貯蔵ビールの香味安定性を、２種類異なる型のビール貯蔵条件の後に評価した。１つの実験系では、ビールを３７℃で１〜４週間の強制熟成プロセスに供した。
ビール試料のＴ２Ｎレベルを、基本的にはＧｒｏｅｎｑｖｉｓｔら（１９９３年）によって記載されたように、Ｏ−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）−ヒドロキシルアミンを用いたカルボニルの誘導体化の後に、質量分光分析検出器を備えるガスクロマトグラフィーで調べた。
訓練されたビール香味官能評価集団は、ビールの総合香味成績を評価した。試験は、ビール中の遊離Ｔ２Ｎを示すボール紙臭の検出を含んでいた。変異体Ｄ１１２および品種Ｂａｒｋｅそれぞれの麦芽から誘導されたビールについて両方の種類の製造したてのビールが、同様のレベルの亜硫酸塩（すなわち、４ｐｐｍおよび５ｐｐｍの亜硫酸塩）を含有していたことは、注目に値する。
強制熟成：品種Ｂａｒｋｅの麦芽から製造された瓶詰めビールと、変異体Ｄ１１２由来の麦芽から製造された瓶詰めビールとを調べ、図１２Ａおよび表５に示すように強制熟成中の遊離Ｔ２Ｎの発生に関する具体的なデータについて調べて比較した。両方のビールは、Ｔ２Ｎ発生の速度論の著しい相違によって区別し得ることが認められる。参照ビールは予期したように性能を発揮したが、変異体Ｄ１１２由来のビールでは予期しない、３７℃で４週間にわたった０．０１ｐｐｂに対応する著しく少ないＴ２Ｎの発生を認めた。
強制熟成実験は、上記２種類のビールの間の相違を強調した。すでに２．５週間後に、参照ビールのＴ２Ｎレベルは香味閾値レベルを越えており、これに対して変異体Ｄ１１２の麦芽を使用して製造したビールは、２〜３週間のインキュベーション後に０．０２５ｐｐｂのＴ２Ｎ濃度で横ばい状態であった。
風味および香味安定性に関して、香味専門家の評価集団は、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ変異体Ｄ１１２の麦芽を使用して製造したビールを評価した。中心は３７℃で強制熟成を行ったビール試料についてであった。香味評価集団は、製造したてのビールと強制熟成させたビール（３７℃で１週間）の両方の種類について満足する香味プロフィールを認めた。しかし、紙臭についての評点は、ヌル−ＬＯＸ変異体Ｄ１１２の麦芽を使用して製造したビールよりも参照ビールの方が高かった（表５）。すなわち参照ビールは上記の異臭についてより強い風味を有していた。一般に、香味官能評価集団は、ヌル−ＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２の麦芽から製造したビールの方を好んだ（香味許容評点、表５）。
２０℃で１２ヶ月間インキュベーションすると、専門家でありかつビールの異臭を味わうために訓練された１０人のビールテイスターからなる官能評価集団は、ヌル−ＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２の麦芽から製造したビールとコントロール麦芽から製造したビールとを比較した。例えば“紙臭”、“酸化臭”、“熟成臭”、“パン臭”、“カラメル臭”、“焦げ臭”および“甘味臭”などのような風味特徴を含む全ての評価により、ヌル−ＬＯＸ−１麦芽から作られたビールよりもコントロールビールにおいてより高いレベルの熟成特異的異臭が明らかにされた（図１２Ｂ）。
また、０〜５の尺度での評価を使用することによって（この場合、高い値が好ましい）、一般的な香味許容評点は、コントロールビールおよびオオムギヌル−ＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２の麦芽を用いて製造したビールそれぞれについて１．０および２．０と判断された。
要約すれば、オオムギ変異体Ｄ１１２の麦芽から醸造したビールの改良された香味安定性は、主として３７℃で貯蔵の後のビール中のＴ２Ｎのレベルが低いことに起因して、著しい。ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ麦芽の使用に焦点を合わせた醸造試験は、麦芽製造および醸造プロセス中のオオムギＬＯＸ−１作用が、Ｔ２Ｎの発生という熟成したビール中の主な異臭化合物について重要な決定因子を構成するという証拠を提供した。
（実施例７）
（ヌル−ＬＯＸ−１麦芽のビール中のトリヒドロキシオクタデセン酸）
リノール酸から誘導されるビール特異的トリヒドロキシオクタデセン酸（ＴＨＡ；ＴＨＯＥとも略記し得る）は、３０年前に記載された（Ｄｒｏｓｔら，１９７４）。この時以来、種々のレポートがビール中のＴＨＡの全含有量は５．７〜１１．４μｇ／ｍｌの範囲に及ぶことを確かめている（Ｈａｍｂｅｒｇ，１９９１；およびそこに記載される参考文献）。９，１２，１３−ＴＨＡは標準的にビール中のＴＨＡの７５〜８５％を構成するが、９，１０，１３−ＴＨＡの割合は標準的にはわずか１５〜２５％である。他の異性体は、微量で見出される。
オオムギ変異体Ｄ１１２の麦芽（すなわち、ヌル−ＬＯＸ−１麦芽）から製造されたビールでは、９，１２，１３−ＴＨＡの濃度は、品種Ｂａｒｋｅの麦芽から製造された参照ビールに比べて２０％（すなわち、ほぼ５分の１）にまで低下した（表６）。すなわち異性体９，１２，１３−ＴＨＡおよび９，１０，１３−ＴＨＡは、ヌル−ＬＯＸ変異体Ｄ１１２の麦芽を使用して製造したビール中にほぼ等量で存在する。これらの測定は、標準的なＨＰＬＣ−質量分光分析を使用して行った。
（実施例８）
（ビール中のトリヒドロキシオクタデセン酸）
種々様々な市販ビール試料中のＴＨＡの濃度を表７に示す。表７に示すように、ビール試料中のＴＨＡに関する結果の精査により、９，１２，１３−ＴＨＡ：９，１０，１３−ＴＨＡの比率は常に３．５を越えることが明らかになった。対照的に、Ｄ１１２から製造されたビールでは、９，１２，１３−ＴＨＡ：９，１０，１３−ＴＨＡの比率は１．３である。従って、ヌル−ＬＯＸ−１オオムギから製造されたビールは、９，１２，１３−ＴＨＡ：９，１０，１３−ＴＨＡについて著しく低い比率を有し、９，１２，１３−ＴＨＡ：９，１０，１３−ＴＨＡの比率の測定は、ビールがヌル−ＬＯＸオオムギ変異体の麦芽（例えば、オオムギ変異体Ｄ１１２の麦芽）を使用して製造されるか否かを調べるためのツールを提供する。ヌル−ＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２のオオムギから誘導される麦芽から製造されたビールは、標準的な麦芽から製造されたビールと比べて著しく低いレベルの全９，１２，１３−ＴＨＡを有することは、注目に値する。
（実施例９）
（オオムギ中のＬＯＸ作用による酵素生成物の生化学的特徴）
成熟野生型オオムギ穀類は、酵素ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２由来の２つの主要なＬＯＸ活性を含む。これらの酵素は、リノール酸のヒドロペルオキシオクタデカジエン酸（ＨＰＯＤＥ）への二原子酸素添加を触媒し、酵素ＬＯＸ−１は９−ＨＰＯＤＥの形成を触媒し、酵素ＬＯＸ−２は１３−ＨＰＯＤＥの形成を触媒する。成熟穀類では、ＬＯＸ由来の活性は胚に限定される。どのようにＬＯＸ−１の遺伝子の変異がＨＰＯＤＥ形成に影響を及ぼすかを調べるために、品種Ｂａｒｋｅからの胚抽出物およびオオムギ株Ｇ（低ＬＯＸ穀粒、Ｄｏｕｍａらの国際公開第ＷＯ０２／０５３７２１Ａ１号として公開されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ０１／００２０７号）からの同様の抽出物、ならびにヌル−ＬＯＸ変異体Ｄ１１２の胚抽出物を、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析で調べた。
