BRPI0508554B1

BRPI0508554B1 - Bebida à base de planta de cevada que apresenta mutação no gene lox-1, bem como métodos para produzir bebida com qualidades organolépticas estáveis, composição de malte sem atividade de lox-1 e planta de cevada que apresenta mutação no gene lox-1

Info

Publication number: BRPI0508554B1
Application number: BRPI0508554-3A
Authority: BR
Inventors: Klaus Breddam; Ole Olsen; Birgitte Skadhauge; Finn Lok; Soren Knudsen; Lene Molskov Bech
Original assignee: Carlsberg A/S
Priority date: 2004-03-11
Filing date: 2005-03-09
Publication date: 2022-04-19
Also published as: EP1727905B1; US20050204437A1; UA89632C2; WO2005087934A3; AR087480A2; AU2005221763B2; AU2005221763C1; US20090029000A1; EP2290089A2; WO2005087934A2; CA2558815A1; US7420105B2; EA014705B1; AU2005221763A1; JP2007527721A; US20110195151A1; NZ550204A; US7838053B2; EP1727905A2; CN1981041A

Abstract

CEVADA PARA A PRODUÇÃO DE BEBIDA COM SABOR ESTÁVEL De acordo com a invenção, fornece-se cevada isenta de LOX-1 e produtos vegetais produzidos a partir dela, tal como malte fabricado usando grãos de cevada defeituosos na síntese da enzima conversora de ácidos graxos, lipoxigenase-1. A dita enzima é responsável pela principal atividade relacionada à conversão de ácido linoléico em ácido 9-hidroperoxi-octadecadienóico, um metabólito da via de lipoxigenase, o qual, através de reações enzimáticas ou espontâneas adicionais, pode levar ao aparecimento de trans-2-nonenal. A invenção permite que os cervejeiros produzam cerveja isenta de desvios de sabor específicos, detectáveis, de 2-nonenal, mesmo depois de estocagem prolongada da bebida.

Description

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à biotecnologia vegetal, descrevendo cevada e malte com defeito na síntese da enzima lipoxigenase (LOX) LOX-1, fornecendo assim uma nova matéria-prima para uso industrial. Por exemplo, a dita matéria-prima pode ser usada para fabricar uma nova cerveja com sabor estável distinto, não tendo qualquer quantidade ou tendo quantidades desprezíveis do composto de desvio de sabor trans-2-nonenal (T2N). O dito T2N é formado pela ação seqüencial de enzimas da via de LOX, onde LOX-1 representa a atividade primária, conferindo dioxigenação do ácido lino- léico, para produzir ácido 9-hidroperoxi-octadecadie-nóico (9-HPODE). Os produtos de cevada e malte da invenção não apresentam qualquer quantidade ou apresentam quantidades desprezíveis de 9-HPODE. Além disso, a invenção refere-se a bebidas produzidas usando a dita cevada e/ou malte.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Uma das metas de pesquisas relacionadas à produção moderna de cervejas é determinar os fatores moleculares para a qualidade e a estabilidade de cervejas. Uma grande fração da cerveja é produzida à base de cevada (Hordeum vulgare, L.). Ela é uma planta monocotilédone de colheita cultivada em muitas partes do mundo, não somente devido à sua importância econômica como uma fonte de produtos industriais, tal como cerveja, mas também como uma fonte de ração animal. Os Estados Unidos da América do Norte são agora um dos maiores produtores de cevada para maltagem, tendo cerca de 13% da safra mundial; Canadá, Austrália e a Europa em conjunto representam cerca de 70% da produção mundial (Bios Intern., 2001).

Um esforço contínuo dos melhoristas de cevada é 5 desenvolver cultivares estáveis com alto rendimento, que são rentáveis em termos agronômicos. Para atingir esta meta, as tentativas incluíram mutagênese aleatória por tratamento químico ou irradiação para modificar os traços de interesse, como por exemplo, para alterar a expressão de genes 10 específicos que podem ser feitos prejudiciais sobre o crescimento da planta e a produtividade da safra em geral, mas também sobre traços que conferem mais qualidade a um produto fabricado a partir da cultura. Está bem estabelecido que a azida sódica, NaN3, é um produto químico útil para 15 mutagenizar a cevada. Especificamente, a mutagênese derivada com NaN3 foi usada para induzir alterações genéticas na cevada, a fim de gerar mutantes bloqueados na síntese de antocianinas e pró-antocianidinas (von Wettstein et al., 1977; von Wettstein et al., 1985; Jende-Strid, 1991; Jende- 20 Strid, 1993; Olsen et al., 1993). Um segundo exemplo refere- se a grãos de cevada mutagenizados com NaN3 para triar quanto a altos níveis de fosfato livre, com o objetivo de identificar mutantes com baixo teor de fitato (Rasmussen e Hatzak, 1998); um total de 10 mutantes entre 2.000 grãos 25 triados foram identificados. Embora uma grande desvantagem na genética da cevada tenha sido a incapacidade de estudar especificamente a função gênica através de genética reversa, triagens genéticas anversas, como por exemplo, após muta- gênese induzida por NaN3, continuam atentando para melhoramentos referentes a parâmetros nutricionais e qualidade do produto de cevada e malte.

Exceto de uma maneira grosseira e genérica, um cruzador nâo consegue prever o resultado de novas linhagens de plantas em desenvolvimento em um processo convencional de cruzamento de plantas. Esta imprevisibilidade é causada principalmente pela falta de controle no nivel celular, mais especificamente no nivel do DNA nuclear, cuja complexidade é enorme. Inúmeros outros fatores influenciam o resultado de um processo de cruzamento de plantas, como por exemplo, o clima e a qualidade do solo na localização geográfica da propagação da planta. Como resultado, diferentes cruzadores de cevada que usam técnicas convencionais nunca desenvol-verão plantas com traços idênticos. No processo de cruza-mento convencional, uma tarefa mais difícil é a identi-ficação de plantas que são geneticamente aprimoradas, não apenas com relação ao traço de interesse, mas também com relação a questões fisiológicas de relevância para o crescimento da planta. 0 processo de seleção é particular-mente difícil quando outros traços embaraçadores mascaram o traço de interesse. Quando os procedimentos atuais do cruza-mento de plantas incluem determinação da seqüência do DNA do gene mutado, ela é em um estágio tardio do programa de cruzamento, isto é, depois da caracterização do mutante, como descrito recentomente, por exemplo, para a triagem de mutações quimicamente induzidas em Arabidopsis e outras plantas (Colbert et al., 2003).

Até agora, a criação de mutações com perda de função indexadas aos genes em uma escala de genoma total foi relatada para a levedura Saccharomyces cerevisiae (Giaever et al., 2002). Para a planta Arabídopsis, 21.700 dos -29.454 genes previstos foram inativados pela inserção de sequências de T-DNA de Agrobacterlum (Alonso et al., 2003).

Até agora, não é incomum que um processo de cruzamento convencional a partir da primeira mutagênese ou cruzamento para comercializar plantas ou sementes leva mais de 10 anos. Especificamente, seria excelente fornecer ao cruzador de plantas métodos para detectar mutações no gene relacionadas ao traço de interesse. Tais melhoramentos aumentariam o nivel de previsibilidade em programas de cruzamento, especialmente quando a seleção de mutantes é direcionada para ter mutações nonsense na parte codificadora da proteína do gene de interesse. Em outros casos, pode ser preferível também, por exemplo, no caso de identificação precoce de mutações do DNA, cancelar cruzamentos adicionais com linhagens caracterizadas por mutações dos promotores no gene de interesse ou quando outras mutações do DNA influenciam a expressão, simplesmente porque fatores ambientais ou fisiológicos poderiam conferir reversão do traço induzido pelo mutágeno. Consequentemente, há uma demanda para encontrar maneiras alternativas para detectar mutações de interesse precocemente no programa de cruzamento. Isto deve tornar o processo de cruzamento inteiro mais rápido e economicamente de interesse mais elevado, maximizando assim a quantidade de grãos produzidos na terra.

Uma grande proporção da cevada produzida compreende variedades para maltagem, cujos grãos são convertidos em malte através de processos com maceração, germinação e secagem controladas da cevada. Uma pequena proporção do malte é usada como ingrediente na indústria alimentícia, enquanto que a maior parte do malte é usada subsequentemente como ingrediente principal na produção de bebidas derivadas de malte, incluindo, porém sem limitações, cerveja e whisky. Na cervejaria, o malte moido é submetido a um processo de empastamento que compreende um aumento escalonado na tempe-ratura de uma suspensão de malte em água, que proporciona degradação enzimática parcial e extração, por exemplo, de polimeros dos grãos, amido e β-glicano. Após a filtração, a pasta aquosa é fervida com lúpulo para produzir o mosto. O dito mosto é subsequentemente fermentado com levedura, dando o produto cervejeiro que, após maturação, é engarrafado. O mosto pode ser usado também para a produção de bebidas não- fermentadas de malte.

A estabilidade da palatabilidade e do sabor de uma bebida é um fator importante de relevância para a composição de cevada e malte. Por isso é que moléculas de sabor naturais derivadas da dita cevada e malte, ou geradas pela ação de enzimas extraídas da dita cevada e malte, podem conferir características indesejáveis de sabor ao produto final (Drost et a_Z., 1990). A este respeito, a formação do composto volátil que dá um sabor semelhante a papelão parece ser de particular interesse bioquimico bem como econômico especifico. Em 1970, a molécula responsável pelo sabor semelhante a papelão foi isolada e identificada como T2N, um alquenal com nove carbonos (Cg) (Jamieson e Gheluwe, 1970) . Como o nivel-limite de sabor para T2N em humanos é extremamente baixo, determinado anteriormente como sendo ao redor de 0,7 nM ou 0,1 ppb (Meilgaard, 1975), os produtos com niveis mesmo diminutos do aldeido são considerados como estando envelhecido devido ao desvio de sabor do produto. Além disso, a liberação de T2N a partir dos adutos de T2N em decomposição durante a estocagem da cerveja pode causar deterioração do produto (Nyborg et al., 1999).

Estudos de marcação radioativa com tecido vegetal estabeleceram que nonenais são derivados do ácido graxo de Cie, ácido linolênico (Grosch e Schwartz, 1971; Phillips e Gaillard, 1978). Estas e inúmeras observações subseqüentes, como resumido, por exemplo, por Tijet et al. (2001), Noordermeer et al. (2001), e Matsui et al. (2003), foram interpretadas como evidência de que T2N é formado pela ação seqüencial de enzimas especificas da via de LOX, sendo que a ação de LOX representa uma etapa enzimática precoce. Consistentemente com esta noção, Kurodo et al. (2003) desco-briram que o malte contém um fator enzimático termoestável que é necessário para a transformação dos produtos fabri-cados por LOX em T2N.

O grão de cevada contém três enzimas LOX conhecidas como LOX-1, LOX-2 e LOX-3 (van Mechelen et al. , 1999). Embora LOX-1 catalise a formação de 9-HPODE, um precursor de T2N, e também de ácidos triidróxi-octadecenóicos (abreviados "THOEs" ou simplesmente "THAs"), a partir do ácido lino-léico, LOX-2 catalisa a conversão do ácido linoléico em 13- HPODE que é metabolizado adicionalmente para hexanal (Figura 1B) , um aldeido de C6 com um nivel-limite de sabor ao redor de 0,4 ppm (Meilgaard, supra). Embora a especificidade por produto de LOX-3 permaneça indefinível, o nível de expressa muito baixo do gene correspondente, como indicado por Mechelen et al, (supra), sugere que sua contribuição para a formação de T2N é desprezível. Uma pesquisa está em andamento para determinar se a atividade de LOXs é a única fonte enzimática para a geração de precursores hidrope- róxidos do ácido linoléico de relevância para a formação de desvios de sabor específicos de T2N, ou se o processo de auto-oxidação de ácidos graxos também contribui. É percep-tível que os hidroperóxidos de Ci8 podem ser convertidos adicionalmente por mais do que sete famílias diferentes de enzimas vegetais e animais, sendo todas a reações denomi-nadas coletivamente via de LOXs (Feussner e Wastermack, 2002); esta via é referida também como a via de oxilipinas. As oxilipinas, como seu nome infere, são moléculas oxigenadas derivadas de lipídeos, que resultam da oxigenação da oxigenação de ácidos graxos insaturados por intermédio da reação de LOX, e incluem também quaisquer moléculas derivadas de tais moléculas oxigenadas.

Os grãos de cevada e as plantas de cevada, que têm uma proteína LOX-1 caracterizada por atividade reduzida, foram descritos no pedido de patente PCT h- PCT/IB01/00207, publicado como documento n'2 WO 02/053721 Al, expedido para Do uma et al. Entretanto, o dito pedido de patente não enuncia a geração e a análise de grãos de cevada com a enzima LOX-1 inativa.

Vários exemplos de plantas mutadas que sintetizam baixos niveis de LOX são conhecidos. Por exemplo, três linhagens de soja foram identificadas no início da década de 80, cada uma deficiente em uma das três enzimas LOX na semente de soja madura: (i) LOX-1 - Embora a base molecular da mutação isenta de LOX-1 permaneça incerta, ela se correlaciona com a ausência do RNAm maduro correspondente (Hildebrandt e Hymowitz, 1982; Start et al., 1986); (ii) LOX-2 - Os transcritos para o gene mutado foram detectados, e foi observada uma única mudança de base, que transfere um ligante de histidina para o ferro do sítio ativo, levando á instabilidade da enzima (Davies e Nielsen, 1986; Wang et al., 1994); (iii) LOX-3 - Mutantes isentos de LOX-3 não apre-sentaram quaisquer níveis detectáveis do transcrito corres-pondente, provavelmente como conseqüência de elementos atua- dores em cis no promotor gênico (Kitamura et al., 1983; Wang et al., 1995).

Na semente de ervilha, foi encontrada uma linhagem isenta de LOX-2 que demonstrou carregar um defeito que leva à ausência da maior parte da proteína de LOX-2 (Forster et al., 1999). Como esta linhagem apresentava um grande decréscimo na quantidade do RNAm de LOX-2, sugeriu-se que a mutação causou uma redução dramática na estabilidade do RN Am.

No arroz, a triagem por "immunoblot" de extratos revelou a presença de dois cultivares naturais, Daw Dam e CI-115, cada um com falta de uma das três enzimas LOX (Ramezanzadeh et al., 1999). Determinou-se que a quantidade de hexanal, pentanal, e pentanol no arroz normal com todas três LOXs era acentuadamente induzida durante a estocagem, enquanto que em Daw Dam e CI-115 ela foi reduzida para a faixa entre 66% e 80%. Apesar de os resultados sugerirem que a ausência de enzimas LOX nos grãos de arroz minora a deterioração oxidante, os determinantes moleculares que conferem as características de menos LOX de Daw Dam e CI-115 permanecem indefinidos.

A depleção transgênica mediada por antisense e também mediada por co-supressão de genes de LOX provou ser útil para elucidar a função de enzimas LOX especificas e seus produtos correspondentes na sinalização de defesa da planta. Em Arabidopsis, por exemplo, a depleção de uma enzima LOX levou a uma redução no acúmulo de ácido jasmônico induzido por ferida (Bell et al.t 1995). Além disso, a depleção mediada por antisense de um gene que codifica LOX estabeleceu o envolvimento da enzima correspondente no traço de incompatibilidade de uma planta de tabaco resistente a um patógeno fúngico (Rancé et al., 1998). Um terceiro exemplo, no qual abordagens transgênicas foram usadas para elucidar as funções de LOXs, refere-se ao papel de uma LOX de batata, designada LOX-H1, no crescimento e desenvolvimento de plantas de batata (León et al, 2002). Demonstrou-se que a depleçâo de LOX-H1 resultou em uma redução acentuada de aldeídos Cc alifáticos voláteis, compostos envolvidos em respostas defensivas da planta e atuantes como moléculas sinalizadoras para a expressão gênica induzida por feridas ou como substâncias antimicrobianas. Um estudo adicional indicou que as plantas de batata transgênicas, depletadas na expressão de um gene de uma enzima LOX, apresentaram desen-volvimento anormal do tubérculo (Kolomiets et al., 2001). Entretanto, as oxilipinas específicas, que eram responsáveis pelo fenótipo do tubérculo não foram identificadas. Em outro estudo, a depleçâo, mediada por antisense, de LOX-H3 de batata, suprimiu a resposta defensiva induzível da planta, concomitantemente com um rendimento maior do tubérculo (Royo et al., 1999). Coletivamente, estes dados sugerem que a expressão de genes que codificam enzimas LOX é importante no desenvolvimento da planta, possivelmente com algumas enzimas LOX desempenhando um papel defensivo contra patógenos, enquanto que outras enzimas LOX geram produtos que podem atuar para regular o desenvolvimento celular.

É também de importância assinalar que os frutos de tomate com níveis reduzidos de 2 a 20% de duas enzimas LOX não apresentaram quaisquer mudanças significativas nos voláteis do sabor, quando comparados com frutos do tipo selvagem (Griffith set al., 1999). Esta descoberta sugere que níveis muito baixos de LOX são suficientes para a geração de aldeídos e álcoois, ou que outras enzimas LOX são ativas na geração desses compostos.

As enzimas oxidantes são de crescente preocupação para a indústria de alimentos e bebidas por causa do seu efeito sobre aspectos importantes relacionados ao sabor e cor dos produtos derivados de plantas. A este respeito, as LOXs são de interesse em virtude da sua capacidade de induzir a formação de radicais livres, que podem então atacar outros constituintes tais como vitaminas, cores, compostos fenó- licos, proteínas, etc. Deve-se assinalar que alguns radicais livres são tidos como tendo um papel na auto-oxidação dos ácidos graxos. Algumas substâncias geradoras de radicais livres podem suportar o processamento térmico, e assim sendo, permanecer suficientemente ativas nos alimentos processados, para iniciar mudanças na qualidade durante a estocagem do produto.

Antioxidantes são amplamente utilizados como ini-bidores de LOXs, alguns dos quais inibem também a auto- oxidação de substratos de LOX. Entretanto, nenhum inibidor de LOX, útil como aditivo para melhorar o sabor de bebidas, foi identificado.

O papel de enzimas LOX está relacionado também a questões fora do campo de fabricação de cerveja, tal como a geração de hidroperoxiácidos graxos, catalisada por LOX, que inibem a formação de micotoxinas em plantas suscetíveis à contaminação fúngica, como descrito, por exemplo, na patente n US 5.942.661, expedida para Keller. Embora o papel de enzimas LOX da defesa de plantas e respostas a feridas permaneça menos claro, as enzimas são induzidas após ferida e incitação por patógenos (Bell e Mullet, 1991; Bell e Mullet, 1993; Mela net al., 1993; Sarvitz e Sledow, 1996). 0 papel das enzimas LOX em feridas e defesa da planta poderia ser a produção de hidroperóxidos de ácidos graxos reativos contra patógenos (Rogers et al., 1998). Alternativamente, as LOXs podem ser induzidas por tensões, para produzir moléculas sinalizadoras, tal como jasmonato de metila (Bell et al., supra).

Foram também descritas estratégias nas quais 13- HPODE, produzido pela ação de uma enzima LOX, atua como um substrato para enzimas conversoras de hidroperóxidos, para produzir aldeídos ativos no sabor (Noordermeer et al., 2002; Husson e Belin, 2002). Processos similares estão descritos em inúmeras patentes, como por exemplo, na patente n- US 6.150.145, expedida para Hãusler et al., e na patente n£ US 6.274.358, expedida para Holtz et al.

Além disso, as enzimas LOX demonstraram contribuir para vários efeitos benéficos na fabricação de pão (Casey, 1997). Entretanto, a patente n- US 6.355.862 Bl, expedida para Handa e Kausch, descreve que a qualidade do fruto pode ser melhorada inibindo a produção de LOX, produzindo uma validade mais longa do produto.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Assim sendo, existe uma necessidade não atendida para se obter plantas de cevada com essencialmente nenhuma atividade de LOX-1 porque as bebidas preparadas a partir de tais plantas terão níveis muito baixos de T2N. Além disso, a presente invenção revela que as bebidas preparadas a partir de tais plantas terão níveis muito baixos de 9,12,13-THOE.

Além disso, tais plantas podem ser úteis para outros propósitos. Surpreendentemente, a presente invenção descreve métodos para preparar plantas de cevada com nenhuma ou muito pouca atividade de LOX-1. Particularmente, a invenção des-creve mutações nulas no gene para LOX-1. Os benefícios esperados da invenção incluem uma eliminação total de T2N da ramificação correspondente da via de LOXs, e a invenção fornece ainda uma maneira excelente para controlar os niveis de T2N no grão de cevada; e a cerveja produzida a partir destes grãos apresenta estabilidade excepcional do sabor depois de estocagem prolongada, mesmo em temperaturas ele-vadas .

O interessante é que a presente invenção fornece também métodos para a detecção precoce de mutações, e assim sendo, as desvantagens da caracterização tardia de mutantes foram solucionadas pela presente invenção. Esta solução faz uso de um novo procedimento interessante para gerar cultivares melhorados de cevada para maltagem, introduzindo o uso seqüencial da caracterização de fenótipos e determinação da seqüência do DNA de genes-alvo em uma população mutante em qualquer ponto precoce no processo de cruzamento. As plantas isoladas podem ser melhoradas ainda mais usando uma série de métodos de cruzamento de plantas.

A presente invenção resolve os problemas, limi-tações e desvantagens atuais relacionadas à presença da enzima LOX-1 em cevada. Em primeiro lugar, esta invenção fornece um método inovador eficiente de triagem, que reduz significativamente o tempo e o labor para triar cevada quimicamente mutagenizada. Em segundo lugar, a presente invenção inclui cevadas inusitadas isentas de LOX-1, úteis, por exemplo, na produção de cerveja com sabor estável.

O fundamento teórico para mutantes de LOXs vegetais, como descrito acima, refere-se a plantas que têm niveis reduzidos da atividade de LOXs. Em contraste, a presente invenção supera as limitações e desvantagens rela-cionadas à atividade baixa ou residual, proporcionando maneiras para gerar eficazmente plantas de cevada isentas de LOX-1. As diferenças especificas incluem: (i) Em contraste com as plantas de cevada descritas no pedido de patente PCT n2 PCT/IB01/00207, publicado como documento n2 WO 02/053721A1, expedido para Douma et al., as plantas da presente invenção compreendem essencialmente nenhuma atividade de LOX-1, e de preferência, as plantas são plantas isentas de LOX-1 verdadeiras, isto é, as plantas apresentam uma total falta da função da proteina LOX-1; (ii) O traço de verdadeira nulidade de LOX-1 aqui descrito poderia ser identificado triando quanto ,à presença de uma mutação nonsense no gene correspondente. Consequentemente, as plantas de cevada homozigóticas para esse traço seriam bloqueadas completamente na sintese da enzima ativa - independentemente das condições de cresci-mento ou efeitos ambientais. Esta é uma propriedade ideal nas técnicas de cruzamento de plantas e contrasta com o resultado de um possível cenário molecular nos mutantes em LOX de soja das técnicas anteriores, onde as condições bióticas ou abióticas poderiam afetar mudanças no estado fisiológico das células que conferem estabilização do RNAm com subsequente translação de LOX; (iii) Quando o traço de relevância em mutantes de LOX de soja e arroz compreendia níveis reduzidos do composto com odor intenso, hexanal, em um alimento básico, a presente invenção refere-se a níveis mais baixos do composto específico de sabor T2N em uma bebida, bem como níveis mais baixos de 9,12,13-THOE em uma bebida; (iv) Os mutantes em LOX de soja e arroz são afetados em moléculas da via de LOX a jusante de 13-HPODE, enquanto que o traço de nulidade de LOX refere-se à ramifi-cação da via de LOXs que compreende moléculas a jusante de 9-HPODE; (v) Embora os mutantes de soja compreendam mutações induzidas por irradiação nos genes para LOX, e Daw Dam e CI-115 representem cultivares de ocorrência natural selecionados de linhagens de cruzamentos de arroz, as mutações em plantas de cevada, que têm o traço de nulidade de LOX-1, foram induzidas pelo produto químico NaNj.

Assim sendo, é um objetivo da presente invenção fornecer plantas de cevada, ou partes ou fragmentos delas, que compreendem menos do que 5%, de preferência menos do que 1% da atividade de LOX-1 de uma planta de cevada do tipo selvagem.

É um segundo objetivo da invenção fornecer grãos de uma planta de cevada que compreende menos do que 5%, de preferência menos do que 1% da atividade de LOX-1 de uma planta do tipo selvagem.

Um terceiro objetivo da presente invenção é forne-cer composições que compreendem uma planta de cevada, ou partes ou fragmentos dela, compreendendo menos do que 5%, de preferência menos do que 1% da atividade de LOX-1 de uma planta de cevada do tipo selvagem.

É um outro objetivo da presente invenção fornecer composições de malte que compreendem uma planta de cevada processada, compreendendo menos do que 5%, de preferência menos do que 1% da atividade de LOX-1 de uma planta de cevada do tipo selvagem. As composições de malte podem ser, de preferência, composições de malte puras. Entretanto, as composições de malte podem ser também, por exemplo, mesclas de cevada e malte.

É também um objetivo da presente invenção fornecer bebidas que têm qualidades organolépticas estáveis, onde tais bebidas são fabricadas usando a planta de cevada da invenção ou parte dela. Particularmente, prefere-se que as ditas bebidas sejam fabricadas usando a composição de malte, tal como uma composição de malte pura ou uma mescla de cevada e malte, aqui descrita acima. Em uma modalidade pre-ferida da invenção, as ditas bebidas consistem em cerveja.

É um objetivo adicional da invenção fornecer uma bebida que tem qualidades organolépticas estáveis, onde a dita bebida é fabricada usando uma planta de cevada, e onde a razão de ácido 9,12,13-triidróxi-octadecenóico (aqui abre-viado 9,12,13-THOE ou apenas 9, 12, 13-THA) para ácido 9,10,13-triidróxi—octadecenóico (aqui abreviado 9,10,13- THOE ou apenas 9, 10,13-THA) dentro da dita bebida é no máximo 1,8. De preferência, a dita bebida é cerveja.

Além disso, um objetivo da invenção é fornecer composições, tais como composições de alimentos, composições de rações, ou composições de matéria-prima de fragrâncias, que compreendem a planta de cevada de acordo com a invenção ou partes dela.

Além disso, é um objetivo da presente invenção fornecer métodos para expressar uma proteína recombinante em uma planta de cevada de acordo com a invenção, onde o dito método compreende transformar a dita planta com uma seqüência de ácidos nucléicos que compreende, como componentes ligados operacionalmente, um promotor expressável em plantas de cevada ou partes delas, uma seqüência de DNA que codifica a dita proteína recombinante, e uma região de terminação transcricional, expressando desta forma a dita proteína recombinante na dita planta de cevada.

Além disso, um objetivo da presente invenção é fornecer métodos para reduzir os níveis de uma proteína em uma planta de cevada da invenção, onde o dito método inclui transformar a dita planta com uma seqüência de ácidos nucléicos que compreende, como componentes ligados operacio-nalmente, um promotor expressável em plantas de cevada ou partes delas, uma seqüência de DNA, e uma região de termi-nação transcricional, onde a expressão da dita seqüência de DNA reduz a expressão de um gene que codifica a dita proteína por antisense, ou co-supressão ou interferência de RN A.

Um objetivo adicional da presente invenção é fornecer métodos para preparar uma planta de cevada que compreende menos do que 5%, de preferência menos do que 1% da atividade de LOX-1 de uma planta de cevada do tipo selvagem, método este que compreende as etapas de: (i) determinar a atividade de LOX-1 em grãos de cevada do tipo selvagem ou partes deles; e (ii) mutagenizar plantas de cevada, e/ou grãos de cevada, e/ou embriões de cevada, e/ou células de cevada e/ou tecido de cevada, obtendo desta forma cevada da geração MO; e (iii) criar as ditas plantas, grãos, células, tecido e/ou embriões de cevada mutagenizada, por pelo menos 2 gerações, obtendo desta forma plantas de cevada da geração Mx, onde x é um número inteiro 22; e (iv) obter grãos ou partes deles a partir das ditas plantas de cevada da geração Mx; e (v) determinar a atividade de LOX-1 nos ditos grãos ou partes deles; e (vi) selecionar plantas nas quais a atividade de LOX-1 dos grãos mutagenizados ou partes deles é menos de 5% da atividade de LOX-1 dos grãos do tipo selvagem ou partes deles, obtendo desta forma uma planta de cevada que compreende menos do que 5% da atividade de LOX-1 de uma planta de cevada do tipo selvagem.

Além disso, é um objetivo da presente invenção fornecer métodos para produzir uma bebida que tem qualidades organolépticas estáveis, compreendendo as etapas de: (i) disponibilizar uma composição de malte de acordo com a invenção; (ii) processar a dita composição de malte para dar uma bebida; obtendo desta forma uma bebida com qualidades organolépticas estáveis.

É um obj etivo adicional da presente invenção for-necer métodos para produzir uma composição de malte com baixa atividade de LOX-1, compreendendo as etapas de: (i) disponibilizar grãos de acordo com a invenção; (ii) macerar os ditos grãos; (iii)germinar os grãos macerados sob condições predeterminadas; (iv) tratar os grãos germinados com calor; produzindo desta forma uma composição de malte com baixa ou nenhuma atividade de LOX-1.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção baseia-se no resultado imprevisto de estudos funcionais do mutante de cevada Dl 12 (aqui referido também como "mutante D112" ou "cevada D112") , que revelou uma perde de função total com relação à principal enzima formadora de 9-HPODE, LOX-1. Foi uma descoberta surpreendente detectar uma distribuição de 10%:90% de 9-HPODE:13-HPODE em ensaios bio-químicos desenhados para determinar o perfil do produto após a conversão de ácido linoléico catalisada com LOX. Dado o baixo limite de sabor de T2N extremamente baixo, foi ainda mais surpreendente que a degradação de 9-HPODE residual e similares em grãos do mutante D112 causasse apenas uma liberação muito baixa de T2N - bem abaixo do nível limite de sabor - durante o envelhecimento de produtos de cerveja fabricados a partir do malte dos ditos grãos.

