KR100808932B1

KR100808932B1 - 대두의 리폭시게나아제 ２에 존재하는 유전적 마커

Info

Publication number: KR100808932B1
Application number: KR1020060076398A
Authority: KR
Inventors: 이석하; 신진희; 반규정; 김문영
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2006-08-11
Publication date: 2008-03-07
Also published as: KR20080014538A

Abstract

본 발명은 대두 리폭시게나아제 2(LOX 2) 유전자의 신규한 5’인접 서열, 대두에서의 콩비린내 특성과 관련된 유전적 마커에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 복잡한 데이터 수집을 요구하는 표현형 결정(phenotyping) 및 접종 과정 없이, 식물체의 초기 성장 단계에서 콩비린내가 없는 변이체를 신속하게 스크리닝할 수 있다. 본 발명의 마커는 다른 유전자형 결정(genotyping) 방법보다 신속하고, 재현성이 우수하며 저가의 유전자형 결정 방법을 제공하는 것을 가능하게 한다.

대두, 리폭시게나아제 2, 콩비린내, 마커, SNP

Description

대두의 리폭시게나아제 ２에 존재하는 유전적 마커{Genetic Markers Present in Lipoxygenase ２ Gene in Soybean}

도 1a는 푸른콩(P)과 진품콩 2(J)로부터 얻어진 리폭시게나아제-2 유전자의 5’인접 서열을 비교한 것이다. 단일뉴클레오타이드다형성(Single Nucleotide polymorphism: SNP)는 별표로 표시되어 있다. 직접염기서열분석에 사용된 프라이머 쌍(Set A)은 밑줄로 표시하였다.

도 1b는 푸른콩(P)과 진품콩 2(J)로부터 얻어진 리폭시게나아제-2 유전자의 5’인접 서열을 비교한 것이다. 단일뉴클레오타이드다형성(Single Nucleotide polymorphism: SNP)는 별표로 표시되어 있으며, 175-bp 삽입 서열은 진품콩 2에서만 발견되었다. 직접염기서열분석에 사용된 프라이머 쌍(Set A-Set C)은 밑줄로 표시하였다.

도 1c는 푸른콩(P)과 진품콩 2(J)로부터 얻어진 리폭시게나아제-2 유전자의 5’인접 서열을 비교한 것이다. 단일뉴클레오타이드다형성(Single Nucleotide polymorphism: SNP)는 별표로 표시되어 있다. 유전자은행(GenBank Acc. No.J03211)에 등록되어 있는 리폭시게나아제-2의 mRNA는 이탤릭체로, 전사개시 ATG는 굵은 글씨체로 표시되어 있다. 직접염기서열분석에 사용된 프라이머 쌍(Set B 및 Set C)은 밑줄로 표시하였다.

도 2는 푸른콩과 진품콩 2 사이에 Lx2 (리폭시게나아제-2) 유전자의 5’인접 서열의 차이를 나타낸 모식도이다.

도 3은 1% 아가로스젤에 전기영동시킨 푸른콩(P)과 진품콩 2(J)에서 각 프라이머를 이용하여 얻어진 PCR 산물을 나타낸다. 프라이머는 표 5에서 보여지는 두 종의 프라이머를 사용하였다. MW는 DNA 표준마커를 나타낸다.

도 4는 90 종의 재조합 내교배주(RIL)를 조사하기 전에 수행된 예비실험결과를 보여준다. 푸른콩과 진품콩에서 각각 971 bp 와 1146 bp가 증폭됨을 확인하였다.

도 5는 1%의 아가로스젤에 전기영동시킨 90 종의 RIL의 PCR 산물을 나타낸다. 레인 1, 푸른콩; 레인 2, 진품콩 2; 레인 3-92, 90 RILs.

도 6은 프라이머 Set A, Set B 그리고 Set C를 사용하여 얻어진 7 종의 대두 재배종의 PCR 산물을 나타낸다. 레인 1, 푸른콩; 레인 2, 진품콩 2; 레인 3, SS2-2; 레인 4, PI96188; 레인 5, 태광콩; 레인 6, 단백콩; 레인 7, 풍산나물콩. 상기 일곱 종의 재배종에서 푸른콩, 진품콩 2, SS2-2 및 태광콩에 대해서 직접염기서열분석을 실시하였다.

도 7은 푸른콩(레인 1 및 3)과 진품콩 2(레인 2 및 4)의 잎과 종실에서의 Lx2 유전자(GmLx2)와 그에 대한 정량적 대조군인 튜블린(Tubulin)의 발현패턴을 나타낸다.

도 8a는 푸른콩(P) 및 진품콩 2(J)의 리폭시게나아제-2 염기서열에 대하여 두 cDNA 서열인 J03211 및 D13949를 함께 비교한 것이다. SNP는 굵은체로 표시되어 있으며 SNP를 포함하는 코돈은 밑줄로 표시되어 있다. 인트론은 소문자로 나타나 있으며, 서열 외부의 수자는 cDNA 서열상의 각 염기에 해당한다.

도 8b는 푸른콩(P) 및 진품콩 2(J)의 리폭시게나아제-2 염기서열에 대하여 두 cDNA 서열인 J03211 및 D13949를 함께 비교한 것이다. 푸른콩과 진품콩 2에서 발견된 GAA 삽입을 굵은체로 표시하고 있다.

본 발명은 식물, 특히 대두에서의 유전적 마커에 대한 것으로서, 보다 상세하게는 대두에서의 콩비린내 특성과 관련된 유전적 마커에 대한 것이다.

리폭시게나아제(lipoxygenase: LOX)는 동식물에서 흔히 발견되는 지질산화효소이다(Start et al., 1986). 이 효소는 모든 식물조직과 기관에 존재하지만, 그 양은 생장단계와 기관에 따라 차이가 있을 것이라 여겨진다. 또한, 비생물학적 그리고 생물학적 스트레스, 예를 들면 가뭄, 상해, 그리고 세균성 또는 진균성 감염과 같은 요인에 의해 LOX 활성과 유전자 발현이 증가한다(Bell et al., 1991).

리폭시게나아제는 종실두[Glycine max (L) Merr.]와 콩 제품에서 콩 특유의 풍미를 갖게 한다(Sessa, 1979). 대두의 리폭시게나아제는 다인자가계(mutligene family)의 예로서, 유전자 변이가 상당히 적으며, 최소 여덟 개의 유전자로 구성되어 있다. 영양생장기관에 존재하는 다섯 가지의 리폭시게나아제인 VLXA-VLXE, 및 세 가지의 종실저장 리폭시게나아제인 LOX1, LOX3 그리고 LOX3가 최소 존재한다(Stephenson et al., 1998). 종실두에 존재하는 상기 세 가지의 동질효소 중에서, LOX2가 일반적으로 콩 비린내를 유발하는 원인으로 작용한다(Davies et al., 1987). 대두 리폭시게나아제-2의 cDNA의 염기서열이 이미 밝혀져 있으며, 리폭시게나아제-1 그리고 -3의 아미노산 서열은 81% 그리고 74%의 상동성을 갖고 있다(Shibata et al., 1988). 일부 대두류의 성숙 종실에서는 리폭시게나아제 동질효소가 결핍되어 있다. 이들 대두류에 대해 유전학적 연구를 수행한 결과, 성숙 종실에서 LOX1, LOX2 그리고 LOX3가 결손된 이유는 각각 lx1 , lx2 그리고 lx3의 단성 열성대립유전자 때문임이 증명되었다(Hajika et al., 1992). Lx1은 LG F 상에서 위치가 파악되었으며(Xu et al., 2000;Cregan et al., 2001), 본 연구팀의 이전 연구에 따르면, Lx2는 Lx1과 거의 동일한 위치에 존재하였다(Kim et al., 2004). 반면에 Lx3의 위치는 Lx1 , Lx2와 각각 독립적으로 존재한다.

