JPH04144687A - 大豆リポキシゲナーゼ構造遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、大豆の発芽期に発現しているリポキシゲナー
ゼ構造遺伝子に関するものである。

また、本発明は、大豆の発芽期に強く発現しているリポ
キシゲナーゼ（ＥＣ，１，１３，１１，１２）　（以下
、ＬＯＸということもある）の構造遺伝子ＤＮＡ配列、
及び核ＤＮＡ配列を保持しているプラスミド、そして核
プラスミドで形質転換した大腸菌に関するものである。

リポキシゲナーゼは植物の耐病性、射出性に関与してお
り、リポキシゲナーゼ遺伝子を葉などで増強させて同酵
素を大量に分泌させれば耐病性、射出性が強められる可
能性があり、無農薬栽培が可能となるので１食品や環境
の農薬による汚染が防止され、本発明は無公害生物農薬
ないし公害防止技術の面でも非常に有用である。

また、本発明に係る遺伝子を微生物等で発現させること
も可能であるので、大量のリポキシゲナーゼを得ること
ができ、各種の用途に利用することができる。

例えば、植物リポキシゲナーゼは古くより小麦粉の漂白
に用いられているが、この遺伝子を用いて微生物で発現
させれば、危険な化学薬品を用いずに漂白が可能になる
のである。

また、この遺伝子にはイントロンが含まれているが、こ
（れら）のイントロンを利用すれば、他のプロモーター
を増強させたり、制御させたりすることが可能となるの
で、遺伝子操作技術における各種の応用が大いに期待で
きる。

（技術的背景及び問題点） 一般に、ＬＯＸはすべての高等動物、高等植物に存在し
ており、微生物での存在も知られている。

本酵素は、リノール酸、リルン酸、アラキドン酸といっ
た１、４−ペンタジェン構造を有する不飽和脂肪酸に分
子状酸素を直接導入する酵素作用を有している。

ＬＯＸの生化学的性状は、生物種間で違いがみられるも
のの、分子量は８万〜１０万の範囲にあり。

１分子の非ヘム鉄を有する点で共通している。動物にお
いては、プロスタグランジン等を生成するアラキドン酸
カスケードの初発反応を触媒する重要な酵素である。植
物においては、分化、発生。

老化に関する代謝系に関するとの報告がある。また、大
豆粕に含まれるＬＯＸは小麦粉の漂白に実用されている
。

また、大豆においては、種子の登熟期に生合成され、乾
燥種子に蓄積する３種のＬＯＸが詳しく研究されている
。（Ａｘｅｌｒｏｄ　Ｂ、　Ｃｈｅｅｓｂｒｏｕｇｈ　
Ｔ、　Ｍ。

Ｌａａｋｓｏ、Ｓ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
、　７１．４４１−４５１（１９８１））またそれらに
対するｃＤＮＡが最近単離された。

（Ｓｈｉｂａｔａ、　Ｄ、　５ｔｅｃｚｋｏ、　Ｊ、　
Ｄｉｘｏｎ、　Ｊ、　Ｅ、　）Ｉｅｒｍｏｄｏｓｏｎ。

Ｍ、　Ｙａｚｄａｎｐａｒａｓｔ、　Ｒ，Ａｘｅｌｒｏ
ｄ、　Ｂ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６２゜
しかしながら、種子が発芽する過程で発現しているＬＯ
Ｘについては研究は少なく、既に存在するＬＯＸどの関
係は不明であった。また、ＬＯＸに対する構造遺伝子の
単離はまったく行われていない。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記した技術の現状に鑑みてなされたもので
あって、ＬＯＸに対する構造遺伝子を解明する目的でな
されたものである。

この目的を達成するため、本発明者らは、ＬＯＸに対す
る遺伝子が大豆種子の発芽期に強く発現することに着目
し、ＬＯＸ構造遺伝子のクローニングについて検討を重
ねた結果、ｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡ
ライブラリーから、ＬＯＸの実質的機能部分をコードし
ているｃＤＮＡ断片を選択してこれをクローニングし、
それを用いて大豆ゲノムＤＮ＾ライブラリーをスクリー
ニングして、　リポキシゲナーゼのゲノム遺伝子の単離
を行った。そのヌクレオチド配列を決定する際に、実質
的機能部分にＬＯＸ構造遺伝子の存在を確認し、そのヌ
クレオチド配列を決定することに成功したのである。