O exame dos resultados dessas análises, usando grãos do tipo selvagem e isentos de LOX-1, fornece uma evidência clara que a alta atividade de LOX-1 pode intensi-ficar o gosto cediço de papelão de T2N, confirmando assim um papel importante da via de LOXs no controle da formação do alquenal. Esta conclusão contrasta com a noção de Liégeois et al. (supra) que sugeriram que a atividade de LOX contribui apenas com uma pequena fração das moléculas precursoras de T2N.

O traço de nulidade de LOX-1 pode ser introduzido em qualquer planta de cevada, tais como as variedades de cevada estabelecidas, como, por exemplo, as variedades de cevada de maltagem estabelecidas, permitindo assim a produção de bebidas com sabor estável e prazos de validade prolongados. Isto pode ser realizado, por exemplo, por métodos de cruzamento convencionais bem conhecidos pelos versados nessas técnicas. Esta abordagem não será apenas independente da região geográfica onde a cevada derivada do mutante Dl 12 é cultivada, mas será independente também do local onde a cerveja derivada do mutante Dl12 é produzida e comercializada para os consumidores. As plantas de cevada do mutante Dl12, ou as plantas derivadas delas, são potencialmente um fator econômico importante para os fazendeiros que cultivam a cultura e para as cervejarias que a usam como uma matéria-prima para a produção de cerveja ou para a produção de outras bebidas baseadas em cevada. Outras aplicações que dependem de matérias-primas sem atividades formadoras de 9- HPODE/9-HPOTE também são previstas para se beneficiarem das propriedades do mutante D112 de cevada.

De acordo com uma modalidade da invenção, fornece- se vários mutantes inusitados de cevada para maltagem, como por exemplo, o mutante D112 de cevada, ou o mutante A618 de cevada (aqui referido também como "mutante A618" ou "cevada A618"). A presente invenção refere-se, portanto, aos grãos dos mutantes D112 ou A618 de cevada, às plantas D112 ou A618 de cevada e métodos para produzir uma planta de cevada derivada a partir do cruzamento dos mutantes de cevada Dl12 ou A618 com si próprios ou outra linhagem de cevada. Além disso, a presente invenção compreende variantes isentas de LOX-1, geradas por mutagênese ou transformação dos mutantes de cevada D112 ou 618. Assim sendo, todas plantas produzidas usando os mutantes de cevada D112 ou A618 - ou um derivado deles - como uma planta parental, estão dentro do âmbito desta invenção.

Em outro aspecto, a invenção fornece células rege-neráveis para uso em cultura de tecido da planta mutante de cevada D112 ou A618. A cultura de tecido deve ser, de preferência, usada para a regeneração de plantas que têm as características das plantas de cevada precedentes, incluindo características morfológicas e genéticas. As células regene-radas em tais culturas de tecidos devem ser embriões, protoplastos, células meristemáticas, calos, pólen, anteras, etc. Deve-se entender que a presente invenção fornece plantas de cevada regeneradas a partir das culturas de tecidos da invenção.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção compreende o malte derivado de grãos de cevada isentos de LOX-1. A presente invenção refere-se também a composições de mosto preparadas a partir de plantas de cevada isentas de LOX-1, ou de partes delas, ou a partir de composições de malte preparadas a partir de tais plantas de cevada.

A invenção compreende ainda bebidas, tais como cervejas, fabricadas usando os grãos de cevada isentos de LOX-1 da presente invenção ou o malte derivado dos ditos grãos.

Além disso, a invenção refere-se a um produto vegetal produzido a partir de uma planta de cevada isenta de LOX-1, ou de partes dela. 0 dito produto vegetal pode ser qualquer produto resultante do processamento da dita planta de cevada ou parte dela. De preferência, o dito produto vegetal é selecionado no grupo que consiste em malte, mosto, bebidas fermentadas tais como cerveja, bebidas não- fermentadas, produtos alimentícios tais como farinha de cevada e produtos para rações.

É também um objeto da invenção fornecer grãos de cevada isentos de LOX-1 que apresentam níveis de resistência a doenças tais que são indistinguíveis de plantas de cevada do tipo selvagem, ou têm mesmo melhor resistência a doenças.

Além disso, a invenção compreende grãos de cevada isentos de LOX-1 e o malte derivado dos ditos grãos, onde os grãos e também o malte apresentam níveis reduzidos de micotoxinas.

Além disso, a presente invenção compreende varie-dades de cevada isentas de LOX-1, com melhor resistência a doenças em relação a plantas do tipo selvagem. Além disso, são descritas plantas de cevada isentas de LOX-1, que têm resistência reduzida a doenças em relação às plantas do tipo selvagem, desde que outras características das ditas plantas proporcionem benefícios que são mais importantes do que a propriedade de menor resistência a doenças.

Além disso, a presente invenção fornece plantas transgênicas dos mutantes de cevada D112 ou A618, ou plantas derivadas delas, onde os gene ou genes introduzidos conferem traços tais como resistência herbicidas, resistência a insetos, resistência a doenças bacterianas, fúngicas ou virais, melhor qualidade nutricional, e uso industrial. 0 gene pode ser um gene endógeno de cevada ou, alternati-vamente, um transgene introduzido através de técnicas de engenharia genética.

Finalmente, a presente invenção fornece métodos para reduzir a atividade de LOX-1 pelo uso de inibidores de LOX-1. Produtos vegetais, ou produtos derivados de plantas, incluindo bebidas e cerveja, obtidos pelos ditos métodos podem ter propriedades similares àquelas dos produtos preparados a partir da cevada isenta de LOX-1 como matéria- prima .

Estas e outras características, aspectos e vanta-gens da presente invenção serão mais bem compreendidas quando relacionadas às definições, descrições, exemplos, reivindicações apensadas, que se seguem, bem como as listagens de sequências e desenhos que as acompanham.

Definições

Na descrição, figuras e tabelas que se seguem, inúmeros termos são usados. Para entender melhor as especi-ficações e as reivindicações, incluindo o sentido a ser inferido a tais termos, são fornecidas as seguintes defini-ções : Como aqui utilizado, o artigo "um" pode significar um ou mais, dependendo do contexto no qual ele é utilizado.

O termo "traço agronômico" descreve um traço fenotipico de uma planta, que contribui para o desempenho ou valor econômico da dita planta. Tais traços incluem resis-tência a doenças, resistência a insetos, resistência a vírus, resistência a nematódeos, tolerância à estiagem, tolerância à alta salinidade, rendimento, estatura da planta, dias para maturação, classificação dos grãos (isto é, fracionamento dos grãos por tamanho), teor de nitrogênio dos grãos, e similares.

O termo "seqüência de nucleotídeos antisense" significa uma seqüência que tem uma orientação inversa à orientação de codificação normal de 5' para 3' dessa seqüência de nucleotídeos. Quando presente em uma célula vegetal, a seqüência de DNA antisense, de preferência, impede a expressão normal da seqüência de nucleotideos para o gene endógeno, e pode romper a produção da proteína nativa correspondente.

O termo "cevada com relação ao processo de fabricar cerveja, particularmente quando usado para descrever o processo de maltagem, significa grãos de cevada. Em todos os outros casos, a menos que diferentemente especificado, "cevada" significa a planta de cevada (Hordeum vulgare, L.), incluindo quaisquer variedades.

O termo "resistência a doenças" significa que as plantas evitam os sintomas de doenças que são resultado de interações planta/patógeno. Desta maneira, os patógenos são impedidos de causar doenças nas plantas e os sintomas associados às doenças, ou alternativamente, os sintomas das doenças. Alternativamente, os sintomas das doenças causados pelo patógeno são minimizados ou reduzidos.

Uma planta de "cereal", como definida neste rela-tório descritivo, é um membro da família das plantas Graminae cultivadas principalmente pelas suas sementes que contêm amido. As plantas cerealíferas incluem, porém sem limita-ções, cevada (Horde um), trigo (Triticum), arroz (Oryza), milho (Zea), centeio (Secale), aveia (Avena), sorgo (Sorghum), e Triticale, um híbrido de centeio e trigo.

O termo "codificador" ou "codificado", no contexto de um ácido nucléico especificado, significa que compreende as informações para a tradução para dentro da proteína especifiçada. Um ácido nucléico que codifica uma proteína pode compreender seqüências não traduzidas (como por exemplo, introns) dentro das regiões traduzidas do ácido nucléico, ou pode carecer de tais seqüências intervenientes não- traduzidas (como por exemplo, no DNAc). As informações pelas quais uma proteina é codificada são especificadas pelo uso de códons.

Como aqui utilizado, o termo "expressão", no con-texto de ácidos nucléicos, deve ser entendido com a trans-crição de a acumulação de RNAm sense ou RNA antisense derivado de um fragmento de ácido nucléico. 0 termo "expressão", utilizado no contexto de proteinas, refere-se à tradução do RNAm em um polipeptídeo.

O termo "moléculas de sabor" significa aldeidos e/ou álcoois que são produzidos e são constituintes do odor e/ou sabor em plantas. Particularmente, as moléculas de sabor incluem certos álcoois e aldeidos voláteis. Os exemplos das moléculas de sabor, que são voláteis, incluem, porém sem limitações, hexanal, (3Z)-hexenal, (2E)-hexenal, (2E) - hexenol, (3Z)-nonenal, (2E)-nonenal. A invenção pode ser usada para modular os niveis de moléculas de sabor em plantas.

O termo "gene" significa o segmento de DNA envol-vido na produção de uma cadeia polipeptidica; ele inclui regiões que precedem e se seguem à região codificadora (promotor e terminador). Os genes eucarióticos são descon-tínuos com proteínas codificadas por eles, consistindo em éxons interrompidos por introns. Depois da transcrição para dentro do RNA, os introns são removidos por recomposição, para gerar um RNA mensageiro maduro (RNAm) . Os "sítios de recomposição" entre éxons são determinados tipicamente por sequências de consenso que atuam como sinais de recomposição para o processo de recomposição, consistindo em uma deleção do intron do transcrito de RNA primário e uma união ou fusão das extremidades do RNA remanescente em cada um dos dois lados do intron excisado. Em alguns casos, padrões alterna-tivos ou diferentes de recomposição podem gerar proteinas diferentes a partir do mesmo prolongamento único do DNA. Um gene nativo pode ser referido como um gene endógeno.

"Silenciamento gênico" é um método para alterar a expressão gênica. Ele se refere ao silenciamento do RNA, que é um mecanismo de silenciamento gênico pós-transcricional conservado entre vários organismos. 0 método inclui o silenciamento gênico pós-transcricional (PTGS) e a interfe-rência do RNA (RNAi) . PTGS é um fenômeno de silenciamento gênico de genes homólogos exógenos. Embora a maioria dos exemplos sobre PTGS estej a nos efeitos causados por cons-truções de co-supressão ou expressão de transgenes na orientação antisense, ele foi observado também em plantas de programas de cruzamento convencionais, como por exemplo, a mutação hgcl no arroz (Kusaba et ai., 2003). Esta mutação demonstrou suprimir a expressão de glutelina por intermédio do silenciamento do RNA, possivelmente em virtude de uma deleção de 3,5 kpb entre dois genes altamente similares para glutelina, que forma uma repetição cauda a cauda invertida que poderia produzir uma molécula de RNA com filamento duplo, e assim sendo, um indutor potente de silenciamento do RNA. Uma segunda forma de silenciamento do RNA é conhecida como interferência de RNA (RNAi), onde a premissa básica é a capacidade de o RNA de duplo filamento bloquear especifica-mente a expressão do seu gene homólogo quando injetado ou ingerido para dentro de células (Goenczy et al., 2000).

Como aqui utilizado, o termo "heterólogo" com relação a um ácido nucléico é um ácido nucléico que se origina de uma espécie estranha, ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificado a partir de sua forma nativa em composição e/ou lócus genômico por intervenção humana deli-berada .

O termo "germinação", como aqui utilizado, signi-fica a inicio ou retomada do crescimento por um grão de cevada em várias composições, tal como o solo normal como encontrado na natureza. A germinação pode ocorrer também no solo de vasos colocados em câmaras de crescimento, e similares, ou, por exemplo, ocorrer sobre papel de filtro úmido colocado em placas de Petri de laboratório padroni-zadas. A germinação é entendida genericamente como incluindo a hidratação dos grãos, intumescimento dos grãos e indução do crescimento do embrião. Os fatores ambientais que afetam a germinação incluem umidade, temperatura e nivel de oxigênio. O desenvolvimento de raizes e brotos é observado.

"Notas verdes" é um termo que descreve moléculas voláteis de sabor e fragrância presentes em inúmeras plantas, e caracterizadas em termos organolépticos como verde fresco e graminoso. Estas moléculas são produzidas pela planta a partir da degradação de lipídeos e ácidos graxos, tais como o ácido linoléico e o ácido linolênico.

Como aqui utilizado, o termo "isolado" significa que o material é removido do seu ambiente original. Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo de ocorrência natural presente em um organismo vivo não é isolado, mas, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo, separado de parte ou todo o material coexistente, no sistema natural, é isolado. Tais polinucleotídeos poderiam ser parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos poderiam ser parte de uma composição, e ainda assim ser isolado porque tal vetor ou composição não é parte de seu ambiente natural.

O termo "grão" é definido como compreendendo a cariopse do cereal, denotada também semente interna, lema e pálea. Na maioria das variedades de cevada, a lema e a pálea aderem à cariopse e fazem parte do grão após a debulha. Entretanto, as variedades de cevada nuas também ocorrem. Nelas, a cariopse é isenta da lema e da pálea e debulha para fora livre como no trigo.

O termo "maturação do grão" ou "desenvolvimento do grão" refere-se ao período que inicia com a fertilização, na qual as reservas metabolizáveis, tais como açúcares, oligossacarídeos, amido, produtos fenólicos, aminoácidos e proteínas são depositados, com ou sem visar vacúolos, sobre vários tecidos no grão, como por exemplo, no endosperma, testa, aleurona, e escutelo, levando ao engrandecimento do grão, preenchimento do grão e terminando com a dessecação do grão.

O termo "atividade de LOX-1" refere-se à atividade enzimática da enzima LOX-1 da cevada. Particularmente, no contexto da presente invenção, "atividade de LOX-1 é a dioxigenação do ácido linoléico, catalisada pela enzima, para dar 9-HPODE. Muito embora a enzima LOX-1 seja capaz de catalisar outras reações, com o propósito de determinar a atividade de LOX-1, de acordo com a presente invenção, apenas a atividade formadora de 9-HPODE deve ser considerada. A Figura 1B delineia a via bioquímica na qual o ácido linoléico é convertido em T2N.

O termo "baixo teor de LOX" refere-se à presença de uma ou várias mutações em um ou mais genes endógenos, causando uma perda de função parcial de uma enzima LOX especificada, de preferência, com relação, porém sem restrições, à atividade enzimática. Por exemplo, as plantas de cevada descritas no pedido de patente PCT n- PCT/IB01/ 00207, publicado como documento n- WO 02/053721A1, em nome de Douma et al., produzem uma enzima LOX-1 mutada que tem 10% da atividade resisual em comparação com a enzima do tipo selvagem correspondente. O termo "baixo teor de LOX", com relação a uma planta, refere-se a uma planta que tem uma perde de função parcial da enzima LOX especificada.

"Maltagem" é uma forma especial de germinação de grãos de cevada, que ocorre sob condições ambientais contro-ladas, incluindo, porém sem limitações, tanques de maceração maltosa e caixas de germinação. De acordo com o processo da presente invenção, a maltagem começa a ocorrer durante e/ou depois que os grãos de cevada foram macerados. O processo de maltagem pode ser interrompido secando os grãos de cevada. Uma composição de malte preparada a partir isenta de LOX-1 é entendida como compreendendo malte isento de LOX-1, tal como um malte puro isento de LOX-1 ou qualquer mescla que compreende malte isento de LOX-1.

"Mosturação" é a incubação do malte moído em água. A mosturação é realizada, de preferência, em uma temperatura específica e em um volume específico de água. A temperatura e o volume de água são importantes, pois isto afeta a taxa de decréscimo da atividade da enzima derivada do malte, e assim sendo, a quantidade especialmente da hidrólise do amido que pode ocorrer. A mosturação pode ocorrer na presença de adjuntos, que compreendem qualquer fonte de carboidrato diferente do malte, como, por exemplo, adjunto de cevada (incluindo a cevada isenta de LOX-1), milho ou arroz, usado principalmente como uma fonte adicional de extrato. Os requisitos para o processamento do adjunto na cervejaria dependem do estado e do tipo de adjunto usado e, particularmente, das temperaturas da gelatinização e liquefação do amido. Caso a temperatura de gelatinização seja acima da temperatura normal de sacarificação do malte, então o amido é gelatinizado e liquefeito antes de adicionar ao macerado.

"Mutações" incluem deleções, inserções, transver- salidades e mutações pontuais nas regiões codificadoras e não-codificadoras de um gene. As deleções podem ser do gene inteiro ou de apenas uma parte do gene. As mutações pontuais podem resultar em códons de interrupção (stop codons), mutações de deslocamento de estrutura ou substituições de aminoácidos. Mutações somáticas são aquelas que ocorrem apenas em certas células ou tecidos da planta e não são herdadas pela próxima geração. Mutações de linhagem germinal podem ser encontradas em qualquer célula da planta e são herdadas.

O termo "isento de LOX" refere-se à presença de uma mutação em um gene codificador de LOX, causando uma perde de função total da enzima LOX codificada. As mutações que geram códons de terminação prematura {nonsense) em um gene que codifica LOX representam apenas um mecanismo pelo qual a perda de função total pode ser obtida. As abordagens moleculares para obter perda de função total de uma enzima LOX compreendem a geração de mutações que causam a ausência total de transcritos para dita enzima, ou mutações que inativam totalmente a enzima codificada. "Isenta de LOX" com relação a uma planta refere-se a uma planta que tem uma perda de função total da enzima LOX codificada.

"Ligado operacionalmente" é um termo usado para se referir à associação de dois ou mais fragmentos de ácidos nucléicos em um único polipeptídeo, de tal modo que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor está ligado operacionalmente a uma seqüência codificadora quando ele é capaz de afetar a expressão desta seqüência codifica-dora, isto é, que a seqüência codificadora está sob o controle transcricional do promotor. As seqüências codifi-cadoras podem estar ligadas operacionalmente a seqüências reguladoras na orientação sense ou antisense.

O termo "PCR" ou "reação de polimerase em cadeia" é bem conhecido pelos versados nessas técnicas como uma técnica usada para a ampliação de segmentos de DNA específicos (patentes n— US 4.683.195 e US 4.800.159, expedidas para Mullis et al.).

O termo "planta" ou "material vegetal" inclui células vegetais, protoplastos vegetais, culturas de tecidos de células vegetais a partir das quais as plantas de cevada podem ser regeneradas, calos vegetais e células vegetais que estão intactas em plantas ou partes de plantas tais como embriões, polens, óvulos, flores, grãos, folhas, raizes, pontas de raizes, anteras, ou qualquer parte ou produto de uma planta.

O termo "produto vegetal" significa um produto resultante do processamento de uma planta ou parte de planta. O dito produto vegetal pode ser assim, por exemplo, malte, mosto, uma bebida fermentada ou não-fermentada, um produto alimentício ou ração.

Como aqui utilizado, o termo "recombinante" com relação a uma proteína é uma proteína que se origina de uma espécie estranha, ou, se originada da mesma espécie, ela é substancialmente modificada a partir de sua forma nativa na composição por intervenção humana deliberada.

"Transcrito de RNA" refere-se ao produto resultante da transcrição catalisada por RNA polimerase de uma seqüência de DNA. Quando o transcrito de RNA é uma cópia complementar perfeita da seqüência do DNA, ele é referido como o transcrito primário. Quando uma seqüência de RNA é derivada do processamento pós-transcricional do transcrito primário, ela é referida como o RNA maduro. "RNA mensageiro" ou "RNAm" refere-se ao RNA que está sem introns e que pode ser traduzido em proteínas pela célula. "DNAc" refere-se ao DNA que é complementar a um modelo de RNAm e é derivado dele. O DNAc pode ser de filamento único ou convertido em uma forma de filamento duplo, como por exemplo, o fragmento Klenow de DNA polimerase I. "RNA sense" refere-se a um transcrito de RNA que inclui o RNAm, e assim sendo, pode ser traduzido em um polipeptídeo pela célula. "RNA antisense" refere-se a um transcrito do RNA que é complementar a um transcrito primário-alvo inteiro ou parte dele, ou RNAm, e que bloqueia a expressão de um gene-alvo. A complementaridade de um RNA antisense pode ser com qualquer parte da seqüência de nucleotídeos específica, isto é, na seqüência não-codificadora de 5', seqüência não-codificadora de 3', introns, ou a seqüência codificadora da proteína. "RNA funcional" refere-se ao RNA sense, RNA antisense, ou outro RNA que não possa ser traduzido em uma proteína, mas ainda assim tem um efeito sobre os processos celulares.

A menos que diferentemente assinalado, "T2N" significa a forma livre de T2N. O termo "potencial de T2N" descreve substâncias químicas que têm a capacidade de liberar T2N, ou podem ser convertidas em T2N, em uma ou mais reações. O potencial de T2N pode ser medido como a concentração de T2N em uma solução, como por exemplo, no mosto ou na cerveja, após uma incubação (como por exemplo, por 2 horas) em uma temperatura elevada (como por exemplo, 100°C) e baixa acidez (como por exemplo, pH 4,0) . Este tratamento da amostra causa a liberação de T2N do potencial de T2N, como por exemplo, a partir de "adutos de T2N", um termo usado para descrever T2N conjugado a uma ou mais substâncias, incluindo, porém sem limitações, proteina(s) , sulfito, detritos celulares, paredes celulares, ou similares. Os adutos de T2N de per si não são sentidos por seres humanos como desvios de sabor. Entretanto, T2N liberado a partir dos ditos adutos de T2N podem, por exemplo, por meio de ácido ou calor, gerar um desvio de sabor.

"Cultura de tecidos" indica uma composição que compreende células isoladas do mesmo tipo ou de um tipo diferente, ou uma coleção dessas células, organizadas dentro de partes de uma planta, como por exemplo, protoplastos, calos, embriões, pólen, anteras, e similares.

"Transformação" significa a introdução de um DNA em um microorganismo, de tal modo que o DNA seja mantido, seja como um elemento extracromossômico (sem integração e herança estável) ou integrante cromossômico (herança geneticamente estável). A menos que diferentemente afirmado, o método aqui utilizado para transformação de K. col.i foi o método de CaCl2 (Sambrook e Russel, supra). Para transformação de cevada mediada por Agrobacteriumf a transformação pode ser realizada basicamente como descrito por Tingay et al. (1997) e Wang et al. (2001), exceto que outro cultivar, tal como o cultivar Golden Promise, pode ser usado como hospedeiro.

Um "transgene" é um gene que foi introduzido dentro do genoma por um procedimento de transformação. Como aqui utilizado, o termo "transgênico" inclui uma referência a uma célula que foi modificada pela intro-dução de um ácido nucléico heterólogo ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim sendo, por exemplo, as células transgênicas expressam genes que não são encontrados em uma forma idêntica dentro da forma nativa da célula, ou expressam genes nativos que são de outra forma expressados anormalmente, subexpressados, ou não expressados de jeito nenhum, côo resultado de uma intervenção humana deliberada. 0 termo "transgênico", como aqui utilizado com relação a plantas, particularmente plantas de cevada, não engloba a alteração da célula por métodos de cruzamento tradicional de plantas, como por exemplo, mutagênese derivada com NaN3, e por eventos que ocorrem naturalmente, tais como aqueles que ocorrem sem intervenção humana deliberada.

O termo "planta de cevada do tipo selvagem" refere-se a uma planta de cevada convencional, e de preferência o termo se refere à planta cevada a partir da qual as plantas de cevada da invenção foram derivadas, isto é, as plantas parentais. Em uma modalidade preferida da invenção, a "planta de cevada do tipo selvagem" é selecionada no grupo que consiste nos cultivares Celeste, Lux, Prestige, Saloon e Neruda. Mais preferivelmente, a "planta de cevada do tipo selvagem" é o cultivar Barke. Os cultivares de cevada do tipo selvagem, ou suas sementes, estão genericamente dispo-níveis, por exemplo, em companhias sementeiras comuns.

BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

A invenção pode ser mais inteiramente entendida a partir da descrição detalhada que se segue e da Listagem de Seqüências que a acompanha (resumida na Tabela 9), que faz parte deste pedido de patente. A dita tabela lista os ácidos nucléicos e polipeptídeos que estão aqui descritos, a designação dos clones do DNAc que compreendem os fragmentos de ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos que repre-sentam todos estes polipeptídeos ou uma parte substancial deles, e o identificador correspondente [SEQ ID NO:]. As descrições das sequências e a Listagem de Seqüências anexada a elas cumprem as regras que ditam as descrições das seqüências de nucleotídeos e/ou aminoácidos em pedidos de patente.

A Listagem de Seqüências contém o código de uma letra para caracteres de seqüências de nucleotídeos e aminoácidos, como definido em conformidade com as recomen-dações padronizadas (Cornish-Bowden, 1985; "IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature", 1984), que são aqui incorporadas como referência. Os símbolos e o formato usados para os dados de seqüências de nucleotídeos e aminoácidos cumprem as regras que ditam as descrições de seqüências em pedidos de patente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Eigura 1 é dividida em três diagramas de fluxo, A, B e C. A Figura IA ilustra como os grãos de cevada mutagenizados com NaN3 podem ser propagados. Os grãos da geração MO crescem para dar plantas que desenvolvem grãos da geração Ml. Estes últimos podem ser semeados e se desenvolverem em plantas Ml que produzem novos grãos da geração M2. A seguir, as plantas M2 crescem e estabelecem grãos da geração M3, que podem ser colhidos e usados para análises de triagem. As sementes M3 também podem ser semeadas, e as flores das plantas correspondentes podem ser usadas para cruzamentos, a fim de obter plantas da geração M4. A Figura 1B é uma representação simplificada de como a via bioquímica de LOXs opera para degradar o ácido linoléico, produzindo eventualmente T2N. A Figura 1C ilustra como o ácido linoléico pode ser transformado no 9- hidroperoxiácido correspondente (9-HPODE) pela ação de LOX- 1, e em seguida, por conversões enzimáticas adicionais por epóxi ácido sintase e epóxido hidrolase em ácido 9,12,13- triidróxi-10-octadecenóico (9,12,13-THOE).

A Figura 2 é uma comparação gráfica das atividades totais de LOXs medidas em extratos de embriões do cultivar Barke, do mutante D112, e em uma amostra de controle que compreende extrato de embriões do cultivar Barke, inativado com calor.

A Figura 3 apresenta uma comparação gráfica das atividades totais de LOXs medidas em extratos de embriões do mutante A618, do cultivar Neruda, e em uma amostra de controle que compreende extrato de embriões do cultivar Barke, inativado com calor.

A Figura 4 ilustra uma comparação das atividades totais de LOXs medidas em grãos de 12 linhagens individuais da progénie M4 do mutante Dl12. As atividades das amostras de controle que consistem em extratos de grãos do cultivar Barke, e extratos de grãos do cultivar Barke, inativados por calor, estão incluídas na comparação.

A Figura 5 resume os resultados das análises quanto à atividade total de LOXs em 90 extratos individuais de grãos de linhagens progênitas M5 do mutante Dl12. As atividades de extratos de grãos de controle do cultivar Barke, e extratos de grãos inativados por calor do cultivar Barke, estão incluídas na comparação.

A Figura 6 fornece um resumo de uma comparação das atividades totais de LOXs, medidas em 40 extratos indivi-duais de grãos de linhagens progênitas M4 do mutante A618. As atividades de amostras de controle com extratos de controle do cultivar Barke, e extratos de grãos inativados por calor do cultivar Barke, estão incluídas na comparação.

A Figura 7 consiste em duas análises por immunoblots separadas, ilustrando que a proteína LOX-1 imu- norreativa não detectável em extratos de grãos do mutante D112, geração M3. Cada inununoblot usou uma sonda com um anticorpo para LOX-1 de cevada, e as amostras consistiam em extratos de células de K. coli que expressam LOX-1 recom- binante (fileira 1) , extratos de grãos do cultivar Vintage (fileira 2), linhagem G mutante (fileira 3 e fileira 7), cultivar Barke (fileira 6 e fileira 8), e linhagens separadas do mutante D112, geração M3 (fileiras 4-5 e 9-16). A posição da proteína LOX-1 imunorrcativa está indicada.

A Figura 8 ilustra dois immunoblots separados, detalhando a ausência de LOX-1 em extratos de grãos do mutante A618, gerações M3 e M4. Cada immunoblot usou uma sonda com um anticorpo para LOX-1 de cevada, e as amostras consistiam em extratos de grãos da linhagem G mutante (fileira 1), cultivar Neruda (fileira 6 e fileira 16). Extratos de grãos M3 e M4 escolhidos aleatoriamente, que não o foram através do procedimento de seleção de LOX, foram separados nas fileiras 2-5 e 8-12, respectivamente; todos estes extratos continham uma proteina imunorreativa LOX-1. 0 fenótipo isento de LOX-1 de um extrato de grãos do mutante A618, geração M3 (fileira 7), foi herdado em linhagens separadas da progénie M4 do mutante A618-82 (fileiras 8-12). A posição da proteína LOX-1 imunorreativa está indicada.

A Figura 9 ilustra esquematicamente a genética do programa de retrocruzamento para o mutante D112 para o cultivar Prestige. 0 traço de LOX-1 do tipo selvagem é designado NN, enquanto que o traço do mutante isento de LOX- 1 é nn. As plantas que têm os genótipos sublinhados são submetidas a cruzamentos.

