JP5989345B2 - 大麦選抜方法及び麦芽発泡飲料 - Google Patents
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Description
被検大麦について、
(a)GroupI型の大麦二量体α−アミラーゼ阻害剤−1(BDAI−1)遺伝子座周辺領域の塩基配列と、(b)GroupII型のBDAI−1遺伝子座周辺領域の塩基配列とを多重整列することにより特定されるDNAマーカーの少なくとも一つについて遺伝子型を同定し、GroupI型の遺伝子型に一致する被検大麦を泡持ちの優れる麦芽発泡飲料用の大麦として選抜する選抜方法を提供する。
本発明の選抜方法は、BDAI−1含有量の高い大麦を選抜することができる。上記選抜方法では、まず、グループI型及びグループII型のBDAI−1遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列することにより特定されるDNAマーカーを得る。被検大麦において、上記DNAマーカーについて1つ以上の遺伝子型を同定し、その遺伝子型が、グループI型の遺伝子型と一致する被検大麦をBDAI−1含有量の高い大麦として選抜する。グループII型の遺伝子型と一致しない被検大麦をBDAI−1含有量の高い大麦として選抜してもよい。
M3 :AfaI、BanI、KpnI、NcoI、RsaI又はStyI
M4 :AccI又はBst1107I
M5 :AccII又はHhaI
M7 :MnlI
M10:FokI又はPstI
M11:AfaI、RsaI又はTaqI
M14:AccI、Bst1107I又はDdeI
M18:AccII、AviII、BssHII、FspI又はHhaI
本発明の交配後代系統の大麦は、上記選抜方法により選抜された大麦同士を交配して得ることができる。上記選抜方法により選抜された大麦は、BDAI−1含有量が高いグループI型の大麦であることから、それらを交配して得られる交配後代系統の大麦もBDAI−1含有量が高いグループI型の大麦となる。
本発明の麦芽製造方法は、上記選抜方法により選抜された大麦又はその交配後代系統の大麦を用いて麦芽を得る製麦工程を含む方法である。BDAI−1含有量の高い大麦として選抜された大麦又はその交配後代系統の大麦を用いて製麦が行われることから、この方法により得られる麦芽はBDAI−1含有量の高いものとなる。製麦は公知の方法で行うことができ、例えば、浸麦度が40%〜45%に達するまで浸麦後、10〜20℃で3〜6日間発芽させ、焙燥することによって麦芽を得ることができる。
本発明の麦芽発泡飲料の製造方法は、仕込工程を少なくとも備え、上記仕込工程において、原料の少なくとも一部として、上記選抜方法により選抜された大麦、上記交配後代系統の大麦又は上記麦芽を使用するものである。これらの大麦及び麦芽はBDAI−1含有量が高いため、本発明の麦芽発泡飲料の製造方法により、泡持ちの優れる麦芽発泡飲料を得ることができる。
大麦CDC Kendall種、CDC Copeland種、Scarlett種、りょうふう種、CDC Reserve種及びSchooner種の6品種を用いた。
上述の大麦種それぞれについて、以下の方法でゲノムDNAを抽出した。葉に抽出バッファー(200mM Tris−HCl,250mM NaCl,25mM EDTA,pH7.5)とジルコニアボールを添加し、振とうした後、60℃で30分間保持した。遠心分離し、得られた上清に等量のイソプロパノールを添加してDNAを析出させた。遠心分離し、得られた沈殿に70%エタノールを添加して、再び遠心分離した。得られたDNAの沈殿を滅菌水に溶解させ、このDNA溶液をPCRの鋳型に用いた。
BDAI−1遺伝子座領域の未知配列を取得するため、TAIL PCR法を行った。TAIL PCR法には以下のプライマーを用いた。なお、特異的プライマー1〜3はNCBIデータベースに登録されているBDAI−1遺伝子の塩基配列情報(NCBI accession No.AJ009801)に基づいて設計した。
5’−GTNCGA(G/C)(A/T)CANA(A/T)GTT−3’
特異的プライマー1(配列番号4):
5’−CCAAGGGCCACTGTTATCACTCCG−3’
特異的プライマー2(配列番号5):
5’−GCGCCCGTCATTGGAGTCACCATG−3’
特異的プライマー3(配列番号6):
5’−CCACATTGCTCCCATTCCCATCTAC−3’
特異的プライマー2−1(配列番号7):
5’−GTATATTTTGTGTACAGGGCGGGGA−3’
特異的プライマー2−2(配列番号8):
5’−CAGGGCGGGGACAGAAATTGTTTC−3’
特異的プライマー2−3(配列番号9):
5’−CTTTGGTTCGGGCCTGACCGCCCA−3’
94℃で1分間保持後、更に95℃で1分間保持した。次に、94℃で1分熱変性し、65℃で1分間アニーリングした後、72℃で3分間伸長反応を行うサイクルを5サイクル実施し、94℃で1分間熱変性、30℃で3分間アニーリング、72℃で3分間伸長反応を行うサイクルを1サイクル実施した。次に、94℃で30秒間熱変性、68℃で1分間アニーリング、72℃で3分間伸長反応、94℃で30秒間熱変性、68℃で1分間アニーリング、72℃で3分間伸長反応、94℃で30秒間熱変性、44℃で1分間アニーリング、72℃で3分間伸長反応、という9ステップで構成されるサイクルを、15サイクル実施した。最後に72℃で5分間伸長反応を実施した。