本発明は、大豆の発芽期に発現しているＬＯＸ構造遺伝
子に関するものであり、そのＤＮＡ配列は第１図に示さ
れている。

また、本発明はＬＯＸ構造遺伝子ＤＮＡ配列を含むプラ
スミドであり、更には、ＬＯＸの構造遺伝子ＤＮＡ配列
を含むプラスミドで形質転換した大腸菌である。

本発明では、発芽期に強く発現している大豆ＬＯＸの実
質的機能部分をコードしているＤＮＡ配列（遺伝子配列
）を大豆のｌｏｘということとする。

本発明に於いて大豆発芽期ＬＯＸの「実質的機能部分を
コードしているＤＮＡ配列」という用語は。

ＬＯＸの全アミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列。

核ＤＮＡ配列を含み、その転写及び翻訳に悪影響を及ぼ
すことのない部分のＤＮＡ配列が付加しているＤＮＡ配
列、及びＬＯＸのアミノ酸配列の全てをコードしていな
いがＬＯＸ活性を示すのに必要な最小限のアミノ酸配列
をコードしているＤＮＡ配列のいずれかを意味する。即
ち、この用語は、適当な宿主細胞中でＬＯＸ活性を実質
的に発現することができるという意味で機能的に定義さ
れた用語であり、物理化学的に単一の物質を指すもので
はない。

次に、発芽期に強く発現している大豆１ｏｘのクローニ
ング及びリポキシゲナーゼ構造遺伝子の塩基配列の決定
の実施例を示す。

（実施例） Ａ、実験に供した試薬 プラスミドベクターｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴはＳｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ社、制限酵素類、及びライゲーションキッ
トは宝酒造社、（ａ　−’　”　Ｐ）ｄＣＴＰはＡｍｅ
ｒｓｈａｍ社、ラベリングキットはベーリンガー社より
購入した。

Ｂ、実験材料 大豆種子ＬＯＸｃＤＮＡ　（プラスミドＰＭＸ８５）は
Ｐｕｒｄｕｅ大学Ｂ、１ｘｅｌｒｏｄ博士より提供され
た。大豆発芽期ｃＤＮＡライブラリー（λｇｔｌｌファ
ージ・ベクターを用いて作成されている）は１京都府立
大学田中國助介博士より提供された。大豆ゲノムＤＮＡ
ライブラリーは、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社より購入した。

大腸菌Ｙ１０９０株、ＸＬＩ　−Ｂｌｕｅ株は、Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ社から購入した。また、大腸菌ＤＨ５α
の株はＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ社より購入した。

ら−」（膿１４す１養 通常の培養には富栄養培地としてＬＢ培地（ＩＱ当りト
リプトンｔｏｇ、イースト抽出物５ｇ、食塩５ｇを含む
ＰＨ７，２の培地）を用いた。固体培地は液体培地に１
．５％（ｗ／ｖ）の寒天を加えて調製した。選択圧とし
て抗生物、質を加える場合の濃度は、アンピシリンが５
０μｇ／ＩＩＱ、テトラサイクリンが１２μｇ／ａｈＱ
となるように加えた。抗生物質は培地滅菌後５５℃以下
になってから添加した。なお、培養の温度は通常３７℃
とした。λファージを加えて培養する場合は４２℃とし
た。

１、試薬の略号 本明細書中で使用した試薬の略号を表１に示す。

表１ ２、　アガロースゲル電気泳動法 １％となるようにアガロースをＴＡＥ液中に加熱融解後
、ゲル化させ、試料ＤＮＡを添加してのち、電気泳動装
置ミューピッドを用いて１００Ｖで泳動させ、染色マー
カー、ブロモフェノールブルーがゲルの端に達したとき
泳動を止めた。ゲルは、２μｇ／ａＱエチジウムブロマ
イド液に浸して染色後、紫外線を当ててＤＮＡバンドを
検出した。