オオムギの胚：胚からの粗製タンパク質抽出物の調製を、胚盤と胚乳の間で切断するために外科用メスを使用して成熟オオムギ穀類から器官を最初に切り裂くことによって行った。次いで、４個の胚からなるそれぞれの試料を、２枚の秤量用紙の間に置き、穏やかにハンマーでたたいて均質な粉末を作った。これを１．５ｍｌ微小遠心管に移し、６００μｌの２００ｍＭ乳酸緩衝液（ｐＨ４．５）を加え、この微小遠心管を氷の上に１０分間置き、その後にプラスチック乳棒（Ｋｏｎｔｅｓ）を使用してさらに均質化した。その後に、６００μｌの水をそれぞれの管に加え、試料を２０，０００×ｇで２分間遠心分離した。得られた上清のアリコート１００μｌを１５ｍｌ遠心分離管［Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅから購入したＣｅｌｌｓｔａｒ（カタログ番号１８８２７１）］に移し、ＬＯＸ作用の後の反応生成物の分析用に、２６０μＭリノール酸を含有する２ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を調製した［基質は、１０ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を、１００μｌの２４ｍＭリノール酸原液と混合することによって調製した。後者は、最初に１５５μｌのリノール酸（１３４ｍｇの遊離酸に対応する；Ｌ−１３７６、Ｓｉｇｍａ）と２５７μｌのＴｗｅｅｎ−２０とを混合し、次いで５ｍｌの容量までＨ２Ｏを加え、次いで６００μｌの１Ｍ ＮａＯＨを加え、溶液が透明になった際に、最終容量をＨ２Ｏで２０ｍｌに調整した］。回転振盪機で１５分インキュベートした後に、２ｍｌの酢酸エチルを加え、９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥを抽出するために試料内容物を５秒間激しく振盪することによって混合した。次いで、試料を８００×ｇで１０分間遠心分離し、１ｍｌ酢酸エチルを１．５ｍｌ微小遠心管に移し、その中で酢酸エチルを窒素ガスの気流下で蒸発させた。その後に、ＨＰＯＤＥを３００μｌのメタノールに再懸濁し、０．４５μｍ膜（Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＮフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して濾過した
ＨＰＯＤＥ含有量の分析は、ＨＰＬＣで行った。各試料から合計１５μｌを、４．６×２５０ｍｍのＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を備えたＨＰＬＣ装置（ＨＰ１１００ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）に注入した。使用した移動相は、水：メタノール：アセトニトリル：テトラヒドロフラン：トリフルオロ酢酸の１６：１２：１２：１０：０．５（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ）混合物であった。移動相の流量は１分当たり１ｍｌであり、そしてカラムの前で測定した圧力は１４０バールであった。分離は３０℃で行った。共役二重結合を有するヒドロペルオキシドの検出は２３４ｎｍで行った。標準試料は、図１３Ａに詳述するように、９（Ｓ）−ヒドロペルオキシ−１０（Ｅ），１２（Ｚ）−オクタデカジエン酸［（９（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ］と１３（Ｓ）−ヒドロペルオキシ−９（Ｚ），１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸［（１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ］との混合物からなっていた。
クロマトグラムの分析により、主として９−ＨＰＯＤＥは品種Ｂａｒｋｅの成熟オオムギ胚から抽出されたＬＯＸ酵素によって形成され（図１３Ｂ）、これに対して９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの両方は低ＬＯＸ株Ｇの成熟胚の抽出物中で形成された（図１３Ｃ）ことが明らかにされた。変異体Ｄ１１２胚の抽出物は、極めて少ない量の９−ＨＰＯＤＥを形成したが、多量の１３−ＨＰＯＤＥを形成し、従ってＬＯＸ−１活性が存在しないことを立証した（図１３Ｄ）。従って、変異体Ｄ１１２の胚抽出物は、野生型オオムギ株の胚抽出物よりもはるかに少ない９−ＨＰＯＤＥを形成した。
オオムギ麦芽：オオムギ麦芽は、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２から誘導される２つの主要なＬＯＸ活性を含む。ＬＯＸ−１が９−ＨＰＯＤＥの形成を触媒する場合には、ＬＯＸ−２作用は１３−ＨＰＯＤＥを生成する。ＬＯＸをコードする遺伝子の変異の麦芽抽出物中のＨＰＯＤＥの生成に対する効果を調べるために、品種Ｂａｒｋｅ、オオムギ低ＬＯＸ株Ｇおよび変異体Ｄ１１２由来の麦芽から調製した抽出物を用いてＨＰＬＣ分析を行った。
麦芽からの粗製タンパク質抽出物の試料を次のようにして調製した。１つの麦芽化されるオオムギ穀類を２枚の秤量用紙の間に置き、穏やかにハンマーでたたいて均質な粉末を製造した。その後の処理の全て、インキュベーション混合物およびＨＰＬＣ分析方法は、胚抽出物中のＬＯＸ産物の測定に関する本実施例の上記の節に記載したものと同じであった。
ＨＰＬＣ分析には、図１４Ａに例示するように、９（Ｓ）−ヒドロペルオキシ−１０（Ｅ），１２（Ｚ）−オクタデカジエン酸［（９（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ］と１３（Ｓ）−ヒドロペルオキシ−９（Ｚ），１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸［（１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ］との標準混合物を使用した。麦芽化されたＢａｒｋｅ、低ＬＯＸおよびＤ１１２の抽出物中のＨＰＯＤＥ生成活性の分析により、品種Ｂａｒｋｅの麦芽における９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの生成活性の６０：４０分布（図１４Ｂ）、低ＬＯＸオオムギ由来の麦芽におけるいくつかの９−ＨＰＯＤＥ生成活性（図１４Ｃ）、および変異体Ｄ１１２の麦芽における極めて低いレベルの９−ＨＰＯＤＥ生成（図１４Ｄ）が実証された。これらのデータは、他のオオムギ株由来の麦芽抽出物よりも変異体Ｄ１１２の麦芽抽出物において著しく低い９−ＨＰＯＤＥの形成を実証している。