94℃で30秒間熱変性、68℃で1分間アニーリング、72℃で3分間伸長反応、94℃で30秒間熱変性、68℃で1分間アニーリング、72℃で3分間伸長反応、94℃で30秒間熱変性、44℃で1分間アニーリング、72℃で3分間伸長反応、という9ステップで構成されるサイクルを、13サイクル実施した。最後に72℃で5分間伸長反応を実施した。
大麦CDC Kendall種、CDC Copeland種、Scarlett種、りょうふう種、CDC Reserve種及びSchooner種の6品種について、上記で決定した塩基配列を多重整列した。多重整列の結果、これらの大麦品種は塩基配列によって2つのグループ(グループI型及びグループII型)に分類できることが判明した。
図1に示した多重整列の結果、グループI型及びグループII型間で塩基種が一致しない塩基部位が合計19ヶ所存在しており、これらをDNAマーカーとして特定した。具体的には、配列番号1で特定される塩基配列(グループIの塩基配列)の第9番目の塩基(M1)、第32番目の塩基(M2)、第60番目の塩基(M3)、第124番目の塩基(M4)、第160番目の塩基(M5)、第208番目の塩基(M6)、第220番目の塩基(M7)、第319〜320番目の塩基の間(M8;図1中のギャップに対応する)、第402〜422番目(M9)、第475番目の塩基(M10)、第490〜491番目の塩基の間(M11;図1中のギャップに対応する)、第557〜558番目の塩基の間(M12;図1中のギャップに対応する)、第1098番目の塩基(M13)、第1181番目の塩基(M14)、第1197番目の塩基(M15)、第1226番目の塩基(M16)、第1233番目の塩基(M17)、第1238番目の塩基(M18)、又は第1274番目の塩基(M19)に相当する塩基部位である。
DNAマーカーM1〜M19のうち、グループI型及びグループII型のいずれかに制限酵素の認識配列が存在するものを下記表1にまとめた。
塩基配列情報からグループI型に分類された大麦とグループII型に分類された大麦を用いて、CAPSマーカーの検証を行った。
5’−CGTGACGGACCGCTAAATCTAGAC−3’
BD2−2プライマー(配列番号11):
5’−CATGACGCATGCGTCGCATAGG−3’
BD−T14プライマーに代えてBD2−3プライマーを用いたこと、制限酵素TaqIに代えて制限酵素DdeIを用いたこと以外は上記と同様にCAPSマーカーの検証を行った。
5’−GTAGATGGGAATGGGAGCAATGTGG−3’
BD2−2プライマー(配列番号11):
5’−CATGACGCATGCGTCGCATAGG−3’
上述のM11を利用したCAPSマーカーを用いて、大麦31品種をグループI型又はグループII型に分類し、BDAI−1含有量を比較した。また、これらの大麦を原料としてビールを製造し、その泡持ちを比較した。
大麦31品種(はるな二条、みょうぎ二条、さきたま二条、さつき二条、新田二条23号、ゴールデンメロン、ほしまさり、りょうふう、りょううん、CDC Kendall、AC Metcalf、Harrington、CDC Copeland、CDC Reserve、CDC PolarStar、Betzes、SloopSA、Schooner、Flagship、Gairdner、Lofty Nijo、Barke、Scarlett、Braemar、Triumph、Prior、Alexis、Optic、Sebastian、Power、Chevallier種)について、上述した方法と同様にして、BD−T14プライマー及びBD2−2プライマーを用いたPCR、制限酵素TaqIによるPCR産物の消化、並びに電気泳動を行い、これらの大麦をグループI型とグループII型に分類した。
上記大麦31品種について、2000年、2004年、2008年及び2009年に群馬県のサッポロビール社圃場で栽培された大麦の種子をそれぞれミルで粉砕し、ELISA法でBDAI−1含有量を定量した。
400Lパイロットスケールでの大麦品種単用醸造試験のNIBEM値から、BDAI−1遺伝子型と泡持ちの関係を調査した(図5)。NIBEM値の解析にはグループI型の大麦としてCDC Kendall(n=4)、CDC Copeland(n=3)、AC Metcalfe(n=1)及びミカモゴールデン(n=1)の4品種、グループII型の大麦としてあまぎ二条(n=2)、りょうふう(n=4)北育39号(n=2)、北育41号(n=2)、CDC Reserve(n=2)及び新田二条23号(n=1)の6品種を用いた。解析の結果、グループI型の大麦は危険率5%で有意にNIBEM値が高いことが示された。このことから、本CAPSマーカーで判別したBDAI−1の遺伝子型は泡持ちを判別するのに有効なDNAマーカーであることが示された。
図1に示した多重整列におけるギャップに位置するDNAマーカーM9を利用し、PCR産物の有無のみによって、BDAI−1の遺伝子型の判別を試みた。PCR用プライマーとして、BD−pat1プライマー及びBD−T1プライマーを設計した。BD−pat1プライマーは、3’末端の6塩基を除いてM9のギャップ(グループIIが欠損している塩基配列)にアニーリングするように設計されている。
5’−GCCCACAAGACACTCATGCAAGCCC−3’
