KR100944107B1 - 보리 리폭시게나제-1 유전자, 보리의 선별방법, 맥아알코올 음료용 원료 및 맥아 알코올 음료의 제조방법 - Google Patents
보리 리폭시게나제-1 유전자, 보리의 선별방법, 맥아알코올 음료용 원료 및 맥아 알코올 음료의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 보리 리폭시게나제-1 유전자 제5 인트론의 스플라이싱 공여 부위의 구아닌이 다른 염기로 변이되어 있는지 여부에 의해 보리 리폭시게나제-1 결실 보리를 판별하는 것을 특징으로 하는 보리 리폭시게나제-1 결실 보리의 선별방법과 이러한 선별방법에 따라 수득된 보리에서 유래하는 맥아 알코올 음료용 원료를 사용하는 맥아 알코올 음료의 제조방법에 관한 것이다.
보리 리폭시게나제-1, 맥아 알코올 음료, 트리하이드록시옥타데센산, 향미 내구성.
Description
본 발명은 보리 리폭시게나제-1 유전자, 보리의 선별방법, 맥아 알코올 음료용 원료 및 맥아 알코올 음료의 제조방법에 관한 것이다.
맥아에 포함되는 효소인 보리 리폭시게나제-1(이하, 「LOX-1」이라고 한다)은 맥아 알코올 음료를 제조할 때의 숙성공정에서 맥아 유래의 리놀산을 산화하여 9-하이드로퍼옥시옥타데카디엔산을 생성한다(Kobayashi, N. et al., J. Ferment. Bioeng., 76, 371-375, 1993). 그리고, 9-하이드로퍼옥시옥타데카디엔산은 다시 퍼옥시게나제 유사 활성에 의해 트리하이드록시옥타데센산(THOD)으로 변환된다(Kuroda, H., et al., J. Biosci. Bioeng., 93, 73-77, 2002). 이러한 THOD는 맥주의 거품 지속성을 저하시키며 또한 수렴(收斂)하는 맛을 주거나 시원한 맛을 악화시키는 것으로 공지되어 있으며(Kobayashi, N., J. Am. Soc. Brew. Chem. 60: 37-41. 2002; Kaneda, H. et al., J. Biosci. Bioeng., 92, 221-226. 2001), 맥아 알코올 음료의 품질 저하를 초래하는 것으로 공지되어 있다. 또한, 9-하이드로퍼옥시옥타데카디엔산은 노화된 맥아 알코올 음료의 카드 보드 냄새의 원인 물질로 되는 트랜스-2-노네날로 변환되는 것으로 공지되어 있다[야스이 양조협회지 96: 94-99(2001)].
맥아 알코올 음료의 향미(香味) 내구성을 개선하기 위해 트랜스-2-노네날의 생성을 억제하는 기술로서, LOX-1 활성이 낮은 맥아를 사용하는 맥아 알코올 음료를 제조하는 방법이 제안되어 있다[Drost, J. Am. Soc. Brew. Chem.48: 124-131(1990)].
또한, Douma 등은 보리로 변이원(약제) 처리를 실시함으로써 유발 돌연변이를 일으키며 LOX-1 활성이 대조군의 9%로 저하된 유발 돌연변이 계통을 작출(作出)하며, 이것을 사용하여 맥아 알코올 음료의 제조를 시도하고 있다(국제공개 제02/053721호 팜플렛).
그러나 이러한 보리를 사용해도 수득되는 맥아 알코올 음료의 트랜스-2-노네날 농도의 감소는 불충분한 것이며, 향미 내구성이 충분하게 개선되지 않는다. 또한, THOD량의 감소나 거품 지속성의 개선에 관해서는 하등 명백하게 되어 있지 않다.