기존의 연구에 의하면, 리폭시게나아제-2 유전자 위치를 찾아내기 위해 단순염기반복지역(SSR)마커를 사용하여 푸른콩 x 진품콩 2의 재조합 내교배주(RIL)군을 대상으로 유전자지도를 작성하였다. Lx2 유전자 서열을 바탕으로 제작된 다섯 개의 프라이머 쌍을 사용하여 푸른콩과 진품콩 2 사이의 SNP를 조사하였으며, 인트론에서 세 개의 SNP를 확인하였다. 게다가, SNP T/C 중 하나가 리폭시게나아제-2 유전자와 동시-분리된 것으로 나타났다. 이러한 SNP T/C마커에 대한 분리 결과를 근거로 Lx2의 위치를 LG F 상에서 찾아내었다.(Kim et al., 2004).

대두 리폭시게나아제에는 여섯 개의 히스티딘 보존잔기가 있으며, 이 중 세 부위가 리폭시게나아제의 활성에 필수적이라는 사실이 Escherichia coli에서의 발현을 통해 밝혀졌다(Steczko et al., 1992). 또한 일본에서 필수 히스티딘의 치환되어 LOX2가 결손된 대두변이주가 확인되었다(Wang et al., 1994). 비록 상기 세 히스티딘 잔기의 효소활성에 대한 역할은 증명되지 않았으나, 철 리간드로서의 역할을 할 것이라고 여겨지고 있다(Steczko et al., 1992).

유전자의 프로모터 서열 상의 다형성으로 비정상적인 전사조절이 초래되며, 그로 인하여 질병의 진행 혹은 치명성에 영향을 미친다(Hobbs et al., 1998). 프로모터 상의 변이와 그 기능에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있다. 예를 들면, 대두 LOX3 유전자의 프로모터 부위에 존재하는 두 개의 단일염기치환으로 인하여 상당한 mRNA의 감소를 초래하였다(Wang et al., 1993). 또한 완두의 LOX-2 결여변이체의 프로모터 내에 다수의 삽입, 결실 그리고 치환이 있음이 확인되었으며, 완두의 결여변이체 종실에서 mRNA가 감소된 것으로 나타났다(Foster et al., 1999).

분자마커

분자마커는 지난 20 년 동안 놀라울 정도로 발전되어 왔다. 초기 대두 유전자지도는 우선적으로 효소절편길이다형성(RFLP)에 의해 제작되었으며, 여기에는 수 십 종의 고전적인 마커와 동질효소 마커가 포함되었다(Keim et al., 1990). 첫 DNA 마커는 효소절편길이다형성 마커이며, 이는 서열 상에서 다양성을 가진 중성부위를 찾는데 사용된다. 얼마 후, 다형DNA 무작위증폭방법(RAPD), 증폭단편다형화(AFLP), 단순염기반복(SSR) 마커가 중합효소반응 기반의 마커처럼 빠르게 개발되었다. 단일뉴클레오타이드다형성(SNP)은 최근 마커로 개발되었다. SNP는 상당히 안정적인 유전자 마커로서, 어떤 경우에는 직접적으로 표현형의 원인이 되며, 자동화된 유전자형 확정 시스템에 아주 적합하다(Landegren et al., 1998).

마커 지원 선별( marker assisted selection : MAS )

농작물의 MAS의 근간을 이루는 분자마커를 사용하여 다수의 농업적으로 중요한 유전자를 표지하고 그 지도를 제작하는데 진보를 이루어 왔다(Mohan et al., 1997). 분자마커는 외부적인 조절을 받지 않으며, 그렇기 때문에 환경이나 생장단계에 의해 영향을 받지 않는다. SNP는 직접적으로 중요한 유전자의 위치파악, 그리고 목적하는 형질선택 또는 작물육종계획에서 유해한 형질제거를 용이하게 하는 유전적인 마커로서 엄청난 잠재성을 가지고 있다는 사실이 점점 확실해지고 있다(Kim et al., 2004). SNP 마커는 대립인자 특이적이기 때문에 MAS를 목적으로 사용하는데 더욱 효율적일 수 있다.

역전사중합효소연쇄반응( RT - PCR )

역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)은 RNA에 대해 역전사효소를 사용하여 상기 RNA 분자를 cDNA로 변환시킴으로서, RNA를 중합효소연쇄반응의 주형으로서 사용이 가능하도록 한다. RT-PCR 기반의 분석은 유전자발현 패턴을 특성화하거나 검증하고 또한, 서로 다른 샘플 군과 mRNA의 정량적 차이를 비교하는데 가장 일반적으로 사용되는 방법이다(Orlando et al., 1998). RT-PCR은 cDNA를 합성하는 단계를 제외하고는 종래의 PCR과 거의 동일하다. cDNA 합성단계는 민감하고 정확한 정량분석을 위하여 절대적으로 중요하며, 역전사효소에 의해 합성되는 cDNA의 양은 반응에 주형으로 첨가된 RNA 양과 정확하게 상응되어야 한다(Bustin, 2002). 또한, RNA 서열분석은 보통 상기 RT-PCR 산물의 서열분석을 통해 이루어진다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 콩비린내를 유발하는 유전전 마커에 대한 연구를 수행하였고, 그 결과 리폭시게나아제 2(LOX 2)의 5’인접 서열에서 단일뉴클레오타이드 다형성 (single nucleotide polymorphism: SNP) 현상을 발견하였고, LOX 2 결여 변이체의 상기 5’인접 서열에서 175 bp 삽입 서열이 유전적 마커로서 이용될 수 있다는 사실을 발견하였다. 또한, LOX 2 유전자의 신규한 5’인접 서열을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 야생형 대두 리폭시게나아제 2(LOX 2) 유전자의 5’인접 서열을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 변이형 대두 리폭시게나아제 2 (LOX 2) 유전자의 5’인접 서열을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 콩비린내(beany flavor)가 없는 특성을 갖는 콩 변이체를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 콩비린내가 없는 특성을 갖는 콩 변이체를 동정하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 콩비린내가 없는 특성을 갖는 콩 변이체를 동정하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 대두 리폭시게나아제 2(LOX 2) 유전자의 5’인접 서열(flanking sequence)을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이 드 서열을 포함하는 대두 리폭시게나아제 2(LOX 2) 유전자의 5’인접 서열을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에서 (i) 38번째와 39번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기, (ⅱ) 642번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기, (ⅲ) 695번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기, (ⅳ) 1347번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기, (ⅴ) 1509번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기, 또는 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 유전적 마커 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

본 발명자들은 콩비린내를 유발하는 유전전 마커에 대한 연구를 수행하였고, 그 결과 리폭시게나아제 2(LOX 2)의 5’인접 서열에서 단일뉴클레오타이드 다형성 (single nucleotide polymorphism: SNP) 현상을 발견하였고, LOX 2 결여 변이체의 상기 5’인접 서열에서 175 bp 삽입 서열이 유전적 마커로서 이용될 수 있다는 사실을 발견하였다. 또한, LOX 2 유전자의 신규한 5’인접 서열을 규명하였다.