BD−T1プライマー(配列番号14):
5’−CCAAGGGCCACTGTTATCACTCCG−3’
上記のCAPSマーカー(M11)を用い、種々のプライマー及びプライマー対を用いて検証を行なった。使用したプライマーの配列は以下のとおりである。
5’−CCAAGGGCCACTGTTATCACTCCG−3’
BD−T3プライマー(配列番号15):
5’−CCACATTGCTCCATTCCCATCT−3’
BD−T5プライマー(配列番号16):
5’−CCTTTCCTCACGCATTGCTAATT−3’
BD−T6プライマー(配列番号17):
5’−GTGGGGTTCACTCAACACTCGG−3’
BD−T13プライマー(配列番号18):
5’−ACGGGGACGGGGCGTGACGG−3’
BD−T14プライマー(配列番号10):
5’−CGTGACGGACCGCTAAATCTAGAC−3’
表2中、「BD−T14」等はプライマーの名前を示す。
Claims (10)
- 泡持ちの優れる麦芽発泡飲料用の大麦を選抜する選抜方法であって、
被検大麦について、
(a)GroupI型の大麦二量体α−アミラーゼ阻害剤−1(Barley dimeric alpha−amylase inhibitor−1)遺伝子座周辺領域の塩基配列と、(b)GroupII型の大麦二量体α−アミラーゼ阻害剤−1遺伝子座周辺領域の塩基配列とを多重整列することにより特定されるDNAマーカーの少なくとも一つについて遺伝子型を同定し、GroupI型の遺伝子型に一致する被検大麦を泡持ちの優れる麦芽発泡飲料用の大麦として選抜するものであり、
前記大麦二量体α−アミラーゼ阻害剤−1遺伝子座周辺領域が、開始コドンに相当するATG配列の上流5cM以内、かつ終止コドンに相当するTAG配列の下流5cM以内の領域である、選抜方法。 - 前記(a)及び(b)の塩基配列が、それぞれ配列番号1及び配列番号2で特定される塩基配列である、請求項1に記載の選抜方法。
- 前記DNAマーカーが、配列番号1で特定される塩基配列の第60番目の塩基、第124番目の塩基、第160番目の塩基、第220番目の塩基、第475番目の塩基、第490〜491番目の塩基の間、第1181番目の塩基又は第1238番目の塩基に相当する塩基部位であり、
遺伝子型の同定が、
前記被検大麦のゲノムDNAを鋳型として、前記DNAマーカーの少なくとも1つを含むポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応法により増幅するステップと、
前記ポリヌクレオチドを、認識配列中に前記DNAマーカーの少なくとも1つを含む1種又は2種以上の制限酵素により消化するステップと、
前記制限酵素により消化して得られるDNA断片の数及び/又はサイズに基づいて、前記遺伝子型を同定するステップと、を含む方法により行われる、請求項1又は2に記載の選抜方法。 - 前記DNAマーカーが、配列番号1で特定される塩基配列の第490〜491番目の塩基の間に相当する塩基部位であり、かつ前記制限酵素が、AfaI、RsaI又はTaqIから選択されるか、又は、
前記DNAマーカーが、配列番号1で特定される塩基配列の第1181番目の塩基に相当する塩基部位であり、かつ前記制限酵素が、AccI、Bst1107I又はDdeIから選択される、請求項3に記載の選抜方法。 - 前記DNAマーカーが、配列番号1で特定される塩基配列の第319〜320番目の塩基の間、又は第402〜422番目の塩基に相当する塩基部位であり、
遺伝子型の同定が、
前記被検大麦のゲノムDNAを鋳型として、少なくとも一方のプライマーが前記DNAマーカーの少なくとも一部にアニーリングする塩基配列を有するプライマー対により、ポリメラーゼ連鎖反応を行うステップと、
前記ポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物の有無に基づいて、前記遺伝子型を同定するステップと、を含む方法により行われる、請求項1又は2に記載の選抜方法。 - 前記DNAマーカーが、配列番号1で特定される塩基配列の第402〜422番目の塩基に相当する塩基部位である、請求項5に記載の選抜方法。
- 前記プライマー対が、配列番号13で特定される塩基配列を有するプライマーと、配列番号14で特定される塩基配列を有するプライマーと、からなる、請求項5又は6に記載の選抜方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の選抜方法により大麦を選抜する工程と、選抜された大麦同士を交配し、泡持ちの優れる麦芽発泡飲料用の交配後代系統の大麦を得る工程とを含む方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の選抜方法により大麦を選抜する工程、又は請求項8に記載の方法により大麦を得る工程と、
当該大麦を製麦する製麦工程と、を含む麦芽製造方法。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載の選抜方法により大麦を選抜する工程、又は請求項8に記載の方法により大麦を得る工程と、
当該大麦を原料の少なくとも一部として使用する仕込工程と、を備える、麦芽発泡飲料の製造方法。
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