본 발명은 상기 종래 기술이 갖는 과제를 감안하여 이루어진 것이며 유전자 조작하지 않고 향미 내구성이나 거품 지속성을 개선한 맥아 알코올 음료를 제조하기 위해 유용한 LOX-1 변이 유전자와, LOX-1 결실 보리의 선별방법과, 선별에 의해 수득된 보리에서 유래하는 맥아 알코올 음료용 원료와, 맥아 알코올 음료용 원료를 사용하는 맥아 알코올 음료의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자등은 상기 목적을 달성하려고 예의 연구를 거듭한 결과, LOX-1 활성이 완전히 결여된 재래 보리 품종을 찾아내는 동시에 당해 보리 품종으로부터 신규한 LOX-1 변이 유전자를 밝혀내고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 LOX-1 변이 유전자는 공지된 LOX-1 유전자의 제5 인트론의 스플라이싱 공여 부위(5'-GT-3')의 구아닌이 다른 염기로 변이되어 있는 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 다른 염기가 아데닌인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 LOX-1 결실 보리의 선별방법은 LOX-1 유전자 제5 인트론의 스플라이싱 공여 부위의 구아닌이 다른 염기로 변이되어 있는지 여부에 의해 보리 LOX-1 결실 보리를 판별하는 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 다른 염기가 아데닌인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 LOX-1 결실 보리의 선별방법은 피검 대상인 보리로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출공정과, 추출한 게놈 DNA에서 LOX-1 유전자 제5 인트론의 스플라이싱 공여 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시키는 DNA 단편 증폭공정과, DNA 단편 증폭공정에서 증폭된 LOX-1 유전자 제5 인트론의 스플라이싱 공여 부위를 포함하는 DNA 단편을 제한효소로 절단하여 소정의 염기수의 DNA 단편을 검출하고, 스플라이싱 공여 부위의 구아닌이 다른 염기로 변이되어 있는지 여부에 의해 보리 LOX-1 결실 보리를 판별하는 DNA 단편 검출공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
여기서, DNA 단편 검출공정에서 사용하는 제한효소가 염기서열 5'-GTAC-3'을 인식하는 AfaI 및/또는 RsaI인 것이 바람직하다.
상기 발명에 따르면 LOX-1 유전자 제5 인트론의 스플라이싱 공여 부위의 구아닌의 변이의 유무에 근거하여, LOX-1 활성 결실 형질을 갖는 보리 품종인지의 여부를 선별할 수 있게 된다.
그 결과, LOX-1 활성을 직접 측정하지 않아도 유전자 수준의 해석으로 용이하게 LOX-1 활성이 결여된 보리 품종을 선별할 수 있다. 특히 효소활성은 식물 개체의 생육단계, 환경 등에 영향받아 정확한 측정이 곤란한 경우가 있지만, 본 방법에 따르면 효소 측정과 상이하며 환경 등에 영향받지 않고 LOX-1 활성이 결실된 보리 품종을 선별할 수 있다. 또한, 효소활성을 측정하는 데는 종자가 성장할 때까지 실시할 수 없지만, DNA 판별은 생육초기에 실시할 수 있으므로 빠른 시기에 활성 결실 형질인지 여부의 판정을 할 수 있으며 또한 연속 복귀 교배 등에 효과적이다.
또한, 본 발명의 맥아 알코올 음료용 원료는 본 발명의 LOX-1 변이 유전자를 갖는 보리에서 유래하는 종자, 맥아, 맥아 추출물, 보리 분해물 또는 보리 가공물인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 맥아 알코올 음료용 원료는 본 발명의 LOX-1 결실 보리의 선별방법에 따라 선별된 보리에서 유래하는 종자, 맥아, 맥아 추출물, 보리 분해물 또는 보리 가공물인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 맥아 알코올 음료의 제조방법은 본 발명의 맥아 알코올 음료용 원료를 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명에 따르면 원료중에 LOX-1을 함유하지 않으므로 맥아 알코올 음료의 제조공정에서 리놀산로부터 9-하이드로퍼옥시옥타데카디엔산이 생성되기 어려워지며 따라서 THOD나 트랜스-2-노네날도 생성되기 어려워지므로 향미 내구성과 거품 지속성이 향상된 맥아 알코올 음료를 수득할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 10의 1 내지 1554번째의 염기의 염기서열로 이루어진 핵산을 제공한다. 이러한 염기서열은 LOX-1 단백질의 리폭시게나제 활성이 결여된 변이 LOX-1 단백질을 암호화하는 유전자의 암호화 영역을 나타내고 있다. 보리 샘플중의 당해 핵산의 유무를 검출함으로써 당해 보리가 LOX-1 활성 결실 형질을 갖는지 여부를 분별할 수 있게 된다.
본 발명은 또한, 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 핵산을 제공한다. 이러한 염기서열은 LOX-1 단백질의 리폭시게나제 활성이 결여된 변이 LOX-1 단백질을 암호화하는 유전자의 게놈 서열을 나타내고 있다. 보리 샘플중의 당해 핵산의 유무를 검출함으로써 당해 보리가 LOX-1 활성 결실 형질을 갖는지 여부를 분별할 수 있게 된다.
본 발명은 또한, 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 핵산에서 3178번째의 염기를 함유하는 10 내지 60개의 연속된 염기서열로 이루어진 핵산을 제공한다. 3178번째의 염기는 1염기 다형이며, 정상 LOX-1에서는 G이지만, 변이 LOX-1에서는 A이다. 보리 샘플중의 다형 부위를 함유하는 핵산의 존재 유무를 검출함으로써 당해 보리가 LOX-1 활성 결실 형질을 갖는지 여부를 분별할 수 있게 된다.