（実施例１０）
（オオムギ変異体Ｄ１１２中のＬＯＸ−１の遺伝子を変異させる）
変異体Ｄ１１２中のＬＯＸ−１の遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２）および品種Ｂａｒｋｅ中のＬＯＸ−１の遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）を得、変異体Ｄ１１２（これは穀類中に対応するＬＯＸ−１酵素が存在しないことに特徴があることが認められている）のヌル−ＬＯＸ−１表現型について分子的基礎を調べるために比較した。
変異体Ｄ１１２および野生型品種Ｂａｒｋｅ由来のゲノムオオムギＤＮＡを、植物ＤＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、製造業者の推奨に従って苗の葉組織から単離した。変異体Ｄ１１２および品種ＢａｒｋｅのゲノムＤＮＡ中のＬＯＸ−１のタンパク質コード領域の側面に位置する４，２２４ｂｐの配列を、プライマー
を使用してＰＣＲで増幅した。プライマー配列の基礎は、ＬＯＸ−１の遺伝子のゲノム配列であった（ｖａｎ Ｍｅｃｈｅｌｅｎら，１９９５；Ｒｏｕｓｔｅｒら，１９９７；ＬＯＸ−１をコードする領域の開始コドンおよび終止コドンに及ぶゲノム配列の概略図を図１５に示す）。ＰＣＲ反応は、５ｐｍｏｌの各プライマーおよび３．５ＵのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する２０μｌ容量中の１００ｎｇのゲノムＤＮＡからなる。ＰＣＲ増幅は、ＭＪサイクラー中で次のサイクリングパラメーターを使用して行った：９６℃で２分を１サイクル；９５℃で１分、６９℃で１分、および７２℃で５分を３０サイクル；７２℃で１０分を１サイクル。ＰＣＲ産物を、１．０％アガロースゲル上で分離した。増幅した領域の長さに相当するＤＮＡ断片を、Ｑｉａｅｘ ＩＩ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、プラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。コード領域の両方の鎖のヌクレオチド配列を、特異的オリゴヌクレオチドプライマーとのジデオキシヌクレオチド鎖終結反応を使用して調べ、ＭｅｇａＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡ配列決定装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で分析した。配列の比較を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ配列分析ソフトウエアパッケージｖｅｒ．５（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して行った。
野生型品種ＢａｒｋｅのＬＯＸ−１の配列（配列番号１）と変異体Ｄ１１２のＬＯＸ−１の配列（配列番号２）との間の直接比較において、変異体のヌクレオチド配列は、エキソン７において位置３５７４でＧ→Ａ置換の形の１つの点変異を明らかにした（図１５；図１６）。ＬＯＸ−１の野生型配列は、９６．４ｋＤａの予測質量を有する８６２残基の長さのタンパク質（配列番号３）をコードする。対照的に、変異体Ｄ１１２の対応する配列の位置３５７４での変異は、未成熟終止コドンの導入をもたらす。
変異体Ｄ１１２の遺伝子をコードするＬＯＸ−１中の終止コドンは、対応するタンパク質の１９７個のアミノ酸のＣ末端切断をもたらすことが予想され、従って７４．２ｋＤａのタンパク質をコードすると予測される。その配列を（配列番号４）に示す。
（実施例１１）
（オオムギ変異体Ａ６１８のＬＯＸ−１の遺伝子を変異させる）
オオムギ変異体Ａ６１８および野生型品種ＮｅｒｕｄａのゲノムＤＮＡの調製、ＰＣＲ反応およびＤＮＡ配列決定ならびにゲノムＤＮＡの分析は、変異体Ｄ１１２および品種Ｂａｒｋｅについて実施例１０に記載のものと同じであった。
オオムギ変異体Ａ６１８のＬＯＸ−１のヌクレオチド（配列番号６）と親品種ＮｅｒｕｄａのＬＯＸ−１のヌクレオチド（配列番号５）の比較により、変異体配列がゲノム配列の位置２３１１でＧ→Ａ置換に対応する１つの点変異を有することが示された（図１５；図１６）。
品種ＮｅｒｕｄａのＬＯＸ−１についての野生型配列は、９６．４ｋＤａの予測質量を有する８６２残基の長さのタンパク質（配列番号７）をコードする。対照的に、変異体Ａ６１８の対応する配列の位置２３１１での変異は、イントロン３供与部位を変異させる。これは、イントロン３においてスプライスエラーを引き起こし、理論的に、３９９個のアミノ酸の翻訳後にイントロン３の未成熟終止コドンをもたらす。
変異体Ａ６１８のＬＯＸ−１に関する遺伝子中の枠内終止コドンは、４４．５ｋＤａの切断された翻訳されたタンパク質（配列番号８）をもたらす。
（実施例１２）
（ＬＯＸ−１の転写産物のＲＴ−ＰＣＲ検出）
品種Ｖｉｎｔａｇｅ、変異体株Ｇ（低ＬＯＸ、Ｄｏｕｍａらの国際公開第ＷＯ０２／０５３７２１Ａ１号として公開されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ０１／００２０７号）、品種Ｂａｒｋｅ、および変異体Ｄ１１２のオオムギ植物を、デンマーク国コペンハーゲンで２００２年の春の間に温室で育てた。穂を開花の当日に標識し、穂状花序を開花後（ＤＡＦ）２０日目、４０日目および６０日目に収穫した。穂状花序を、全ての試料を同時に処理できるまで−８０℃で保持した。時間点当たり合計１０個の胚を成長する穎果から切り裂き、ＲＮＡをＦａｓｔＲＮＡ、Ｇｒｅｅｎ ＲＮＡ単離キット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を使用し、製造業者の推奨を使用して抽出した。
ＲＴ−ＰＣＲ反応のテンプレートは、上記の胚のＲＮＡ１００ｎｇからなっていた。２０μｌのＲＴ−ＰＣＲ反応物は５０ｐｍｏｌの各プライマーと５ＵのＲＴ−ＰＣＲ酵素混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有していた。ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、ＭＪサイクラー中で、以下のように行った：４８℃で４５分を１サイクル；９５℃で１分を１サイクル；９４℃で１分、６５℃で１分および７２℃で１分を３０サイクル；最後に７２℃で１０分間を１サイクル。
正方向プライマー
を使用して、２９２ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ断片を生成した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲル上で分離した。増幅された領域に長さが相当するＤＮＡ断片を、Ｑｉａｅｘ ＩＩ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、プラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。プラスミド挿入物のヌクレオチド配列を、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ）を使用して配列決定した。ＤＮＡ配列の比較を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ配列分析ソフトウエアパッケージｖｅｒ．５（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して行った。