Ｅ、　　ＤＮＡプローブの作成 大豆登熟期ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＭＸ８５．５０
μｇを、１００μＱの反応液中で制限酵素Ｐｓｔｌ（５
０ユニツト）を用いて切断した後、　１％アガロース電
気泳動を行い、ｃＤＮＡ断片とベクタ一部分を分け、ｃ
ＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡの回収は、ｃＤＮＡを含
むゲル断片を注射器から押し出して、粉砕後フェノール
／トリスを加え、−８０℃にして凍結させた後、遠心分
離を行ってＤＮＡを水層に移した。この水層に２倍量の
エタノールを加えて沈澱させた。沈澱は遠心分離により
回収し、２０μＱのＴＨに溶解した。

ＤＮＡ断片は〔α−”Ｐ〕ｄＣＴＰ及びベーリンガー社
ラベリングキットを用いてランダムプライマー法で比活
性Ｉ　Ｘ　１０”ＣＰＭ／μｇのプローブを作製した。

発芽期ｃＤＮＡライブラリー（λｇｔｌｌファージ・ベ
クターを用いて作成されている）を希釈して、１００４
　Ｑ中に２，０ＯＯｐｆｕの濃度のλｇｔｌｌファージ
を含むファージ液を調製した。このファージ液１００μ
Ｑに対して、ＬＢ培地で一晩、３７℃培養した大腸菌Ｙ
１０９０株１００μＱを加え混合後、３７℃で１５分間
インキュベートしてファージを大腸菌に吸着させた。

０．７％寒天を含むＬＢ培地を融解後５５℃に保った培
地に吸着させたファージ液を加え混合後、ＬＢ寒天培地
（直径９ｃＩ１１のベトリシャーレ）上に流し込み固化
させた。固化後、４２℃で４時間保持し大腸菌を生育さ
せるとともに、ファージプラークを形成させた。

このプラーク上にニトロセルロースフィルターを接触さ
せ、１０分間放置してファージをこのフィルターに移し
た。フィルターに位置決めのため注射針で穴を開けた後
、フィルターを剥がし、　０．５ＭＮａＯＨ５１，５Ｍ
　ＮａＣＱを含む口紙上に　３分間賃き、ファージに含
まれるＤＮＡをアルカリ変性させた。その後直ぐに０．
５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　ｐＨ８，ｏ、１．５Ｍ　Ｎａ
ＣＱを含む口紙上に移し５分間中和した。このフィルタ
ーを８０℃で２時間以上ベーキングした。

フィルターを、３　Ｘ　５ＳＣ１０，１％ＳＯＳで６５
℃にて５時間プレーウオツシングした後２０％ホルムア
ミドを含むハイブリダイゼーション溶液（フィルター１
枚当り２　ｔＱ）に入れ、加熱したＤＮＡプローブを加
えて、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。

ハイブリダイゼーション後、ｌＸ５ＳＣ１０，１％ＳＤ
Ｓを用いて３７℃で洗浄後、フィルターをＸ線フィルム
に当て一２０℃で２０時間露光した後現像した。

フィルムに現われているポジティブスポットを元のプレ
ートに合せてポジティブなプラークを同定した。

上記の操作を繰返して、プローブにハイブリッドする４
０個のファージクローンを単離した。

ファージＤＮＡの 各ファージを大腸菌Ｙ１０９０株を用いて増殖させた。

即ち、ファージプラークを爪楊枝で突き刺し。

先に付いたファージを大腸菌Ｙ１０９０株（−晩培養し
たもの）　１００μＱに懸濁させ、３７℃で３０分間フ
ァージを吸着させた後、ｌ　２ｍＱのＬＢ培地と１２０
μＱの１０％グルコース、１２０μＱのＩ　Ｍ　ＭｇＣ
Ｑｚを含む試験管（直径２ｃｍ　Ｘ長さ２０ｃｍ）に移
し３７℃で一晩培養した。

この培養液０．７５ｎ＋Ｑに、ＬＢ培地に懸濁させたＤ
Ｅ５２−セルロース（ワットマン社）　０．７５ｍ１２
を加え混合した。遠心分離を行った後、上清０．６ｍＱ
に０．５ｍＱのフェノール／トリスを加えて、５分間振
とうした。

１００μＱのクロロホルムを加えて混合後、遠心分離し
た。

この上清に７．５Ｍ酢酸アンモニウム１００μＱと６０
０μＱのイソプロパツールを加え、−８０℃で２０分間
装いた。遠心分離を行い、沈澱を回収した。沈澱を８０
％エタノールで洗浄後、乾燥させ、２０μＱの水に溶解
した。