본 발명의 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열은 LOX 2 유전자의 5’인접 서열로서, 콩비린내가 있는 야생형 콩(특히, 대두)의 LOX 2 유전자의 5’인접 서열이다.

본 발명의 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열은 LOX 2 유전자의 5’인접 서열로서, 콩비린내가 없는 변이형 콩(특히, 대두)의 LOX 2 유전자의 5’인접 서열이다. 상기 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에는 LOX 2 결여(null) 변이체, 즉 콩비린내가 없는 변이형 콩을 검출 또는 선별할 수 있는 유전적(또는 분자적) 마커로서 이용될 수 있는 독특한 서열이 포함되어 있다.

본 명세서에서 용어, "뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서 LOX 2 유전자를 언급하면서 사용되는 용어 “5’인접 서열(flanking sequence)"은 LOX 2 유전자의 출발코돈의 업스트림에 위치한 서열을 의미한다.

본 발명의 유전적 마커는 LOX 2 결여(null) 변이체, 즉 콩비린내가 없는 변이형 콩을 동정, 검출 또는 선별할 수 있는 마커로서 이용될 수 있다. 본 발명의 유전적 마커는 총 6종이 있다.

본 명세서 용어 “LOX 2 결여(null) 변이체” 및 “콩비린내가 없는 변이체”는 특별한 언급이 없는 한 동일한 의미로 사용된 것으로서, 리폭시게나아제 2의 단백질로의 발현이 실질적으로 없거나 활성이 실질적으로 없는 변이체를 의미하며, 이러한 변이체는 콩비린내가 없는 특성(phenotype)을 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “유전적 마커(genetic marker)”는 지놈에 있는 특정 서열로서 특정 형질(phenotype)을 가리키는(indicating) 표지로서 이용될 수 있는 것을 의미하며, 용어 “분자 마커”와 혼용된다.

상기 유전적 마커 중에서, 642번째 뉴클레오타이드, 695번째 뉴클레오타이드, 1347번째 뉴클레오타이드 및 1509번째 뉴클레오타이드는 SNP에 해당되는 것이다. 콩비린내가 없는 변이형 콩에서, 642번째, 695번째, 1347번째 및 1509번째 뉴클레오타이드는 각각 "A", “C", “T" 및 “T"이고, 콩비린내가 있는 야생형에서는 상기 뉴클레오타이드 위치는 각각 “T", "A" 및 “A" 및 “C"이다.

또한, 상기 유전적 마커 중에서, 38번째와 39번째 뉴클레오타이드(이하, “2 bp-삽입 변이”라 한다)는 LOX 2 결여 변이체에만 존재하고, 야생형에서는 이에 대응되는 뉴클레오타이드가 결여되어 있다. 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 유전적 마커(이하, “175 bp-삽입 변이”라 한다)는 LOX 2 결여 변이체에만 존재하고, 야생형에서는 이에 대응되는 뉴클레오타이드가 결여되어 있다.

본 발명의 유전적 마커는 콩에 적용되며, 가장 바람직하게는 대두(Glycine max)에 적용된다.

한편, 본 발명은 상술한 바와 같이, 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에서 642번째, 695번째, 1347번째 및 1509번째 뉴클레오타이드가 각각 "A", “C", “T" 또는 “T"인 LOX 2 결여 변이체에 대한 대립형(allele), 38번째와 39번째 뉴클레오타이드(GT)가 추가적으로 삽입된 대립형, 그리고 888번째 뉴클레오타이드 로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열기 추가적으로 삽입된 LOX 2 결여 변이체에 대한 대립형에 관한 것이나, 이러한 대립형 뉴클레오타이드가 이중가닥의 gDNA(genomic DNA)에서 발견되는 경우, 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 즉, 상보적인 뉴클레오타이드 서열에서 LOX 2 결여 변이체를 나타내는 SNP 중 하나인 642번째 뉴클레오타이드 "A"는 "T"가 된다.

이러한 측면에서, 본 명세서의 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, gDNA에서 센스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 콩으로부터 핵산 분자를 분리하는 단계; 및 (b) 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에서 (ⅰ) 38번째와 39번째 뉴클레오타이드, (ⅱ) 642번째 뉴클레오타이드, (ⅲ) 695번째 뉴클레오타이드, (ⅳ) 1347번째 뉴클레오타이드, (ⅴ) 1509번째 뉴클레오타이드, 또는 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열의 존재 유무를 상기 분리된 핵산 분자에서 확인하는 단계를 포함하며, 상기 뉴클레오타이드가 존재하는 경우에는 콩비린내(beany flavor)가 없는 특성을 갖는 콩으로 판정하는 것을 특징으로 하는 콩비린내가 없는 특성을 갖는 콩 변이체를 동정하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서, 용어 "핵산 분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타 이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 방법에 있어서, 상기 핵산분자는 콩 식물체의 다양한 기관으로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 잎, 뿌리, 줄기 및 종자(또는 종실)로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 종자로부터 얻는다. 핵산분자의 공급원(source)로서의 식물체는 어떠한 발달 단계에 있는 것이든 모두 공급원으로서 이용될 수 있다. 한편, 본 발명의 방법은 초기 발달 단계에 있는 식물체로부터 핵산 분자를 얻어 그 식물체가 LOX 2 결여 변이체, 즉 콩비린내가 없는 변이형 콩인지를 초기에 판정할 수 있다.

본 발명의 방법에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich (1994)).

출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol. Rep ., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem . 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 식물세포로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전 사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 특정 서열을 규명하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화(FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res ., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann . Rev . Genet ., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다.

다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNPs, 2 bp-삽입 변이 및 175 bp-삽입 변이를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다.

예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 식물체로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.

혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNPs, 2 bp-삽입 변이 및 175 bp-삽입 변이를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 LOX 2 결여 변이체 여부를 결정한다.

본 명세서에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNPs, 2 bp-삽입 변이 및 175 bp-삽입 변이를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에서 (i) 38번째와 39번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기, (ⅱ) 642번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기, (ⅲ) 695번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기, (ⅳ) 1347번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기, (ⅴ) 1509번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기, 또는 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNPs 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스 (duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건 (stringent condition)은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명의 방법이 상기의 SNPs를 검출하기 위하여 실시되는 경우, 가장 바람직하게는, 본 발명 방법의 단계 (b)는 대립형-특이 유전자 증폭 방법에 의해 실시된다. 이와 같이, 본 발명의 SNPs가 유전자 증폭 방법에 적용되는 경우, 특히 SNAP(single nucleotide amplified polymophism)라 통칭된다.

본 발명의 방법이 기본적으로 증폭 방법을 적용하여 실시하는 경우, 바람직 하게는, 상기 단계 (b)는 서열목록 제2서열의 (ⅰ) 38번째와 39번째 뉴클레오타이드, (ⅱ) 642번째 뉴클레오타이드, (ⅲ) 695번째 뉴클레오타이드, (ⅳ) 1347번째 뉴클레오타이드, (ⅴ) 1509번째 뉴클레오타이드, 또는 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 이용하여 상기 분리된 핵산 분자를 증폭하여 실시된다.

본 발명의 방법에 이용될 수 있는 증폭 기술은 PCR 증폭 (참조: Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822)), 리가아제 체인 반응 (LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), 중합효소 리가아제 체인 반응 (Barany, PCR Methods and Applic ., 1:5-16(1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), 리페어 체인 반응 (EP 439,182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) 및 NASBA (U.S. Pat. No. 5,130,238)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 PCR 증폭 단계에 따라 증폭한다.