得られたＰＣＲ産物は、ゲノムクローンのヌクレオチド位置３２８３〜３６５９に対応する領域に及んだ（配列番号１）。この領域は、８３ｂｐの長さをもつイントロン５を含み、これはＤＮＡ−遊離ＲＮＡ調製物のＲＴ−ＰＣＲテンプレートには存在しなかった（図１７Ａ）。ＤＮＡ配列分析により、単離断片はＬＯＸ−１の遺伝子の不可欠な部分であることが確認され、そしてイントロン５配列の不存在が実証されたことから、誤った増幅が酵素ＬＯＸ−２のオオムギ遺伝子から断片を生じることを除外することができた（図１７Ｄ）。従って、増幅された断片は、ＲＮＡ転写産物の増幅の生成物に相当した。
品種Ｖｉｎｔａｇｅおよび変異体株Ｇの２０ＤＡＦ、４０ＤＡＦおよび６０ＤＡＦのオオムギ胚から精製したＲＮＡの比較ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＬＯＸ−１の転写産物のレベルは同様の成長段階で上記２つの品種について同様であることを明らかにした。ＬＯＸ−１の転写産物のレベルは２０ＤＡＦから６０ＤＡＦまでの時間内で徐々に増加する（図１７Ｂ）。
しかし、対照的に、一組の同様のデータを品種Ｂａｒｋｅおよび変異体Ｄ１１２について調べると、著しい相違が認められた。ここで、ＲＴ−ＰＣＲ実験により、変異体Ｄ１１２におけるＬＯＸ−１転写産物が、品種ＢａｒｋｅのＬＯＸ−１転写産物と比較した場合にその量において実質的に少ないことを明らかにした（図１７Ｃ）。
要約すると、上記観察は、変異体Ｄ１１２のＬＯＸ−１の遺伝子のプロモーター領域における可能な変異によって説明することが可能である。他のまだ知られていない要因が、変異体Ｄ１１２のＬＯＸ−１の遺伝子の転写調節に関与し得る。この点において、変異体Ｄ１１２のＬＯＸ−１の転写産物における終止コドンがナンセンス介在ｍＲＮＡ崩壊を与えるということは除外され得ない（ｌｓｓｈｉｋｉら，２００１）。
（実施例１３）
（Ｄ１１２変異を有するオオムギ変異体の遺伝子検出）
最新のオオムギ育種の戦略は、変異誘発から商業化までのプロセスを促進するためにバイオテクノロジー技術をしばしば包含する。従って、目的の遺伝子内の一塩基多型の検出について植物材料の早期スクリーニングを実施することが有用であり得る。この技術をゲノムＤＮＡと共におよび高速処理システムと組み合わせて使用すると、育種株の数を播種期で５０％に狭めることが可能であり得る。
ＣＡＰＳアッセイ：変異体Ｄ１１２後代株のＬＯＸ−１の遺伝子のクローニングおよび配列決定は、変異が次世代まで伝えられることを示した。この技術は、労力を要し、実用的なオオムギ育種には有用ではない。
低ＬＯＸ株Ｇに特異的な変異は、育種材料において切断増幅多型配列アッセイ（ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｓｓａｙ）（ＣＡＰＳアッセイ）を使用してＤｏｕｍａらの国際公開第ＷＯ０２／０５３７２１Ａ１号として公開されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ０１／００２０７号の実施例４の開示のようにして、同定することができる。しかし、変異体Ｄ１１２のＬＯＸ−１の遺伝子における変異の性質は、変異を含む６０ｂｐの領域中で改変された制限地図を作成するのに使用することはできない。
ＳＮＰアッセイ：このことに対する代替的な解決法は、一塩基多型（ＳＮＰ）を包含する分析を行うことである。ＳＮＰは、１つの遺伝子座で表される少なくとも２種類のヌクレオチドを有する変異点である。この分析は、２組のゲノムＰＣＲ反応の組み合わせに基づく。両方の反応物は、遺伝子座特異的プライマーと、２個のＳＮＰプライマーのうちの１つ（配列のそれぞれの対立遺伝子について１つ）を含む。２組のＰＣＲ反応は、植物株当たりにつき行われ、ＰＣＲ反応の結果はいずれもＳＮＰプライマーが変異体または野生型対立遺伝子の配列に結合するということである（図１８Ａ）。いくつかの方法の１つにおいて、ＳＮＰ分析は、ＰＣＲ産物の電気泳動の後のバンドパターンを評価することによる変異体株の同定に基づき得る。
１７の育種株由来のゲノムオオムギＤＮＡおよび野生型品種Ｂａｒｋｅ由来のゲノムオオムギＤＮＡを、苗の葉の組織から、Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して製造業者の推奨に従って単離した。
野生型ＬＯＸ−１の遺伝子のＳＮＰを増幅するのに使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、
であった。変異体Ｄ１１２の対応する遺伝子については、プライマーは、
であった。
これらのプライマー組み合わせをＰＣＲ反応に使用して、変異体Ｄ１１２または品種ＢａｒｋｅのＬＯＸ−１のコード領域の一部を含む１６６ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した（図１８Ａ）。
２５ｐｍｏｌのプライマーおよび２．５ＵのＦａｓｔＳｔａｒｔ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を含有する２０μｌ容量での１００ｎｇのゲノムＤＮＡからなるＰＣＲ反応物を、製造業者者の指示書に従って使用した。ＰＣＲ増幅は、ＭＪサイクラー中で、以下のように行った：９６℃で５分を１サイクル；９５℃で１分、７０℃で１分、７２℃で１分を２０サイクル；最後に７２℃で１０分を１サイクル。
ＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲル上で分離した。増幅した領域に長さが相当するＤＮＡ断片を、Ｑｉａｅｘ ＩＩ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＰＣＲ産物をＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒでジデオキシヌクレオチド連鎖終結反応を使用して直接的に配列決定した。配列の比較を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ配列分析ソフトウエアパッケージｖｅｒ．５（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して行った。
ＳＮＰ分析による合計で１７の育種株のスクリーニングから得られたデータおよびＰＣＲ産物の直接的な配列決定から得られた実験データをまとめると、同じ結果が得られた。これらの実験に基づいて、ＳＮＰ技術を使用して、原料がオオムギ変異体Ｄ１１２のＬＯＸ−１の遺伝子の配列と同じ遺伝子配列を含むことを確認し得るということが、結論付けられ得る（図１８Ｂ）。
（実施例１４）
（試料混合物中の変異体の検出）