본 발명은 또한, 보리 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하는 공정 및 서열번호 11의 염기서열의 3178번째의 염기를 검출하고 이의 염기의 존재를 당해 보리의 LOX-1 활성의 부재의 지표로 하는 공정을 포함하는 보리에서 LOX-1 활성의 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에 따르면 검사대상의 보리가 LOX-1 활성 결실 형질을 갖는지 여부를 분별할 수 있게 된다.
이와 같이 찾아낸 LOX-1 활성이 결여된 보리에서 유래하는 종자, 맥아, 맥아 추출물, 보리 분해물 또는 보리 가공물 등을 원료로 하여 맥아 알코올 음료를 제조하면, 향미 내구성과 거품 지속성이 향상된 맥아 알코올 음료를 수득할 수 있다.
도 1은 탐색 시험 1에서 LOX-1 활성의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 2는 증명 시험 1에서 LOX-1 억제활성의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 3은 증명 시험 2에서 보리 종자의 LOX 단백질의 웨스턴 해석의 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. A는 SDS-PAGE 후의 웨스턴 해석의 결과를 나타내며, B는 IEF 후의 웨스턴 해석의 결과를 나타낸다.
도 4는 증명 시험 3에서 보리 종자의 RNA의 RT-PCR(Polymerase Chain Reaction Method) 해석의 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 5는 증명 시험 4에서 LOX-1 유전자 제5 인트론 스플라이싱 공여 부위의 구조를 도시하는 도면이다.
도 6은 증명 시험 5에서 LOX-1 변이 유전자의 스플라이싱에 관해서 해석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. A는 제3 인트론 내지 제5 인트론을 포함하는 증폭 단편의 전기영동 사진이며, B는 A와 동일한 증폭 단편을 StuI로 소화한 후의 전기영동 사진이다.
도 7은 증명 시험 7, 8에서 대장균에서의 발현 유도 단백질의 전기영동 사진이다.
도 8은 증명 시험 7, 8에서 대장균에서 발현 유도시킨 LOX-1의 활성을 도시하는 그래프이다.
도 9는 증명 시험 9에서 Kendall×SBOU2의 잡종 제2 세대에서의 DNA 다형을 나타내는 전기영동 사진이다.
도 10은 증명 시험 9에서 Kendall×SBOU2의 잡종 제2 세대에서의 DNA 다형 및 잡종 제3세대에서의 LOX 활성을 정리한 도면이다.
도 11은 실시예 1에서 일반 보리 품종/계통의 AfaI법에 의한 해석의 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 12는 실시예 2에서 LOX-1 결실 보리의 AfaI법에 의한 해석 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 13은 실시예 2에서 LOX-1 결실 보리의 종자 LOX 활성의 결과를 도시하는 도면이다. A는 효소 반응시간 5분의 결과, B는 효소 반응시간 90분의 결과를 도시하는 도면이다.
도 14는 실시예 5에서 LOX+F4 집단 및 LOX-F4 집단의 종자의 맥아 분석의 결 과를 도시하는 도면이다.
도 15는 실시예 5에서 맥즙중의 트랜스-2-노네날 농도와 노네날 포텐셜을 도시하는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 양태
이하, 본 발명의 적합한 실시 양태에 관해서 상세하게 설명한다.
우선, 본 발명에 따른 LOX-1 변이 유전자에 관해서 설명한다.
본 발명에 따른 LOX-1 변이 유전자는 본 발명자들에 의해 찾아낸 신규 유전자이며, 공지된 LOX-1 유전자(서열번호 1)와 비교하여 60번째의 염기 G가 A로 치환되어 있는 것을 특징으로 한다(서열번호 2). 서열번호 1의 60-61번째는 스플라이싱 공여 부위(5'-GT-3')이므로 이러한 염기의 치환에 의해 LOX-1은 스플라이싱에 이상을 초래하여, 활성이 있는 LOX-1을 발현할 수 없게 된다.
또한, 서열목록의 서열번호 1에는 공지된 LOX-1 유전자의 제5 인트론 영역의 염기서열, 서열번호 2에는 본 발명의 LOX-1 변이 유전자의 LOX-1 유전자의 제5 인트론 영역에 상당하는 부분의 염기서열을 기재한다.
다음에 본 발명의 LOX-1 결실 보리의 선별방법에 관해 설명한다.