증폭 기술이 적용되는 경우에는, 프라이머의 디자인이 중요하다. 바람직하게는, (ⅱ) 642번째 뉴클레오타이드, (ⅲ) 695번째 뉴클레오타이드, (ⅳ) 1347번째 뉴클레오타이드 또는 (ⅴ) 1509번째 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭하여 상기 단계 (b)를 실시하는 경우, 상기 프라이머쌍 중에서 전방향 프라이머 또는 역방향 프라이머는 서열목록 제2서열에서 (ⅱ) 642번째 뉴클레오타이드, (ⅲ) 695번째 뉴클레오타이드, (ⅳ) 1347번째 뉴클레오타이드 또는 (ⅴ) 1509번째 뉴클레오타이드에 해당하는 LOX 2 결여 표현형-관련 단일뉴클레오타이드 다형 성(SNP) 염기에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 전방향 또는 역방향 프라이머의 3'-말단은 상기 SNP 염기에 매칭되는 염기를 갖는다.

예를 들어, 642번째 뉴클레오타이드에 있는 SNP인 “A"를 검출하여 LOX 2 결여 변이체를 동정하는 경우, 상기 SNP의 업스트림에 상보적인 서열을 전방향 프라이머로서 이용할 수 있으며, 역방향 프라이머의 3’-말단은 상기 SNP에 매칭되는 염기 즉 “A" 염기를 가지며, 나머지 부분은 서열목록 제2서열에서 642번째 뉴클레오타이드의 다운스트림에 위치한 서열과 실질적으로 대응되는 서열을 갖는다. 이러한 프라이머쌍을 이용하여 642번째 SNP를 검출하는 증폭 반응을 실시할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (ⅰ) 38번째와 39번째 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭하여 상기 단계 (b)를 실시하는 경우, 상기 프라이머쌍 중에서 전방향 프라이머 또는 역방향 프라이머는 서열목록 제2서열에서 (ⅰ) 38번째와 39번째 뉴클레오타이드에 해당하는 LOX 2 결여 표현형-관련 유전적 마커에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 전방향 또는 역방향 프라이머의 3'-말단은 상기 유전적 마커의 염기에 매칭되는 염기를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭하여 상기 단계 (b)를 실시하는 경우, 상기 프라이머쌍 중에서 전방향 프라이머 또는 역방향 프라이머는 서열목록 제2서열에서 (ⅵ) 888번째 뉴클레 오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열에 해당하는 LOX 2 결여 표현형-관련 유전적 마커에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 전방향 또는 역방향 프라이머는 상기 유전적 마커의 뉴클레오타이드 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 변형예에 따르면, 상기 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭하여 상기 단계 (b)를 실시하는 경우, 상기 프라이머쌍 중에서 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서열목록 제2서열에서 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열에 해당하는 LOX 2 결여 표현형-관련 유전적 마커에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 콩비린내가 없는 특성을 갖는 콩 변이체의 동정은 증폭 반응 산물 크기를 비교하여 실시된다. 즉, 두 번째 프라이머 디자인 방식은, 175 bp-삽입 변이 서열의 업스트림 및 다운스트림에 있는 서열을 이용하는 것이다. 이러한 프라이머를 이용하여 증폭하게 되면, LOX 2 결여 변이형은 야생형보다 175 bp 정도 더 큰 크기의 증폭 산물을 만들기 때문에, 전기영동 젤에서 용이하게 관찰 및 분석할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 서열목록 제2서열의 (ⅰ) 38번째와 39번째 뉴클레오타이드, (ⅱ) 642번째 뉴클레오타이드, (ⅲ) 695번째 뉴클레오타이드, (ⅳ) 1347번째 뉴클레오타이드, (ⅴ) 1509번째 뉴클레오 타이드, 또는 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 포함하는 콩비린내가 없는 특성을 갖는 콩 변이체를 동정하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프라이머쌍 중에서 전방향 프라이머 또는 역방향 프라이머는 서열목록 제2서열에서 (ⅱ) 642번째 뉴클레오타이드, (ⅲ) 695번째 뉴클레오타이드, (ⅳ) 1347번째 뉴클레오타이드 또는 (ⅴ) 1509번째 뉴클레오타이드에 해당하는 LOX 2 결여 표현형-관련 단일뉴클레오타이드 다형성(SNP) 염기에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 전방향 또는 역방향 프라이머의 3'-말단은 상기 SNP 염기에 매칭되는 염기를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프라이머쌍 중에서 전방향 프라이머 또는 역방향 프라이머는 서열목록 제2서열에서 (ⅰ) 38번째와 39번째 뉴클레오타이드에 해당하는 LOX 2 결여 표현형-관련 유전적 마커에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 전방향 또는 역방향 프라이머의 3'-말단은 상기 유전적 마커의 염기에 매칭되는 염기를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프라이머쌍 중에서 전방향 프라이머 또는 역방향 프라이머는 서열목록 제2서열에서 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열에 해당하는 LOX 2 결여 표현형-관련 유전적 마커에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서 열을 포함하며, 상기 전방향 또는 역방향 프라이머는 상기 유전적 마커의 뉴클레오타이드 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 변형예에 따르면, 상기 프라이머쌍 중에서 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서열목록 제2서열에서 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열에 해당하는 LOX 2 결여 표현형-관련 유전적 마커에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 키트는 상술한 프라이머를 필수 구성요소로 하는 바, 프라이머에 대한 상세한 설명은 본 발명의 키트에 이용되는 프라이머에도 적용된다. 따라서, 반복적인 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명에 따르면, 복잡한 데이터 수집을 요구하는 표현형 결 정(phenotyping) 및 접종 과정 없이, 식물체의 초기 성장 단계에서 콩비린내가 없는 변이체, 즉 풍미가 우수한 콩(특히, 대두)을 신속하게 스크리닝할 수 있다. 본 발명의 마커는 다른 유전자형 결정 (genotyping) 방법보다 신속하고, 재현성이 우수하며 저가의 유전자형 결정 방법을 제공하는 것을 가능하게 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

식물 재료

대두의 리폭시게나아제-2의 SNP를 규명하기 위하여, 푸른콩과 진품콩 2를 사용하였다. 푸른콩은 풀과 콩의 풍미를 가지는 작은 크기의 종실을 생산하며, Lx2 유전자가 우성으로 존재한다. 반면에, 진품콩 2는 풍미가 없는 lx2 무반응 대립형질(null allele)을 가지고 있다(Kim et al., 1996). 또한, 진품콩 2는 모든 리폭시게나아제 동질효소(Lx1 , Lx2 그리고 Lx3)가 결여되어 있는데, 상기 효소 때문에 콩 종실에서 특유의 맛을 갖는다. 그러므로 진품콩 2는 콩 특유의 비린내가 없기 때문에 산업적 용도로서 유용한 형질을 가지고 있다(Kim et al., 1997).