A Figura 10 fornece uma ilustração de sete iimnunoblots separados, cada um com uma sonda de anticorpo para LOX-1 de cevada. Os inununoblots indicam a presença ou ausência da proteína LOX-1 imunorreativa em grãos de plantas separadas da primeira geração do cruzamento do mutante Dl12 para o cultivar Prestige (fileiras 1-6 e fileiras 9-14), e a presença ou ausência da proteína LOX-1 imunorreativa em grãos da segunda geração do cruzamento do mutante D112 para o cultivar Prestige (fileiras 17-22, fileiras 25-30, fileiras 33-38, fileiras 41-45, e fileiras 4 8-52) . Os extratos de grãos do controle do mutante D112, faltando LOX-1 imunorrea- tiva (fileiras 8, 16, 24, 32, 40, 47, 54), foram usados como controle. A posição da proteína LOX-1 imunorreativa está indicada.

A Figura 11 é uma visão esquemática simplificada do processo de produção de cerveja sem o uso de adjuntos, mas incluindo a maceração do grão de cevada (1), maltagem (2), secagem em forno (3), moagem do malte seco (4), mosturação (5), filtração (6), fervura do mosto na presença de lúpulo adicionado (7), fermentação na presença de levedura (8), maturação da cerveja (9), filtração da cerveja (10), embalagem, incluindo, porém sem limitações, embalagem dentro de garrafas, latas e similares (11), e rotulação (12). Os processos individuais podem ser agrupados em seções que compreendem a produção de malte (1-3), produção do mosto (4- 7), fermentação (8-9) e preparação da cerveja acabada (10- 12) .

A Figura 12 concentra-se nas características de cervejas produzidas usando malte derivado de cevada do mutante D112 isento de LOX-1. A Figura 12A ilustra a acumulação de T2N livre durante o envelhecimento forçado por 4 semanas a 37°C. O aldeído foi medido na cerveja produzida a partir do malte do mutante D112 isento de LOX-1 (À), e do malte do cultivar Barke do controle (•) . 0 nível-1imite do sabor para T2N na cerveja é de aproximadamente 0,05 ppb. A Figura 12B fornece uma representação gráfica dos dados compilados depois da avaliação dos avaliadores de sabor sobre as características individuais do sabor de cervejas incubadas a 20°C por 12 meses. As cervejas foram fabricadas com malte derivado do cultivar de cevada Barke (barras cheias) ou a partir da cevada do mutante D112 isento de LOX- 1 (barras vazadas).

A Figura 13 apresenta os cromatogramas de análises por HPLC/ usadas para testar quanto à formação de 9- e 13- HPODEs em tecidos de cevada. Os níveis de HPODEs foram analisados medindo a absorvância a 234 nm, estando os resul-tados fornecidos em miliunidades de absorvância (mAU). Os picos dos perfis de eluição que correspondem a 9-HPODE e 13- HPODE estão indicados por setas. A Figura 13A ilustra o cromatograma dos padrões de 9-HPODE e 13-HPODE. A Figura 13B é um cromatograma de HPODEs formados em extratos preparados a partir de embriões maduros do cultivar Barke. A Figura 13C é um cromatograma de HPODEs formados em extratos preparados a partir de embriões maduros de grãos com baixo teor de LOXs. A Figura 13D é um cromatograma de HPODEs formados em extratos preparados a partir de embriões maduros do mutante D112 isento de LOX-1.

A Figura 14 representa os cromatogramas de análises por HPLC/ usadas para testar quanto à formação de 9- e 13- HPODEs no malte. Os níveis dos ditos HPODEs foram analisados medindo a absorvância a 234 nm, estando os resultados fornecidos em miliunidades de absorvância (mAU). Os picos dos perfis de eluição que correspondem a 9-HPODE e 13-HPODE estão indicados por setas. A Figura 14A ilustra o cromato-grama dos padrões de 9-HPODE e 13-HPODE. Os picos dos croma-togramas correspondentes a 9-HPODE e 13-HPODE estão indica- dos por setas. A Figura 14B é um cromatograma dos HPODEs formados em extratos de malte do cultivar Barke. A Figura 14C é um cromatograma dos HPODEs formados em extratos de malte da cevada com baixo teor de LOXs. A Figura 14D é um cromatograma dos HPODEs formados em extratos de malte do mutante D112 isento de LOX-1.

A Figura 15 é um mapa que ilustra a organização do gene para LOX-1 de cevada, cobrindo o códon iniciação (ATG) e o códon de interrupção (TAA). O desenho esquemático da seqüência com um comprimento de 4.165 pb indica 7 éxons (retângulos cheios) e 6 introns (linhas). As posições das mutações identifiçadas no gene para LOX-1, isto é, especifica para a linhagem G (baixo teor de LOXs), mutante A618 e mutante D112, estão indicadas por setas.

A Figura 16 resume as diferenças moleculares previstas relacionadas ao gene para LOX-1 de plantas de cevada do tipo selvagem, mutante A618 e mutante Dl12. As informações listadas nas colunas marcadas "Resultado", "Comprimento em aminoácidos", e "Massa em kDa" são previstas a partir da seqüência de DNA.

A Figura 17 fornece as maneiras usadas par realizar a análise de mutantes por RT-PCR e a verificação de transcritos relacionados ao gene de cevada que codifica LOX- 1. Em "A" está ilustrado esquematicamente o principio para a detecção por RT-PCR de um transcrito especifico para o gene que codifica LOX-1 em embriões em desenvolvimento do cultivar Vintage e da linhagem G do mutante com baixo teor de LOX-1. Os iniciadores (primers) consistiram em FL821 [SEQ ID NO: 11] e FL852 [SEQ ID NO: 12], que anelam nos éxons que flanqueiam o intron 5 com 83 pb de comprimento; as diferenças dos produtos da PCR, usando o DNA genômico ou modelos de RNAm, estão indicadas. Em "B" está indicado o resultado de uma análise por RT-PCR em gel de agarose, onde o foco foi sobre a detecção de um transcrito especifico relacionado ao gene que codifica LOX-1 em embriões de cevada em desenvolvimento, cultivar Vintage e linhagem mutante G. As fileiras 1 e 5 continham fragmentos marcadores, e as fileiras 2, 3 e 4 continham os produtos da PCR derivados de tecidos de embriões do cultivar Vintage depois de 20, 40 e 60 dias após a antese (DAF), respectivamente. As fileiras 6, 7 e 8 contêm os produtos derivados de tecidos de embriões da linhagem mutante G depois de 20, 40 e 60 dias após a antese (DAF), respectivamente. Em "C", as fileiras 1-5 ilustram o resultado de um experimento similar àquele detalhado para as fileiras 1-5 em "B", enquanto que as fileiras 6, 7 e 8 continham os produtos derivados da detecção por RT-PCR de um transcrito especifico do embrião do mutante D112 do gene para LOX-1 depois de 20, 40 e 60 dias após a antese (DAF), respectivamente. Em "D", está ilustrado um eletroferograma que resultou de uma reação de seqüenciamento de um fragmento da RT-PCR especifico quanto ao gene para LOX-1. A análise de seqüências revelou que o RNA-alvo da RT-PCR era isento de DNA. O triângulo preto aponta para o ponto de recomposição, indicando a recomposição correta do transcrito.

A Figura 18 detalha os resultados de uma detecção auxiliada por SNP do mutante D112 de cevada. A análise baseou-se na geração de um padrão do fragmento específico da PCR, usando dois conjuntos de reações PCR por amostra, como ilustrado esquematicamente em "A" (o conjunto de iniciadores 1 consiste no iniciador FL820 [SEQ ID NO: 13] e no iniciador FL823 [SEQ ID NO: 15], e o conjunto de iniciadores 2 consiste no iniciador FL820 [SEQ ID NO: 13] e no iniciador FL825 [SEQ ID NO: 14] . Em "B", está ilustrado o resultado de uma análise de padrão por PCR do material de cruzamento com qualidade superior. 0 DNA genômico de plantas foi submetido a análises por PCR. Os resultados nas fileiras 2-3 (planta 1), 4-5 (planta 2), 6-7 (planta 3), 8-9 (planta 4), 10-11 (planta 5), 12-13 (planta 6), 14-15 (planta 7), 16-17 (planta 8), e 18-19 (planta 9), utilizaram a combinação de iniciadores 1 (fileiras de números pares), ou a combinação de iniciadores 2 (fileiras de números ímpares). A comparação do padrão de formação de bandas com aquele ilustrado em "A" revelou que as plantas 1, 2, 4, 5 e 8 eram mutantes homozi- góticos, enquanto que o genótipo das plantas 3, 6 e 9 poderia ser classificado como tipo selvagem homozigótico. O DNA marcador foi separado nas fileiras 1 e 20.

A Figura 19 demonstra o princípio da análise por SNP multiplex de amostras de cevada que contêm material do mutante G ou mutante D112. A análise utilizou reações de PCR multiplex, de tal modo que o comprimento do fragmento ampliado pudesse ser relacionado ao genótipo do material adicionado. A ampliação de um fragmento de 370 pb indicaria que uma amostra de malte continha material derivado da linhagem mutante G, enquanto que a ampliação de um fragmento de 166 pb apontaria para a presença de material derivado do mutante D112. 0 Quadro A é uma ilustração esquemática deta-lhando como os pares de iniciadores específicos, cada um com um iniciador que contém uma seqüência que é especifica para o mutante de interesse (asterisco; para a linhagem mutante G, nucleotideo número 2.279 no clone genômico para LOX-1, e para o mutante D112, posição 3.574). A combinação de iniciadores FL918 [SEQ ID NO: 16] e FL920 [SEQ ID NO: 17] foi usada para a detecção da mutação especifica da linhagem mutante G, enquanto que FL820 [SEQ ID NO: 13] e FL823 [SEQ ID NO: 15] foram utilizados para a detecção da troca de bases especifica do mutante Dl12. Em "B", está ilustrado como as quantidades relativas do material especifico do mutante (fileiras 2-7: linhagem mutante G; fileiras 8-13: mutante Dl12) em amostras pode intensificar a sintese de um fragmento de PCR especifico (fileiras 2 e 8: nenhum material mutante adicionado; fileiras 3 e 9: 20% de material mutante adicionado; fileiras 4 e 10: 403 de material mutante adicio-nado; fileiras 5 e 11: 603 de material mutante adicionado; fileiras 6 e 12: 80% de material mutante adicionado; fileiras 7 e 13: 100% de material mutante). A fileira 1 consistiu em fragmentos marcadores.

A Figura 20 apresenta o resultado da análise SDS- PAGE de LOX-1 marcada com His, purificada por afinidade, a partir de células de E. coli transformadas com o vetor plasmidico pET19b (fileiras 2-5), plasmideo de expressão pETLl (fileiras 6-10), e plasmideo de expressão pETL2 (fileiras 11-15). As proteinas das frações que compreendem proteínas não-ligadas (fileiras 2, 6, 11) ; primeira lavagem (fileiras 3, 7, 12); segunda lavagem (fileiras 4, 8, 13); primeiro eluido (fileiras 5, 9, 14); e segundo eluído (fileiras 10 e 15) foram analisadas. A seta superior indica a posição de LOX-1 recombinante (correspondente a LOX-1 do tipo selvagem), enquanto que a seta inferior indica a posição de LOX-1 recombinante truncada (correspondente a LOX-1 no mutante D112 de cevada). A fileira 1 compreendia proteínas marcadoras separadas.

A Figura 21 ilustra inserções plasmídicas para transformação de cevada. Em "A", está ilustrado um cassete de expressão que consiste no promotor ubiquitina 1 de milho e o intron 1 (denotados coletivamente como o promotor UBI), direcionando a expressão constitutiva do gene bar (BAR), que codifica o marcador selecionável fosfinotricina acetil transferase. A terminação da transcrição é proporcionada pela seqüência terminadora NOS (N). Em "B" está ilustrado um cassete de expressão que consiste no promotor UBI supramen-cionado, neste caso direcionando a expressão constitutiva da seqüência do DNAc de cevada para LOX-1 em orientação sense ou antisense. Em "C" está ilustrado um cassete de expressão que consiste no promotor UBI direcionando a expressão constitutiva de uma construção em hairpin que contém íntron, onde a seqüência do í ntron 1 do gene de Arabidopsis para o íntron 1 (Int) de ácido graxo dessaturase FAD2, flanqueado pelo braço sense (—>) e braço antisense (<—) de um fragmento com um comprimento de aproximadamente 200 pb do gene para LOX-1. A terminação da transcrição é proporcionada pela seqüência terminadora NOS (N). Para a geração de plantas de cevada que apresentam co-supressão do gene para LOX-1, são usadas misturas de plasmideos que compreendem quantidades iguais de plasmideos de expressão que compreendem as inserções detalhadas em "A" e "B". Para a geração de plantas de cevada que apresentam o silenciamento total do gene para LOX-1, são usadas misturas que compreendem quantidades iguais de plasmideos de expressão que compreendem as inserções em "A" e "C".

A Figura 22 detalha os resultados experimentais referentes a inibidores que reduzem a atividade de LOX-1. Em "A" está representada a separação eletroforética de proteí-nas em uma SDS-PAGE a 10%, com fileiras separadas ilustrando o resultado de uma purificação em etapas de LOX-1 marcada com His a partir de células de E. coli (cf, Exemplo 18). As proteínas em extratos brutos de transformantes com o vetor pET19b e o plasmídeo pETLl estão indicadas na fileira 1 e fileira 2, respectivamente, enquanto que as fileiras 3-5 contêm proteínas separadas das soluções de lavagem 2, 3 e 4. Alíquotas de 3 μL de amostras de eluídos de 1 mL da coluna de afinidade foram separadas na fileira 6 (eluído 1), fileira 7 (eluído 2) , fileira 8 (eluído 3) , e fileira 9 (eluído 4) . A seta horizontal indica a posição de LOX-1 recombinante. Alíquotas de LOX-1 do eluído 2 foram usadas para os estudos dos inibidores, como resumido em "B". Neste caso, a atividade de LOX-1 residual foi medida após a incubação com 5 μL de LOX-1 (eluído 2), na presença de inibidor, seja NDGA (•) ou gaiato de octila (A).

A Figura 3 fornece um resumo detalhando os níveis de T2N em amostras de mosto preparadas a partir de mosturações sem inibidor adicionado (barras vazadas) , ou na presença de 0,05 nM do inibidor de LOX-1 gaiato de octila (barras cheias). As amostras, retiradas após a mosturação (37°C), ou depois da fervura (mosto fervido), compreendiam mosto de mosturações com malte do cultivar Barke de cevada ou do mutante D112 de cevada isento de LOX-1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Com o propósito de clareza da descrição, e não a título limitativo, a descrição detalhada de invenção está dividida nas seguintes subseções: (i) Planta de cevada; (ii) Preparação de cevada isenta de LOX-1; (iii)Composição; (iv) Mutagênese química; (v) Seleção de mutantes de cevada; (vi) Cruzamento de plantas; (vii)Cruzamento de cevadas; (viii)Enzimas LOX; (ix) Produtos da via de LOXs; (x) Potencial de T2N; (xi) Resistência a doenças; (xii)Micotoxinas; (xiii)Fragrâncias (xiv)Expressão heteróloga de genes que codificam LOX; (xv) Inibidores de LOX.

Plantas de Cevada "Cevada selvagem", Hordeum vulgare spp. spontaneunif é considerada a progenitora das formas cultivadas de cevada atualmente. Foi aceito há muito tempo que a exploração deste cereal fornece uma indicação para explicar o início do cultivo de grãos no Crescente Fértil. O fato de que os seres humanos puderam colher os grãos na longa estação do verão inteira tornaram-nos candidatos pré- adaptados para domesticação. Os domesticados iniciais eram provavelmente geneticamente muito diversos, uma noção fundamentada por um estudo de cevada selvagem em Israel, na Turquia e no Irã (Nevo, 1992). Descobriu-se que as populações de cevada selvagem diferem consideravelmente em seu conteúdo alélico. Dos 127 alelos em 27 loci compartilhados, 65 alelos demonstraram ser singulares, isto é, eles ocorriam em apenas um país.

Acredita-se que a transição de cevada de um estado selvagem para um estado cultivado tenha coincidido com uma mudança radical de freqüências de alelos em inúmeros loci. Os alelos raros e novos eventos mutacionais foram selecionados positivamente pelos agricultores que estabeleceram rapidamente os novos traços nas populações de plantas domesticadas, denotadas "linhagens regionais de cevada". Elas são geneticamente mais intimamente aparentadas aos cultivares modernos do que a cevada selvagem e representam uma fonte de alelos úteis para esforços de cruzamentos adicionais (Ellis et al., 1998). Até o final do século XIX, as linhagens regionais de cevada existiam como misturas altamente heterogêneas de linhagens endógamas e segregados híbridos, incluindo poucas plantas originadas de cruzamentos « aleatórios em gerações iniciais. A maioria das linhagens regionais foi substituída em agriculturas avançadas por cultivares de linhagens puras. Níveis intermediários ou altos de diversidade genética caracterizam as linhagens regionais remanescentes.

Inicialmente, os cultivares de "cevada moderna" representavam seleções a partir de linhagens regionais. Eles originaram-se posteriormente de ciclos sucessivos de cruza-mentos entre linhagens puras estabelecidas, tais como aquelas de origens geográficas diversas. Eventualmente, isto resultou em um estreitamento acentuado da base genética em muitas, e provavelmente todas agriculturas avançadas. Compa-rados com linhagens regionais, os cultivares de cevada modernos têm inúmeras propriedades melhoradas (Nevo, 1992; e von Bothmer et al., 2003), como por exemplo, sem limitações: (i) Grãos cobertos e nus; (ii) Dormência de sementes; (iii)Resistência a doenças; (iv) Proporções de lisina e outros aminoácidos; (v) Teor protéico; (vi) Teor de nitrogênio; (vii)Composição de carboidratos; (viii)Padrões de hordeína.

Assim sendo, em uma modalidade da invenção, a planta de cevada é um cultivar de cevada moderna, modificado para compreender menos do que l!à da atividade de LOX-1 de uma planta de cevada do tipo selvagem correspondente. Assim sendo, nesta modalidade, prefere-se que a planta de cevada não seja de uma linhagem regional de cevada.

A presente invenção refere-se a plantas de cevada, e partes delas, que compreendem menos de 5%, de preferência menos de 4%, mais preferivelmente menos de 3% ainda mais preferivelmente, menos de 2%, ainda mais preferivelmente, menos de 1% da atividade de LOX-1 de uma planta de cevada do tipo selvagem. As plantas de cevada da invenção, que compreendem menos de 1% da atividade de LOX-1, são aqui denominadas também "plantas de cevada isentas de LOX-1".

A planta de cevada pode estar em qualquer forma apropriada. Por exemplo, a planta de cevada de acordo com a invenção pode ser uma planta de cevada viável, uma planta desidratada, uma planta homogeneizada, tais como grãos de cevada moídos. A planta pode ser uma planta madura, um embrião, um grão germinado, um grão maltado, ou similares.

As partes das plantas de cevada podem ser qualquer parte apropriada, tais como grãos, embriões, folhas, ramos, raízes, flores ou frações delas. As frações podem ser, por exemplo, uma seção de um grão, embrião, folha, ramo raiz ou flor. As partes de plantas de cevada podem ser também uma fração de um homogeneizado, ou planta ou grão de cevada moído.

Em uma modalidade da invenção, as partes de plantas de cevada podem ser células da dita planta de cevada, de preferência células viáveis, que podem ser propagadas em culturas de tecidos in vitro.

Em uma modalidade preferida da invenção, as plantas de cevada isentas de LOX-1 compreendem menos de 5%, de preferência menos de 3%, mais preferivelmente menos de 1%, de preferência menos de 0,5%, ainda mais preferivelmente, menos de 0,1% da atividade de uma planta de cevada do tipo selvagem. A atividade pode ser determinada por qualquer método apropriado, de preferência, entretanto, a atividade é determinada usando o método do Exemplo 1 abaixo. Em uma modalidade muito preferida da invenção, as plantas de cevada isentas de LOX-1 não têm essencialmente nenhuma atividade de LOX-1, mais preferivelmente absolutamente nenhuma atividade de LOX-1. 0 termo "essencialmente nenhuma atividade de LOX- 1" significa nenhuma atividade de LOX-1 usando um ensaio quanto à atividade de LOX-1 aqui descrito abaixo.

A atividade de LOX-1 quase ausente da cevada isenta de LOX-1 pode ser, por exemplo, resultado de que a dita planta de cevada compreende uma proteína LOX-1 com mau funcionamento, tal como uma proteína LOX-1 mutante. Entre-tanto, a cevada isenta de LOX-1 compreende apenas muito pouco ou, mais preferivelmente, nenhuma proteína LOX-1, tal como menos de 5%, de preferência menos de 3%, mais preferi-velmente menos de 1%, de preferência menos de 0,5%, ainda mais preferivelmente, menos de 0,1% da proteína LOX-1, em comparação com uma planta de cevada do tipo selvagem. Mais preferivelmente, a cevada isenta da proteína LOX-1 não compreende essencialmente nenhuma proteína LOX-1, e com a maior preferência, absolutamente nenhuma proteína LOX-1. O termo "essencialmente nenhuma proteína LOX-1" significa que cobre nenhuma proteína LOX-1 detectável. A proteína LOX-1 pode ser detectada por qualquer meio apropriado conhecido pelos versados nessas técnicas; entretanto, de preferência, a proteína é detectada por técnicas nas quais a proteína LOX-1 é detectada por anticorpos específicos para LOX-1. As ditas técnicas podem ser, por exemplo, Western blotting ou ELISA. Os ditos anticorpos específicos monoclonais ou policlonais; entretanto, de preferência, os ditos anticorpos são policlonais que reconhecem vários epítopos diferentes dentro da proteína LOX-1. A proteína LOX-1 pode ser detectada também indiretamente, como por exemplo, por métodos que determinam a atividade de LOX-1, por métodos que detectam mutações no gene que codifica LOX-1 ou por métodos que detectam a expressão do gene de LOX-1. As mutações no gene que codifica LOX-1 podem ser detectadas, por exemplo, seqüenciando o dito gene. A expressão do gene de LOX-1 pode ser detectada, por exemplo, por Northern blotting ou RT-PCR. Em uma modalidade preferida da invenção, a proteína LOX-1 é detectada usando os métodos delineados no Exemplo 4 do presente pedido de patente.

O termo "proteína LOX-1" pretende cobrir a proteína LOX-1 de comprimento inteiro da cevada, como enunciado em [SEQ ID NO: 3] ou [SEQ ID NO: 7] ou um seu homólogo funcional. O sítio ativo de LOX-1 fica situado na parte do terminal C de LOX-1. Particularmente, é a região que cobre os aminoácidos 520-862 ou partes dela relevantes para a atividade de LOX-1. Conseqüentemente, em uma modalidade, a cevada isenta de LOX-1 compreende, de preferência, um gene que codifica uma forma mutante de LOX-1 na qual faltam alguns ou todos aminoácidos 520-862 de LOX-1. A dita LOX-1 mutante pode carecer também de outros residues de amino-ácidos que estão presentes na LOX-1 do tipo selvagem.

Consequentemente, a cevada isenta de LOX-1 pode compreender uma forma truncada de LOX-1, que não é funcional, tal como uma forma truncada no terminal N ou no terminal C. De preferência, a dita forma truncada não compreende mais do que 800, mais preferivelmente não mais do que 750, ainda mais preferivelmente não mais do que 700, mais ainda preferivelmente não mais do que 690, ainda mais preferivelmente não mais do que 680, ainda mais preferivelmente não mais do que 670 aminoácidos consecutivos de LOX-1, tal como não mais do que 665, como por exemplo, não mais do que 650, tal como não mais do que 600, como por exemplo, não mais do que 550, tal como não mais do que 500, como por exemplo, não mais do que 450, tal como não mais do que 425, como por exemplo, não mais do que 399 aminoácidos consecutivos de LOX-1 [SEQ ID NO: 3]. De preferência, a dita forma truncada compreende apenas um fragmento do terminal N de LOX-1. Assim sendo, de preferência, a dita forma truncada compreende no máximo 800, mais preferivelmente no máximo 750, ainda mais preferivelmente no máximo 700, mais ainda preferivelmente no máximo 690, ainda mais preferivelmente no máximo 680, ainda mais preferivelmente no máximo 670, ainda mais preferivelmente no máximo ainda mais preferivelmente no máximo 665 aminoácidos do terminal N de [SEQ ID NO: 3], tal como não mais do que 665, como por exemplo, não mais do que 650, tal como não mais do que 600, como por exemplo, no máximo 550, tal como no máximo 500, como por exemplo, no máximo 450, tal como no máximo 450, tal como no máximo 425, como por exemplo, no máximo 399 aminoácidos consecutivos do terminal N de [SEQ ID NO: 3] .

Em uma modalidade muito preferida, a forma truncada pode consistir nos aminoácidos 1-665 de [SEQ ID NO: 3]. Em uma modalidade preferida da invenção, a planta de cevada compreende um gene transcrito para dentro do RNAm que codifica LOX-1, onde o dito RNAm compreende um códon nonsense ou um códon de interrupção a montante do códon de interrupção do RNAm de LOX-1 do tipo selvagem. Tal códon nonsense é aqui designado como um códon nonsense prematuro. De preferência, todos genes transcritos para dentro do RNAm que codifica LOX-1 da dita planta compreendem um gene nonsense prematuro ou um códon de interrupção. O códon nonsense ou códon de interrupção fica, de preferência, situado no máximo 800, mais preferivelmente no máximo 750, ainda mais preferivelmente no máximo 700, ainda mais preferivelmente no máximo 690, ainda mais preferivelmente no máximo 680, ainda mais preferivelmente no máximo 670, ainda mais preferivelmente no máximo 665 códons a jusante do códon de iniciação. A seqüência do DNA genõmico do tipo selvagem que codifica LOX-1 é fornecida em [SEQ ID NO: 1] ou [SEQ ID NO: 5] .

Em uma modalidade preferida, a planta de cevada compreende um gene que codifica LOX-1, onde o pré-RNAm transcrito do dito gene compreende a seqüência de ácido ribonucléico correspondente a [SEQ ID NO: 2].

Em outra modalidade preferida da invenção, a planta de cevada compreende um gene que codifica uma LOX-1 mutante, onde o dito gene compreende pelo menos uma, tal como 1, como por exemplo, 2, tal como 3, como por exemplo, 4, tal como 5 mutações em pelo menos um, tal como 1, como por exemplo, 2, tal como 3 sítios de recomposição. De preferência, a dita mutação ou as ditas mutações resultam no fato de que pelo menos um sítio de recomposição seja não- funcional . O RNAm transcrito de tal gene será, assim, anormal devido à recomposição aberrante. Conseqüentemente, prefere-se que o RNAm transcrito do gene de LOX-1 da planta de cevada isenta de LOX-1, de acordo com a invenção, não codifique nenhuma proteína ou uma proteína que compreende apenas o terminal N de LOX-1. A dita proteína pode compreender outras seqüências codificadas pelo RNAm anormal, que não são derivadas do gene de LOX-1. Neste contexto, o terminal N de LOX-1 compreende o aminoácido 1 até o aminoácido N, onde N é um número inteiro na faixa entre 2 e 800, mais preferivelmente na faixa entre 2 e 750, ainda mais preferivelmente na faixa entre 2 e 700, ainda mais preferivelmente na faixa entre 2 e 650, ainda mais preferivelmente na faixa entre 2 e 600, ainda mais preferivelmente na faixa entre 2 e 550, ainda mais preferivelmente na faixa entre 2 e 500, ainda mais preferivelmente na faixa entre 2 e 450, ainda mais preferivelmente na faixa entre 2 e 400, ainda mais preferivelmente na faixa entre 2 e 378.

Em uma modalidade da invenção, a planta de cevada compreende um gene que codifica uma LOX-1 mutante, onde o dito gene tem uma mutação no sítio de recomposição que leva ao RNAm que codifica uma proteína que consiste nos aminoácidos 1 a 378 de [SEQ ID NO: 3], bem como uma seqüência de aminoácidos adicional não derivada de LOX-1. De preferência, a dita LOX-1 mutante consiste na seqüência delineada em [SEQ ID NO: 8].

Em uma modalidade muito preferida da invenção, o gene que codifica LOX-1 mutante da planta de cevada isenta de LOX-1 compreende uma mutação nonsense, sendo que a dita mutação corresponde a uma substituição G—>A na posição 3.574 de [SEQ ID NO: 1]. Mais preferivelmente, a planta de cevada isenta de LOX-1 é uma planta designada D112 que tem o número de acesso PTA-5487 do depósito junto à American Type Culture Collection (ATCC).

Em outra modalidade muito preferida da invenção, o gene que codifica LOX-1 da planta de cevada isenta de LOX-1 compreende um sítio de recomposição doador de íntron 3 não- funcional . O RNAm de LOX-1 da dita planta, assim, codifica uma proteína que contém os aminoácidos 1-378 de LOX-1 e aminoácidos adicionais do íntron 3, compreendidos em [SEQ ID NO: 8] . Mais preferivelmente, a planta de cevada isenta de LOX-1 é uma planta designada A618 que tem o número de acesso PTA-5584 do depósito junto à American Type Culture Collection (ATCC) .

As plantas de cevada, de acordo com a invenção, podem ser também a progénie de uma planta de cevada isenta de LOX-1. Assim sendo, a planta de cevada pode ser a progénie da planta de cevada designada Dl12, que tem o número de acesso PTA-5487 do depósito junto à American Type Culture Collection (ATCC) , ou a planta de cevada designada A618 que tem o número de acesso PTA-5584 do depósito junto à American Type Culture Collection (ATCC).