クローンのサブクローニング 得られたλＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した後、プラスミ
ドベクターｐＢＬＵＥｓｃＲＩＰＴ−ｐＫｓ＋　（以下
ｐＫＳ＋と略す）のＥｃｏＲＩ部位に導入した後、大腸
菌ＸＬＩ　−Ｂｌｕｅ株に導入した。即ち、λＤＮＡ液
５μＱに水３μΩ、制限酵素緩衝液１　ｔｔＱ、　Ｅｃ
ｏＲＩ　１μＱ（１０ユニツト）を加え、３７℃で３時
間反応後、１分間１００℃で処理して酵素を失活させた
。この反応液３μＱにｐＫｓ＋（２５ｎｇ、１μＱ）を
加え、宝酒造のライゲーションキットによってライゲー
ションを行わせた（終審量３ｏμＱ）。

このライゲーション液を用いてＨＡＮＡＨＡＮ法（ＨＡ
ＮＡＨＡＮ、Ｄ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１６６．５５
７−５８０（１９８３））で調製した大腸菌コンピテン
トセル（ＤＨ５α株）を形質転換した。即ち、凍結コン
ピテントセル（−８０℃）２０μＱを氷上で溶解後、１
μＱのライゲーション液を加え、氷上で３０分間装いた
後、４２℃で９０秒間ヒートショックを行った。１０■
Ｍ　Ｍｇ５Ｏい２〇−Ｎグルコースを含むＬＢ培地を８
０μＱ加えた後、３７℃で１時間培養した。　これをア
ンピシリン、８０μｇ／■Ｑ５−ブロモー４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、２０１１Ｍイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含むＬ
Ｂ寒天培地にまき３７℃で一晩培養した。培地上に現れ
た白色のコロニーを拾い上げ、ＬＢ培地で培養した後、
３０％グリセリンを加えて一２０℃で保存した。

２」し二２！す１新− 得られたクローンが同一種類かどうかを調べるために、
ドツトハイブリダイゼーション法を行った。クローンか
らのｃＤＮＡ断片の回収及びｆｆ２ｐによる標識は、Ｅ
ｃｏＲＩ消化後、上記の方法で行った。

λＤＮＡ液各１Ｐａをニトロセルロースフィルター上に
スポットした後、上記のプラークバイブ１．１！ダイゼ
ーシヨン法と同様にしてフィルターを処理した。ハイブ
リダイゼーションは５０％ホルムアミドを含むハイブリ
ダイゼーション液を用いた点と、ハイブリダイゼーショ
ン後、ｏ、２ｘＳＳｃ１０．１％ＳＯ５を用いて６５℃
でフィルターを洗浄した点を除いて他は同じ条件で行っ
た。

１つのクローンからのプローブでハイブリッドしたクロ
ーンを１つのグループとしてまとめ、ハイブリッドしな
かったものの中から１つを選び、ハイブリダイゼーショ
ンを行い順次分類していくと、３つのグループに分れる
ことがわかった。これらのグループ名を５ＧＬ−Ａ、　
５ＧＬ−Ｂ、　５ＧＬ−Ｃと名付けた。それぞれの中で
最も長いｃＤＮＡを含むものを組み込んだプラスミドは
、ｐｓ５１４、ＰＳ５０１、ＰＳ１７４と名付けた。ま
た、それぞれのｃＤＮＡは、５５１４．５５０１．５１
７４と名付けた。

ゲノムＤＮＡのクローニング 上記プラークハイブリダイゼーションと同様に大豆ゲノ
ムＤＮＡライブラリーより５５１４をプローブとして、
これにハイブリットするゲノムＤＮＡを単離した。即ち
、ρ５５１４からのｃＤＮＡの回収、′Ｊ２Ｐによる標
識は、クローンの解析で示した方法によった。

また、ハイブリダイゼーションの条件も、クローンの解
析に示した方法によった。この方法によって、このプロ
ーブに強くハイブリッドする２つのファージクローンを
得た。それぞれ、λ５Ｇ１４、λ５Ｇ１９３と名付けた
。