푸른콩 x 진품콩 2로부터 나온 단일종실직계에 의해 개발된 총 90 개의 RIL 에 대해서도 조사하였다. 또한, 다른 다섯 종의 대두 재배종(SS2-2, PI 96188, 태광콩, 단백콩 및 풍산나물콩)을 확실한 비교를 위해 대조군으로 사용하였다. 모든 식물은 한국의 수원에 위치한 서울대학교 농장에서 재배되었다.

gDNA 의 추출

gDNA는 유식물 잎으로부터 Shure et al(1983)에 설명된 과정에 따라 추출하였다. DNA 농도는 호체스트(Hoechst) 염색약을 사용한 방법을 사용하여 형광분광측정기(모델 F-4500, 히다찌(주), 이바라기, 일본)로 측정하였다. DNA 용액은 Tris-EDTA 버퍼(pH 8.0)에 실험 시 사용될 농도로 희석하여 사용 전까지 -70℃에 보관하였다.

프라이머 제작

푸른콩과 진품콩 2의 Lx2 유전자의 5’인접부위 DNA를 분리하기 위해, 여섯 개의 목표부위특이성을 갖는 프라이머(TSP)를 GENERUNR프로그램을 사용하여 제작하였다. 프라이머는 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스에서 공개하고 있는 Lx2 유전자 서열(GeneBank Acc. No. J03211)을 기초로 제작되었다.

DNA WalkingSpeedUP™Premix Kit(시젠, 서울, 한국)을 사용하여 크로모좀 워킹을 하는데 최소한 세 쌍의 TSP가 필요하였다. TSP는 18-23 염기 정도의 길이제한 및 GC함유량 40% 내지 60%의 조건에 맞추어 제작하였다. 1 번 TSP(TSP1)의 융해온도(Tm)는 55℃ 내지 60℃ 사이였으며, 2 번과 3 번 TSP는 60℃ 내지 65℃ 사이였다. 프라이머에는 헤어핀 구조를 가지지 않으며, 각 프라이머와 프라이머 쌍 사이의 3’ 말단에 대한 상보성을 나타내지 않았다. 1차 크로모좀 워킹의 서열결과로부터 리폭시게나아제-2 유전자의 5’-인접의 서열을 좀 더 포함하도록 세 종류의 TSP를 제작하였다. 상기 프라이머 서열은 표 1에 나타나 있다.

	프라이머 이름	서 열
1차 크로모좀 워킹	TSP 1	CCAAGAAAGCAGTGAGGTT
	TSP 2	GTCCAACACATTCCTCATC
	TSP 3	TATGCCCTCCTCCTCTGTTC
2차 크로모좀 워킹	TSP 1	ATCGCACAGAATCCTCAA
	TSP 2	ATGCGAGGTGTCACACAGA
	TSP 3	ATGAATGTGCATGTGATGGACTG

Lx2 유전자의 5’인접 DNA 의 분리

푸른콩과 진품콩 2의 Lx2 유전자의 5’인접 DNA는 키트를 사용하여 제조사가 설명하는 과정을 정확하게 준수하여 분리하였다. 마스터믹스 II에는 DNA 주형과 프라이머를 제외한 PCR에 필요한 모든 성분이 포함되어 있다. 1차 PCR 반응은 전방향 프라이머로써 키트에서 제공되는 네 가지의 어닐링 조절 프라이머(annealing control primer 1-4: ACP1-4)와 TSP1을 역방향 프라이머로 사용하여 독립적으로 실시하였다(표 2).

구 성	양/반응 (㎕)
50 ng/㎕ DNA 주형l	4
2.5 μM DW-ACP (one of DW-ACP 1, 2, 3, and 4)	4
10 μM TSP 1	1
증류수	16
2X SeeAmpTM ACP TM 마스터믹스 Ⅱ	25
총량	50

이 때 PCR 반응기에 반응튜브를 장착하기 이 전에 반응기 덮개를 예열(94℃)하여 사용하는 것이 절대적으로 중요하다. 1차 PCR 조건은 다음과 같다: 5분 동안 94℃에서 초기 변성, 1분 동안 42℃에서 어닐링, 1분 동안 72℃에서 신장; 30초 동안 94℃에서 두 번째 변성, 30초 동안 55℃에서 어닐링 100초 동안 72℃에서 신장. 상기 조건을 MJ Tetrad thermocycler(MJ Research, WAtertown, MA, USA)를 사용하여 30회 반복하였다.

반응액 상에 존재하는 DW-ACP와 TSP1 프라이머를 제거하기 위해 1차 PCR 산물을 AccuPrep^?PCR 정제키트(바이오니아, 대전, 한국)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 1차 PCR산물을 DNA주형으로 하여 2차 PCR을 수행하였다(표 3). 2차 PCR 조건은 다음과 같다: 3분 동안 94℃에서 초기 변성, 30초 동안 94℃에서 변성, 30초 동안 60℃에서 결합, 100초 동안 72℃에서 신장; 7분 동안 72℃에서 최종신장.

구 성	양/반응 (㎕)
1차 PCR 정제물	4
10 μM DW-ACPN	1
10 μM TSP 2	1
증류수	4
2X SeeAmpTM ACP TM 마스터믹스 Ⅱ	10
총량	20

2차 PCR 산물을 3차 PCR의 DNA주형으로 사용하였다(표 4). 3차 PCR 조건은 다음과 같다: 3분 동안 94℃에서 초기 변성, 30초 동안 94℃에서 변성, 30초 동안 65℃에서 결합, 100초 동안 72℃에서 신장; 7분 동안 72℃에서 최종신장.

구 성	양/반응(㎕)
2차 PCR 산물	2
10 μM 유니버살 프라이머	1
10 μM TSP 3	1
증류수	6
2X SeeAmpTM ACP TM 마스터믹스 Ⅱ	10
총량	20

총 20 ㎕의 세 번째 PCR 산물을 2.0%의 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide)로 염색된 아가로스젤에 전기영동하고, 상기 DNA 밴드를 수거하였다. PCR산물은 Necleospin(MACHEREY-NAGEL, Duren, Germany)을 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 p-GEM-T Easy 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝하였으며, 얻어진 클론은 ABI3700 염기서열분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 유전자 서열을 분석하였다. 다섯 개의 클론에 대해 유전자 서열을 분석하였으며, PCR 아티팩트의 서열을 해석하는 오류를 피하기 위해 비교분석하였다.

염기서열분석

서로 다른 대두 유전형사이에 리폭시게나아제-2 유전자 내에 존재하는 SNP의 존재유무를 확인하기 위하여 상기 유전자의 서열을 SeqScape Version 2.0(Applied biosystems, Forster City, CA, USA)을 사용하여 정렬비교 하였다. T-백터 서열과 아비트러리 전방향 프라이머 서열은 BLAST Network Service(NCBI, National Center for Biotechnology Service)를 사용한 서열분석을 수행하기 전에 제거하였다.

PCR 에 의한 크로모좀 워킹 결과의 검증

각 재배종에 대한 크로모좀 워킹의 결과를 검증하기 위하여 두 가지의 프라이머 쌍를 제작하였다. 상기 프라이머를 175 bp 삽입단편 주변의 gDNA를 증폭시키는데 사용한 후에, PCR 산물을 전기영동하여 상기 삽입을 증명하였다(표 5).