A planta de cevada de acordo com a invenção pode ser preparada por qualquer método apropriado conhecido pelos versados nessas técnicas, de preferência por um dos métodos aqui delineados abaixo (vide por exemplo, a seção "Preparação de Cevada Isenta de LOX-1").

Em uma modalidade da invenção, prefere-se que a planta de cevada isenta de LOX-1, de acordo com a presente invenção, tenha uma fisiologia de crescimento da planta e desenvolvimento dos grãos comparáveis à cevada do tipo selvagem. Assim sendo, prefere-se que a planta de cevada isenta de LOX-1 seja similar à cevada do tipo selvagem com relação à estatura da planta, número de brotos por planta, inicio da antese e/ou número de grãos por espiga.

É também um aspecto da invenção fornecer uma planta de cevada isenta de LOX-1, onde a dita planta é caracterizada por: (i) ter maior resistência a doenças; ou (ii) ter potencial reduzido para a produção de micotoxinas; ou (iii)compreender células regeneráveis para uso em cultura de tecidos; ou (iv) ter qualquer combinação dos traços de (i) a (iii) .

Em uma modalidade da invenção, a planta de cevada é uma planta de cevada isenta de LOX-1, desde que a dita planta de cevada não carregue uma mutação de G no sitio doador de recomposição do intron 5. Nesta modalidade, a invenção refere-se também a produtos vegetais, tais como malte, mosto, bebidas fermentadas ou não-fermentadas, cerveja, alimentos ou rações, preparados a partir de uma planta de cevada isenta de LOX-1, ou parte dela, desde que a dita planta de cevada não carregue uma mutação de G no sitio doador de intron 5 da recomposição. 0 dito G corresponde, por exemplo, a G na posição 2.968 de SEQ ID NO: 1. Pode-se determinar se um produto vegetal é preparado a partir de uma planta de cevada com uma dada mutação isolando o DNA do dito produto vegetal e identificando a presença ou ausência da dita mutação por métodos convencionais conhecidos pelos versados nessas técnicas. 0 DNA pode ser, por exemplo, isolado a partir do mosto, cerveja ou outra bebida usando secagem por congelamento, recolocação em suspensão em um tampão aquoso, extração com clorofórmio/álcool isoamílico, e em seguida, precipitação com álcool. Por exemplo, a mutação de G no sitio doador de intron 5 da recomposição pode ser identificada de uma maneira similar, como descrito no documento n- WO 2004/085652, em nome de Hirota et al.

Preparação de Cevada Isenta de LOX-1

A planta de cevada de acordo com a invenção pode ser preparada por qualquer método apropriado conhecido pelos versados nessas técnicas. De preferência, a planta de cevada da invenção é preparada por um método que compreende as etapas de mutagenizar plantas de cevada, ou partes delas, como por exemplo, grãos de cevada, em seguida, triar e selecionar plantas de cevada quanto a plantas com menos de 5% da atividade de LOX-1. O interessante é que a presente invenção, em um aspecto, refere-se a um método de triagem inovador e muito eficiente, significativamente melhor do que o método de triagem descrito, por exemplo, no documento n- WO 02/053721, em nome de Douma et âl. O novo método de triagem permite identificar de forma reprodutível plantas de cevada com nenhuma atividade ou muito pouca atividade de LOX-1. Este novo método de triagem inclui obter grãos, ou partes deles, tais como embriões, a partir de cevada mutage- nizada, e determinar a atividade de LOX-1 nos ditos grãos ou partes deles.

Conseqüentemente, é um objetivo da presente inven-ção fornecer métodos para preparar uma planta de cevada que compreende menos de 5% da atividade de LOX-1 de uma planta de cevada do tipo selvagem, métodos estes que compreendem as etapas de: (i) Determinar a atividade de LOX-1 em grãos de cevada do tipo selvagem, ou partes deles; e (ii) Mutagenizar plantas de cevada e/ou células de cevada e/ou tecido de cevada e/ou grãos de cevada e/ou embriões de cevada, obtendo cevada da geração MO; e (iii)Cruzar as ditas plantas, grãos e/ou embriões de cevada mutagonizados por pelo menos 2 gerações, obtendo desta forma plantas de cevada de geração Mx, onde x é um número inteiro > 2; e (iv) Obter grãos e/ou partes deles a partir das ditas plantas Mx; e (v) Determinar a atividade de LOX-1 nos ditos grãos ou partes deles; e (vi) Selecionar plantas nas quais a atividade de LOX-1 dos grãos mutagenizados, ou partes deles, é menos de 5% da atividade de LOX-1 dos grãos do tipo selvagem ou partes deles; obtendo desta forma uma planta de cevada que compreende menos de 5% da atividade de LOX-1 de uma planta de cevada do tipo selvagem.

A Etapa (ii) na lista acima pode envolver mutage- nizar um material vivo selecionado no grupo que consiste em plantas de cevada, células de cevada, tecido de cevada, grãos de cevada e embriões de cevada, de preferência sele-cionado no grupo que consiste em plantas de cevada, grãos de cevada e embriões de cevada, e mais preferivelmente, grãos de cevada. Prefere-se que a atividade de LOX-1 dos grãos mutagenizados seja determinada usando o mesmo tipo de material usado para a determinação da atividade de LOX-1 dos grãos de cevada do tipo selvagem, isto é, prefere-se que o grão de cevada, ou partes dele, da etapa (i), seja do mesmo tipo do grão de cevada, ou partes dele, mencionado na etapa (iv). A título exemplificativo, caso a atividade de LOX-1 de cevada do tipo selvagem seja determinada em embriões de cevada do tipo selvagem, prefere-se que a etapa (iv) compreenda determinar a atividade de LOX-1 em embriões de plantas de cevada mutagenizadas.

A mutagênese pode ser realizada por qualquer método apropriado. Em uma modalidade, a mutagênese é realizada incubando uma planta de cevada ou uma parte dela, como por exemplo, grãos de cevada ou células individuais da cevada com um agente mutagenizante. O dito agente é conhecido pelos versados nessas técnicas, como por exemplo, porém sem limi-tações, azida sódica (NaN3), metanossulfonato de etila (EMS), azidoglicerina (AG, 3-azido-l,2-propanodiol), metil- nitrosouréia (MNU), e hidrazida maléica (MH).

Em outra modalidade, a mutagênese é realizada irradiando, como por exemplo, por UV, uma planta de cevada ou uma parte dela, tal como o grão. Em modalidades prefe-ridas da invenção, a mutagênese é realizada de acordo com qualquer um dos métodos aqui delineados abaixo na seção "Mutagênese Química". Um exemplo não-limitativo de um proto-colo de mutagênese apropriado está enunciado no Exemplo 1.

Prefere-se que a mutagênese seja realizada de uma maneira tal que a frequência esperada de mutantes desejados seja de pelo menos 0,5, tal como na faixa entre 0,5 e 5, como por exemplo, na faixa entre 0,9 e 2,3 por 10.000 grãos, quando se está triando cevada M3. Em uma modalidade preferida, a mutagênese é reali-zada em grãos de cevada. Os grãos mutagenizados são desig-nados M0 (vide também Figura IA).

Subsequentemente à mutagênese, as plantas de cevada, ou partes delas, que compreendem menos de 5%, de preferência menos de 1% da atividade de LOX-1, são sele-cionadas. A seleção pode ser realizada de acordo com qualquer método conhecido pelos versados nessas técnicas. De preferência, a seleção compreende obter uma amostra de uma planta de cevada, tal como de um grão de cevada, determinar a atividade de LOX-1 na dita amostra e selecionar plantas, onde cada amostra tem menos de 5%, ou de preferência menos de 1% da atividade de LOX-1 de uma planta de cevada do tipo selvagem.

A amostra pode ser retirada de qualquer parte da dita planta. De preferência, entretanto, a amostra é retirada do grão, mais preferivelmente a amostra é retirada do tecido do embrião de um grão, a ainda mais preferivelmente, a amostra consiste em tecido embrionário de um grão. Genéricamente, a mostra deve ser homogeneizada usando qualquer método apropriado, antes de determinar a atividade de LOX-1.

Em uma modalidade preferida, a amostra é retirada de grãos da geração Mx, onde x é um número inteiro >2, de preferência x é um número inteiro na faixa entre 2 e 10, mais preferivelmente na faixa entre 3 e 8. Em uma modalidade muito preferida, a atividade de LOX-1 é determinada em grãos M3 ou uma amostra derivada de grãos. Nesta modalidade, prefere-se que os grãos de cevada mutagenizados (geração MO) seja desenvolvidos para obter plantas de cevada que são cruzadas para obter grãos Ml. 0 procedimento é repetido até que estejam disponíveis grãos M3 (vide também Figura IA).

A determinação da atividade de LOX-l pode ser conduzida usando qualquer ensaio apropriado, de preferência um dos métodos aqui delineados abaixo. Particularmente, prefere-se que o ensaio monitore a dioxigenação de ácido linoléico para dar 9-HPODE por LOX-1. Genericamente, os testes envolvem, portanto, as etapas de: (i) Disponibilizar uma amostra preparada a partir de um grão de cevada ou parte dele; e (ii) Disponibilizar ácido linoléico; e (iii)Incubar a dita amostra com o dito ácido linoléico; e (iv) Detectar a dioxigenação do ácido linoléico para 9-HPODE.

A detecção pode ser realizada direta ou indire- tamente. Qualquer método de detecção apropriado pode ser utilizado com a presente invenção. Em uma modalidade da invenção, são detectados hidroperóxidos do ácido linoléico. Os hidroperóxidos do ácido linoléico podem ser detectados, por exemplo, por degradação acopladora dos ditos hidroperó-xidos do ácido linoléico com uma reação oxidante, que desenvolve um composto detectável. Por exemplo, isto pode ser feito como descrito no Exemplo 1. Em outra modalidade, o 9-HPODE é detectado diretamente como por exemplo, por métodos espectrofotométricos, tal como HPLC, como descrito no Exemplo 9. Em uma modalidade da invenção, a atividade de LOX-1 é determinada simplesmente determinando a quantidade de 9-HPODE em uma amostra de um grão de cevada. Isto pode ser feito por qualquer método apropriado conhecido pelos versados nessas técnicas, como delineado, por exemplo, no Exemplo 9.

É importante em qual pH a determinação da atividade de LOX-1 é realizada. De preferência, a dita determinação é realizada em um pH que permite alta atividade de LOX-1, mas apenas baixa atividade de LOX-2. Assim sendo, a determinação da atividade de LOX-1 é feita, de preferência, em um pH na faixa entre 3 e 6,5, como por exemplo, na faixa entre 3 e 4, tal como na faixa entre 4 e 5, como por exemplo, na faixa entre 5 e 6, tal como na faixa entre 6 e 6,5. De prefe-rência, o pH é ao redor de 3, tal como ao redor de 3,5, como por exemplo, ao redor de 4, tal como ao redor de 4,5, como por exemplo, ao redor de 5, tal como ao redor de 5,5, como por exemplo, ao redor de 6, tal como ao redor de 6, 5, como por exemplo, ao redor de 7. Prefere-se também que a dita amostra seja preparada em pH apropriado, tal como um pH na faixa entre 3 e 6,5, como por exemplo, na faixa entre 3 e 4, tal como na faixa entre 4 e 5, como por exemplo, na faixa entre 5 e 6, tal como na faixa entre 6 e 6,5. De preferên-cia, o pH é ao redor de 3, tal como ao redor de 3,5, como por exemplo, ao redor de 4, tal como ao redor de 4,5, como por exemplo, ao redor de 5, tal como ao redor de 5,5, como por exemplo, ao redor de 6, tal como ao redor de 6,5, como por exemplo, ao redor de 7.

Os métodos preferidos para selecionar plantas de cevada de acordo com a invenção estão aqui descritos abaixo na seção "Seleção de Mutantes de Cevada". Um exemplo preferido de um método para determinar a atividade de LOX-1 está enunciado no Exemplo 1.

O procedimento de seleção pode ser adaptado para procedimentos de ensaios em placas de microtitulação, ou outros formatos de ensaios repetitivos de alta produção, conhecidos, que permitem a triagem rápida de muitas amostras . Prefere-se que pelo menos 5.000, tal como pelo menos 7.500, como por exemplo, pelo menos 10.000, tal como pelo menos 15.000 plantas de cevada mutagenizadas sejam anali-sadas quanto à atividade de LOX-1.

Subsequentemente à seleção de plantas de cevada úteis, como menos de 5% da atividade de LOX-1, podem ser realizadas opcionalmente uma ou mais triagens adicionais. Por exemplo, os mutantes selecionados podem ser propagados adicionalmente, e as gerações subseqüentes podem ser triadas novamente quanto à atividade de LOX-1.

Subsequentemente à seleção de plantas de cevada úteis, elas podem ser submetidas ao cruzamento, tal como um cruzamento convencional. Os métodos de cruzamento estão aqui descritos abaixo (seções "Cruzamento de Plantas" e "Cruza-mentos de Cevada").

A planta de cevada de acordo com a invenção pode ser preparada também, entretanto, por outros métodos, como por exemplo, métodos que resultam em transcrição e/ou tradução reduzida de LOX-1. Assim sendo, a planta de cevada isenta de LOX-1 pode ser preparada transformando uma planta de cevada com uma seqüência de ácidos nucléicos que compreende, como componentes ligados operacionalmente, um promotor expressável em plantas de cevada, uma seqüência de DNA, e uma região de terminação transcricional, onde a expressão da dita seqüência de DNA reduz a expressão do gene que codifica LOX-1 por: (i) silenciamento antisense; ou (ii) silenciamento por co-supressão; ou (iii)interferência de RNA.

Em uma modalidade, a planta de cevada é preparada por um método que envolve transformar uma planta de cevada com uma seqüência de ácidos nucléicos capaz de reduzir a transcrição ou tradução de um gene que codifica LOX-1, como por exemplo, uma seqüência de ácidos nucléicos que compreende seqüências antisense de LOX-1. As ditas seqüências antisense podem ser, por exemplo, a seqüência antisense de [SEQ ID NO: 1], ou um fragmento dela. A seqüência antisense deve estar ligada operacionalmente a uma seqüência promotora de um gene expressado em plantas de cevada. Um exemplo não-limitativo de tal método está delineado aqui abaixo no Exemplo 16.

A planta de cevada pode ser transformada por qualquer método útil, como por exemplo, transferência mediada por Agrobacterium tumefaciens ou captação de DNA mediada por bombardeio de partículas.

É também um âmbito da presente invenção que a planta de cevada isenta de LOX-1 seja preparada por um método que compreende as etapas de: (i) Mutagenizar plantas de cevada e/ou grãos de cevada e/ou embriões de cevada; e (ii) Determinar a presença ou ausência de uma mutação no gene de LOX-1, onde a dita mutação leva a um gene de LOX-1 que codifica uma forma polipeptidica de LOX-1, compreendendo menos de 700 aminoácidos contíguos da seqüência enunciada em SEQ ID NO: 3, de preferência o dito polipeptídeo é um fragmento do terminal N de LOX-1, compreendendo no máximo os 700 aminoácidos do terminal N de [SEQ ID NO: 3], (iii)Selecionar plantas que carregam a dita mutação, obtendo desta forma uma planta de cevada que compreende menos de 5% da atividade de LOX-1 de uma planta de cevada do tipo selvagem.

Mais preferivelmente, a dita mutação pode levar a um gene de LOX-1 que codifica qualquer um dos fragmentos do terminal N de LOX-1, como aqui descrito.

A dita mutação pode ser detectada usando qualquer método apropriado, como por exemplo, seqüenciamento do gene de LOX-1 ou análise de polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) . Um exemplo de como realizar uma análise de SNP está descrito no Exemplo 13 e no Exemplo 14 abaixo.

Uma vez preparada uma planta de cevada isenta de LOX-1 com uma mutação específica em um gene de LOX-1 (tal como qualquer uma das mutações supramencionadas) , plantas de cevada adicionais com a mesma mutação podem ser geradas por métodos de cruzamento convencionais bem conhecidos pelos versados nessas técnicas. Por exemplo, a dita planta de cevada isenta de LOX-1 pode ser retrocruzada em outro fundo de cultivar de cevada. A Figura 9 descreve um exemplo de um esquema para tal retrocruzamento.

Composição

A presente invenção refere-se também a composições que compreendem as plantas de cevada descritas acima, ou partes delas, ou composições preparadas a partir das ditas plantas de cevada, ou partes delas. Devido ao fato de que as ditas plantas de cevada têm menos de 5%, de preferência menos de 1% da atividade de LOX-1, as composições que compreendem, ou são preparadas a partir de tais plantas de cevada, ou partes delas, compreenderão genericamente niveis muito baixos de T2N e potencial de T2N. Os exemplos de composições úteis que compreendem ou são preparadas a partir da cevada isenta de LOX-1 estão aqui descritos abaixo.

Prefere-se que as ditas composições tenham: (i) menos de 30%, de preferência menos de 20%, mais preferivelmente menos de 10%, ainda mais preferivelmente menos de 5%, tal como menos de 2%, como por exemplo, menos de 1% de T2N; e/ou (ii) menos de 30%, de preferência menos de 20%, mais preferivelmente menos de 10%, ainda mais preferivel-mente menos de 5%, tal como menos de 2%, como por exemplo, menos de 1% de potencial de T2N, em comparação com uma composição similar que compreende ou foi preparada a partir de plantas de cevada do tipo selvagem.

A presente invenção refere-se, em um aspecto, a grãos de cevada que compreendem menos de 1% da atividade de LOX-1, em comparação com grãos de cevada do tipo selvagem. De preferência os grãos não compreendem qualquer atividade de LOX-1. A presente invenção refere-se também a composições que compreendem os ditos grãos e composições preparadas a partir dos ditos grãos.

Em um aspecto, a invenção refere-se a composições de malte preparadas a partir de grãos isentos de LOX-1 por maltagem. O termo "maltagem" deve ser entendido como germi-nação de grãos de cevada macerados, que ocorre sob condições ambientais controladas (como ilustrado, por exemplo, na Figura 11, Etapas 2 e 3).

A maltagem é um processo de maceração e germinação controladas, e em seguida, secagem do grão de cevada. Esta seqüência de eventos é importante para a síntese de inúmeras enzimas que causam modificação dos grãos, um processo que principalmente despolimeriza as paredes celulares de endos- permas mortos e mobiliza os nutrientes dos grãos. No processo de secagem subseqüente, o sabor e a cor são produ-zidos devido a reações de bronzeamento químico. Embora o uso principal do malte seja a produção de bebidas, ele pode ser utilizado também em outros processos industriais, como por exemplo, como uma fonte de enzima na indústria de panifica-ção, ou como um agente de sabor e cor na indústria alimen-tícia, por exemplo, como malte ou como uma farinha de malte, ou indiretamente, como um xarope de malte, etc.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a métodos para produzir a dita composição de malte. Os métodos compreendem, de preferência, as etapas de: (i) Disponibilizar grãos de cevada isentos de LOX-1; (ii) Macerar os ditos grãos; (iii)Germinar os grãos macerados sob condições predeterminadas; (iv) Secar os ditos grãos germinados; produzindo desta forma uma composição de malte com baixa ou nenhuma atividade de LOX-1. Por exemplo, o malte pode ser produzido por qualquer um dos métodos descritos em Hoseney (1994). Entretanto, qualquer outro método para pro-duzir malte pode ser usado também com a presente invenção, tais como métodos para a produção de maltes especiais, incluindo, porém sem limitações, métodos para torrar o malte. Um exemplo não-limitativo está descrito no Exemplo 6.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a composi-ções de mosto preparadas a partir de composições de malte preparadas a partir de grãos isentos de LOX-1. O dito malte pode ser preparado a partir de apenas grãos isentos de LOX-1 ou misturas que compreendem outros grãos. A invenção refere- se também a composições de mosto preparadas usando cevada isenta de LOX-1 ou partes dela, sozinha ou misturada com outros componentes. 0 dito mosto pode ser o primeiro e/ou o segundo e/ou o mosto de etapa posterior. Genericamente, uma composição de mosto deve ter um alto teor de nitrogênio amínico e carboidratos fermentáveis, principalmente maltose. Na Figura 11, as etapas 4 a 6 ilustram o método comum para preparar mosto a partir de malte. Genericamente, o mosto é preparado incubando o malte com água, isto é, mosturando. Durante a mosturação, a composição de malte/água pode ser suplementada com composições ricas em carboidratos adicionais, como por exemplo, adjuntos de cevada, milho ou arroz. Os adjuntos de cereais não-maltados não contêm usualmente quaisquer enzimas ativas e, portanto, baseiam-se em malte ou enzimas exógenas para fornecer as enzimas necessárias para a conversão de açúcar.

Genericamente, a primeira etapa no processo de produção de mosto é a moagem do malte, para que a água possa acessar as partículas dos grãos na fase de mosturação, que é fundamentalmente uma extensão do processo de maltagem com despolimerização enzimática de substratos. Durante a mostu-ração, o malte moído é incubado com uma fração líquida, tal como água. A temperatura é mantida constante (mosturação isotérmica) ou é aumentada gradualmente. Em qualquer caso, as substâncias solúveis produzidas na maltagem e na mostu-ração são extraídas para dentro da fração líquida, antes de ela ser separada por filtração para dentro do mosto e as partículas sólidas residuais são denominadas grãos gastos. Este mosto pode ser denominado também como primeiro mosto. Depois da filtração, um segundo mosto é obtido. Mostos adicionais podem ser preparados repetindo o procedimento. Os exemplos não-limitativos de procedimentos apropriados para a preparação de mosto estão descritos em Hoseney (supra).

A composição de mosto pode ser preparada também incubando plantas de cevada isentas de LOX-1, ou partes delas, tais como plantas isentas de LOX-1 não-maltadas, ou partes delas, com uma ou mais enzimas apropriadas, tais como composições de enzimas ou composições de misturas de enzimas, como por exemplo, Ultrafio ou Cereifo (Novozymes). A composição de mosto pode ser preparada também usando uma mistura de malte e plantas de cevada não-maltada, ou partes delas, adicionando opcionalmente uma ou mais enzimas apro-priadas durante a dita preparação.

A presente invenção refere-se também a composições alimentícias, composições de rações, e composições de matérias-primas para fragrâncias, que compreendem plantas de cevada isentas de LOX-1, ou partes delas. As composições alimentícias podem ser, por exemplo, porém sem limitações, grãos de cevada maltada ou não-maltada, farinhas de cevada, pães, mingaus, misturas de cereais, que compreendem cevada, produtos para a saúde, tais como bebidas que compreendem cevada, xaropes de cevada, e composições de cevada em escamas, moída ou extrudada. As composições de rações incluem, por exemplo, composições que compreendem grãos e/ou farinhas de cevada. As composições de matérias-primas para fragrâncias estão descritas abaixo.

A invenção refere-se também a misturas das composições da invenção. Por exemplo, a invenção, em um aspecto, refere-se a uma composição preparada por uma mistura de (i) uma composição que compreende uma planta de cevada, ou uma parte dela, compreendendo menos de 5% da atividade de LOX-1 de uma planta de cevada do tipo selvagem, e (ii) uma composição de malte preparada a partir de grãos isentos de LOX-1.

Em um aspecto preferido, a presente invenção refere-se a bebidas, mais preferivelmente bebidas derivadas de malte, ainda mais preferivelmente bebidas alcoólicas, tais como cerveja que tem qualidades organolépticas estáveis, onde a dita bebida é preparada usando a cevada isenta de

LOX-1, ou partes dela. Assim, sendo, em uma modalidade preferida da invenção, a bebida é preparada, de preferência, por fermentação de cevada isenta de LOX-1, ou partes dela, ou seus extratos, como por exemplo, por fermentação do mosto produzido usando o malte produzido a partir de cevada isenta de LOX-1, sozinha ou em combinação com outros ingredientes.

Entretanto, em outras modalidades da invenção, a bebida é uma bebida não-fermentada, como por exemplo, mosto. Está compreendido também no âmbito da presente invenção que a dita bebida pode ser preparada a partir de plantas de cevada não-maltada ou partes delas.

De preferência, entretanto, a dita bebida é preparada a partir de uma composição de malte preparada a partir de grãos de cevada isentos de LOX-1. Mais preferi-velmente, a dita bebida é cerveja. Ela pode ser qualquer tipo de cerveja conhecida pelos versados nessas técnicas. Em uma modalidade, a cerveja é, por exemplo, uma cerveja clara (Lager). A cerveja é, de preferência, produzida por fermen-tação, usando uma composição de malte que compreende uma cevada isenta de LOX-1 germinada. A composição de malte, entretanto, pode compreender outros componentes, como por exemplo, outros cereais germinados ou não-germinados, tais como cevada do tipo selvagem, cevada isenta de LOX-1, trigo e/ou centeio, ou matérias-primas não-germinadas que com-preendem açúcares ou composições derivadas da matérias- primas maltadas ou não-maltadas, como por exemplo, compo-sições de xaropes.

O termo "qualidades organolépticas" significa qualidades que atraem os sentidos olfativo e gustativo. Elas são analisadas, por exemplo, por avaliadores de sabor trei-nados. De preferência, tais avaliadores de sabor treinados são treinados para reconhecer especificamente aldeídos responsáveis por desvios de sabor, tal como T2N. Generica-mente, os avaliadores de sabor devem consistir em 3 a 30 membros, como por exemplo, na faixa entre 5 e 15 membros. Os avaliadores de sabor podem avaliar a presença de vários sabores, tais como desvios de sabor, tais como o sabor semelhante a papel, sabor oxidado, sabor envelhecido e sabor semelhante a pão. Um método para determinar as "qualidades organolépticas" de uma bebida está descrito no Exemplo 6 abaixo. Em modalidades preferidas, as qualidades organolép-ticas estáveis são, pelo menos parcialmente, resultado de baixa produção de T2N ou potencial de T2N.

Consequentemente, um objeto da presente invenção é fornecer bebidas fabricadas usando uma planta de cevada, tal como uma cerveja, compreendendo de preferência menos de 50%, de preferência menos de 40%, mais preferivelmente menos de 35%, tal como menos de 30%, como por exemplo, menos de 20%, tal como menos de 10%, como por exemplo, de preferência menos de 5%, tal como menos de 2%, por exemplo, menos de 1% de T2N e/ou potencial de T2N, em comparação com uma bebida preparada a partir de cevada do tipo selvagem, depois de estocagem por pelo menos 1 semana, de preferência pelo menos 2 semanas, mais preferivelmente pelo menos 3 semanas, ainda mais preferivelmente pelo menos 4 semanas, tal como na faixa entre 1 e 3 meses, como por exemplo, na faixa entre 3 e 6 meses, tal como na faixa entre 6 e 12 meses, como por exemplo, por mais de um ano. A estocagem é realizada em uma temperatura na faixa entre 15°C e 40°C, de preferência na faixa entre 30°C e 37°C, mais preferivelmente a 37°C. As bebidas da invenção compreendem, de preferência, no máximo 0,07, de preferência no máximo 0,06, mais preferivelmente no máximo 0,05, ainda mais preferivelmente no máximo 0,04, tal como no máximo 0,03 ppb (partes por bilhão) de T2N livre, depois de estocagem por pelo menos 1 semana, de preferência pelo menos 2 semanas, mais preferivelmente pelo menos 3 semanas, ainda mais preferivelmente pelo menos 4 semanas, tal como na faixa entre 1 e 3 meses, como por exemplo, na faixa entre 3 e 6 meses, tal como na faixa entre 6 e 12 meses, como por exemplo, por mais de um ano depois da esto-cagem em uma temperatura na faixa entre 15°C e 40°C, de preferência na faixa entre 30°C e 37°C, mais preferivelmente a 37°C. De preferência, a bebida compreende também na faixa entre 1 e 10 ppm (partes por milhão) de sulfito, mais preferivelmente na faixa entre 2 e 8 ppm, mais preferivel-mente na faixa entre 3 e 7 ppm, ainda mais preferivelmente na faixa entre 4 e 6 ppm de sulfito. Em uma modalidade preferida, as bebidas de acordo com a invenção compreendem no máximo 0,04, mais preferivelmente no máximo 0,03, como por exemplo, no máximo 0, 025 ppb de T2N livre, após a estocagem por 2 semanas a 37°C. Em outra modalidade preferida da invenção, as bebidas de acordo com a invenção compreendem no máximo 0,07, de preferência no máximo 0,06, mais prefe- rivelmente no máximo 0,05, ainda mais preferivelmente no máximo 0,04, tal como no máximo 0,03 ppb (partes por bilhão) de T2N após a estocagem por 4 semanas a 37°C, na presença de uma faixa entre 4 e 6 ppm de sulfito.

Prefere-se que as bebidas de acordo com a presente invenção tenham um sabor menos semelhante a papel, em comparação com uma bebida similar preparada a partir de uma cevada diferente da cevada isenta de LOX-1, depois da esto-cagem por pelo menos 10 meses em uma temperatura na faixa entre 15 e 25°C, tal como ao redor de 20°C. De preferência, o dito sabor semelhante a papel é menos do que 90%, mais preferivelmente, menos do que 80%, tal como menos do que 70%, avaliado por um grupo de avaliadores de sabor treinados.

Em uma modalidade a invenção refere-se a bebidas, tal como cerveja, com baixos níveis de certos ácidos triidróxi-octadecenóicos, particularmente bebidas com baixos níveis de 9,12,13-THOE. Os ácidos triidróxi-octadecenóicos têm um sabor amargo (Baur e Grosch, 1977; e Baur et al., 1977) e são, portanto, indesejáveis.