醸造業は、ビールの製造にオオムギと麦芽との混合物、特定の麦芽品種の望まれていない化学特性を遮蔽し得る性質を使用し得る。特定の種子材料の使用に関する簡単な確認は、ＰＣＲ分析による変異体遺伝子の増幅を包含し得る。
混合麦芽試料のＳＮＰ分析は、変異体Ｄ１１２と品種Ｂａｒｋｅとの試料混合物、および変異体株Ｇ（Ｄｏｕｍａらの国際公開第ＷＯ０２／０５３７２１Ａ１号として公開されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ０１／００２０７号）と品種Ｂａｒｋｅとの試料混合物を使用して行った。変異体Ｄ１１２の穀類を０％、２０％、４０％、６０％、８０％および１００％含有する６種類のオオムギ試料を分析した。別のシリーズでは、変異体株Ｇの穀類を０％、２０％、４０％、６０％、８０％および１００％含有する６種類のオオムギ試料を分析した。粉砕穀類からＮｕｃｌｅｏｎ Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、製造業者の推奨に従ってＤＮＡを単離した。
変異体Ｄ１１２のＬＯＸ−１の遺伝子の１６６ｂｐのＳＮＰを増幅するのに使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、
であった。変異体株ＧのＬＯＸ−１の遺伝子の３７０ｂｐのＳＮＰを増幅するのに使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、
であった。４種類のプライマーを同時に使用する多重反応として、ＰＣＲを行った（図１９Ａ）。各反応物は、酵素の供給業者によって提供された指示に従って、５０ｐｍｏｌの各プライマーおよび１０μｌのＲｅｄＴａｑポリメラーゼ溶液（Ｓｉｇｍａ）を含有する２０μｌ容量に１００ｎｇのゲノムＤＮＡを含有していた。ＰＣＲ増幅は、ＭＪサイクラー中で以下のように行った：９５℃で１分を１サイクル；９４℃で１分、６６℃で１分、７２℃で３０秒を２５サイクル；最後に７２℃で１０分を１サイクル。ＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲル上で分離した。増幅した領域に長さが相当するＤＮＡ断片を、Ｑｉａｅｘ ＩＩ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、プラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。プラスミド挿入物の両方の鎖のヌクレオチド配列を、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたジデオキシヌクレオチド鎖終結反応を使用して決定し、ＭｅｇａＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で分析した。配列の比較を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ配列分析ソフトウエアパッケージｖｅｒ．５（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して行った。
図１９Ｂに示したゲル分析により、変異体Ｄ１１２の穀類を含有する混合物に由来する試料の全部について陽性ＳＮＰ分析を明らかにした。同様に、変異体系列Ｇ由来の物質を含有する試料を確認することができた。要するに、遺伝子分析は、変異体株Ｇまたは変異体Ｄ１１２いずれかの変異体ＬＯＸ植物を含有するオオムギ混合物の使用を容易に確認することができる。
（実施例１５）
（変異体Ｄ１１２の組換えＬＯＸ−１は不活性である）
変異体Ｄ１１２のＬＯＸ−１の遺伝子は、未成熟終止コドンを含むことを示した（実施例１０を参照のこと）。従って、遺伝子の植物内での発現は、野生型ＬＯＸ−１に認められる最初の６６５個のアミノ酸残基のみを含む対応するＬＯＸ酵素の切断バージョンの合成を生じることが予期された。ＬＯＸ−１の切断バージョンを特定するヌクレオチド配列をＥ．ｃｏｌｉ細胞中で発現させて、それが酵素的に不活性であり、そしてオオムギ変異体Ｄ１１２の細胞中でＨＰＯＤＥの形成を触媒することができないことを確認した。
Ｅ．ｃｏｌｉ中で野生型および変異体のＬＯＸ−１を発現させるためのプラスミド：ＬＯＸ−１をコードするオープンリーディングフレーム全体を、標準ＰＣＲプロトコールを使用することによって増幅させた。テンプレートは、オオムギｃＤＮＡ（ｖａｎ Ｍｅｃｈｅｌｅｎ，１９９９）であり、使用したプライマーは、
であった。２，５９７ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を得、精製した。ＰＣＲ断片をＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、ベクターｐＥＴ１９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の大きなＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片に結合し、ＬＯＸ−１の遺伝子が、１０残基の長さのＨｉｓ末端の配列の枠内で、下流でクローン化される発現プラスミドｐＥＴＬ１を得た。ＤＮＡ配列決定分析により、プラスミド挿入物が正しい配列を含むことを確認した。
次の実験は、ＬＯＸ−１の切断バージョンの発現のためのプラスミドの構築を包含する。その目的は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞でのタンパク質合成がＬＯＸ−１の切断バージョンを生じるように、ｐＥＴＬ１のＬＯＸ−１のオープンリーディングフレームのコドン番号６６６を終止コドンに変化させることにある。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるリボソームによって終止コドンの中の読み通しを完全に抑制するために、ｐＥＴＬ１中のＬＯＸ−１の番号６６５のコドンの下流の全てのコドンが除去され、終止コドンＴＧＡで置換されている発現プラスミドを構築した。以下のプロトコールを使用した。１２９ｂｐの断片を、ｐＥＴＬ１からプライマー
の存在下でのＰＣＲを使用して増幅した。この増幅は、上記断片に終止コドンおよびＥｃｏＲＩ部位を導入した。これをその後にＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＥＴＬ１の大きなＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片に結合した。得られた発現プラスミドをｐＥＴＬ２と命名し、挿入物の正しい配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、組換えＬＯＸタンパク質を合成する：Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１細胞（Ｎｏｖａｇｅｎから購入した）を、ベクターｐＥＴ１９ｂならびに発現プラスミドｐＥＴＬ１およびｐＥＴＬ２（上記のもの）を用いて別々に形質転換した。プラスミドを有する細菌細胞を、標準ルリア・ブロス（ＬＢ）培地に接種し、３７℃で２時間増殖させた。その後に、１ｍＭ ＩＰＴＧを加えて異種遺伝子の発現を誘導し、その培養物を２０℃で一夜増殖させた。