프라이머 서열	예상 증폭크기 (bp)
	푸른콩	진품종 2
F: GCTATAAATCACGTTTCGTTAC	971	1146
R: TATGCCCTCCTCCTCTGTTC
F: GCTATAAATCACGTTTCGTTA	594	769
R: ATGCGAGGTGTCACACAG

90 종의 RIL 과 다른 5 종의 대두 재배종에 대한 PCR 실험

상기 두 가지의 프라이머 쌍를 사용하여 크로모좀 워킹의 결과를 검증하는 동안, 하나의 프라이머 쌍(전방향 프라이며: 5’-GCTATAAATCACGTTTCGTTAC-3' 및 역방향 프라이머: 5’-TATGCCCTCCTCCTCTGTTC-3')를 90종의 RIL에 대해 조사하는데 사용하였다. 또한 다른 다섯 종의 대두 재배종(SS2-2, PI 96188, 태광콩, 단백콩 그리고 풍산나물콩)을 확실한 비교를 위하여 함께 조사하였다. 각 PCR 반응은 최종 부피 50 ㎕에서 수행하였다(표 6).

구성	양/반응 (㎕)
20 ng/ml gDNA	2.5
10 μM 프라이머 혼합물	4.0
2.5 μM dNTP	4.0
10 X 버퍼	5.0
Taq 중합효소 (2 U/㎕)	0.8
증류수	33.7
총량	50.0

상기 반응은 3분 동안 94℃에서 변성시켰으며, 그런 다음 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분의 조건을 30회 반복하였다. PCR은 72℃에서 10분간의 단일 단계로 종료하였다. 상기 PCR 산물은 2% 아가로스젤 상에서 전기영동하여 밴드의 크기를 확인하였다. 푸른콩 및 진품콩 2와 동일한 밴드 패턴을 나타내는 대두종은 각각 숫자 1 및 3을 부여하였다. 그리고 두 밴드를 모두 나타내는 것은 숫자 2를 부여하였다. 상기 결과는 SNP T/C 마커의 Lx2 유전자와 비교하였으며, 상기 유전자의 동시-분리를 보고하였다(Kim et al., 2004).

직접염기서열분석( direct sequencing ) 및 프로모터 부위 조사

Taq 중합효소에 교정활성이 없기 때문에 이로 인한 아티팩트와 진정한 SNP를 구별할 필요하였다. 이러한 문제를 바로잡기 위해, 직접염기서열분석을 수행하였는데, 이 방법을 사용한 이유는 상기 에러가 무작위적으로 존재했기 때문이었다. 직접염기서열분석을 용이하게 수행하기 위하여 증폭된 리폭시게나아제-2 유전자의 5’-인접의 전체 부분을 포함하는 세 가지 프라이머를 제작하였다(표 7). 175 bp 삽입단편의 전서열 부위, 175 bp 삽입단편 부위 그리고 175 bp 삽입단편의 후서열 부위를 프라이머 Set A, Set B, Set C로 각각 증폭시켰다.

게다가, SS2-2, PI 96188, 태광콩, 단백콩 및 풍산나물콩에 대해서도 함께 조사하였으며 그런 후, 태광콩 및 SS-2의 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다.

프라이머	프라이머 서열	예상 증폭크기 (bp)
		푸른콩	진품종 2
Set A	F: GCAACTTCCTGTTAACTTGG	858	858
	R: CAATATATTGCTGTCATGCTG
Set B	F: GCTATAAATCACGTTTCGTTAC	594	769
	R: ATGCGAGGTGTCACACAGA
Set C	F: GGAGGCGATCTATCTTTACC	687	687
	R: TATGCCCTCCTCCTCTGTTC

총 RNA 추출

본 연구에서는 개화 후 35일 내지 40일의 중간 성숙단계의 종실을 사용하였다. 2주 정도의 어린잎을 수거하여 액체질소에 즉시 냉동시켰다. 각 수거물의 0.5 g의 냉동 조직에 대해 Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 엽조직에 Trizol(1 ml/ 50 -100 mg 조직)을 첨가하여 와동시키며 균일파쇄하였다. 상기 호모제네이트는 상온에서 5분 동안 정체시켜 핵단백 복합체가 완전히 해리되도록 하였다. 균일파쇄 과정 후, 불용성 물질은 4℃, 12,000 g에서 10분간 원심분리를 통해 제거하였다. 그런 다음, 상기 호모제네이트에 0.2 ml의 클로로포름을 첨가하였고, 완전히 밀봉하여, 15초 동안 세게 교반시켰다. 상기 혼합물을 상온에서 2 분 내지 15분 동안 정체시키고 4℃, 12,000 g에서 10분간 원심분리하였다. 수용액 부분을 새로운 튜브에 옮기고 0.5 ml의 이소프로판올을 첨가하여 RNA를 침전시켰다. 상기 시료를 10분간 상온에 방치한 후, 4℃ 내지 25℃, 12,000 g에서 8분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후에, 팰렛을 1 ml의 에탄올로 와동시키면서 세척하였으며, 5분 동안 공기건조 시켰다. RNA를 RNA분해효소-비함유 물(GenDEPOT, Inc., San Jose, CA, USA)에 용해시켰다. 총 RNA의 순도와 농도는 260 nm 및 280 nm에서 분광측정기로 측정하였다. 상기 RNA는 사용 전까지 -70℃에 보관하였다.

역전사중합효소연쇄반응( RT - PCR )

RT-PCR의 기술은 SuperScript™One-Step RT-PCR(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 리폭시게나아제-2 유전자의 발현 패턴을 분석하는데 사용하였다. 각 반응은 최종 부피 25 ml에서 수행하였다(표 8).

구성	양/반응 (㎕)	최종농도
RNA분해효소 비함유 물	10	-
2X 반응버퍼*	12.5	1X
전방향 프라이머 (10 μM)	0.5	0.2 μM
역방향 프라이머 (10 μM)	0.5	0.2 μM
RT/Platinum^RTaq Mix	0.5	-
총 RNA 주형	1	1 ㎍
총량	25	-

*0.4 mM dNTP 및 2.4 mM MgSO₄를 포함하는 버퍼

특이적 프라이머(전방향 프라이머:5’-GGTGTCGGGAATCCTGAACA-3’ 및 역방향 프라이머: 5'-TTGCAAACAAAGCGAATGGTT-3’)를 National Center for Biotechnology Information(NCBI) 데이터베이스에서 공개하고 있는 Lx2 유전자 서열을 바탕으로 제작하였다(GenBank Acc. No. J03211). 대두 튜블린 유전자는 프라이머 5’-AACCTCCTCCTCATCGTACT-3’ 및 5’-GACAGCATCAGCCATGTTCA-3’로 증폭되며, 대조군으로 사용하였다.

RT-PCR은 세 단계의 반응으로 수행하였다; 첫 단계는 cDNA를 합성하고, 예비변성 단계로서 50℃에서 30분 그리고 94℃에서 2분으로 구성된다. 다음, PCR 증폭은 94℃에서 1분(변성), 50℃ 내지 60℃에서 1분(어닐링), 72℃에서 1분(신장)의 단계를 40회 반복하고, 72℃에서 10분 동안의 최종 신장을 수행하였다.

gDNA 염기서열분석에 의한 lx2 유전자 상의 미스센스돌연변이 ( missense mutation) 검증

두 cDNA 서열, D13949 및 J03211 사이에 상이함이 존재하였다. 우선, lx2 유전자 상에 점돌연변이(point mutation)는 이미 보고되었다(Wang et al., 1994). T가 A로 치환되면서 히스티딘이 글루타민으로 바뀌는 아미노산의 변화를 초래하였다. 둘째로, cDNA J033211의 Lx2와 비교하였을 때, 다수 다른 재배종과 cDNA D13949의 lx2 상에 GAA 삽입이 발견되었다. 이러한 푸른콩 및 진품콩2 상이의 상기 두 서열상의 차이를 확인하기 위해 두 가지 프라이머 쌍를 제작하여 유전자 서열을 비교하였다.