É, portanto, desejável que o nível de 9,12,13-THOE seja tão baixo quanto possível, de preferência mais baixo do que 1,3 ppm, tal como mais baixo do que 1 ppm. Entretanto, a concentração total de 9,12,13-THOE em uma bebida derivada de malte (tal como cerveja) é dependente também da quantidade de malte usada para a preparação da dita bebida específica. Assim sendo, genericamente, uma cerveja encorpada compreen-derá mais 9, 12, 13-THOE do que uma cerveja mais leve e um nível total mais alto de 9,12,13-THOE deve ser aceitável em uma cerveja mais encorpada. Consequentemente, prefere-se que a bebida de acordo com a invenção compreenda um nível de 9,12,13-THOE mais baixo do que uma cerveja normal de um tipo similar. Tal bebida pode ser obtida usando malte isento de LOX-1 para a preparação da dita bebida. Assim sendo, as bebidas preferidas de acordo com a invenção compreendem uma proporção baixa de 9,12,13-THOE, em comparação com um padrão interno, que se corrige para a quantidade de malte usada na preparação da dita bebida. O dito padrão pode ser, por exemplo, outro ácido triidróxi-octadecenóico.

Assim sendo, é importante para a qualidade de uma bebida, tal como uma cerveja, que a proporção dos vários ácidos triidróxi-octadecenóicos (THAs) seja mantida dentro de uma faixa específica. Surpreendentemente, além de baixos níveis de T2N, o produto da via de LOX-1 (vide Figura 1B) , as bebidas preparadas a partir da cevada isenta de LOX-1 de acordo com a invenção têm também um nível muito baixo de 9,12,13-THOE (vide Figura 1C), e consequentemente, uma razão muito baixa de 9,12,13-THA para 9,10,13-THA. Assim sendo, em um aspecto, a presente invenção refere-se a bebidas, tais como cervejas, que têm qualidades organolépticas estáveis, onde a dita bebida é fabricada usando uma planta de cevada ou partes dela, de preferência cevada isenta de LOX-1, e onde a razão de 9,12,13-THA para 9,10,13-THA dentro da dita bebida é no máximo 1,8, de preferência no máximo 1,7, mais preferivelmente no máximo 1,6, ainda mais preferivelmente no máximo 1,5, ainda mais preferivelmente no máximo 1,4. Assim sendo, é muito mais preferido que a dita razão fique na faixa entre 0 e 1/8, de preferência na faixa entre 0 e 1,6, tal como na faixa entre 0 e 1,4. Em uma modalidade, a dita razão é de aproximadamente 1,3. A quantidade de 9,12,13-THOE e 9,10,13-THOE em uma bebida pode ser determinada por métodos padronizados, como por exemplo, por espectrometria de cromatografia de massas, como descrito, por exemplo, por Hamber, 1991.

De preferência, os ditos THAs são oxilipinas da conversão do ácido linoléico. O interessante é que as bebidas com tais proporções de THAs podem ser preparadas usando a planta de cevada de acordo com a invenção. De preferência, tais bebidas são preparadas usando nenhuma outra cevada que não a cevada isenta de LOX-1, tal como nenhum outro malte que não o malte preparado a partir da cevada isenta de LOX-1. Em uma modalidade preferida da invenção, a bebida compreende: (i) uma razão de 9,12,13-THA para 9,10,13-THA como descrita acima; e (ii) um nivel de T2N livre após estocagem como descrito acima.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma bebida, tal como uma cerveja, com melhor estabilidade da espuma em comparação com uma bebida convencional similar. Tais bebidas podem ser preparadas, por exemplo, a partir da cevada isenta de LOX-1 ou partes dela, como por exemplo, malte. A estabilidade da espuma pode ser determinada, por exemplo, como descrito em "Brãutechnische Analysenmetoden", 2002.

A invenção refere-se também a métodos para produzir a dita bebida. Os métodos compreendem, de preferência, as etapas de: (i) Disponibilizar uma composição de malte que compreende grãos isentos de LOX-1 germinados; (ii) Processar a dita composição de malte para dar uma bebida; obtendo desta forma uma bebida com qualidades organolépticas estáveis.

Em uma modalidade preferida, a bebida é cerveja. Neste caso, a etapa de processamento compreende, de prefe-rência, preparar mosto a partir da dita composição de malte, como por exemplo, por qualquer um dos métodos aqui descritos acima, e fermentar o dito mosto.

Em termos genéricos, as bebidas alcoólicas, tais como cervejas, podem ser fabricadas a partir de grãos de cevada maltados ou não-maltados. 0 malte, além do lúpulo e da levedura, contribui para o sabor e a cor da cerveja. Além disso, o malte funciona como uma fonte de açúcar fermentável e enzimas. Uma representação esquemática de um processo genérico de produção de cerveja está ilustrada na Figura 11, enquanto que descrições detalhadas de exemplos de métodos apropriados para maltagem e fermentação podem ser encontra-das, por exemplo, na recente publicação por Hoseney (supra). Inúmeros métodos atualizados regularmente para análises de cevada, malte e produtos de cervejaria estão disponíveis [como por exemplo, porém sem limitações, em American Association of Cereal Chemist (1995); American Society of

Brewing Chemists (1992); European Brewery Convention (1998); Institute of Brewing (1997)]. Admite-se que muitos procedi-mentos específicos são empregados para uma dada cervejaria, sendo que as variações mais significativas referem-se às preferências dos consumidores locais. Qualquer método para produzir cerveja pode ser utilizado com a presente invenção. Um exemplo não-limitativo está descrito no Exemplo 6.

A composição de malte para a dita cerveja, como por exemplo, cerveja, bebidas de malte ou mosto não-fermen- tado, pode ser obtida, por exemplo, por qualquer um dos métodos aqui descritos acima. O mosto pode ser preparado a partir da dita composição de malte, como aqui descrito acima.

A primeira etapa para produzir cerveja a partir do mosto envolve, de preferência, ferver o dito mosto. Durante a fervura, outros ingredientes podem ser adicionados, como por exemplo, lúpulo, que proporciona as características amargas e aromáticas da cerveja. A fervura do mosto causa também uma agregação entre polifenóis e proteínas desnatu-radas, que precipitam principalmente durante a fase subse-quente de resfriamento do mosto. Depois de ser resfriado, o mosto é transferido para tanques de fermentação que contêm levedura. De preferência, a dita levedura é o levedo de cerveja, Saccharomyces carlsbergensis. O mosto deve ser fermentado por qualquer período de tempo apropriado, genericamente na faixa entre 1 e 100 dias. Durante a fermentação que dura vários dias, o açúcar é convertido em álcool e CO2 concomitantemente com desenvolvimento de algumas substâncias saporíferas.

Subseqüentemente, a cerveja pode ser processada adicionalmente. Em geral, ela será refrigerada. Ela pode ser também filtrada e/ou clarificada - um processo que desenvolve um aroma agradável e um sabor menos semelhante a levedura. Finalmente, a cerveja pode ser pasteurizada ou filtrada, antes de ela ser embalada (como por exemplo, engarrafada ou enlatada).

Apesar dos avanços que foram feitos na área de produção de cerveja, seria benéfico reduzir os níveis de T2N, seus precursores, e o potencial de T2N, na cerveja. Consequentemente, ainda existe uma necessidade de se obter novas matérias-primas, particularmente cevada e malte, que contribuem com menos desvios de sabor da cerveja acabada. É, portanto, um objeto da presente invenção fornecer tal cevada e tal mosto.

Mutagênese Química

Em um aspecto, a presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, no uso de mutagênese química de grãos de cevada, um método que reconhecidamente introduz mutações aleatórias. A mutagênese da cevada pode ser realizada usando qualquer procedimento químico que causa mutagênese; entre-tanto, de preferência, ela é realizada tratando os grãos com NaNj, deixando que os grãos sobreviventes germinem, e depois, analisando as plantas progênitas. A geração de plantas que crescem a partir de grãos mutagenizados, referidas como MO, contém quimeras heterozigóticas para qualquer dada mutação (cf. Figura IA e Figura 9).

Tratar grãos com NaN3 não é equivalente a tratar uma única célula porque os grãos depois do tratamento conterão algumas células não-mutantes e uma série de células que têm mutações do DNA. Como as mutações em linhagens de células que não levam à linhagem germinativa serão perdidas, a meta é direcionar o mutágeno para as poucas células que se desenvolvem para tecidos reprodutivos que contribuem para o desenvolvimento da geração Ml.

Para avaliar a eficiência global da mutação, quimeras albinas e plantas albinas foram contadas nas gera-ções MO e Ml, respectivamente. O número de pontuação (score) mutante em função de plantas sobreviventes dá uma estimativa da eficiência da mutação, enquanto que o número da pontuação mutante em função das sementes tratadas mede a combinação de eficiência da mutação e exterminação de grãos.

Deve-se assinalar que as células têm mecanismos de garantia de qualidade em virtualmente cada etapa da expressão gênica, possivelmente para moderar os efeitos da mutações danificadoras. Um exemplo bem estudado em eucariontes é o decaimento do RNAm mediado por nonsense, denotado NMD, que impede a síntese de proteínas prematuramente truncadas, potencialmente prejudiciais (Maquat e Carmichael, 2001) . No NMD, um códon de terminação é identificado como prematuro por sua posição em relação a elementos desestabilizadores a jusante. Em Saccharomyces cerevisiae, eles são seqüências de RNAm vagamente definidas, e em células de mamíferos, eles são complexos protéicos que são depositados em junções éxon- éxon durante a pré-recomposição do RNAm. Como a degradação de RNAm's nonsense e das proteínas que eles produzem são coordenadas é uma área para estudos futuros.

As mutações que geram códons (nonsense) de termi-nação prematura (PTCs) algumas vezes aumentam os níveis de transcritos alternadamente unidos que omitem as mutações lesivas, preservando potencialmente desta forma a função da proteína (Mendell e Dietz, 2001) . Devido ao fato de que se acredita que a tradução e divisão do RNA ocorrem em dife-rentes compartimentos celulares, era um paradoxo encontrar um mecanismo regulador ascendente do RNAm específico do códon nonsense, que atua independentemente do rompimento intensificador de divisão em células de mamíferos (Wang et a_Z., 2002). Entretanto, tais mecanismos não foram observados nem nas plantas de cevada da presente invenção nem em outras plantas.

NMD, PCT, e similares, são de particular interesse no contexto do cruzamento de plantas porque tais fenômenos aumentam o número de grãos a serem triados para identificar um novo traço de interesse.

Seleção de Mutantes de Cevada

Um aspecto da presente invenção é fornecer condições de triagem para a atividade de LOX-1, onde a atividade de LOX-2 é diminuída. Os métodos baseiam-se na descoberta surpreendente que a natureza do tecido de cevada a ser triado e as condições da reação podem intensificar a atividade de LOXs derivada da enzima LOX-1 e diminuir a da enzima LOX-2. Embora a triagem quanto a mutantes com baixo teor de LOXs, como detalhado no pedido de patente n-PCT/IBOl/00207, publicado como documento n° WO 02/053721A1, em nome de Douma et al., utilizasse um extrato proteináceo das pontas das folhas de cevada, com determinação da atividade enzimática em pH 7,5, a presente publicação detalha parâmetros de triagem vantajosos que permitem identificar de forma reprodutível os mutantes de cevada isentos de LOXs. Em primeiro lugar, quando se efetua a triagem quanto à atividade de LOX-1, é importante que tecidos específicos das plantas de cevada sejam utilizados. De preferência, o dito tecido compreende o grão de cevada, mais preferivelmente embriões de grãos de cevada. Genericamente, a triagem deve ser realizada em um extrato do dito tecido, isto é, um extrato de grãos de cevada ou embriões de cevada. Mais preferivelmente, os extratos para a determinação da atividade de LOX-1 compreendem ou, mais preferivelmente, consistem em tecido de embrião homogeneizado de grãos de cevada desidratados. Desta maneira, apenas a atividade marginal derivada de LOX-2 contribuirá para as determinações da atividade. Em segundo lugar, os ensaios quanto à atividade de LOX-1 são realizados em um pH que, de preferência, inativa as enzimas aleno óxido sintases, produzindo assim HPODEs com bom rendimento.

Cruzamento de Plantas Em uma modalidade da invenção, o objetivo é forne-cer plantas de cevada úteis para uso agronômico, que compreendem o traço de nulidade de LOX-1. O desenvolvimento da cultura pode ser observado como um processo estendido que começa apenas com a introdução do novo traço. Do ponto de vista de um agricultor, esta etapa quase sempre resulta em uma planta que tem um perfil global menos desejável de traços agronômicos do que as variedades comerciais atuais.

Além do traço de nulidade de LOX-1, há outros fatores importantes a serem considerados nas técnicas de 5 gerar uma variedade comercial de cevada para maltagem, como, por exemplo, o rendimento do grão, o tamanho do grão e outros parâmetros referentes ao desempenho da maltagem. Como ) muitos, se não todos, esses traços demonstraram estar sob controle genético, seria altamente desejável fornecer culti- 10 vares para maltagem homozigóticos com alto rendimento, modernos, que resultam de cruzamentos com plantas de cevada isentas de LOX-1, que estão descritas no presente pedido de patente. Os grãos de tais plantas de cevada proporcionam uma matéria-prima nova excelente que não tem qualquer capaci- . 15 dade, ou apenas uma capacidade marginal para a conversão de ácido linoléico em 9-HPODE. O melhorista de cevada, portanto, deve selecionar e desenvolver plantas de cevada que têm traços que resultam em cultivares excelentes com perda de função de LOX-1. Alternativamente, os melhoristas de cevada 20 podem utilizar as plantas da presente invenção para a mutagênese adicional para gerar novos cultivares derivados de cevada isenta de LOX-1. As plantas de cevada de acordo com a presente invenção podem ser cruzadas de acordo com qualquer esquema 25 apropriado.

Cruzamentos de Cevada Outro objeto da presente invenção é fornecer plantas de cevada superiores do ponto de vista agronômico, que compreendem o traço de nulidade de LOX-1. Consequentemente, esta invenção refere-se também a métodos para produzir uma planta de cevada isenta de LOX-1, cruzando uma primeira planta de cevada parental com uma segunda planta de cevada parental, onde a primeira ou a segunda planta é uma cevada isenta de LOX-1. Adicionalmente, a primeira e também a segunda plantas de cevada parentais podem advir de uma variedade de cevada isenta de LOX-1. Assim sendo, qualquer um desses métodos que usam a variedade de cevada isenta de LOX-1 fazem parte desta invenção: autogamia, retrocruza- mentos, cruzamentos com populações, e similares. Todas plantas produzidas usando uma variedade de cevada isenta de LOX-1 como um progenitor estão dentro do âmbito desta invenção, incluindo aquelas desenvolvidas a partir de variedades derivadas de uma variedade de cevada isenta de LOX-1. A cevada isenta de LOX-1 pode ser usada também para transformação genética no casos em que um DNA exógeno é introduzido e expressado na planta ou no tecido vegetal isento de LOX-1.

Métodos de retrocruzamento podem ser usados com a presente invenção para introduzir uma característica de nulidade de LOX-1 de uma planta de cevada mutada dentro de outra variedade, como por exemplo, o cultivar Scarlett ou o cultivar Jersey, sendo ambos cultivares de cevada contemporâneos, de alto rendimento, para maltagem. Em um protocolo de retrocruzamento padrão, a variedade original de interesse (progenitor recorrente) é cruzada com uma segunda variedade (progenitor não-recorrente) que carrega o único gene de interesse a ser transferido. Os progênitos isentos de LOX-1 resultantes deste cruzamento são então cruzados novamente com o progenitor recorrente, sendo o processo repetido até que seja obtida uma planta de cevada na qual essencialmente 5 todas as características especificadas pelo progenitor recorrente sejam recuperadas na planta convertida, além do arranjo genético transferido quanto ao traço de nulidade de I LOX-1 do progenitor não-recorrente. A última geração do retrocruzamento é então autofertilizada para dar a progénie 10 pura do cruzamento quanto ao traço de nulidade de LOX-1 (cf. Figura 9).

Ter um progenitor recorrente apropriado é impor-tante para um procedimento de retrocruzamento exitoso, cuja meta é introduzir o traço de nulidade de LOX-1 dentro da - 15 variedade original. Para realizar isto, o arranjo genético da variedade recorrente é modificado com isso para o traço de baixo teor de LOX-1 do progenitor não-recorrente, e ao mesmo tempo, retendo essencialmente todo o resto dele da variedade original. Embora os métodos de retrocruzamento 20 sejam simplificados quando a característica que está sendo transferida é um alelo dominante, foi possível retrocruzar a do traço recessivo de nulidade de LOX-1, mas neste caso foi necessário introduzir uma análise bioquímica para avaliar se a característica desejada foi transferida.

Uma maneira para acelerar o processo de cruzamento de plantas compreende uma multiplicação inicial de mutantes gerados pela aplicação de técnicas de cultura e regeneração de tecidos. Assim sendo, outro aspecto da presente invenção é fornecer células, as quais, após crescimento e diferen-ciação, produzem plantas de cevada que têm o traço de nulidade de LOX-1. Por exemplo, o cruzamento pode envolver cruzamentos tradicionais, preparar plantas férteis antero- 5 derivadas usar cultura de micrósporos.

Enzimas LOX Um objeto importante da presente invenção é for- I necer plantas que carecem da capacidade de sintetizar a enzima LOX-1 ativa. As LOXs são proteínas monoméricas grandes com um único fator não-ferro heme. A inspeção do Banco de Dados de Proteínas em http//www.rcsb.org/pbd revelou que a estrutura de várias enzimas LOX foi resolvida por cristalografia com raios X. As proteínas compartilham uma organização global de dobra e domínio, cada uma tendo um . 15 domínio menor de barril-β de oito filamentos no terminal N e um domínio maior no terminal C constituído majoritariamente de hélices α longas. 0 átomo de ferro fica localizado no domínio do terminal C, onde ele é coordenado a resíduos de histidina e, singularmente, ao terminal carboxila do polipeptídeo, que acontece ser uma isoleucina. Vários canais levam da superfície da proteína para a vizinhança do sítio de ferro, e eles presumivelmente proporcionam acesso de substratos, ácidos graxos poliinsaturados, e oxigênio molecular, para o sítio ativo. Como a ligação de lipossomas e corpos lipídicos de LOX de corpos lipídicos do pepino depende da presença do barril-β do terminal N (May et al.)m e LOX-1 da soja se liga às membranas bicamadas em um processo que é intensificado por íons cálcio (Tatulian e Steczko, 1998), pode-se especular que as enzimas LOX se ligam às membranas bicamadas lipídicas e que isso é muito possivelmente uma função do domínio do terminal N. Os métodos para determinar a atividade de LOXs, bem como para o isolamento, caracterização e quantificação de produtos diretos e a jusante de catalisadores de LOXs estão prontamente disponíveis para os versados nessas técnicas. Produtos da Via de LOX

Em várias modalidades, a presente invenção refere- se a plantas de cevada, ou produtos delas, bloqueadas na capacidade de formar o alquenal T2N. As enzimas LOX catalisam a dioxigenação de ácidos graxos poliinsaturados com um sistema cis-1,cis-4-pentadieno. Em plantas, os ácidos poliinsaturados de Cie, ácido linoléico (18: 3Δ9,12'15) e ácido a- linolênico (18:2â9'12), são substratos de LOX importantes. A via de lipoxigenases do metabolismo de ácidos graxos é iniciada pela adição de oxigênio molecular na posição C-9 ou C-13 da cadeia acila, produzindo os hidroperóxidos dos ácidos 9- e 13-linoléico ou linolênico correspondentes. Com o ácido linoléico como substrato, os ácidos 9- ou 13- hidroperóxi-octadecadienóicos (HPODEs) podem ser formados, enquanto que os ácidos 9- ou 13-hidroperóxi-octadecatrie- nóicos (HPOTEs) são os produtos quando o substrato é o ácido a-linolênico. Na ramificação hidroperóxido liase da via de LOXs, os 9- e 13-hidroperóxidos podem ser subsequentemente clivados para dar oxoácidos e aldeídos de cadeia curta (cf. Figura 1B).

É perceptível que 9-HPODE pode ser metabolizado adicionalmente para dar 9,12,13-THOE (cf. Figura 1C) , um THOE que tem um sabor amargo (Baur et al., 1977; Baur e Grosch, 1977). Consequentemente, as plantas com LOX-1 inati- vada formarão THOEs em proporções diferentes daquelas observadas em plantas do tipo selvagem.

Reconhece-se que a presente invenção engloba I influenciar a produção de metabólitos a jusante da catálise de LOX-1, que são produzidos, não como um produto direto de 10 uma reação catalisada com LOX-1, mas como resultado de uma reação subseqüente de uma série de reações, envolvendo um produto da catálise de LOX-1. Estas reações incluem a isomerização espontânea, induzida por fatores ou catalisada com enzimas. Assim sendo, a produção desses metabólitos a , 15 jusante poderia ser influenciada modulando a expressão de hidroperóxido liase (HPL).

Supondo que a auto-oxidação do ácido linoléico pode gerar moléculas precursoras relacionadas à formação de T2N, pode ser possível reduzir ainda mais o nível do 20 alquenal. Especificamente, espera-se que a regulação descen-dente dos genes que codificam Δ9-dessaturase (converte ácido esteárico em ácido oléico) ou Δ12-dessaturase (converte ácido oléico em ácido linoléico) altere as proporções relativas dos ácidos graxos de Cie (ácidos esteárico, oléico e 25 linoléico), diminuindo os níveis dos ácidos graxos a jusante da enzima relevante e aumentando os níveis do substrato de ácido graxo intermediário. Foram usados exemplos em que o cruzamento seletivo que utiliza variantes naturais ou mutações induzidas para desenvolver uma série de óleos melhorados em culturas de oleaginosas, incluindo, porém sem limitações, soja com alto teor esteárico (HS) (Graef et al., 1985), colza com alto oléico (HO) (Auld et al., 1992), bem como girassol HS e HO, por Osório et al, (1995) e Soldatov (1976), respectivamente.

É de interesse especial que a invenção engloba a produção de aldeídos que não são produtos diretos da ação de LOX-1, mas são produzidos pela ação de enzimas da via de LOXs, ou pela isomerização de aldeidos, como por exemplo, isomerização de (3Z)-nonenal para (2E)-nonenal, como indicado na Figura 1B. Reconhece-se também que a invenção engloba a produção dos álcoois que correspondem aos aldeídos produzidos como resultado da dita isomerização. Os ditos álcoois são produzidos tipicamente pela ação de membros enzimáticos da superfamília de aldo-ceto redutase (Srivastava et al., 1999), como por exemplo, conversão enzimática de (2E)-nonenal em (2E)-nonenol. Potencial de T2N

Um outro objeto da presente invenção é reduzir ou eliminar moléculas relacionadas à formação de T2N, incluindo a formação de precursores de T2N e adutos de aldeídos. Embora várias reações químicas relacionadas à putrefação da cerveja permaneçam indefinidas, os processos de oxidação são reconhecidos como as principais causas do desenvolvimento do sabor estragado em produtos de cerveja (Narziss, 1986; Ohtsu et al., 1986) . Como descrito detalhadamente na -"Antecedentes da Invenção", sabe-se bem que o maior contribuidor molecular para o sabor putrefato é T2N. Quando este aldeído é gerado no processo de fabricação de cerveja em um estágio de produção antes da fermentação, ele pode participar na formação de adutos através da ligação a, por exemplo, 5 aminoácidos e proteínas (Noêl e Collin, 1995) - mas possi-velmente também ácidos nucléicos, glutationa ou similares - e subsequentemente, serem protegidos da redução ou oxidação levedo fermentativo (Lermusieau et al,, 1999). Entretanto, os adutos de T2N podem ser formados também com sulfito 10 durante a fermentação, tornando o aldeído inativo em sabor (Nyborg et al.t supra).

A maioria dos adutos de T2N são transferidos para a cerveja acabada, na qual T2N livre é liberado (Liégeois et al., 2002), sendo as condições de acidez e temperatura . 15 fatores importantes neste processo. Os adutos de T2N com-preende parte do potencial de T2N, uma medida da degradação de adutos de T2N para dar T2N livre, sob condições de reação definidas, como por exemplo, incubação a 100°C, pH 4,0, por 2 h. Os versados nessas técnicas sabem como relacionar o 20 potencial de T2N como um indicador de como a cerveja liberará T2N durante a estocagem, como descrito, por exemplo, por Drost et al. (supra).

Os grãos de cevada da presente invenção ficam restritos na formação de 9-HPODE catalisada por LOX-1, uma 25 molécula que funciona normalmente como um precursor na ramificação da via de LOXs, que produz T2N. As cervejas produzidas usando os grãos de cevada isentos de LOXs, portanto, não possuirão apenas um nível muito baixo de T2N, mas também um nível muito baixo de potencial de T2N. Estão dentro do âmbito da presente invenção os grãos de cevada isentos de LOX-1, que produzem produtos de cerveja totalmente isentos de T2N, ou contêm níveis insignificantes de potencial de T2N, incluindo adutos de T2N. Consequentemente, não há essencialmente nenhum, ou apenas um insignificante desenvolvimento de desvios de sabor específicos de T2N durante a estocagem da cerveja produzida usando os grãos isentos de LOX-1.

Resistência a Doenças

A presente invenção refere-se ainda a uma cevada resitente a doenças. As LOXs vegetais são consideradas como estando envolvidas no desenvolvimento de mecanismos de resistência a doenças ativas, conhecidos coletivamente como a resposta hipersensível (HR), uma forma de morte celular programada (Rustérucci et al,, 1999). Na resposta hipersensível (HR), um episódio de infecção seguido de rápida morte celular de células vegetais localizadas ao redor do local da infecção, e isto leva à formação de uma lesão necrótica. Desta maneira, a disseminação do patógeno fica limitada e impede lesão adicional do restante do órgão da planta. Em vários sistemas planta/patógeno, a resposta hipersensível (HR) é ligada à expressão de LOXs que têm especificidade para a geração de 9-HPODE e 9-HPOTE (Rustérucci et al., supra; Jalloul et al., 2002), possivel-mente porque a produção maciça de hidroperoxiácidos graxos confere necrose tecidual.

O gene que codifica LOX-1 é expressado principal-mente em grãos de cevada, enquanto que inúmeras enzimas adicionais são expressadas nas folhas das plantas. Conse-quentemente, as ramificações da via de LOXs, que levam à formação de 9-HPODE, 13-HPODE, 9-HPOTE e 13-HPOTE, são funcionais em folhas de cevada, e diferentes conjuntos de oxilipinas refletem episódios de infecção e lesionamento I separados. Um ambiente molecular similar foi descrito para folhas de batata (Weber et al., 1999).

Os aldeidos voláteis de ocorrência natural inibem o crescimento de certos patógenos em plantas, e a resis-tência natural de algumas plantas a um patógeno específico pode ser atribuída à geração de aldeídos voláteis (Croft et al,; Blée e Joyard, 1996; Vancanneyt et al., 2001). Assim . 15 sendo, em relação a plantas do tipo selvagem, o perfil alterado de oxilipinas das plantas de cevada isentas de LOX- 1 da invenção podem impedir, reduzir, melhorar ou eliminara presença de um patógeno, um produto de um patógeno, ou um produto de uma interação planta/patógeno. Um exemplo não 20 limitativo de um patógeno é Aspergillus (vide aqui abaixo).

Assim sendo, em uma modalidade, a invenção refere- se a uma planta de cevada isenta de LOX-1, que apresenta maior resistência a doenças. Micotoxinas

A presente invenção revela também o uso de plantas de cevada com suscetibilidade reduzida à colonização de Aspergillus. Aspergillus é um colonizador prejudicial de grãos de cevada, causando frequentemente contaminação com as micotoxinas carcinogênicas, aflatoxina e esterigmatocistina.

Como a produção de aflatoxina pelo fungo é influenciada por altos niveis de 9-HPODE, 13-HPODE, 9-HPOTE e 13-HPOTE, a patente n2 US 5.942.661, expedida para Keller, reivindica 5 plantas de culturas transgênicas que produzem os ditos hidroperoxiácidos graxos em quantidades suficientes para inibir a produção de micotoxinas fúngicas. Adicionalmente, a dita patente norte-americana, bem como os dados produzidos por Burow et al. (200), especificam que 13-HPODE inibe a produção de aflatoxina, enquanto que 9-HPODE impulsiona a produção de aflatoxina. Como os grãos isentos de LOX-1 carecem da enzima LOX-1 ativa, os ditos grãos contêm niveis ligeiramente mais altos de 13-HPODE do que as plantas do tipo selvagem, mas . 15 também niveis mais baixos de 9-HPODE em relação ao tecido de sua planta parental não modificada geneticamente. Em relação a grãos do tipo selvagem, os grãos isentos de LOX-1 podem, portanto, repelir a colonização de Aspergillus, ou apresentarem niveis reduzidos de micotoxinas após a contaminação 20 com Aspergillus.

Assim sendo, a presente invenção refere-se a plantas de cevada com niveis reduzidos de micotoxinas, em comparação com plantas do tipo selvagem. Fragrâncias

É também um aspecto da presente invenção usar cevada isenta de LOX-1 para a produção de fragrâncias e compostos de notas verdes. Até hoje, a maioria dos esforços investigativos relacionados às várias ramificações da via de ' LOXs em cevada concentrou-se em aspectos de geração do ácido jasmônico a partir de 13-HPOTE (Turner et al., 2002) e na resistência a doenças, como descrito acima. Menos atenção foi prestada para hidroperoxiácidos graxos da cevada com 5 propósitos comerciais alternativos. Entretanto, é perceptível que a total ausência de LOX-1 ativa nos grãos de cevada isentos de LOX-1 deve ser prevista como enriquecendo I 13-HPODE e 13-HPOTE nos ditos grãos. Baseado nesta propriedade inusitada, novas aplicações são possíveis com relação 10 ao uso industrial da cultura de cevada, por exemplo, na produção de aldeídos e álcoois alifáticos de cadeia curta (como por exemplo, os compostos de nota verde hexanal/ hexenal e hexanol/hexenol).