細胞を１４，０００×ｇで１分間遠心分離することにより回収し、次いで得られた細胞ペレットを、６Ｍ塩酸グアニジン、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭイミダゾールを補足した５０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液からなる変性溶液に再懸濁した。氷上で超音波粉砕した後に、溶解細胞を１４，０００×ｇで１分間遠心分離し、上清をＮｉ樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ）と混合し、次いで４℃で３０分間インキュベートした。Ｎｉ樹脂を遠心分離することにより沈殿させ、上記の変性溶液で２回洗浄した。最後に、Ｈｉｓ標識タンパク質を、上記樹脂から０．３Ｍ ＮａＣｌおよび０．５Ｍイミダゾールを補足した５０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液を使用して２回溶出した。分画し、溶出した試料のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した（図２０）。約１００ｋＤａの明瞭なバンド（ＬＯＸ−１対応する）、および約６６ｋＤａの明瞭なバンド（切断ＬＯＸ−１の計算質量に対応する）が、ｐＥＴＬ１およびｐＥＴＬ２それぞれを有する細胞から得られた。ｐＥＴ１９ｂを有する細胞は、溶出した画分にバンドを生じなかった。
ＬＯＸ−１の切断バージョンは不活性である：ｐＥＴ１９ｂ、ｐＥＴＬ１およびｐＥＴＬ２を有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１を、標準ＬＢ培地に接種し、３７℃で２時間増殖させた。その後に、１ｍＭ ＩＰＴＧを加えて異種遺伝子の発現を誘導し、培養物を２０℃で一夜増殖させた。この細胞を１４，０００×ｇで１分間遠心分離することにより回収した。得られた細胞ペレットをＢｕｇＢｕｓｔｅｒとＢｅｎｚｏｎａｓｅとの混合物（Ｎｏｖａｇｅｎ）に再懸濁することによって、細胞溶解液を得た。ＬＯＸ活性を、上記溶解液中で、６．２５ｍＭ ３−ジメチルアミノ安息香酸、０．３１２５ｍＭリノール酸、０．１ｍＭ ３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾンおよび０．０５ｍｇ／ｍｌヘモグロビンを含有するリポキシゲナーゼアッセイ試薬を使用して測定した。１８０μｌの上記試薬を１０μｌのそれぞれの細胞溶解液と混合し、室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション中に生成したインダミンの量（５９５ｎｍでの吸光度として分光光度分析により決定された）は、細胞溶解液のリポキシゲナーゼ活性に対応する。ｐＥＴＬ１を用いて形質転換した細胞（Ｈｉｓ標識ＬＯＸ−１を生成する）が大きなＬＯＸ−１活性を示したのに対し、変異体Ｄ１１２特異的切断ＬＯＸ−１を生成する細胞は、ベクターのみを用いて形質転換したコントロール細胞と同じＬＯＸ活性を有していた（表８）。これは、オオムギ変異体Ｄ１１２の切断ＬＯＸ−１が不活性であることを実証している。
（実施例１６）
（トランスジェニックオオムギ植物）
プラスミド構築：遺伝子配列を、標準プラスミドベクター（例えば、ｐＵＣ１８）のポリリンカー領域に挿入する。この挿入断片を図２１に列挙する。１つの構築物（図２１Ａ）では、トウモロコシユビキチン−１プロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９２；Ｊｅｎｓｅｎら，１９９６）（同じ遺伝子のイントロン１を含む）は、選択可能なマーカーのホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードするｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅら，１９９０）の転写を導く。ＬＯＸ−１の遺伝子のセンス抑制（ｓｅｎｓｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）のために設計した第２の構築物（ＤｏｕｇｈｅｒｔｙおよびＰａｒｋｓ，１９９５）において、オオムギＬＯＸ−１のオープンリーディングフレームを、トウモロコシユビキチン−１プロモーターおよびイントロン１の下流に直接に挿入した（図２１Ｂ）。ＬＯＸ−１のオオムギ遺伝子の発現をサイレンシングするための構築物を図２１Ｃに示す。オオムギ細胞中のこの構築物の発現は、イントロンがスプライスされたヘアピンＲＮＡの形成によって上記遺伝子の完全なサイレンシングを与え、この構築体をＳｍｉｔｈら（２０００年）による刊行物の図１ａに詳述されたデータに従って設計する。具体的には、図２１Ｃで構築物の「イントロン１」と表される配列は、Ｓｍｉｔｈら（前出）による刊行物の図１ａに示されるイントロン配列と同じである。図２１Ｃにおける構築物のセンスおよびアンチセンスアームは、オオムギＬＯＸ−１をコードするオープンリーディングフレームのセグメントを含む同じ約２００ｂｐの長さの断片の反対方向を表し、上記のリーディングフレームのセグメントは、ＬＯＸ−１のオープンリーディングフレームのどこかに配置される。あるいは、２００ｂｐの長さの配列を、ＬＯＸ−１をコードするオオムギ遺伝子の終止コドンの下流の配列から選択する。
トランスジェニック植物の形質転換および再生：品種Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｒｏｍｉｓｅの温室で育てた供与体オオムギ植物由来の成熟オオムギ胚を、ＬＯＸ−１をコードするオオムギ遺伝子を共抑制するための図２１Ａ、Ｂに示される挿入断片を含むプラスミドの混合物、および上記遺伝子をサイレンシングするための図２１Ａ、Ｃに示されるプラスミドの混合物と衝突させた。形質転換、形質転換細胞の選択、およびトランスジェニック植物の繁殖を、ＷａｎおよびＬｅｍａｕｘ（１９９４）およびＪｅｎｓｅｎら（前出）によって詳述されたようにして行った。
トランスジェニック植物を、数世代にわたって育てるか、または異なるオオムギ品種を用いて受粉させ、次いで所望の表現型を有する子孫植物を同定した。２世代またはそれ以上の世代は、所望の表現型特性の発現が安定的に維持され、遺伝することを確実にするために生育させてもよい。種子を収穫して、所望の表現型特性が達成されていることを調べた。
ＬＯＸ−１をコードするオオムギ遺伝子の共抑制またはサイレンシングの効果を調べるために、トランスジェニック穀粒を、本明細書の実施例１に詳述したように、最初にＬＯＸ−１由来の酵素活性について分析した。その後に、ＬＯＸ−１活性を有していないかまたはほとんど有していないトランスジェニック穀粒を、本明細書の実施例５および実施例６でヌル−ＬＯＸ−１穀粒について詳述したように麦芽製造および醸造実験で調べた。さらに、トランスジェニック穀粒の抽出物を、アスペルギルス属真菌の増殖に対する負の効果を有する穀粒を同定するために、Ｋｅｌｌｅｒの米国特許第５，９４２，６６１号に記載の方法を使用して分析した。
（実施例１７）
（グリーンノート化合物）
グリーンノート化合物の製造プロセスは、