실험 결과

진품콩 2의 리폭시게나아제 -2 유전자의 5’인접 서열은 푸른콩의 동일부위의 서열과 다르다

푸른콩 및 진품콩 2의 증폭된 단편의 길이는 1차 크로모좀 워킹에 의해 각각 620 bp 그리고 1,891 bp인 것으로 확인되었다. 푸른콩으로부터 유전자 서열을 좀 더 얻기 위해, 상기 620-bp 서열을 바탕으로 세 가지의 TSP를 새롭게 제작하였다. 세 가지 TSP를 사용하여 2차 크로모좀 워킹을 수행한 후, 푸른콩에서 총 1,714 bp의 염기서열을 얻었다.

상기 PCR 산물을 클로닝하고 염기서열을 분석한 다음, 상기 산물이 리폭시게나아제-2 유전자로부터 증폭된 것인지를 검증하기 위해 상기 서열을 NCBI 데이터베이스의 BLAST를 사용하여 리폭시게나아제-2 유전자와 비교하였다. 상기 서열의 3’ 말단은 Glycine max의 리폭시게나아제-2의 mRNA의 5’ 부위와 상동성을 갖고 있었다(도 1a, 1b 및 1c). 진품콩 2의 리폭시게나아제-2 유전자의 5’-인접 서열을 푸른콩의 동일부위와 비교한 결과, 다섯 개의 SNP와 175-bp 삽입단편이 발견되었다(도 2).

PCR 에 의한 크로모좀 워킹 결과의 검증

크로모좀 워킹 결과를 검증하기 위하여, 다수의 실험을 수행하였다. 우선, SNP T/C 마커를 사용하여 리폭시게나아제-2 유전자와의 175-bp 삽입단편의 동시-분리를 비교하여 조사하였으며, 이는 전 연구에서 리폭시게나아제-2 유전자와 동시-분리되어 있음을 보고하였다(Kim et al., 2004). 2차 크로모좀 워킹으로 확인한 다섯 개의 SNP가 리폭시게나아제-2 유전자의 5’인접 서열에 존재함을 증명하기 위하여 직접염기서열분석법을 실시하였다.

175-bp 삽입단편 부위를 증폭하도록 제작된 각 프라이머를 사용하여 표준 PCR을 수행한 결과 예상대로의 PCR 산물이 증폭되었다(도 3) 또한, 상기 PCR 산물의 염기서열을 분석하였으며, 상기 결과는 크로모좀 워킹의 결과와 동일하였다.

90 종의 RIL 사이의 175- bp 삽입단편의 분리

두 프라이머 중 하나인 프라이머 2(도 3)를 선택하여 90 종의 RIL을 조사하는데 사용하였다. 최적의 gDNA의 양을 결정하기 위하여 예비실험을 수행하였으며, 대략 50 ng의 gDNA가 90 종의 RIL에 대한 각 반응에 충분할 것이라 판단하였다(도 4).

90 종의 RIL 중에서, 35개의 라인과 53개의 라인이 각각 푸른콩과 진품콩 2와 동일한 밴드 패턴을 나타내었다(도 5). 그리고 두 개의 밴드를 나타내는 두개의 이형접합체가 존재하였다. 이러한 분리 밴드 패턴을 리폭시게나아제-2 유전자가 동시-분리되어 있는 것으로 알려진 SNP T/C 마커의 결과와 비교하였다(표 10).

NPJ	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
SNP T/C	1	3	3	3	1	3	1	3	3	1	3	3
175 bp	1	3	3	3	1	3	1	3	3	1	3	3
NPJ	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22	23	24
SNP T/C	1	3	3	3	1	3	1	3	3	1	1	1
175 bp	1	3	3	3	1	3	1	3	3	1	1	1
NPJ	25	26	27	28	29	30	31	32	33	34	35	36
SNP T/C	1	1	1	3	3	3	1	1	3	3	1	3
175 bp	1	1	1	3	3	3	1	1	3	3	3	3
NPJ	37	38	39	40	41	42	43	44	45	46	47	48
SNP T/C	1	3	3	1	3	1	1	3	3	3	3	1
175 bp	1	3	3	1	3	1	1	3	3	3	3	3
NPJ	49	50	51	52	53	54	55	56	57	58	59	60
SNP T/C	1	3	3	1	1	3	3	3	1	2	1	3
175 bp	1	3	3	1	1	3	2	3	1	2	1	3
NPJ	61	62	63	64	65	66	67	68	69	70	71	72
SNP T/C	3	1	3	1	1	3	3	1	3	1	1	1
175 bp	3	1	3	1	1	3	3	1	3	1	1	1
NPJ	73	74	75	76	77	78	79	80	81	82	83	84
SNP T/C	3	3	3	3	3	3	1	14	1	3	3	1
175 bp	3	3	3	3	3	3	1	1	1	3	3	1
NPJ	85	86	87	88	89	90	91	92
SNP T/C	3	3	1	3	3	3	3	1
175 bp	3	3	1	3	3	3	3	1

다섯 종의 대두 재배종의 조사와 직접염기서열분석

리폭시게나아제-2 유전자의 5’-인접 서열을 증폭하기 위해 제작한 프라이머를 사용하여 표준 PCR을 수행하였다. Set A 및 Set C 사이에는 크기의 차이는 발견되지 않았다(도 6). 반면에 진품콩 2의 증폭산물은 Set B에서의 다른 산물보다 길이가 더 긴 것으로 나타났다. 각 프라이머 서열은 도 1에서 밑줄로 표시되어 있다.

진품콩 2의 단일형(haplotype)이 네 종의 대두 재배종 가운데 유일한 것으로 밝혀졌다. 또한, 175-bp 삽입단편이 진품종 2에서만 존재하였다. SNP 위치를 나타내는 윗 줄의 수자는 푸른콩, SS2-2 그리고 태광콩을 나타내며, 아래 줄의 수자는 진품콩의 SNP 위치를 나타낸다(표 11). 표 10의 네 개의 SNP는 직접염기서열분석을 통해 확인하였으나, 반면에 염기번호 38의 GT 삽입은 검증하지 못했다. 그 이유는 프라이머 서열과 프라이머 서열의 근접부위는 직접염기서열분석 과정에서 확실히 읽힐 수 없기 때문이다. 모든 SNP와 삽입은 상당히 연관이 있었으며, 이는 유전자의 전사 혹은 해석과정의 조절과 연관될 수 있다는 것을 의미하였다.