Vários aspectos relacionados à produção de notas . 15 verdes estão descritos, porém sem limitações, nas patentes n— US 6.008.034, 6.150.145 e 6.274.358, que são discutidas. Enquanto a patente n- US 6.008.034, expedida para Hausler et al. descreve o uso de uma hidroperóxido liase específica para a produção de compostos de notas verdes, a patente n” US 6.150.145, expedida para Hãusler et al., e a patente n2 US 6.274.358, expedida para expedida para Holtz et al., descrevem o uso de um material vegetal padrão para tal processo. Usar grãos isentos de LOX-1 para a produção de compostos de notas verdes compreende o uso de uma matéria- prima inusitada para a dita produção. A matéria-prima inusitada derivada dos grãos de cevada isentos de LOX-1 da presente invenção não pode ser considerada um material vegetal padrão, pois ela é derivada de grãos que foram selecionados após um protocolo de mutagênese, como detalhado nas Seções "Mutagênese Química" até "Cruzamentos de Cevada" do presente pedido de patente. O uso industrial de grãos de cevada isentos de LOX-1 é considerado como estando fora do âmbito das reivindicações enunciadas nas patentes descritas nos parágrafos anteriores, principalmente porque a matéria- prima inusitada produzida a partir dos grãos isentos de LOX- 1 da presente invenção melhorará muito nas limitações normais impostas pela geração de 9-HPODE e 9-HPOTE catalisada por LOX-1, dois hidroperoxiácidos graxos que não conseguem funcionar como moléculas precursoras para a geração enzimática das notas verdes cis-3-hexenal e cis-3-hexenol.

Expressão Heteróloga de Genes que Codificam LOX Em várias modalidades, a presente invenção refere- se a plantas de cevada transgênicas, que têm o traço de nulidade de LOX-1. Prevê-se que avanços futuros na engenharia genética de plantas levarão à geração de plantas de cevada com síntese de LOX-1 suprimida. O conceito foi proposto para controlar a formação de desvios de sabor, mas os resultados de tal abordagem não estão relatados (McElroy e Jacobsen, 1995). A invenção aqui descrita pode ser usada em conjunto com tais aperfeiçoamentos futuros para gerar plantas LOX-1 antisense que têm construções antisense complementares a pelo menos uma parte do RNA mensageiro (RNAm) para as seqüências de LOX-1 podem ser construídas. Nucleotídeos antisense são construídos para hibridizarem com o RNAm correspondente, como por exemplo, similares àqueles descritos para a expressão da seqüência da proteína cinase ' SnRKl antisense em cevada transgênica (Zhang et al,f 2001). As modificações das seqüências antisense podem ser feitas desde que as seqüências hibridizem para e interfiram com a expressão do RNAm correspondente. Desta maneira/ as cons- 5 truções antisense que têm 70%, de preferência 80%, mais preferivelmente 85 de identidade de seqüência com as seqüências antisense correspondentes podem ser usadas. Além disso, f partes dos nucleotídeos antisense podem ser usadas para romper a expressão do gene-alvo. Genericamente, seqüências 10 com pelo menos 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos ou maiores podem ser usadas. Assim sendo, a aplicabilidade desta invenção não está limitada apenas às plantas geradas por métodos convencionais de mutagênese.

Embora a substituição de genes visados por inter- . 15 médio de recombinação homóloga seja extremamente fácil em levedura, sua eficiência na maioria dos eucariontes multi- celulares ainda é limitada, e não permite ainda a geração de tais plantas de cevada, bem como a geração de um conjunto de rompimentos de genoma/gene amplo (Parinov e Sundaresan, 20 2000). O silenciamento de genes foi usado recentemente para estudar o papel de ~86% dos genes previstos do genoma de Caenorhabditis elegans em vários processos em desenvolvimento (Ashrafi et al., 2003; Kamath et al., 2003). Para a geração de plantas de cevada com perda de função completa de 25 um gene específico, tal como o gene que codifica LOX-1, o uso do método de interferência de RNA (RNAi) tem várias desvantagens. Elas incluem a falta de herdabilidade estável de um fenótipo, níveis variáveis de atividade gênica residual (Hannon, 2002; Bargman, 2001; Wesley et al., 2001), e a incapacidade de silenciar simultaneamente vários genes não relacionados (Kamath et al., 2000).

As seqüências de nucleotideos da presente invenção podem ser usadas também na orientação sense para suprimir a expressão de genes endógenos que codificam enzimas LOX em plantas. Os métodos para suprimir a expressão gênica em plantas, usando seqüências de nucleotideos na orientação sense, são conhecidos nessas técnicas (vide, por exemplo, patente n- US 5.283.184, expedida para Jorgensen e Napoli). Os métodos envolvem genericamente transformar plantas com uma construção de DNA que compreende um promotor que direciona a expressão em uma planta ligada operacionalmente a pelo menos uma parte de uma seqüência de nucleotideos que corresponde ao transcrito do gene endógeno. Tipicamente, tal seqüência de nucleotideos tem substancial identidade de seqüência com a seqüência do transcrito do gene endógeno, de preferência mais do que cerca de 65% de identidade de seqüência, mais preferivelmente, mais do que cerca de 85% de identidade de seqüência, e com a maior preferência, mais do que cerca de 95% de identidade de seqüência.

Deve-se assinalar que vários aspectos relacionados à expressão heteróloga de genes que codificam enzimas LOX estão descritos e revelados na publicação do pedido de patente n2 US 2003/0074693 Al, em nome de Cahoon et al. Embora o dito pedido de patente enuncie técnicas anteriores com relação a enzimas LOX em cevada , e descrevam inúmeras seqüências de genes que codificam LOX, nenhum dos genes de cevada que codificam LOX-1, LOX-2 e LOX-3 apresenta um grau suficiente de identidade a ser englobado dentro das reivindicações enunciadas no pedido de patente n° US 2003/0074693 Al, em nome de Cahoon et al.

Embora a invenção tenha sido detalhada na descrição precedente, esta última é considerada como tendo caráter ilustrativo e não restritivo, entendendo-se que se deseja que todas mudanças e modificações que venham a estar dentro do espirito da invenção estejam protegidas. Consequentemente, deve ficar óbvio que certas mudanças e modificações, tais como modificações e mutações de um único gene, variantes somaclonais, indivíduos variantes selecionados entre populações grandes das plantas do presente cultivar, e similares, podem ser praticadas dentro do âmbito da invenção, conforme limitadas apenas pelo âmbito das reivindicações apensadas. A invenção será descrita ainda mais fazendo referência aos exemplos específicos que se seguem; eles são fornecidos para ilustrar ainda mais a presente invenção, mas não devem ser interpretados como limitativos do seu âmbito.

Inibidores de LOX

A presente invenção também se refere a métodos para redução ou prevenção da atividade de LOX-1 de cevada. Vários inibidores de LOX podem ser selecionados a partir de classes de inibidores redox e não redox, antioxidantes, agentes que1antes de ferro, compostos contendo imidazóis, derivados de benzopirano, e semelhantes. Portanto, a invenção em uma modalidade refer-se a métodos para reduzir a ativi- dade de LOX de cevada (preferencialmente LOX-1) compreen-dendo as etapas de: (i) fornecer uma planta de cevada ou partes da mesma ou um produto da planta preparado a partir da cevada, (ii) fornecer um inibidor de LOX, (iii)incubar a referida planta de cevada ou partes da mesma ou um produto da planta preparado a apartir da cevada com o referido inibidor de LOX, reduzindo, assim, a atividade do LOX de cevada (preferencialmente, LOX-1).

Em uma modalidade, o dito produto vegetal é malte e o dito inibidor de LOX é adicionado ao dito malte durante o processo de mosturação. Isto resultará, de preferência, em um nível mais baixo de T2N no mosto produzido no dito processo de mosturação.

A dita planta de cevada, ou parte dela, ou um produto vegetal preparado a partir da cevada, pode ser cevada isenta de LOX-1 ou parte dela, ou um produto vegetal preparado a partir da cevada isenta de LOX-1. Entretanto, outras cevadas podem ser, de preferência, usadas com os métodos.

Dentre os vários inibidores de LOX, inibidores de LOX de oxirredução podem ser selecionados a partir de derivados de catecolbutano, tais como qualquer um dos descritos nas patentes n— US 5.008.294, expedida para Jordan et al., 4.708.964, expedida para Allen, e 4.880.637, expedida para Jordan, tal como o ácido nordiidroguaiarético (NDGA) ou um dos seus enantiômeros.

Um inibidor de LOX antioxidante é selecionado vantajosamente entrefenóis, flavonóides, e similares. Um inibidor de LOX antioxidante pode ser selecionado também entre gaiatos, incluindo gaiato de octila. Pode-se confirmar que um composto é realmente um inibidor de LOX por um ensaio descrito no Exemplo 18 abaixo.

Para a indústria, o gaiato de octila é um inibidor conhecido de lipoxigenase de soja (Ha et al., 2004), e é de particular interesse, pois ele está atualmente permitido para uso como um aditivo antioxidante em alimentos (Aruoma et a1., 1993) . Esta propriedade tornou-o de interesse para testar LOX-1 de cevada purificada quanto à atividade na presença do inibidor putativo, gaiato de octila. O interessante é que a presença de gaiato de octila durante a mostu- ração resulta em níveis mais baixos de T2N.

Uma modalidade da presente invenção é, portanto, fornecer um inibidor de LOX-1, bem como seus usos, o qual, após adição a uma mosturação, conferirá niveis reduzidos de T2N.

EXEMPLOS

Os exemplos em questão ilustram modalidades preferidas da invenção e não devem ser considerados como limitativos da invenção.

A menos que diferentemente indicado, foram reali-zadas técnicas básicas de biologia molecular para manipular ácidos nucléicos e bactérias, como descrito em Sambrook et al. (1989) e Sambrook e Russel (2001).

Com o propósito de clareza da descrição, e não a título limitativo, a presente seção de exemplo está dividida nos seguintes tópicos: (i) Triagem e seleção de mutantes (ii) Mutantes de cevada D112 e A618 (iii)Propriedades fisiológicas dos mutantes de cevada D112 e A618 (iv) Mutantes de cevada D112 e A618 são plantas isentas de LOX-1 (v) Mosturação (vi) Produção de malte e cerveja usando malte do tipo selvagem e malte isento de LOX-1 (vii)Ácidos triidróxi-octadecenóicos em cerveja de malte isento de LOX-1 (viii)Ácidos triidróxi-octadecenóicos em cerveja (ix) Caracterização bioquímica de produtos enzimáticos a partir da ação de LOX em cevada (x) O gene de LOX-1 no mutante de cevada Dl 12 é mutado (xi) 0 gene de LOX-1 no mutante de cevada A618 é mutado (xii)Detecção de transcritos de LOX-1 por RT-PCR (xiii)Detecção genética de mutantes de cevada portadores da mutação D112 (xiv)Detecção de mutantes em misturas de amostras (xv) LOX-1 recombinante do mutante D112 é inativa (xvi)Plantas de cevada transgênicas (xvii)Compostos notas verdes (xix)Mosturaçâo com gaiato de octila

EXEMPLO 1

Triagem e Seleção de Mutantes Mutagênese de Cevada Grãos colhidos de plantas de cevada dos cultivares Barke, Celeste, Lux, Prestige, Saloon e Neruda foram incubados separadamente com o mutágeno NaN3, de acordo com os detalhes fornecidos por Kleinhofs et al. (1978). Este procedimento foi escolhido porque ele reconhecidamente induz mutações pontuais no DNA genômico de cevada, e confere substituições ou truncamentos de aminoácidos nas proteínas codificadas pelo DNA mutagenizado.

Nos experimentos de mutagênese da presente invenção, escolheu-se propagar grãos mutados da geração Ml em canteiros no campo através de duas gerações subsequentes, produzindo eventualmente uma alta proporção de plantas homozigóticas com propósitos de triagem (Figura IA) . Esperava-se que os grãos mutantes da geração M3 resultante fossem ocorrer em uma freqüência de 0,9 a 2,3 por 10.000 grãos (Kleinhofs et al., supra). É perceptível que grãos M2 não foram triados, principalmente porque eles contêm uma proporção relativamente alta de mutações pontuais heterozi- góticas.

Triagem O objetivo foi desenvolver um rápido procedimento de triagem com alta produção, para detectar grãos de cevada mutantes M3 que carecem de atividade de LOX-1, para evitar o procedimento de triagem laborioso que usa pontas de folhas que contêm reconhecidamente várias atividades de LOXs (descrito no pedido de patente PCT n- PCT/IB01/00207, publicado como documento n2 WO 02/053721 Al, em nome de Douma et al.) . O foco foi sobre a determinação da atividade de LOXs no embrião, incluindo o tecido do escutelo, de grãos de cevada maduros. Genericamente, as condições do ensaio foram similares àquelas descritas por Anthon e Barrett (2001). O ensaio baseou-se na geração de ácido linoléico e hidrope- róxidos, catalisada por LOX, os quais, em uma reação catalisada com hemoglobina, acoplam de forma oxidante 3-metil-2- benzotiazolinona com ácido 3-(dimetil-amino)-benzóico, resultando na formação de uma cor azul que pode ser medida de forma espectrofotométrica.

Em termos práticos, uma série de ensaios foi iniciada pela homogeneização separada de 96 tecidos de embriões de cevada, incluindo o escutelo, dentro de compo-sições de um pó fino. Eles foram transferidos para placas de estocagem geladas (ABgene), onde cada um dos 96 poços de 1,2 mL continha uma pérola de vidro de 5 mm e 2 00 μL de H20. A placa foi então incubada por 35 segundos em um moinho de laboratório MM 300 (Retsch), ajustado eletronicamente para sacolejar em uma freqüência de 27 s-1. Subsequentemente, a placa foi centrifugada a 4.000 rpm em uma Centrífuga Allegra 6R (Beckman-Coulter) por 15 min a 4°C, para precipitar o material insolúvel, e depois disso, mantida sobre gelo por no máximo 120 min, até processamento posterior.

A placa de 96 poços foi transferida para uma "Biomek 2000 Laboratory Automation Workstation" (Beckman- Coulter) , que foi programada para pipetar, de acordo com o ensaio de LOX descrito por Anton e Barrett (supra). Eventualmente, 96 extratos de embriões de 26 μL foram transferidos para uma placa padrão de microtitulação de 96 poços (Nunc) t e em seguida, adição de 90 μL de Reagente A [ácido 3~(dimetil-amino)-benzóico 12,5 mM, ácido linoléico 0,625 mM (preparado como detalhado no Exemplo 9)] e 90 μL de Reagente B (3-metil-2-benzotiazolino-hidrazona 0,25 mM, 0,125 mg/mL de hemoglobina). 0 Reagente A foi preparado primeiramente misturando 155 μL de ácido linoléico, correspondente a 134 mg de ácido livre (Sigma, L-1376) e 257 μL de Tween-20, e depois adicionou-se água para dar um volume de 5 mL, e em seguida, foram adicionados 600 μL de NaOH 1 M, e quando a solução ficou límpida, ela foi ajustada até 20 mL com mais H2O. A595 foi medido em cada um dos 96 poços da placa, usando um espectrofotômetro Fluorostar Galaxy (BMG Labtechnologies), sendo a formação da cor de produtos hidroperóxidos uma medida da atividade de LOX total presente [as atividades são dadas consequentemente em unidades A595 (U A595) ] .

Identificação de Mutantes Potenciais Grãos de cevada do cultivar Barke (derivados de um total de 2.160 linhagens), cultivar Celeste (2.867 linhagens), cultivar Lux (2.625 linhagens, cultivar Prestige (1.379 linhagens), cultivar Saloon (1.743 linhagens), e cultivar Nevada (3.780 linhagens), foram triados quanto às atividades de LOXs, com o objetivo de identificar grãos altamente reduzidos na dita atividade quando comparados com grãos do tipo selvagem. Um total de 90 mutantes potenciais crus foram identificados na geração M3 [cultivar Barke (12 linhagens, cultivar Celeste (38 linhagens), cultivar Lux (9 linhagens), cultivar Prestige (16 linhagens), cultivar Saloon (12 linhagens) , e cultivar Neruda (3 linhagens). Os grãos de cada um destes mutantes foram propagados para a geração M4, colhidos, e depois triados novamente quanto ao traço de atividade de LOX muito baixa. Eventualmente, apenas uma linhagem do cultivar Barke, denotado mutante Dl12, e uma linhagem do cultivar Neruda, denotado mutante A618, demonstraram apresentar a dita atividade de LOX total muito baixa.

Foram realizadas medições detalhadas das atividades de LOX com extratos de grãos quiescentes maduros, nos quais a atividade de LOX foi conferida quase exclusivamente por LOX-1 (Schmitt e van Mechelen, 1997) . Para os embriões de grãos M3 maduros desidratados do mutante Dl12, a atividade de LOX total, determinada pelo ensaio colorimétrico de LOX descrito acima (cf. Figura 2; Tabela 1), foi de 0,407 ± 5,8% U As95/embrião, enquanto que para o cultivar Barke foi de 1,245 ± 7,6% U A595/embrião. Em um segundo conjunto de experimentos, a atividade de LOX em extratos de embriões de grãos maduros desidratados da geração M3 do mutante A618 foi de 0,221 ± 2,6% U Asjs/embrião, enquanto que encontrou-se 0,721 ± 3,6% U A595/embrião em extratos do cultivar Neruda do tipo selvagem (Figura 3; Tabela 1).

EXEMPLO 2

Mutantes de Cevada Dl12 e A618 Foram conduzidas análises para estabelecer se as plantas isentas de LOX-1 das gerações M4 e M5 eram homozi- góticas para o fenótipo mutante correspondente. Este tipo de análise foi útil para a determinação da natureza recessiva ou dominante da mutação de interesse na geração M3. Em outras palavras, se as plantas da geração M3 fossem hetero- zigóticas para uma mutação dominante, então as gerações subseqüentes segregariam quanto a esse fenótipo.

A atividade total de LOXs foi medida em embriões das gerações M3, M4 e M5 dos mutantes de cevada D112 e A618, e as atividades foram comparadas com aquelas de embriões do cultivar Barke e do cultivar Neruda, respectivamente. A determinação da atividade de LOXs foi como descrito no Exemplo 1 do presente relatório descritivo. Em todos experimentos, extratos-padrão de embriões do cultivar Barke, bem como extratos-padrão inativados com calor de embriões do cultivar Barke, foram usados como amostras de controle.

Para os embriões de grãos da geração M4 do mutante D112, a atividade de LOXs total média era de 0,334 ± 1,5% U A595 (n = 12), e aquela de embriões da geração M5 do mutante D112 era 0,294 ± 4,1% U A595 (n = 90) . Para comparação, os embriões do cultivar Barke do tipo selvagem da geração M4 e da geração M5 produziram 0, 738 ± 3,2% U A595 (n = 2) e 0,963 ± 2,1% U A595 (n = 4), respectivamente (cf. Figura 4; Figura 5; Tabela 1, Experimento 1).

Os embriões da geração M4 do mutante de cevada A618 produziram uma atividade de LOXs média de 0,222 ± 2,1% U A595 (n = 4). Outros resultados deste experimento revelaram que a atividade de LOXs em embriões do cultivar Neruda foi de 0, 684 ± 5,8% U As95 (n = 90). Os resultados estão resumidos na Figura 6 e na Tabela 1, Experimento 2.

Resumindo, os dados experimentais confirmaram que os grãos das gerações M4 e M5 do mutante D112 eram homozi- góticos para o traço genético específico para uma atividade de LOXs total muito baixa. A mesma propriedade foi demonstrada para os grãos da geração M4 do mutante A618.

EXEMPLO 3

Propriedades Fisiológicas dos Mutantes de Cevada D112 e A618 Propagação da Planta na Estufa Grãos do cultivar Barke e do mutante Dl 12 (gerações M4 e M5) foram germinados e desenvolvidos em uma estufa sob 20 h de iluminação a 12°C em uma umidade relativa de 65%. As características do crescimento das plantas do mutante D112 e do cultivar Barke do tipo selvagem eram similares com relação à estatura das plantas, número de grelos por planta, início da antese e número de grãos por espiga. Portanto, não se pode apenas concluir que o mutante D112 tem uma fisiologia de crescimento de uma planta selvagem, mas também um desenvolvimento normal dos grãos.

Os grãos do mutante A618 da geração M4 e os grãos do cultivar Neruda foram germinados e desenvolvidos em uma estufa sob condições de iluminação/escuridão de 20 h/4 h a 12°C e uma umidade relativa de 65%. Comparando o mutante A618 com o cultivar Neruda, nenhuma diferença foi observada com relação à estatura das plantas, número de grelos por planta, início da antese e número de grãos por espiga. Entretanto, os grãos do lado dorsal do mutante A618 diferiam da progenitora do cultivar Neruda em uma estrutura anormal semelhante a um buraco. Resumindo, pode-se concluir que o mutante A618 apresenta uma fisiologia de crescimento da planta semelhante ao tipo selvagem, mas um desenvolvimento anormal dos grãos.

Desempenho Agronômico do Mutante Dl12 sob Condições de Campo Plantas do mutante 112 e do cultivar Barke foram comparadas em testes de campo para identificar possíveis diferenças com relação à estatura das plantas, duração do ciclo vegetative, resistência a doenças, acamamento, rompimento da exina, tempo de maturação e rendimento (vide Tabela 2).

Os testes foram realizados de acordo com procedimentos padronizados para testes de campo. Consequentemente, quantidades iguais de grãos do mutante Dl 12 e do cultivar Barke foram semeados em canteiros de 7,88 m2 em 2 locais, cada um compreendendo 3 replicações. As características dos dados agronômicos, com ênfase nas propriedades descritas acima, foram observadas cuidadosamente durante a estação de crescimento inteira. Nenhuma diferença com relação aos traços agronômicos foi observada, nem para o mutante Dl 12, nem para o cultivar Barke.

EXEMPLO A

Os Mutantes D112 e A618 são Plantas Isentas de LOX-1 Análises de Proteínas As análises que se seguem foram realizadas para caracterizar o fenótipo mutante dos mutantes D112 e A618. Foram realizadas análises Western blot de extratos de embriões removidos de grãos de cevada quiescentes. Um embrião foi extraído em 300 μL de água gelada em um almofariz, os extratos foram transferidos para um tubo de microcentrifugação e centrifugados a 10.000 x g. Alíquotas de amostras compreendendo 10 μg de extratos brutos foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida/dodecil- sulfato de sódio (SDS-PAGE), de acordo com as descrições fornecidas por Laemmli (1970). As proteínas separadas foram, depois disso, transferidas para membranas de nitrocelulose por maculação semi-seca, como detalhado por Towbin et al. (1979). A mancha recebeu sonda de uma diluição 1:500 do anticorpo monoclonal 5D2 específico de LOX-1 (Holtman et al., 1996), e em seguida, por incubação com anticorpo caprino anti-camundongo acoplado à fosfatase alcalina, e detectado com os substratos de fosfatase alcalina, nitro azul de tetrazólio e fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila, como descrito por Holtman et al. (supra). LOX-1 foi reconhecida pelos anticorpos 5D2 em extratos dos embriões do cultivar Barke, e a proteína migrou em SDS-PAGE similarmente aos de LOX-1 do cultivar Barke.

LOX-1 imunodetectável estava ausente nas amostras do mutante D112, mas a proteína pôde ser identificada em extratos do cultivar Barke, linhagem G mutante, e do cultivar Vintage. As análises Western blot do cultivar Barke e das linhagens progênitas do mutante D112 da geração M4 revelaram que a proteína LOX-1 estava presente em grãos dos embriões do cultivar Barke, mas não em qualquer um dos grãos progênitos do mutante D112 (Figura 7), confirmando assim que

O traço de nulidade de LOX-1 é geneticamente estável. Os dados foram estatisticamente significantes, como determinado por um teste qui (%) ao quadrado (p < 3,84).

O mutante A618 e o cultivar Neruda foram analisados quanto à proteína LOX-1 em embriões das gerações M3 e M4, como descrito acima. A proteína LOX-1 pôde ser detectada em extratos de embriões do cultivar Neruda em ambas gerações. Entretanto, uma banda da proteína LOX-1 muito tênue foi observada no mutante A618 bruto e também nos embriões das linhagens progênitas (Figura 8), possivelmente por causa de reação cruzada com outras enzimas LOX.

Retrocruzamento

Usou-se retrocruzamento repetido para transferir o fenótipo de nulidade de LOX-1 do mutante D112 para um progenitor recorrente (cf. Figura 9) , no caso do presente relatório descritivo, o cultivar Prestige. O programa de retrocruzamento foi planejado como ilustrado na Figura 9, combinado com seleção quanto ao traço de interesse. O objetivo era substituir progressivamente o genoma do mutante Dl12 por aquele do progenitor recorrente. Desta maneira, outras mutações potenciais desvantajosas, introduzidas no genoma do mutante Dl 12 durante o tratamento de mutagênese com NaNj, podem ser eliminadas.

No primeiro retrocruzamento do mutante Dl12 homo- zigótico isento de LOX-1 (denotado genótipo nn) para o cultivar Prestige (denotado genótipo NN), esperava-se que as linhagens progênitas compreendessem um genótipo heterozigó- tico (denotado genótipo Nn). É digno de nota que um fenótipo com baixo teor de LOX, devido à sua natureza recessiva, escaparia da detecção nessas linhagens que são heterozigóticas para a mutação. Esperava-se que as plantas progênitas autopolinizadas produzissem uma população de plantas que segregariam em um padrão mendeliano normal, a saber, na razão 1 NN : 2 Nn : 1 nn. Esperava-se que o genótipo nn homozigótico, que compreende o genótipo de nulidade de LOX- 1, e resultante do primeiro retrocruzamento, compreendesse 50% do fundo genético do cultivar Prestige. Depois de 10 rodadas de retrocruzamento, esperava-se que o fundo parental recorrente atingisse um valor de até -99,9%.

As plantas de cevada do cultivar Prestige e do mutante D112 isento de LOX-1 foram propagadas em uma estufa durante o programa de retrocruzamento inteiro. Os grãos da progénie retrocruzada foram analisados quanto à presença da proteína LOX-1 em extratos de embriões, como descrito no Exemplo 1. A frequência esperada do fenótipo de nulidade de LOX-1 na progénie em segregação da primeira e segunda gerações do retrocruzamento foi de 25% para uma mutação recessiva (Figura 10) . Usando a análise Western blot como base para detecção de linhagens mutantes de cevada que carecem da banda da proteína LOX-1, a freqüência na geração do primeiro retrocruzamento correspondeu a 3 linhagens de um total de 28 linhagens retrocruzadas. Na geração do segunda retrocruzamento, 9 linhagens de um total de 28 linhagens retrocruzadas careciam da banda da proteína LOX-1 na análise Western blot (Figura 10) > Como o fundo parental recorrente monta em cerca de 75% na progénie do segundo retrocruza- mento, a co-herança do gene mutado para LOX-1 e o fenótipo de nulidade de LOX-1 correspondente forneceram informações quanto à sua ligação genética. Um teste de qui (/) ao quadrado revelou que os dados observados poderiam ser classificados como sendo estatisticamente significantes. O valor de p foi baixo (< 3,84), uma propriedade que demonstrou significância para a primeira, a segunda, a terceira e a quarta geração dos retrocruzamentos.

O programa de retrocruzamento demonstrou que o alelo mutante, que confere o fenótipo de nulidade de LOX-1, pode ser transferido para um fundo genético alternativo, e que ele foi herdado de uma maneira recessiva monofatorial, seguindo a segregação mendeliana.

EXEMPLO 5

Mosturação Preparação do Mosto Para testar as propriedades de novos cultivares de cevada, foram produzidas amostras de 25 a 225 g de seu malte. Usando um sistema de mosturação de laboratório, que compreendia um agitador externo e um banho de água equipado com um termostato capaz de ascender a temperatura em um gradiente bem definido, a mosturação foi realizada em pequena escala. A pasta final foi filtrada usando um papel de filtro. A fervura do mosto foi realizada em escala de laboratório, usando uma manta de aquecimento e um frasco com fundo redondo conectado a um resfriador de refluxo.

EXEMPLO 6

Produção de Malte e Cerveja Usando Malte de Cevada do Tipo Selvagem e Mutante As cevadas do cultivar Barke e do mutante Dl 12 foram propagadas no campo por várias estações, a fim de obter material em grãos suficiente para maltagem e fermentação. A análise da cerveja acaba quanto a T2N, bem como a análise organoléptica, demonstraram a melhor estabilidade do sabor da cerveja fermentada com o malte do mutante Dl12. Maltagem de Grãos Derivados do Mutante D112 e do Cultivar Barke

A maltagem foi realizada em uma escala de 20 kg, em uma sala de maltagem, da seguinte maneira: grãos de cevada do mutante D112 (colhidos em 2003), grãos do cultivar Barke (colhidos em 2002). As condições de maceração foram: 8 h úmido; 14 h seco; 8 h úmido; 10 h seco; 4 h úmido em água de maceração a 16°C. As condições de maltagem foram: 12 h a 18°C; 24 h a 16°C; 24 h a 14°C; 60 h a 12°C. As condições de secagem foram: 12 h a 60°C; 3 h a 68°C; 4 h a 74°C; 3 h a 80°C.

Os dados das análises da maltagem, usando amostras de malte derivadas do mutante Dl 12 e do cultivar Barke, estão comparadas na Tabela 3. Os resultados demonstraram que os maltes do mutante Dl12 e do cultivar Barke atenderam às especificações do malte, e confirmaram que os maltes eram apropriados para fermentação. Uma redução significativa nos niveis de T2N foi observada no malte do mutante Dl12, em comparação com o malte do cultivar Barke, correspondendo a uma redução de ~642> (Tabela 4).