ゲノムＤＮＡの解析 ファージＤＮＡの調製で述べた方法でλＤＮＡを調製し
た。これを、クローンのサブクローニングで述べた方法
でＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡ断片をサブクローニングし
た。これらは、ｐｓＧ１４−４、ｐｓＧ１４−２ｃ、ｐ
ｓＧ１４−１．５、ｐｓＧ１４−２ｄ、　ｐｓＧ１４−
１、ｐｓＧ１４−２ａ、ｐｓＧ１４−２ｂ、ｐｓＧ１４
にｐ、　ｐＳＧ１４Ｈ−ｐｓＧ１３９Ｋｐと名付けた。

　λ５Ｇ１４、λ５Ｇ１９３の制限酵素地図とサブクロ
ニングされた部分は、第２図に示す。

人員菫勿亙ｌ亙１ 上記で得られた各プラスミドｐｓ５１４、ＰＳＧ１４−
４゜ｐｓＧ１４−２ｃ、　ｐｓＧ１４−１．５、ｐｓＧ
１４−２ｄ、　ｐｓＧ］、４−１、ｐｓＧ１４−２ａ、
ｐｓＧ１４−２ｂ、ｐｓＧ１４Ｋｐ、ｐｓＧ１４Ｈ１ｐ
ｓＧ１３９Ｋｐは、それぞれ常法によって大腸菌ＤＨ５
α株に挿入し、形質転換し、大腸菌ＤＨ５α／ｐｓ５１
４、大腸菌ＤＨ５ａ　／ｐｓＧ１４−４、大腸菌ＤＨ５
ａ　／ｐｓＧ１４−２ｃ。

大腸菌ＤＨ５α／ρ５Ｇ１４−１．５、大腸菌ＤＨ５α
／ｐｓＧ１４−２ｄ、大腸菌ＤＨ５ａ　／ｐｓＧ１４−
１、大腸菌ＤＨ５ａ　／ｐｓＧ１４−２ａ。

大腸菌ＤＨ５α／ｐｓＧ１４−２ｂ、大腸１１ＤＩ（５
α／ρ５Ｇ１４ｋｐ、大腸菌ＤＨ５α／ＰＳＧ１４Ｂ、
大腸菌ＤＨ５α／ｐｓＧ１３９Ｋｐを得た。

リポキシゲナーゼ構　　伝子の塩基　　のりポキシゲナ
ーゼ構造遺伝子は、第２図のｐｓＧ１４−２ｃ、　ｐｓ
Ｇ１４−１．５、ｐｓＧ１４−２ｄ＋　ｐｓＧ１４−１
において、太線で示した部分に含まれているので、これ
らをＰｒｏ■ｅｇａ社のプリージョンキットを用いてプ
リージョンを行った後、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株を形
質転換し、ヘルパーファージを用いて一本鎖ＯＮ＾を調
製し、宝酒造社の塩基配列キットを用いてジデオキシ法
により配列決定を行った。　その結果をアミノ酸配列（
一部）とともに第１図に示した。

なおこのＤＮＡはイントロンを含んでおり、その部分に
は下線を付した。

（発明の効果） 本発明は、大豆の発芽期に顕著に発現しているＬＯＸ構
造遺伝子のクローニングにはじめて成功し、塩基配列も
決定したものである。

このような遺伝子を各種形質転換体で発現させることに
よりしＯｘを著量生産することができ、広範な用途に利
用することができる。

また最近、ＬＯＸ活性と病害虫に対する抵抗性との関係
が示されており、病害虫に対して高い抵抗性を示す植物
を作出することも可能となる。その意味においても、Ｌ
ＯＸ遺伝子の解明は産業上重要な意義を有するものであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のリポキシゲナーゼ構造遺伝子のＤＮＡ
配列を示す図で、第２図はλＤＮＡからクローニングし
たλ５Ｇ１４及びλ５Ｇ１９３の制限酵素地図とサブク
ローニングされた部を示す図である。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 塚

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、大豆の発芽期に発現しているリポキシゲナーゼ構造
   遺伝子。 ２、第１図に記載の配列を有する第１項に記載のリポキ
   シゲナーゼ構造遺伝子ＤＮＡ配列。 ３、第２項に記載のリポキシゲナーゼ構造遺伝子ＤＮＡ
   配列を含むプラスミド。 ４、第２項に記載のリポキシゲナーゼ構造遺伝子ＤＮＡ
   配列を含むプラスミドで形質転換した大腸菌。