（ｉ） ヌル−ＬＯＸ−１オオムギ穀粒を微粉末に変える工程；
（ｉｉ） 得られた粉末を水または特定の緩衝液に懸濁する工程；
（ｉｉｉ）得られた懸濁物をインキュベートする工程。あるいは、得られた粉末懸濁物を、（ａ）脂肪酸（リノール酸またはリノレン酸あるいはこれらの混合物）；または（ｂ）１３−ＨＰＯＤＥまたは１３−ＨＰＯＴＥあるいはこの両方に特異性を有するヒドロペルオキシドリアーゼ酵素；または（ｃ）上記脂肪酸と上記酵素とを含有する混合物と反応させる工程；
（ｉｖ） 得られるアルデヒドをアルコールデヒドロゲナーゼと反応させる工程；
（ｖ） アルデヒドまたはアルコールを精製し、そして芳香剤または香味組成物の有用な調製物を調製する工程
を包含する。
（実施例１８）
（ＬＯＸ−１インヒビター）
組換えＬＯＸ−１の新たに調製した溶液を分析のために使用した。この実験では、１００ｍｌのＡＢ３増殖培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足した）を供給業者（Ｒｅｍｅｌ）による推奨を使用して調製し、次いでプラスミドｐＥＴＬ１（Ｈｉｓタグ付きＬＯＸ−１をコードする；実施例１５を参照のこと）を用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞の一夜培養物５ｍｌを接種した。得られた細菌培養物を、細胞密度がＯＤ６００＝０．８に達するまで３７℃で増殖させた。培養物を２０℃で３０分間インキュベートし、次いで０．４ｍＭ ＩＰＴＧを補足して異種遺伝子の発現を誘導し、２０℃で一夜インキュベートした。
培養物の細胞を、１５分間遠心分離することによってペレット化し、５ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ＨＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に再懸濁し、穏やかに振盪しながら２０分間インキュベートして核酸をハイブリダイズさせた。その後に、細胞砕片を遠心分離により取り除き、その上清を０．４５μｍ濾紙に通して濾過することによりきれいにし、同容量の結合用緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールを補足した５０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ７．５）に加えた。得られた抽出物を、製造業者の推奨に従ってＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に加え、洗浄用緩衝液（［イミダゾール］＝１５０ｍＭである以外は上記の結合用緩衝液と同じ）で１回洗浄し、結合されたタンパク質を溶出用緩衝液（［イミダゾール］＝５００ｍＭである以外は上記の結合用緩衝液と同じ）を用いて溶出した。
洗浄液および溶出液のタンパク質を含有する画分１ｍｌのアリコート３μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し（図２２Ａ）、溶出液２の画分１ｍｌが約０．７ｍｇの組換えＬＯＸ−１を含有することを示した。
次いで、精製ＬＯＸ−１をアッセイに使用して、選択したＬＯＸインヒビターが酵素活性を低減するか否かを決定した。最初に、リノール酸の原液（実施例９に詳述したように調製した）を、その初期濃度の１／１０まで希釈し、２．４ｍＭリノール酸の溶液を得た。そのアリコート４５μｌに、０ｍＭ、５ｍＭ、１２ｍＭおよび２４ｍＭの没食子酸オクチル、またはＮＤＧＡ（推定されるＬＯＸ−１インヒビター）を含有するエタノール溶液５μｌを補足した。リノール酸−インヒビター混合物のアリコート１０μｌを、１００ｍＭ Ｎａ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）９９０μｌに加え、２０℃で１分間インキュベートし、その後に５μｌの組換えＬＯＸ−１（溶出液２、上記を参照のこと）を加えた。
ＬＯＸ−１の添加の後に、Ａ２５４を３分間にわたって記録した。ＬＯＸ−１酵素活性を、時間に対してプロットしたＡ２５４の傾きのグラフとして測定した。結果を図２２Ｂに要約する。この結果は、インヒビターのマイクロモル濃度でのＬＯＸ−１の著しい阻害を示す。
（実施例１９）
（没食子酸オクチル（ＬＯＸ−１インヒビター）を用いるマッシング工程）
オオムギ品種Ｂａｒｋｅの麦芽２５ｇを含有するか、またはヌル−ＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２の麦芽２５ｇを含有する１００ｍｌの小規模のマッシング工程を実施例５に記載の装置と同様の装置を使用して行った。マッシング工程の開始（ｍａｓｈｉｎｇ−ｉｎ）は３７℃で１５分間であり、糖化は６８℃で３０分間であり、マッシング工程の終了（ｍａｓｈｉｎｇ−ｏｆｆ）は７７℃で１０分間であり、次いで麦芽汁の最終煮沸は６０分間であり；温度シフトは１分当たり１℃に調節した。
ＬＯＸ−１インヒビターの存在下でのマッシング工程の効果を試験するために、オオムギ品種Ｂａｒｋｅの麦芽を用いたマッシュに、マッシング工程の開始時に０．５ｍＭ没食子酸オクチルを補足した。平行操作のマッシング工程は、没食子酸オクチルを添加せずにオオムギ品種Ｂａｒｋｅの麦芽を用いた実験、および０．５ｍＭ没食子酸オクチルの存在下または非存在下でのヌル−ＬＯＸ−１オオムギ変異体Ｄ１１２の麦芽を用いたマッシング工程を包含する。
４回のマッシング工程の全ての試料アリコートを、１５分のマッシング工程の開始工程後の麦芽汁煮沸工程の後に回収し、次いで実施例６に記載のようにしてＴ２Ｎレベルを決定した。結果を図２３に要約する。
Ｔ２Ｎに著しい減少が、没食子酸オクチルの存在下でオオムギ品種Ｂａｒｋｅの麦芽を用いたマッシング工程の麦芽汁試料で、マッシング工程開始後に分析した試料および煮沸麦芽汁の試料の両方で観察した。両方の種類の麦芽の煮沸麦芽汁中のＴ２Ｎの濃度が同様のレベルに達したことは注目に値する。
要するに、マッシュにマッシングする工程中にＬＯＸ−１インヒビターの没食子酸オクチルを補足すると、Ｔ２Ｎのレベルの減少を特徴とする麦芽汁の新規の製造法が提供される。
（表１．原料変異体（Ｍ３世代）および後代（Ｍ４世代およびＭ５世代）の胚抽出物中の全ＬＯＸ活性）
（表２．作物学的性能の比較）
ａ０〜９の尺度（但し、０は感染または倒伏無しを表し、そして９は極端な感染または倒伏を表す）
ｂ２つの異なる場所での３回反復の相対平均収量
（表３．パイロット麦芽製造試験後の分析）
（表４．変異体Ｄ１１２の生成物中のＴ２Ｎの減少レベル）
（表５．香味に対するビール貯蔵の効果）
ａ評価の尺度−０：存在しない；１：弱い；２：目立つ程度；３：中程度；４：強い；５：極端。低い値が好ましい
ｂ評価の尺度は１〜５である；高い値が好ましい
ｎｄ＝測定されなかった。
（表６．標準オオムギおよび変異体Ｄ１１２の麦芽から製造したビール中のＴＨＡ）
（表７．市販ビール中のＴＨＡ）
（表８．ＬＢおよびＩＰＴＧ中で一晩増殖させた下記に示したベクターを有する細胞からの粗製細胞抽出物由来のリポキシゲナーゼ活性）
ａ結果は示した変数を有する４つの個々の測定の平均値として示す。
（表９．配列表）
（８．寄託情報）
Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ Ａ／Ｓ所有のオオムギ変異体Ｄ１１２（上記に開示しかつ添付の特許請求の範囲に列記した）の寄託は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０、ＵＳＡになされた。変異体Ｄ１１２の寄託の日は、２００３年９月１１日であり、本出願の出願日の前から、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ Ａ／Ｓでの寄託から採取された２，５００穀粒からなる。変異体Ａ６１８の寄託の日は、２００３年１０月１３日であり、本出願の出願日の前から、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ Ａ／Ｓでの寄託から採取された２，５００穀粒からなる。これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタベスト条約およびその規則（ブダベスト条約）の規定の下になされた。これは、寄託の日から３０年間の寄託物の生存培養物の保管を保障する。寄託は試料の生存の表示の提供を含む連邦法施行規則第３７巻１．８０１−１．８０９の要件の全てを満たすことが意図される。変異体Ｄ１１２については、ＡＴＣＣ受託番号はＰＴＡ−５４８７である。変異体Ａ６１８については、ＡＴＣＣ受託番号はＰＴＡ−５５８４である。寄託材料のアリコートは、ＡＴＣＣから、受託番号を特定することによって、そしてＡＴＣＣによって課され標準的な制限を受け入れることによって得ることができる。しかし、寄託の利用可能性は、政府の行為によって許可された特許権の減損において対象発明を実施するためのライセンスという性質ではないことが理解されるべきである。
本出願全体を通じて、種々の刊行物、特許および特許出願が参照される。これらの刊行物の開示は全体として、本発明が関係する技術の状態をより詳しく述べることを目的として、本出願明細書に参考として援用される。本発明の上記の説明は、例示および説明のための模範である。種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。従って、以下の特許請求の範囲は、このような改変を包含すると解釈されることが意図される。
（参考文献）
（特許文献）
（他の刊行物）
［配列表］

Claims (17)

  1. オオムギ植物もしくはその一部を使用するかまたは該オオムギ植物もしくはその一部またはこれらの混合物から調製された麦芽組成物を使用して調製される、麦芽汁組成物であって、該オオムギ植物は、完全機能喪失を生じるＬＯＸ−１遺伝子の変異を有し、該オオムギ植物のＬＯＸ−１をコードする遺伝子が、配列番号２の塩基番号３５７２−３５７４に対応するナンセンスコドン、または、配列番号６の塩基番号２３１１に対応するスプライス変異を含むが、但し、該オオムギ植物はイントロン５のスプライス供与部位にＧの変異を保有しない、麦芽汁組成物。
  2. 前記植物の一部が穀粒である、請求項１に記載の麦芽汁組成物。
  3. 前記組成物が酵素組成物または酵素混合組成物を使用して調製される、請求項１〜２のいずれか１項に記載の麦芽汁組成物。
  4. 前記オオムギ植物がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）寄託の受託番号ＰＴＡ−５４８７を有するＤ１１２と命名された植物およびその後代植物からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の麦芽汁組成物。
  5. 前記オオムギ植物がＡＴＣＣ寄託の受託番号ＰＴＡ−５５８４を有するＡ６１８と命名された植物およびその後代植物からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の麦芽汁組成物。
  6. 安定な感覚刺激品質を有する飲料であって、該飲料は、オオムギ植物もしくはその一部またはこれらの混合物を製造することによって得られ、該オオムギ植物は、完全機能喪失を生じるＬＯＸ−１遺伝子の変異を有し、該オオムギ植物のＬＯＸ−１をコードする遺伝子が、配列番号２の塩基番号３５７２−３５７４に対応するナンセンスコドン、または、配列番号６の塩基番号２３１１に対応するスプライス変異を含むが、但し、該オオムギ植物はイントロン５のスプライス供与部位にＧの変異を保有しない、飲料。
  7. 前記飲料がビールである、請求項６に記載の飲料。
  8. 前記飲料が前記オオムギ植物の穀粒から調製された麦芽を使用して調製される、請求項６〜７のいずれか１項に記載の飲料。
  9. 前記飲料が、前記オオムギ植物もしくはその一部から調製された麦芽汁組成物から調製されるか、または該オオムギ植物もしくはその一部から調製された麦芽組成物から調製される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の飲料。
  10. 前記飲料が麦芽化されていないオオムギ植物またはその一部から調製される、請求項６に記載の飲料。
  11. 前記飲料が非発酵飲料である、請求項６および８〜１０のいずれか１項に記載の飲料。
  12. 前記オオムギ植物がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）寄託の受託番号ＰＴＡ−５４８７を有するＤ１１２と命名された植物およびその後代植物からなる群より選択される、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の飲料。
  13. 前記オオムギ植物がＡＴＣＣ寄託の受託番号ＰＴＡ−５５８４を有するＡ６１８と命名された植物およびその後代植物からなる群より選択される、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の飲料。
  14. 前記飲料は、安定な感覚刺激品質を有し、そして、該飲料内の９，１０，１３−トリヒドロキシオクタデセン酸に対する９，１２，１３−トリヒドロキシオクタデセン酸の比率が多くても１．８である、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の飲料。
  15. 前記飲料は、４〜６ｐｐｍの範囲内の亜硫酸塩の存在下で３７℃にて４週間のインキュベーションの後に、多くても０．０５ｐｐｂの遊離トランス−２−ノネナール（Ｔ２Ｎ）を含有する、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の飲料。
  16. オオムギ植物もしくはまたはその一部から製造される、植物製品であって、該オオムギ植物は、完全機能喪失を生じるＬＯＸ−１遺伝子の変異を有し、該オオムギ植物のＬＯＸ−１をコードする遺伝子が、配列番号２の塩基番号３５７２−３５７４に対応するナンセンスコドン、または、配列番号６の塩基番号２３１１に対応するスプライス変異を含むが、但し、該オオムギ植物はイントロン５のスプライス供与部位にＧの変異を保有しない、植物製品。
  17. 明細書中に記載の発明。
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