Fermentações com Malte do Mutante D112 e do Cultivar Barke As fermentações foram realizadas em uma escala de 50 L, e envolveram as seguintes etapas: (i) preparação do mosto; (ii) separação do mosto; (iii) fervura do mosto; (iv) fermentação; (v) clarificação (lagering) ; (vi) filtração da cerveja clara; e (vii) engarrafamento. O mosto foi preparado usando malte do mutante D112 ou o malte do cultivar Barke, sendo este último usado como amostra referencial. Para cada fermentação, foi usado um total de 13,5 kg de malte. A mosturação foi a 47 °C por 20 min, em seguida 18 min de aquecimento, quando a temperatura foi elevada de 48°C para 67°C; 30 min de pausa a 67°C; depois, aquecimento até 72°C por 5 min; 15 min de pausa a 72°C; aquecimento até 78°C por 6 min; pausa de 5 min a 78°C. As etapas na fabricação de cerveja de filtração e fervura do mosto, separação do sorvedouro, fermentação, clarificação e embalagem em garrafas de vidro verde foram de acordo com as especificações para a prática de fabricação padronizada de cerveja. Foram engarrafados 33 L de cerveja no total.

Estabilidade do Sabor e Análises de T2N A cerveja foi produzida usando os maltes do mutante Dl 12 e do cultivar Barke, como descrito acima. A cerveja recém-engarrafada foi estocada a 5°C e analisada dentro de 2 meses após a produção. A estabilidade do sabor das cervej as fresca e estocada foi avaliada depois de dois tipos diferentes de condições de estocagem das cervejas. Em uma série experimental, a cerveja foi submetida a um processo de envelhecimento forçado a 37°C por um periodo de 1 a 4 semanas.

Os níveis de T2N das amostras de cerveja foram determinados por cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massas, depois da derivação de carbonilas com O-(2,3,4,5,6-pentaflúor-benzil)-hidroxilamina, essencialmente como descrito por Grõnqvist et al. (1993).

Um grupo de provadores de cerveja treinados avaliou a pontuação (score) global do sabor da cerveja. Os exames incluíram a detecção de um sabor de papelão, indicativo de T2N livre na cerveja. Deve-se assinalar que ambos tipos de cerveja fresca continham níveis similares de sulfito, a saber, 4 ppm e 5 ppm de sulfito para a cerveja derivada a partir dos maltes do mutante Dl 12 e do cultivar Barke, respectivamente.

Envelhecimento Forçado A cerveja engarrafada produzida a partir do malte do cultivar Barke e a cerveja engarrafada produzida a partir do malte derivado do mutante Dl12 foram examinadas e comparadas com respeito a dados específicos sobre o desenvolvimento de T2N livre durante o envelhecimento forçado, como indicado na Figura 12A e na Tabela 5. Observa- se que as cervejas podem ser distinguidas pelas diferenças acentuadas na cinética do desenvolvimento de T2N. Embora a cerveja referencial tenha se desempenhado como esperado, um desenvolvimento inesperado e acentuadamente baixo de T2N foi observado na cervej a derivada do mutante Dl12, correspondente a 0,01 ppb durante 4 semanas a 37°C.

O experimento de envelhecimento forçado enfatizou a diferença entre as duas cervejas. Já depois de 2,5 semanas, o nivel de T2N da cerveja referencial excedeu o nive1-1imite do sabor, enquanto que aquela produzida usando o malte do mutante D112 estacionou em um patamar de contração de T2N de 0,25 ppb depois de 2 a 3 semanas de incubação.

Quanto ao gosto e à estabilidade do sabor, um grupo de especialistas em sabor avaliaram a cervej a produzida usando o malte do mutante de cevada D112 isento de LOX-1. O foco foi sobre as amostras de cerveja que tinham sofrido envelhecimento forçado a 37°C. Os avaliadores do sabor encontraram perfis de sabor satisfatórios para ambos tipos de cerveja, a fresca recém-preparada e a que sofreu envelhecimento forçado (1 semana a 37°C). Entretanto, as pontuações do sabor semelhante a papel foram mais altas para a cerveja referencial do que para aquela produzida a partir do malte do mutante de cevada Dl 12 isento de LOX-1 (pontuação de aceitação do sabor, Tabela 5).

Após incubação a 20°C por 12 meses, um grupo de 10 avaliadores de sabor, que eram especialistas e treinados para saborear desvios de sabor em cervejas, comparou cervejas produzidas a partir do malte do mutante D112 isento de LOX-1 e o malte do controle. Todas avaliações, incluindo características de sabor tais como "Semelhante a Papel", "Oxidado", "Envelhecido", "Semelhante a Pão", "Caramelo",

"Queimado", e "Doce", revelaram níveis mais altos dos desvios de sabor específicos do envelhecimento nas cervejas do controle do que naquelas fabricadas com o malte isento de LOX-1 (Figura 12B).

E usando uma classificação em uma escala de 0 a 5, onde os valores altos são preferidos, a pontuação de aceitação do sabor geral foi julgada como sendo 1,0 e 2,0 para a cervej a do controle e para aquela produzida com o malte da cevada mutante Dl 12 isento de LOX-1, respectivamente.

Resumindo, a melhor estabilidade do sabor da cerveja fermentada a partir do malte de cevada mutante D112 é notável, principalmente devido aos baixos níveis de T2N na cerveja após estocagem a 37°C. O teste de produção de cerveja que se concentrou no uso do malte de cevada isento de LOX-1 forneceu evidência de que a ação de LOX-1 da cevada durante os processos de maltagem e fermentação constitui um determinante importante para o aparecimento de T2N, um composto de desvio de sabor importante na cerveja envelhecida .

EXEMPLO 7

Ácidos Triidróxi-octadecenóicos em Cerveja de Malte Isento de LOX-1 Os ácidos triidróxi-octadecenóicos (THAs; podendo ser abreviados também THOEs) específicos de cervejas, derivados do ácido linoléico, foram descritos 30 anos atrás (Drost et al., 1974). Desde então, vários relatórios verificaram que o teor total de THAs na cerveja fica na faixa entre 5,7 e 11,4 μg/mL (Hamberg, 1991; e referências lá citadas). Embora 9, 12, 13-THA constitua normalmente 75-85% dos THAs na cerveja, o teor de 9,10,13-THA é normalmente apenas 15-25%. Outros isômeros são encontrados em quantidades na faixa de traços.

Na cerveja produzida a partir do malte do mutante D112 de cevada (isto é, malte isento de LOX-1), a concentração de 9,12, 13-THA foi reduzida para 20% (isto é, quase 5 vezes) em comparação com a cerveja referencial fabricada a partir do cultivar Barke (Tabela 6) , isto é, os isômeros 9,12,13-THA e 9,10,13-THA estão presentes em quantidades quase iguais na cerveja produzida usando o malte do mutante D112 isento de LOX. Estas medições foram conduzidas usando análises padronizadas por espectrometria de massas - HPLC.

EXEMPLO 8

Ácidos Triidróxi-octadecenóicos em Cerveja A concentração de THAs em uma ampla série de amostras de cervejas disponíveis no mercado está indicada na Tabela 7. Uma inspeção cuidadosa do resultado sobre THAs em amostras de cervej a, como indicado na Tabela 7, revelou que a razão de 9,12,13-THA para 9,10,13-THA sempre excedeu 3,5. Em contraste, na cerveja produzida a partir de D112, a razão de 9,12,13-THA para 9,10,13-THA é 1,3. Assim sendo, a cerveja produzida a partir da cevada isenta de LOX-1 compreende uma razão significativamente mais baixa, e a determinação da razão 9,12, 13-THA para 9,10,13-THA fornece uma ferramenta para determinar se uma cerveja é produzida usando malte de mutantes de cevada isentos de LOXs, como por exemplo, aquele do mutante de cevada Dl12. É perceptível que a cerveja produzida com o malte derivado do mutante D112 de cevada isento de LOX-1 tem um nível total significativamente mais baixo de 9,12,13-THA, em comparação com a cerveja produzida a partir de malte normal.

EXEMPLO 9

Caracterização Bioquímica de Produtos Enzimáticos Produzidos a Partir da Ação de LOXs em Cevada Os grãos maduros de cevada do tipo selvagem contêm duas atividades de LOXs principais, derivadas das enzimas LOX-1 e LOX-2. As enzimas catalisam a dioxigenação do ácido linoléico para dar ácidos hidroperóxi-octadecadienóicos (HPODEs), sendo que a enzima LOX-1 catalisa a formação de 9- HPODE e a enzima LOX-2 catalisa a formação de 13-HPODE. No grão maduro, a atividade derivada de LOXs fica confinada no embrião. Para examinar como as mutações no gene de LOX-1 afetam a formação de HPODEs, extratos de embriões do cultivar Barke e extratos similares da linhagem G de cevada (grãos com baixo teor de LOXs, pedido de patente PCT n2 PCT/IB01/ 00207, publicado como documento n2 WO 02/053721A1, em nome de Douma et al.), bem como extratos de embriões do mutante D112 isento de LOXs, foram estudados por análise de cromatografia de líquidos sob alta pressão (HPLC).

Embriões de Cevada As preparações de extratos proteicos brutos de embriões foram preparadas primeiramente dissecando os órgãos de grãos de cevada maduros, usando um escalpelo para cortar entre o escutelo e o endosperma. Cada amostra, consistindo em 4 embriões, foi então colocada entre dois pedaços de papel de pesagem, e martelada suavemente para produzir uma farinha homogênea. Este material foi transferido para um tubo de microcentrifugação de 1,5 mL, adicionou-se 600 μL de um tampão de ácido lático 200 mM, pH 4,5, e o tubo foi colocado sobre gelo por 10 min, antes de uma homogeneização adicional, usando um pilão de plástico (Kontes). Subsequentemente, 600 μL de água foram adicionados a cada tubo e as amostras foram centrifugadas por 2 min a 20.000 x g. Uma aliquota de 100 μL do sobrenadante resultante foi transferida para um tubo de centrifugação de 15 mL [Cell star (N2 do Catálogo 1888271) adquirido da Greiner Bio-One], para preparar para análise dos produtos da reação após a ação de LOX. Foram adicionados 2 mL de um tampão de fosfato de sódio 100 mM, pH 6,5, contendo ácido linoléico 260 μM [o substrato foi preparado misturando 10 mL de uma solução 100 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 6,5, com 100 μL de uma solução de insumo de ácido linoléico 24 mM. Esta última foi preparada primeiramente misturando 155 μL de ácido linoléico (correspondente a 134 mg de ácido livre; L-1376, Sigma) e 257 μL de Tween-20, e depois adicionando H2O até um volume de 5 mL, e em seguida, adição de 600 μL de NaOH 1 M, e quando a solução ficou limpida, o volume final foi ajustado para 20 mL com H2O]. Depois de uma incubação de 15 min em um vascolejador rotativo, 2 mL de acetato de etila foram adicionados e o conteúdo da amostra foi misturado sob vascolejamento intenso por 5 segundos, para extrair 9-HPODE e 13-HPODE. A amostra foi então centrifugada por 10 min a 800 x g, e 1 mL de acetato de etila foi transferido para um tubo de microcentrifugação de 1,5 mL, no qual o acetato de etila foi evaporado sob uma corrente de gás nitrogênio. Subseqüentemente, os HPODEs foram recolocados em suspensão em 300 μL de metanol, e filtrados através de uma membrana de 0,45 μm (filtro Millex-HN, Millipore).

A análise do teor de HPODEs foi realizada por HPLC. Um total de 15 μL de cada amostra foi injetado para dentro do aparelho de HPLC (Série HP 1100, Hewlett Packard), equipado com uma coluna Symmetry C18 de 4, 6 x 250 mm (Waters). A fase móvel usada foi uma mistura 16:12:12:10:0,5 (v:v:v:v:v) de água:metanol:acetonitrila:tetraidrofurano:ácido triflúor- acético. A vazão da fase móvel foi de 1 mL/min e a pressão medida na frente da coluna foi de 140 bar. A separação foi realizada a 30°C. A detecção de hidroperóxidos com ligações duplas conjugadas foi realizada a 234 nm. Uma amostra-padrão compreendeu uma mistura de ácido 9 (S)-hidroperóxi- 10(E),12(Z)-octadecadienóico [9(S)-HPODE] e ácido 13 (S)- hidroperóxi-9(Z),11(E)-octadecadienóico [13 (S)-HPODE], como detalhado na Figura 13A. As análises dos cromatogramas revelaram que se formou principalmente 9-HPODE pelas enzimas LOXs extraídas de embriões maduros de cevada do cultivar Barke (Figura 13B), enquanto que 9- e 13-HPODE foram formados em extratos de embriões maduros da linhagem G com baixo teor de LOXs (Figura 13C). Os extratos de embriões do mutante D112 formaram quantidades muito baixas de 9-HPODE, mas altas quantidades de 13-HPODE, verificando assim a ausência da atividade de LOX-1 (Figura 13D). Consequentemente, os extratos de embriões do mutante D112 formaram muito menos 9- HPODE do que aqueles das linhagens de cevada do tipo selvagem.

Malte de Cevada O malte de cevada contém duas atividades de LOXs principais, derivadas de LOX-1 e LOX-2. Quando LOX-1 catalisa a formação de 9-HPODE, a ação de LOX-2 gera 13- HPODE. Para examinar o efeito de mutações nos genes que codificam LOXs sobre a formação de EPODE em extratos de malte, foram realizadas análises por HPLC com extratos preparados a partir do malte derivado do cultivar Barke, da linhagem G com baixo teor de LOXs, e do mutante Dl12.

As amostras de extrato protéico bruto do malte foram preparadas da maneira que se segue. Um grão de cevada maltada foi colocado entre dois pedaços de papel de pesagem, e martelado suavemente para produzir uma farinha homogênea. Todos os manuseios, misturas de incubação e métodos de análise por HPLC foram idênticos àqueles descritos na seção anterior do presente exemplo referente à medição de produtos de LOXs em extratos de embriões.

Para a análise por HPLC, usou-se uma mistura padrão de ácido 9(S)-hidroperóxi-10(E),12(Z)-octadecadienóic o [9 (S)-EPODE] e ácido 13(S)-hidroperóxi-9(Z),11(E)-octade- cadienóico [13(S)-EPODE], como ilustrado na Figura 14A. A análise da atividade formadora de HPODEs em extratos do cultivar Barke maltado, de baixo teor de LOXs e D112 demonstraram uma distribuição de 60:40 das atividades formadoras de 9- e 13-HPODE no malte do cultivar Barke (Figura 14B), alguma atividade formadora de 9-HPODE no malte derivado da cevada com baixo teor de LOXs (Figura 14C), e niveis muito baixos de formação de 9-HPODE no malte do mutante D112 (Figura 14D). Estes dados demonstram uma formação acentuadamente mais baixa de 9-HPODE nos extratos de malte do mutante D112, do que nos extratos de malte derivados de outras linhagens de cevada.

EXEMPLO 10

O Gene de LOX-1 no Mutante D112 de Cevada está Mutado A seqüência de nucleotideos do gene de LOX-1 no mutante D112 [SEQ ID NO: 2] e no cultivar Barke [SEQ ID NO: 1] foram obtidas e comparadas, para determinar a base molecular para o fenótipo de nulidade de LOX-1 do mutante Dl 12, que se caracterizou pela ausência da enzima LOX-1 correspondente no grão.

O DNA genômico da cevada do mutante Dl 12 e do cultivar Barke do tipo selvagem foram isolados a partir de tecidos foliares de mudas, usando o Kit de Isolamento de DNA Vegetal (Roche Applied Science), de acordo com as recomendações do fabricante. Uma seqüência de 4.224 pares de bases (pb) que flanqueia a região codificadora da proteína para LOX-1 no DNA genômico do mutante Dl 12 e do cultivar Barke foi ampliada por PCR, usando os iniciadores 5'>GAAAGCGAGGAGAGGAGGCCAAGAACCAA<3' [SEQ ID NO: 9] e 5' >TTATTCATCCATGGTTGCCGATGGCTAGA<3' [SEQ ID NO: 10]. A base para as seqüências dos iniciadores foi a seqüência genômica do gene para LOX-1 (van Mechelen et al.f 1995; Rouster et al., 1997; um desenho esquemático da seqüência genômica que cobre os códons de iniciação e interrupção da região que 5 codifica LOX-1 está ilustrado na Figura 15) . As reações de

PCR consistiram em 100 ng de DNA genômico em um volume de 20 μL, contendo 5 pmol de cada iniciador e 3,5 U de polimerase Expand High Fidelity (Roche Applied Science). As ampliações por PCR foram conduzidas em um aparelho de ciclagem MJ, 10 usando os seguintes parâmetros dos ciclos: 2 min a 96°C por 1 ciclo; 1 min a 95°C, 1 mina 69°C, e 5 min a 72°C por 30 ciclos; 10 min a 72°C por 1 ciclo. Os produtos da PCR foram separados em géis de agarose a 1%. Os fragmentos de DNA, correspondentes em comprimento à região ampliada, foram . 15 purificados usando o kit de extração em gel Qiaex II (Qiagen), e inseridos dentro do vetor plasmidico pCR2.1-TOPO ♦ (Invitrogen). A seqüência de nucleotídeos de ambos filamentos das regiões codificadoras foi determinada usando a reação de terminação de cadeia com didesoxinucleotídeo, com iniciadores 20 de oligonucleotídeos específicos, e analisadas em um seqüenciador de DNA MegaBACE 1000 (Amersham). As comparações de seqüências foram realizadas usando o pacote do programa de software de análise de seqüências Lasergene, versão 5 (DNASTAR).

Em uma comparação direta entre a seqüência para LOX-1 do cultivar Barke do tipo selvagem [SEQ ID NO: 1] e do mutante D112 [SEQ ID NO: 2], a seqüência de nucleotídeos do mutante revelou uma mutação pontual na forma de uma substituição G—>A na posição 3.574 no éxon 7 (Figura 15; Figura 16). A seqüência do tipo selvagem para LOX-1 codifica uma proteina com um comprimento de 862 resíduos [SEQ ID NO: 3] , com uma massa prevista de 96,4 kDa. Em contraste, a mutação na posição 3.574 na seqüência correspondente do mutante Dl 12 causa a introdução de um códon de interrupção prematura.

O códon de interrupção na LOX-1 que codifica o gene do mutante D112 é previsto para resultar em um truncamento no terminal C de 197 aminoácidos da proteína correspondente, codificando assim uma proteína de 74,2 kDa, cuja seqüência está listada em [SEQ ID NO: 4].

EXEMPLO 11

O Gene de LOX-1 no Mutante A618 de Cevada está Mutado A preparação do DNA genômico, as reações de PCR e a determinação da seqüência do DNA e as análises do DNA genômico do mutante de cevada A618 e do cultivar Neruda do tipo selvagem foram idênticas àquelas descritas para o mutante D112 e para o cultivar Barke no Exemplo 10.

A comparação do nucleotídeo para LOX-1 do mutante de cevada A618 [SEQ ID NO: 6] com aquele do cultivar Neruda parental [SEQ ID NO: 5] indicou que a seqüência mutante tem uma mutação pontual, correspondente a uma substituição G->A na posição 2.311 na seqüência genômica (Figura 15; Figura 16) .

A seqüência do tipo selvagem para LOX-1 do culti var Neruda codifica uma proteína longa com 862 resíduos [SEQ ID NO: 7], com uma massa prevista de 96,4 kDa. Em contraste, a mutação na posição 2.311 na seqüência correspondente do mutante A618 muta o sítio doador do íntron 3. Isto causa um erro de junção no íntron 3, levando teoricamente a um códon de interrupção prematuro no íntron 3 depois da tradução de 399 aminoácidos. O códon de interrupção dentro da estrutura no gene para LOX-1 do mutante A618 resultará em uma proteína traduzida truncada de 44,5 kDa [SEQ ID NO: 8],

EXEMPLO 12

Detecção por RT-PCR de Transcritos para LOX-1 Plantas de cevada do cultivar Vintage, linhagem mutante G (baixo teor de LOXs, pedido de patente PCT n- PCT/IB01/00207, publicado como documento nθ WO 02/053721A1, em nome de Douma et al.) , do cultivar Barke, e do mutante D112, foram desenvolvidas em uma estufa durante a época da primavera de 2002 em Copenhague, Dinamarca. As espiguetas foram marcadas no dia da antese, e as espigas foram colhidas em 20, 40 e 60 dias após a antese (DAF) . As espigas foram mantidas a -80 °C até que todas as amostras pudessem ser processadas simultaneamente. Um total de 10 embriões por ponto no tempo foram dissecados da cariopse em desenvolvimento, e o RNA foi extraído usando o kit de isolamento de RNA FastRNA, Green (Qbiogene), usando as recomendações do fabricante.

O modelo para as reações de RT-PCR consistiu em 100 ng de RNA dos embriões descritos acima. As reações de RT-PCR de 20 μL continham 50 pmol de cada iniciador e 5 U da mistura de enzimas para RT-PCR (Promega). As ampliações por RT-PCR foram conduzidas em um aparelho de ciclos MJ: 45 min a 48°C por 1 ciclo; 1 min a 95°C por 1 ciclo; 1 min a 94°C, 1 min a 65°C e 1 min a 72°C por 30 ciclos; e finalmente, 10 min a 72°C por 1 ciclo.

Um iniciador anverso, 5'>AGGGACTGCCGGACGATCTCA<3' [seq id no: 11], e um iniciador reverso, 5'>GCCAGCTCCGGCACA CTT<3' [seq id no: 12], foram usados para gerar um fragmento de RT-PCR de 292 pb. Os produtos da RT-PCR foram separados em um gel de agarose a 1%. Os fragmentos de DNA, correspondentes em comprimento à região ampliada, foram purificados usando o kit de extração em gel Qiaex II (Qiagen), e inseridos no vetor plasmídico pCR2.1-TOPO (Invitrogen). A seqüência de nucleotideos da inserção plasmidica foi seqüenciada usando um Analisador Genético ABI Prism 310 (ABI). As comparações das seqüências de DNA foram realizadas usando o pacote do software de análise de seqüências Lasergene, versão 5 (DNASTAR).

O produto da PCR resultante cobria a região correspondente às posições de nucleotideos 3.283 a 3.659 no clone genômico [SEQ ID NO: 1 ] . Esta região compreendia o intron 5 com um comprimento de 83 pb, que estava ausente do modelo de RT-PCR em uma preparação de RNA isenta de DNA livre (Figura 17A) . Como a análise de seqüências de DNA confirmou que o fragmento isolado era uma parte integrante do gene para LOX-1 e verificou a ausência da seqüência do intron 5, pôde-se excluir que a ampliação falsa produziu fragmentos do gene de cevada para a enzima LOX-2 (Figura 17D) , Consequentemente, o fragmento ampliado representava o produto de uma ampliação do transcrito de RNA.

A análise comparativa por RT-PCR do RNA purificado a partir de embriões de cevada, 20, 4 0 e 60 dias após a antese (DAF) , do cultivar Vintage e da linhagem G mutante, revelou que os níveis de transcritos para LOX-1 são similares para as duas variedades em estágios de desenvolvimento similares. O nível de transcritos para LOX-1 está aumentando gradualmente no período de tempo entre 20 dias após a antese (DAF) (Figura 17B).

Em contraste, entretanto, uma diferença acentuada foi observada quando um conjunto de dados similar foi examinado para o cultivar Barke e o mutante Dl12. Neste caso, os experimentos de RT-PCR revelaram que os transcritos de LOX-1 no mutante Dl 12 eram substancialmente mais baixos em abundância quando comparados com aqueles do cultivar Barke (Figura 17C).

Resumindo, as observações podem ser explicadas por uma mutação potencial na região do promotor do gene para LOX-1 no mutante D112. Outros fatores ainda desconhecidos podem estar envolvidos na regulação transcricional do gene para LOX-1 no mutante D112. A este respeito, não se pode excluir que o códon de interrupção no transcrito para LOX-1 do mutante Dl12 confere decaimento do RNAm mediado por nonsense (Isshiki et al., 2001).

EXEMPLO 13

Detecção Genética de Mutantes de Cevada Portadores da Mutação D112 As estratégias modernas de cruzamento de cevada compreendem freqüentemente tecnologias biotecnológicas para acelerar o processo a partir de mutagênese para comercialização . Portanto, pode ser útil implementar uma triagem precoce de material vegetal com relação à detecção de polimorfismos de nucleotídeos individuais em genes de interesse. Usando esta técnica com o DNA genômico e combinado com um sistema de alta produção, pode ser possível estreitar o número de linhagens de cruzamentos com 50% no estágio de muda.

Ensaios de CAPS A clonagem e o seqüenciamento do gene para LOX-1 das linhagens progênitas do mutante Dl12 demonstraram que a mutação é transmitida para a geração seguinte. Esta técnica é laboriosa e não é útil para o cruzamento prático de cevada.

A mutação específica para a linhagem G com baixo teor de LOXs pôde ser identificada no material de cruzamento usando um ensaio de seqüências polimórficas ampliadas, clivadas (ensaio CAPS), como descrito no Exemplo 4 do pedido de patente PCT n2 PCT/IB01/00207, publicado como documento n2 WO 02/053721 Al, expedido para Douma et al. Entretanto, a natureza da mutação no gene para LOX-1 do mutante D112 não pode ser usada para gerar um mapa de restrição alterado em uma região de 60 pb que compreende a mutação. Ensaios de SNP

Uma solução alternativa para isso e realizar uma análise que compreende um único polimorfismo de nucleotídeo (SNP) . O SNP é uma mutação pontual com pelo menos dois nucleotideos diferentes representado em um locus, A análise baseia-se em uma combinação de dois conjuntos de reações de PCR genômicas. Ambas reações contêm um iniciador especifico * do locus, e um dos dois iniciadores de SNP (um para cada alelo da seqüência) . Dois conjuntos de reações de PCR são realizados por linhagem da planta e o resultado de uma reação de PCR é que o iniciador de SNP se liga a seqüências do alelo do mutante ou do tipo selvagem (Figura 18A) . Em um dos vários métodos, a análise por SNP pode se basear na identificação de linhagens mutantes, avaliando o padrão de formação de bandas após eletroforese de produtos da PCR.

O DNA genômico da cevada de 17 linhagens de cruzamento e do cultivar Barke do tipo selvagem foram isolados a partir de tecidos foliares de mudas, usando o kit de isolamento de DNA vegetal (Roche Applied Science), de acordo com as recomendações do fabricante.

Os iniciadores de oligonucleotideos usados para ampliar o SNP do gene para LOX-1 do tipo selvagem foram 5'>CAAGGTGCGGTTGCTGGTGTC<3' [SEQ ID NO: 13] e 5'>CTCGCGCGTC TCCTTCCAC<3' [SEQ ID NO: 14]. Para o gene correspondente do mutante Dl12, os iniciadores foram 5'>CAAGGTGCGGTTGCTGGTG TC<3' [SEQ ID NO: 3 3] e 5' >CTCGCGCGTCTCCTTCCAT<3' [SEQ ID NO: 15].

Estas combinações de iniciadores foram usadas em reações de PCR para ampliar fragmentos de DNA de 166 pb, compreendendo partes das regiões codificadoras para LOX-1 do mutante D112 ou do cultivar Barke (Figura 18A).

As reações de PCR consistiram em 100 ng de DNA genômico em um volume de 20 μL, contendo 25 pmol de iniciador e 2,5 U de DNA polimerase Faststart Tag (Roche), usado de acordo com as instruções do fabricante. As ampliações por PCR foram conduzidas em um aparelho de ciclos MJ: 5 min a 96°C por 1 ciclo; 1 min a 95°C, 1 min a 70°C, 1 min a 72°C por 20 ciclos; e finalmente, 10 min a 72°C por 1 ciclo.

Os produtos da PCR foram separados em géis de agarose a 1,0%. Os fragmentos de DNA, correspondentes em comprimento à região ampliada, foram purificados usando o kit de extração em gel Qiaex II (Qiagen). Os produtos da PCR foram seqüenciados diretamente, usando a reação de terminação de cadeia com didesoxinucleotideo, e um Analisador Genético ABI Prism 310. As comparações das seqüências foram realizadas usando o pacote de software para análise de seqüências Lasergene, versão 5 (DNASTAR).

Compilando os dados de triagem, um total de 17 linhagens de cruzamento por análise de SNP, bem como os dados experimentais do seqüenciamento direto dos produtos da PCR, produziram resultados idênticos. Baseado nestes experimentos, pode-se concluir que a tecnologia SNP pode ser usada para confirmar que uma matéria-prima compreende uma seqüência gênica idêntica àquela do gene para LOX-1 do mutante de cevada D112 (Figura 18B).

EXEMPLO 14

Detecção de Mutantes em Misturas de Amostras A indústria cervejeira pode usar misturas de cevada e malte para produção de cerveja, uma propriedade que pode mascarar características quimicas indesejadas de uma variedade especifica de malte. Uma simples confirmação para uso de um material de semente pode compreender a ampliação do gene mutante por análise de PCR.

A análise de SNP de amostras de maltes mistos foi realizada usando uma mistura de amostras do mutante D112 e do cultivar Barke, e uma mistura de amostras da linhagem mutante G (pedido de patente PCT n2 PCT/IB01/00207, publicado como documento n2 WO 02/053721 Al, expedido para Douma et ai«, e do cultivar Barke. Seis amostras de cevada, contendo 0, 20, 40, 60, 80 e 100% de grãos do mutante D112 foram analisadas. Em outra série, seis amostras de cevada, contendo 0, 20, 40, 60, 80 e 100% de grãos da linhagem mutante G, foram analisadas. O DNA foi isolado dos grãos moidos usando o kit de isolamento de DNA Nucleon Phytopure (Amersham), de acordo com as recomendações do fabricante.