대두 재배종	SNPs				175-bp 삽입유무
대두 재배종	640 (642)	693 (695)	1170 (1347)	1332 (1509)	175-bp 삽입유무
푸른콩	T	A	A	C	무
진품콩 2	A	C	T	T	유
SS2-2	T	A	A	C	무
태광콩	T	A	A	C	무

RT - PCR

lx2의 발현이 전사단계에서 조절되는지를 평가하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 하우스키핑유전자의 하나인 튜블린을 사용하여 유전자 발현을 검사하였으며, 두 대두종에서 강하게 발현되는 것으로 나타났다. 리폭시게나아제-2의 전사체는 두 재배종의 2주 성장된 대두엽에서는 발견되지 않았다. 반면에 진품종 2의 종실에는 상기 효소가 결실되어 있음에도 불구하고 두 재배종의 종실에서 선택적으로 발현되었다(도 7). 게다가, 상기 RT-PCR 산물의 염기서열을 분석하였으며, 상기 서열이 리폭시게나아제-2 유전자와 동일함을 확인하였다. 그러므로, Lx2는 전사단계가 아닌 해석단계에서 조절되는 것으로 결론지을 수 있다.

gDNA 염기서열분석에 의한 lx2 의 미스센스 돌연변이의 검증

푸른콩 및 진품콩2의 gDNA 서열을 J13211 및 D13949의 상응부위와 비교하였다(도 8a). 두 재배종 간에는 두 개의 SNP가 존재하였다. 하나는 액손에서 T에서 A로 변환되었으며, 다른 하나는 인트론에 존재하였다. 알려진 SNP 위치에 푸른콩 및 Lx2 cDNA J03211에는 T를, 진품콩 2와 lx2 cDNA D13949에는 A가 존재하였다. 상기 SNP는 아미노산 서열에 미스센스돌연변이를 일으켜 히스티딘이 글루타민으로 치환되는 결과를 초래하였다(Wang et al., 1994). 진품종 2 및 푸른콩에서 GAA 삽입이 발견되었다(그림 8b). 다시 말해서, GAA 염기는 센츄리 품종, J03211에서만 발견되지 않았으며, 이 염기서열은 유전자의 발현에는 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 야생형 대두 리폭시게나아제 2(LOX 2) 유전자의 5’인접 서열 및 변이형 대두 리폭시게나아제 2 (LOX 2) 유전자의 5’인접 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 콩비린내(beany flavor)가 없는 특성을 갖는 콩 변이체를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 본 발명은 콩비린내가 없는 특성을 갖는 콩 변 이체를 동정하는 방법 및 키트를 제공한다. 본 발명에 따르면, 복잡한 데이터 수집을 요구하는 표현형 결정(phenotyping) 및 접종 과정 없이, 식물체의 초기 성장 단계에서 콩비린내가 없는 변이체를 신속하게 스크리닝할 수 있다. 본 발명의 마커는 다른 유전자형 결정 (genotyping) 방법보다 신속하고, 재현성이 우수하며 저가의 유전자형 결정 방법을 제공하는 것을 가능하게 한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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서열목록 전자파일 첨부

Claims

대두 리폭시게나아제 2 (LOX 2) 유전자의 5' 인접 서열에 위치한 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열.
대두 리폭시게나아제 2 (LOX 2) 유전자의 5' 인접 서열에 위치한 서열목록 제 2 서열의 뉴클레오타이드 서열.
서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에서 (i) 38번째와 39번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기, (ⅱ) 642번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기, (ⅲ) 695번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기, (ⅳ) 1347번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기, (ⅴ) 1509번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기, 또는 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 유전적 마커 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열.
상기 제 3 항에 있어서, 상기 유전적 마커는 콩비린내(beany flavor)가 없는 특성을 갖는 콩 변이체를 동정하는 데 이용되는 것을 특징으로 하는 유전적 마커.
(a) 콩으로부터 핵산 분자를 분리하는 단계; 및 (b) 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에서 (ⅰ) 38번째와 39번째 뉴클레오타이드, (ⅱ) 642번째 뉴클레오타이드, (ⅲ) 695번째 뉴클레오타이드, (ⅳ) 1347번째 뉴클레오타이드, (ⅴ) 1509번째 뉴클레오타이드, 또는 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열의 존재 유무를 상기 분리된 핵산 분자에서 확인하는 단계를 포함하며, 상기 뉴클레오타이드가 존재하는 경우에는 콩비린내(beany flavor)가 없는 특성을 갖는 콩으로 판정하는 것을 특징으로 하는 콩비린내가 없는 특성을 갖는 콩 변이체를 동정하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 콩의 종실(seed)로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 콩비린내가 없는 특성을 갖는 콩 변이체를 동정하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 서열목록 제2서열의 (ⅰ) 38번째와 39번째 뉴클레오타이드, (ⅱ) 642번째 뉴클레오타이드, (ⅲ) 695번째 뉴클레오타이드, (ⅳ) 1347번째 뉴클레오타이드, (ⅴ) 1509번째 뉴클레오타이드, 또는 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 이용하여 상기 분리된 핵산 분자를 증폭하여 실시하는 것을 특징으로 하는 콩비린내가 없는 특성을 갖는 콩 변이체를 동정하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 (ⅱ) 642번째 뉴클레오타이드, (ⅲ) 695번째 뉴클레오타이드, (ⅳ) 1347번째 뉴클레오타이드 또는 (ⅴ) 1509번째 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭하여 상기 단계 (b)를 실시하는 경우, 상기 프라이머쌍 중에서 전방향 프라이머 또는 역방향 프라이머는 서열목록 제2서열에서 (ⅱ) 642번째 뉴클레오타이드, (ⅲ) 695번째 뉴클레오타이드, (ⅳ) 1347번째 뉴클레오타이드 또는 (ⅴ) 1509번째 뉴클레오타이드에 해당하는 LOX 2 결여 표현형-관련 단일뉴클레오타이드 다형성(SNP) 염기에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 전방향 또는 역방향 프라이머의 3'-말단은 상기 SNP 염기에 매칭되는 염기를 갖는 것을 특징으로 하는 콩비린내가 없는 특성을 갖는 콩 변이체를 동정하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 (ⅰ) 38번째와 39번째 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭하여 상기 단계 (b)를 실시하는 경우, 상기 프라이머쌍 중에서 전방향 프라이머 또는 역방향 프라이머는 서열목록 제2서열에서 (ⅰ) 38번째와 39번째 뉴클레오타이드에 해당하는 LOX 2 결여 표현형-관련 유전적 마커에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 전방향 또는 역방향 프라이머의 3'-말단은 상기 유전적 마커의 염기에 매칭되는 염기를 갖는 것을 특징으로 하는 콩비린내가 없는 특성을 갖는 콩 변이체를 동정하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭하여 상기 단계 (b)를 실시하는 경우, 상기 프라이머쌍 중에서 전방향 프라이머 또는 역방향 프라이머는 서열목록 제2서열에서 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열에 해당하는 LOX 2 결여 표현형-관련 유전적 마커에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 전방향 또는 역방향 프라이머는 상기 유전적 마커의 뉴클레오타이드 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 콩비린내가 없는 특성을 갖는 콩 변이체를 동정하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클 레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭하여 상기 단계 (b)를 실시하는 경우, 상기 프라이머쌍 중에서 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서열목록 제2서열에서 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열에 해당하는 LOX 2 결여 표현형-관련 유전적 마커에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 콩비린내가 없는 특성을 갖는 콩 변이체의 동정은 증폭 반응 산물 크기를 비교하여 실시되는 것을 특징으로 하는 콩비린내가 없는 특성을 갖는 콩 변이체를 동정하는 방법.
서열목록 제2서열의 (ⅰ) 38번째와 39번째 뉴클레오타이드, (ⅱ) 642번째 뉴클레오타이드, (ⅲ) 695번째 뉴클레오타이드, (ⅳ) 1347번째 뉴클레오타이드, (ⅴ) 1509번째 뉴클레오타이드, 또는 (ⅵ) 888번째 뉴클레오타이드로부터 1062번째 뉴클레오타이드까지의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 포함하는 콩비린내가 없는 특성을 갖는 콩 변이체를 동정하기 위한 키트.