Os oligonucleotideos iniciadores usados para ampliar um SNP de 166 pb do gene para LOX-1 do mutante D112 foram 5' >CAAGGTGCGGTTGCTGGTGTC<3' [SEQ ID NO: 13] e 5' >CTCGCGCGTCTCCTTCCAT<3' [SEQ ID NO: 15]. Os iniciadores usados para ampliar um SNP de 370 pb do gene para LOX-1 da linhagem G mutante foram 5'>TACGTGCCGCGGGACGAGAAG<3' [SEQ ID NO: 16] e 5'>TGATCATGACCGGGTTGACGT<3' [SEQ ID NO: 17] . As PCRs foram conduzidas como reações multiplex usando os quatro iniciadores simultaneamente (Figura 19A) . Cada reação compreendeu 100 ng de DNA genômico em uma volume de 20 μL, contendo 50 pmol de cada iniciador e 10 μL de solução de RedTaq polimerase (Sigma), de acordo com as instruções fornecidas pelo fornecedor da enzima. As ampliações por PCR foram conduzidas em um aparelho de ciclos MJ: 1 min a 95°C por 1 ciclo; 1 min a 94°C, 1 min a 66°C, 30 segundos a 72°C por 25 ciclos; e finalmente, 10 min a 72°C por 1 ciclo. Os produtos da PCR foram separados em géis de agarose a 1,0%. Os fragmentos de DNA, correspondentes em comprimento à região ampliada, foram purificados usando o k.i t de extração em gel Qiaex II (Qiagen), e inseridos no vetor plasmídico pCR2.1-TOPO (Invitrogen). As seqüências de nucleotideos de ambos filamentos das inserções plasmídicas foram determinadas usando um seqüenciador de DNA MegaBACE 1000 (Amersham) . As comparações das seqüências foram realizadas usando o pacote do software de análise de seqüências Lasergene, versão 5 (DNASTAR) .

A análise do gel apresentada na Figura 19B revelou uma análise de SNP positiva para todas amostras derivadas de misturas que contêm grãos do mutante D112. Similarmente, foi possível identificar as amostras que contêm material da linhagem mutante G. Resumindo, as análises genéticas podem verificar facilmente o uso de misturas de cevada que compreendem plantas mutantes de LOX da linhagem mutante G ou do mutante D112.

EXEMPLO 15

LOX-1 Recombinante do Mutante D112 é Inativa O gene para LOX-1 do mutante Dl12 demonstrou conter um códon de interrupção prematuro (cf. Exemplo 10) . Esperava-se, portanto, que a expressão in planta do gene resultasse na sintese de uma versão truncada da enzima LOX correspondente, contendo apenas os primeiros 665 residuos de aminoácidos encontrados em LOX-1 do tipo selvagem. A seqüência de nucleotídeos que especifica a versão truncada de LOX-1 foi expressada em células de K. coli, para verificar que ela está enzimaticamente inativa, e não consegue catalisar a formação de HPODEs em células do mutante Dl 12 de cevada. Plasmideos para Expressão de LOX-1 do Tipo Selvagem e Mutante

A estrutura de leitura aberta inteira que codifica LOX-1 foi ampliada, usando um protocolo-padrão de PCR. O modelo foi o DNAc de cevada (van Mechelen, 1999) , e os iniciadores usados foram 5'>CATATGCTGCTGGGAGGGCTG<3' [SEQ ID NO: 18; o códon de iniciação está marcado em letras em negrito; o sítio Ndel está sublinhado), e 5'>GAATTCTTAGATG GAGATGCTGTTGGG<3' (SEQ ID NO: 19; o códon de interrupção complementar do tipo selvagem está indicado em letras em negrito; o sítio EcoRI está sublinhado). Um fragmento de DNA ampliado com 2.597 pb foi obtido e purificado. O fragmento da PCR foi digerido com Ndel-EcoRI e ligado ao fragmento grande de Ndel-EcoRI do vetor pET19b (Novagen), que produz o plasmídeo de expressão pETLl no qual o gene para LOX-1 é clonado a jusante, na estrutura de uma seqüência para uma cauda His com um comprimento de 10 resíduos. As análises de seqüenciamento verificaram que a inserção plasmidica continha uma seqüência correta.

O próximo experimento compreendeu a construção de um plasmídeo para a expressão da versão truncada de LOX-1. O objetivo foi trocar o códon número 666 da estrutura de leitura aberta para LOX-1 de pETLl por um códon de interrupção, de tal modo que a síntese da proteína em células de E. coli gerasse uma versão truncada de LOX-1. Para impedir completamente a leitura através do códon de interrupção por ribossomas em E. coli, foi construído um plasmídeo de expressão no qual todos códons a jusante daquele para o número 665 de LOX-1 em pETLl foram removidos e substituídos pelo códon de interrupção TGA. Usou-se o protocolo que se segue. Um fragmento com 129 pb foi ampliado a partir de pETLl, usando PCR, na presença dos iniciadores 5'>CTACCCGTACG CGGCGGACGGGCT<3' ([SEQ ID NO: 20]; anelando a montante da mutação no gene para LOX-1 do mutante Dl 12; o sítio BsiWI está sublinhado), e 5'>TCCTGAATTCACGCCTGCACCTCCGTATCGC<3r ([SEQ ID NO: 21]; o sítio EcoRI está sublinhado; as letras em negrito indicam a seqüência complementar do códon de interrupção introduzido). A ampliação introduziu um códon de interrupção e um sítio £cc*RI no fragmento. Este material foi subsequentemente digerido com RsiWi-EcoRI e ligado ao fragmento grande BsíWi-EcoRI do plasmídeo pETLl. O plasmídeo de expressão resultante foi denominado pETL2, e a seqüência correta da inserção foi verificado por seqüenciamento de DNA. Células de E. coli Transformadas Sintetizam Proteínas LOX

Recombinantes Células de E. coli BL21, adquiridas na Novagen, foram transformadas separadamente com o vetor pET19b e com os plasmideos de expressão pETLl e pETL2 (descritos acima). As células bacterianas que alojam os plasmideos foram inoculadas em meio de Caldo Luria (LB) padrão e desenvolvidas por 2 h a 37°C. Depois disso, adicionou-se IPTG 1 mM para induzir a expressão dos genes heterólogos, e as culturas foram desenvolvidas durante a noite inteira a 20°C. As células foram colhidas por centrifugação por 1 min a 14.000 x g, e em seguida, recolocando os agregados celulares em suspensão em uma solução desnaturadora que consistia em um tampão de fosfato de sódio 50 mM, suplementado com cloridrato de guanidina 6 M, NaCl 0,3 M e imidazol 10 mM. Após passagem por ultra-som sobre gelo, as células lisadas foram centrifugadas por 1 min a 14.000 x g, e o sobrenadante foi misturado com resinas Ni (Novagen), e em seguida, uma incubação de 30 min a 4°C. As resinas Ni foram precipitadas por centrifugação e lavadas duas vezes com a solução desnaturadora descrita acima. Finalmente, as proteínas marcadas com His foram eluídas duas vezes das resinas, usando um tampão de fosfato de sódio 50 mM, suplementado com NaCl 0,3 M e imidazol 0,5 M. Alíquotas das amostras eluídas fracionadas foram separadas por SDS-PAGE (Figura 20). Bandas distintas de -100 kDa, correspondentes a LOX-1, e -66 kDa, correspondentes à massa calculada de LOX-1 truncada, foram obtidas a partir das células portadoras de pETLl e pETL2, respectivamente. As células portadoras de pET19b não produziram quaisquer bandas nas frações eluídas.

A Versão Truncada de LOX-1 é Inativa E. coll BL21 portadoras de pET19b, pETLl, e pETL2 foram inoculadas em meio LB padrão e desenvolvidas por 2 h a 37°C. Depois disso, adicionou-se IPTG 1 mM, para induzir a expressão dos genes heterólogos, e as culturas forma desenvolvidas durante a noite inteira a 20°C. As células foram colhidas por centrifugação durante 1 min a 14.000 x g. Os Usados celulares foram obtidos recolocando os agregados celulares em suspensão em uma mistura de BugBuster e Benzonase (Novagen). A atividade de LOXs foi medida nos lisados, usando um regente de ensaio de lipoxigenase, contendo ácido 3-dimetil-amino-benzóico 6,25 mM, ácido lino- léico 0,3125 mM, 3-metil-2-benzotiazolino-hidrazona 0,1 mM, e 0,05 mg/mL de hemoglobina. 180 μL do reagente foram misturados com 10 μL do lisado celular respectivo, e incubados por 10 min à temperatura ambiente. A quantidade de indamina produzida durante a incubação, determinada por espectrofotometria na absorvância a 595 nm, corresponde à atividade de lipoxigenase do lisado celular. Embora as células transformadas com pETLl (produzindo LOX-1 marcada com His) apresentasse grande atividade de LOX-1, as células que produzem LOX-1 especifica do mutante Dl 12 tiveram a mesma atividade de LOXs que as células do controle transfor- madas com o vetor somente (Tabela 8) . Isto demonstra que a LOX-1 truncada do mutante D112 de cevada está inativa.

EXEMPLO 16

Plantas de Cevada Transgênicas Construção de Plasmídeos Seqüências gênicas são inseridas na região poli- ligante de vetores plasmidicos padrão, tal como pUC18. As inserções estão listadas na Figura 21. Em uma construção (Figura 21A), o promotor de ubiquitina 1 de milho (Christensen et al., 1992; Jensen et al., 1996) - incluindo o intron 1 do mesmo gene - direciona a transcrição do gene bar (White et al., 1990}, que codifica o marcador selecio- nável fosfinotricina acetil transferase (PAT). Em uma segunda construção, desenhada para supressão sense do gene para LOX- 1 (Dougherty e Parks, 1995), a estrutura de leitura aberta para LOX-1 de cevada é inserida imediatamente a jusante do promotor de ubiquitina 1 do milho e do intron 1 (Figura 21B) . Uma construção para silenciar a expressão do gene de cevada para LOX-1 está ilustrada na Figura 21C. A expressão desta construção em células de cevada confere silenciamento total do dito gene pela formação de RNA hairpin unido por intron, e é desenhada de acordo com os dados detalhados na Figura la da publicação por Smith et al. (2000). Especificamente, a seqüência denominada "íntron 1" da construção na Figura 21C é idêntica à seqüência do íntron ilustrada na Figura la da publicação por Smith et al. (supra). Os braços sense e antisense da construção na Figura 21C representam direções opostas do mesmo fragmento com um comprimento de -200 pb, que compreende um segmento da estrutura de leitura aberta que codifica LOX-1 de cevada, sendo que o dito fragmento da estrutura de leitura está localizado em qualquer lugar na estrutura de leitura aberta para LOX-1. Alternativamente, a seqüência com 200 pb de comprimento é selecionada a partir da seqüência a jusante do códon de interrupção do gene de cevada que codifica LOX-1.

Transformação e Regeneração de Plantas Transgênicas Embriões de cevada imaturos de plantas de cevada doadoras, desenvolvidas em estufa, do cultivar Golden Promise, são bombardeados com uma mistura de plasmideos que contêm as inserções ilustradas na Figura 21A,B para co- supressão do gene de cevada que codifica LOX-1, e uma mistura de plasmideos ilustrada na Figura 21A,C para silenciamento do dito gene. A transformação, a seleção de células transformadas, e a propagação de plantas transgênicas são realizadas como detalhado por Wan e Lemaux (1994) e Jensen et ai. (supra).

As plantas transgênicas são desenvolvidas por várias gerações, ou polinizadas com um cultivar de cevada diferente, e em seguida, faz-se a identificação de plantas progênitas com o fenótipo desejado. Duas ou mais gerações podem ser desenvolvidas para assegurar que a expressão da característica fenotipica desejada seja mantida e herdada de forma estável. As sementes são colhidas para examinar se a característica fenotipica foi conseguida.

Para examinar os efeitos os efeitos da co-supressão ou do silenciamento do gene de cevada que codifica LOX- 1, os grãos transgênicos são primeiramente analisados quanto à atividade enzimática derivada de LOX-1, como detalhado no Exemplo 1 do presente pedido de patente. Os grãos transgênicos, que não tem qualquer atividade de LOX-1 ou uma pequena atividade de LOX-1 são subsequentemente examinados em experimentos de maltagem e fabricação de cerveja, como detalhado para grãos isentos de LOX-1 no Exemplo 5 e no Exemplo 6 do presente pedido de patente. Além disso, os extratos de grãos transgênicos são analisados para identificar os que têm efeitos negativos sobre o crescimento de fungos Aspergillus, usando os métodos descritos na patente n- US 5.942.661, expedida para Keller.

EXEMPLO 17

Compostos de Notas Verdes 0 processo para produção de compostos de notas verdes compreende: (i) Converter grãos de cevada isentos de LOX-1 em farinha moída; (ii) Colocar a farinha em suspensão em água ou em um tampão específico; (iii)Incubar a suspensão; alternativamente, reagir a suspensão de farinha com (a) um ácido graxo (ácido linoléico ou ácido linolênico ou uma mistura deles); ou (b) uma enzima hidroperóxido liase que tem especificidade para 13-HPODE ou 13-HPOTE ou ambos; ou (c) uma mistura que compreende os ditos ácidos graxos e a dita enzima; (iv) Reagir os aldeídos resultantes com álcool desidrogenase; (v) Purificar os aldeídos ou álcoois, e preparar uma preparação útil da composição de fragrância ou sabor.

EXEMPLO 18

Inibidores de LOX-1 Uma solução de LOX-1 recombinante recém-preparada foi usada para as análises. Neste experimento, 100 mL de meio de crescimento AB3, suplementado com 100 μg/mL de ampicilina, foram preparados usando a recomendação do fornecedor (Remei) , e então inoculados com 5 mL de uma cultura, preparada de um dia para o outro, de células BL21 (DE3) pLysS de E. coli transformadas com o plasmídeo pETLl (que codifica LOX-1 marcada com His; cf. Exemplo 15). A cultura bacteriana resultante foi propagada a 37°C até que a densidade celular atingisse D06oo - 0,8. A cultura foi incubada a 20°C por 30 min, e depois suplementada com IPTG 0,4 mM, para induzir a expressão do gene heterólogo, e incubada a 20°C de um dia para o outro.

As células da cultura foram agregadas por uma centrifugação de 15 min, recolocadas em suspensão em 5 mL de BugBuster HT (Novagen), e incubadas por 20 min sob vascole- jamento suave, para hidrolisar os ácidos nucléicos. Depois disso, os fragmentos celulares foram removidos por centrifugação, e o sobrenadante foi clarificado por filtração através de um filtro de 0,45 μm, e adicionado a um volume igual de tampão de ligação (tampão de fosfato de sódio 50 mM, pH 7,5, suplementado com NaCl 0,3 M e imidazol 10 mM) . 0 extrato resultante foi aplicado em uma coluna HisTrap HP (Amersham Biosciences), de acordo com as recomendações do fabricante, lavado uma vez com tampão de lavagem (idêntico ao tampão de ligação, exceto que imidazol = 150 mM) , e a proteina ligada foi eluida com tampão de eluição (idêntico ao tampão de ligação, exceto que imidazol - 150 mM).

Alíquotas de 3 μL das frações de 1 mL, que compreendem proteínas das lavagens e das eluições, foram analisadas por SDS-PAGE (Figura 22A), indicando que a fração de 1 mL do eluído 2 continha -0,7 mg de LOX-1 recombinante.

A LOX-1 purificada foi subsequentemente usada em ensaios para determinar se os inibidores de LOX selecionados reduzem as atividades enzimáticas. Em primeiro lugar, uma solução de insumo de ácido linoléico (preparada como descrito no Exemplo 9) foi diluída até 1/10 da sua concentração inicial, produzindo uma solução 2,4 mM de ácido linoléico. Alíquotas de 45 μL dessa solução foram suplementados com 5 μL de soluções em etanol que contêm gaiato de octila ou NDGA 0, 5, 12 e 24 mM (inibidores de LOX-1 putativos) . Alíquotas de 10 μL das misturas linolato/inibidor foram adicionadas a 990 μL de um tampão de fosfato de sódio 100 mM, pH 6,0, e incubadas por 1 min a 20°C, e antes adicionou-se 5 μL de LOX-1 recombinante (eluído 2, vide acima).

Após a adição de LOX-1, A-si foi registrado durante um período de tempo de 3 min. A atividade enzimática de LOX- 1 foi determinada como a inclinação do gráfico com A254 plotado contra o tempo. Os resultados estão resumidos na Figura 22B, indicando uma inibição acentuada de LOX-1 em concentrações micromolares dos inibidores.

EXEMPLO 19

Mosturação com Gaiato de octila, um Inibidor de LOX-1 Mosturações em pequena escala de 100 mL, contendo 25 g de malte de cevada do cultivar Barke ou 25 g de malte do mutante D112 isento de LOX-1 foram realizadas usando equipamentos similares àqueles descritos no Exemplo 5. A entrada mosturação foi a 37°C por 15 min, a sacarificação a 68°C por 30 min, a saida da mosturação a 77°C por 10 min, e em seguida, uma fervura final do mosto por 60 min; os deslocamentos de temperatura foram ajustados para 1°C por minuto.

Para testar o efeito de uma mosturação na presença de um inibidor de LOX-1, a pasta com malte de cevada do cultivar Barke foi suplementada com gaiato de octila 0,5 mM na entrada da mosturação. Mosturações em corridas paralelas compreendiam experimentos com o malte do cultivar Barke de cevada sem adição de gaiato de octila, bem como mosturações com o malte do mutante Dl 12 de cevada isento de LOX-1, na presença ou ausência de gaiato de octila 0,5 mM.

Alíquotas de amostras de todas as quatro mosturações foram coletadas depois da fase de mosturação de 15 min depois da fase de fervura do mosto, e em seguida, determinou-se os níveis de T2N, como descrito no Exemplo 6. Os resultados estão resumidos na Figura 23.

Um decréscimo acentuado em T2N foi observado nas amostras de mosto da mosturação com o malte de cevada do cultivar Barke na presença de gaiato de octila, tanto na amostra analisada depois da mosturação, bem como na amostra do mosto fervido. É perceptível também que a concentração de T2N no mosto fervido de ambos tipos de malte atingiu níveis similares.

Resumindo, a suplementação de uma pasta com o 5 inibidor de LOX-1 gaiato de octila durante a mosturação proporciona uma nova maneira para produzir um mosto que se caracteriza por um nível reduzido de T2N. TABELA 1 Atividade Total de LOX em Extratos de Embriões de Mutantes 10 Crus (Geração M3) e Progénie (Gerações M4 e M5)

TABELA 2 Comparação de Desempenho Agronômico

Em uma escala de 0 a 9, onde 0 representa nenhuma infecção ou alojamento e 9 representa infecção ou alojamento extremo Rendimento médio relativo de três replicações em dois locais diferentes TABELA 3 Análises após Testes-piloto de Maltagem

TABELA 4 Níveis Reduzidos de T2N em Produtos do Mutante D112

TABELA 5 Efeitos da Estocagem de Cerveja sobre o Sabor

3 Escala de pontuação - 0: não presente; 1: fraco; 2: perceptível; 3: médio; 4: intenso; 5: extremo. Os valores baixos são preferidos b Escala de pontuação é entre 1 e 5; os valores altos são preferidos nd ~ não determinado TABEIA 6 THAs em Cervejas Produzidas a Partir do Malte de Cevada Normal e do Mutante D112

TABELA 7 5 THAs em Cervejas Disponíveis no Mercado

TARELA 8 Atividade de Lipoxigenases de Extratos Celulares Brutos de Células Portadoras dos Vetores Indicados, Desenvolvidos de um Dia para o Outro em LB e IPTG

Os resultados são fornecidos como valor médio de quatro medições individuais com a variação indicada. TABELA 9 Listagem de Seqüências

INFORMAÇÕES SOBRE OS DEPÓSITOS

Um depósito dos mutantes Dl 12 de cevada da proprietária Carlsberg A/S - descrito acima e enunciado nas reivindicações apensadas - foi feito junto à American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, EUA. A data do depósito para o mutante D112 foi 11 de setembro de 2003, consistindo em 2.500 grãos retirados de um depósito na Carlsberg A/S, desde antes da data do depósito deste pedido de patente, A data do depósito para o mutante A618 foi 23 de outubro de 2003, consistindo em 2.500 grãos retirados de um depósito na Carlsberg A/S, desde antes da data do depósito deste pedido de patente. Estes depósitos foram realizados segundo as disposições do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do Depósito para Microorganismos com o Propósito de Procedimento de Patente e as Regulamentações pertinentes (Tratado de Budapeste). Isto assegura a manutenção de uma cultura viável do depósito por 30 anos a partir da data do depósito. Os depósitos pretendem atender a todas as exigências d 37 C.F.R. § 1.801-1.809, incluindo o fornecimento de uma indicação da viabilidade das amostras. No caso do mutante D112, o número de acesso da ATCC é PTA-5487. No caso do mutante A618, o número de acesso da ATCC é PTA-5584. Aliquotas do material depositado podem ser obtidas na ATCC, especificando o número de acesso e aceitando as restrições padronizadas impostas pela ATCC. Entretanto, deve-se entender que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a invenção em questão em derrogação de diretos de patente garantidos por ação governamental.

Neste pedido de patente inteiro, várias publica- ções, patentes e pedidos de patente estão referenciados. Os teores destas publicações em suas totalidades são aqui incorporados como referência nesta publicação, para descrever mais integralmente o estado da arte ao qual a invenção pertence. A descrição precedente da invenção é exemplifica- 5 tiva com os propósitos de ilustração e explanação. Deve-se entender que várias modificações podem ser feitas sem fugir do espirito e do âmbito da invenção. Consequentemente, pretende-se que as reivindicações que se seguem sejam interpretadas como englobando todas essas modificações.

REFERÊNCIAS

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TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DE DEPÓSITOS DE MICROORGANISMOS PARA PROPÓSITOS DE PROCEDIMENTOS DE PATENTE FORMULÁRIO LXTEXAC1ONAL RECIBO NO CASO DE UM DEPÓSITO ORIGINAL EXPEDIDO CONFORME A REGRA 7.3 E DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE EXPEDIDA CONFORME A REGRA 10.2 Para: (Nome e Endereço do Depositante ou Advogado): Dr. Ole Olscn Carlsberg Research Laboratory Gamle Carlsberg Vej 10 DK-2500 Copenhagen-Valby Depositado em favor de: Carlsberg A/S, Carlsberg Research Laboratory, Gamle Crisberg Vej 10, DK-2500 Copenhagen-Valby, Denmark

Referência de Identificação pelo Depositante: Designação do Depósito de Patente: Cevada, Hordeum vulgare L. sementes: Dl 12 PTA-54S7 As sementes foram acompanhadas por: _ descrição específica de uma descrição taxonômica proposta indicada acima. As sementes foram recebidas em 11 de setembro de 2003 por esta Autoridade Depositária Internacional e foram aceitas. PELO SEU REQUERIMENTO: X Nós informaremos dos requerimentos para as sementes por 30 anos. As sementes tomar-se-ão disponíveis se um escritório de patente signatário do Tratado de Budapeste certificar que o direito de uma parte, ou se uma patente Norte-Americana for publicadas citando as sementes e ATCC for instruído pelo Escritório de Marcas e Patentes dos Estados Unidos ou pelo depositante para liberar as referidas sementes. Se as sementes morrerem ou forem destruídas durante o prazo efetivo do depósito, deve ser de sua responsabilidade repô-las com sementes viáveis das mesmas. As sementes serão mantidas por um período de pelo menos 30 anos da data do depósito, ou cinco anos após o pedido mais recente pela amostra, o que for mais longo. Os Estados Unidos e muitos outros países são signatários do Tratado de Budapeste. A viabilidade das sementes citadas acima foi testada em 19 de setembro de 2003. Nesta data as sementes encontravam-se viáveis.

Autoridade Depositária Internacional: American Type Culture Collection, Manassas, VA 20111-2209 USA. Assinatura de pessoa tendo autoridade para representar ATCC: TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DE DEPÓSITOS DE MICROORGANISMOS PARA PROPÓSITOS DE PROCEDIMENTOS DE PATENTE FORMULÁRIO MTENACIONAL RECIBO NO CASO DE UM DEPÓSITO ORIGINAL EXPEDIDO CONFORME A REGRA 7.3 E DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE EXPEDIDA CONFORME A REGRA 10.2 Para: (Nome c Endereço do Depositante ou Advogado): Carlsberg Research Laboratory Dr. Ole Olsen Gamle Carlsberg Vej 10 DK-2500 Copenhagen-Valby Depositado em favor de: Carlsberg A/S, Carlsberg Research Laboratory, Gamle Carlsberg Vej 10, DK- 2500 Copenhagen-Valby, Denmark Referência de Identificação pelo Depositante: Designação do Depósito de Patente: Cevada, Hordeum vulgare L. sementes: A618 PTA-5584

As sementes foram acompanhadas por: _ descrição específica de uma descrição taxonômica proposta indicada acima. As sementes foram recebidas em 13 de outubro de 2003 por esta Autoridade Depositária Internacional e foram aceitas.

PELO SEU REQUERIMENTO: X Nós informaremos dos requerimentos para as sementes por 30 anos. As sementes tomar-se-ão disponíveis se um escritório de patente signatário do Tratado de Budapeste certificar que o direito de uma parte, ou se uma patente Norte-Americana for publicada, citando as sementes e ATCC for instruído pelo Escritório de Marcas e Patentes dos Estados Unidos ou pelo depositante para liberar as referidas sementes.

Se as sementes morrerem ou forem destruídas durante o prazo efetivo do depósito, deve ser de sua responsabilidade repô-las com sementes viáveis das mesmas. As sementes serão mantidas por um período de pelo menos 30 anos da data do depósito, ou cinco anos após o pedido mais recente pela amostra, o que for mais longo. Os Estados Unidos e muitos outros países são signatários do Tratado de Budapeste. A viabilidade das sementes citadas acima foi testada em 20 de outubro de 2003. Nesta data as sementes encontravam-se viáveis.

Autoridade Depositária Internacional: American Type Culture Collection, Manassas, VA 20111-2209 USA. Assinatura de pessoa tendo autoridade para representar ATCC:

Claims

1. Bebida, CARACTERIZADA pelo fato de ser à base de uma planta de cevada, ou uma parte dela, em que a referida planta de cevada apresenta uma mutação no gene LOX- 1, que causa uma total perda de função, em que a referida mutação leva a um gene que codifica uma forma polipeptídica de LOX-1 consistindo em um fragmento N-terminal de LOX-1 compreendendo no máximo os 665 aminoácidos N-terminais da cevada do tipo selvagem de LOX-1 de cevada mostrada como SEQ ID NO: 3, em que a razão de ácido 9,12,13- triidroxioctadecenóico para ácido 9,10,13- triidroxioctadecenóico dentro da referida bebida é no máximo 1,8, e em que a bebida compreende álcool e/ou a bebida compreende lúpulo.

2. Bebida de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a bebida tem qualidades organolépticas estáveis, e compreende no máximo 0,06 ppb de trans-2-nonenal (T2N) livre após estocagem por 4 semanas a 37 °C.

3. Bebida de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a bebida foi fermentada com levedura.

4. Bebida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene que codifica LOX-1 da referida planta de cevada compreende um códon non-sense prematuro.

5. Bebida de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene que codifica LOX-1 da referida planta de cevada compreende um códon non-sense, sendo que o dito códon corresponde às bases nos 3572-3574 de SEQ ID NO: 2.

6. Bebida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene que codifica LOX-1 da referida planta de cevada compreende pelo menos uma mutação em um sítio de junção (splice).

7. Bebida de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene que codifica LOX-1 da referida planta de cevada compreende uma mutação em sítio de junção, sendo que a referida mutação corresponde à base no 2311 de SEQ ID NO: 6.

8. Bebida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida bebida é cerveja.

9. Bebida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida bebida é preparada usando o malte preparado a partir de grãos da dita planta de cevada.

10. Bebida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida bebida é preparada a partir de uma composição de mosto preparada a partir de uma planta de cevada ou parte dela, ou a partir de composição de malte preparada a partir de referida planta de cevada ou parte dela.

11. Bebida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida bebida é preparada a partir de plantas de cevada sem malte ou partes delas.

12. Bebida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4 a 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida bebida é uma bebida não-fermentada.

13. Bebida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida bebida compreende no máximo 0,05 ppb de trans-2- nonenal livre (T2N) depois da incubação a 37 oC por 4 semanas, na presença de sulfito em uma faixa entre 4 e 6 ppm.

14. Método para produzir uma bebida que tem qualidades organolépticas estáveis, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método compreende as etapas de: (i) preparar uma composição que compreende uma planta de cevada ou partes dela, a referida planta de cevada apresentando uma mutação no gene LOX-1, que causa uma total perda de função, em que a referida mutação leva a um gene que codifica uma forma polipeptídeo de LOX-1 consistindo de um fragmento N-terminal de LOX-1 compreendendo no máximo os 665 aminoácidos N-terminais da cevada do tipo selvagem LOX-1 mostrada como SEQ ID NO: 3; (ii) processar a composição de (i) para obter uma bebida; obtendo desta forma uma bebida com qualidades organolépticas estáveis.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a planta de cevada é como definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 7.

16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (i) compreende preparar uma composição de malte a partir de grãos da referida planta de cevada ou uma parte dela.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende ainda a incubação com um inibidor de LOX.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o processamento da composição em uma bebida compreende uma etapa de maceração.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que um inibidor de LOX é adicionado durante a referida etapa de maceração.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende a adição de lúpulo.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende fermentação com uma levedura.

22. Método para produzir uma composição de malte com nenhuma atividade de LOX-1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método compreende as etapas de: (i) fornecer grãos de uma planta de cevada, a referida planta de cevada apresentando uma mutação no gene LOX-1, que causa uma total perda de função, em que a referida mutação leva a um gene que codifica uma forma polipeptídeo de LOX-1 consistindo em um fragmento N-terminal de LOX-1 compreendendo no máximo os 665 aminoácidos N- 5 terminais da cevada do tipo selvagem LOX-1 mostrada como SEQ ID NO: 3; (ii) infundir os ditos grãos; (iii) germinar os grãos infundidos sob condições predeterminadas; 10 (iv) tratar os grãos germinados com calor; produzindo desta forma uma composição de malte com nenhuma atividade de LOX-1.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a planta de cevada é como 15 definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 7.