본 발명의 LOX-1 결실 보리의 선별방법은 LOX-1 유전자의 제5 인트론의 스플라이싱 공여 부위의 구아닌이 다른 염기로 변이되어 있는지 여부에 의해 보리 LOX-1 결실 보리를 판별하는 것을 특징으로 한다.
상기한 염기의 변이를 이용하여 LOX-1 결실 보리를 선별하는 방법으로서는 예를 들면, 프라이머 서열의 3'말단 또는 프라이머 서열 내부에 변이부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 DNA의 증폭을 실시하며 증폭의 유무나 증폭 효율로 염기의 변이를 검출하며 LOX-1 결실 보리를 선별하는 방법이나 변이부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭하여, 염기서열을 결정함으로써 염기의 변이를 검출하며 LOX-1 결실 보리를 선별하는 방법 등을 사용할 수 있다.
이들 염기의 변이의 검출은 DNA 단편을 검출할 수 있으면 특별한 제한은 없지만, 아갈로스 겔 전기영동이나 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하면 양호하다. 또한, 증폭의 유무나 증폭 효율로 DNA 변이를 검출하는 경우에는 전기영동 이외에 TAQMAN법 등의 정량적 PCR법도 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 LOX-1 결실 보리의 선별방법은 바람직하게는 피검 대상인 보리로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출공정과, 추출된 게놈 DNA로부터 LOX-1 유전자 제5 인트론의 스플라이싱 공여 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시키는 DNA 단편 증폭공정과, DNA 단편 증폭공정에서 증폭된 LOX-1 유전자 제5 인트론의 스플라이싱 공여 부위를 포함하는 DNA 단편을 제한효소로 절단하여 소정의 염기수의 DNA 단편을 검출하고 스플라이싱 공여 부위의 구아닌이 다른 염기로 변이되어 있는지 여부에 의해 보리 LOX-1 결실 보리를 판별하는 DNA 단편 검출공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
우선, 본 발명에 따른 게놈 DNA 추출공정에 관해 설명한다.
피검 대상인 보리로부터 게놈 DNA를 추출하는 방법으로서는 특별한 제한은 없으며 공지된 방법에 따라 실시할 수 있지만, 구체적으로는 예를 들면, CTAB법 (Murray et al., 1980, Nucleic Acids Res. 8: 4321-4325)이나 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide)법(Varadarajan and Prakash 1991, Plant Mol. Biol. Rep. 9: 6-12)에 의해 추출할 수 있다. 여기서, 게놈 DNA를 추출하는 조직은 보리 종자 뿐만 아니라 잎, 줄기, 뿌리 등을 사용할 수 있다. 예를 들면, 잎을 사용하는 것으로 복귀 교배세대 도중의 다수의 개체 선별에 이용할 수 있게 된다.
다음에 본 발명에 따른 DNA 단편 증폭공정에 관해 설명한다.
DNA 단편을 증폭하는 방법으로서는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, PCR법에 따라 실시할 수 있다. 여기서, PCR법에서 사용되는 프라이머는 LOX-1 유전자 제5 인트론의 스플라이싱 공여 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭할 수 있는 영역에 설정되어 있는 것이면, 염기서열은 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는 예를 들면, LOX-1 유전자에서 염기수가 10 내지 60개의 연속된 염기인 것이 바람직하며 15 내지 30개의 연속된 염기인 것이 보다 바람직하다. 또한, 일반적으로는 프라이머의 염기서열에서 GC 함량이 40 내지 60%인 것이 바람직하다. 또한, PCR법에 사용되는 2개의 프라이머의 프라이머 사이의 Tm치에 차이가 없거나 적은 것이 바람직하다. 또한, 프라이머 내에 2차 구조를 취하지 않는 것이 바람직하다.
다음에 본 발명에 따른 DNA 단편 검출공정에 관해서 설명한다.
본 발명에 따른 LOX-1 변이 유전자는 상기한 바와 같이 공지된 LOX-1과 염기서열에 상위(相違)가 보이므로 당해 상위 부분을 인식하거나 절단하는 제한효소를 사용하여 증폭 산물을 절단하면, 수득되는 DNA 단편의 크기에 상위가 보인다. 본 발명에 따른 제한효소로서는 이와 같이 상위 부분을 인식하거나 절단하는 것이면 특별한 제한은 없지만, 이미 이러한 작용을 갖는 것이 판명되고 있는 제한효소 AfaI 및/또는 RsaI인 것이 바람직하다.
즉, 본 발명의 LOX-1 변이 유전자는 스플라이싱 공여 부위의 구아닌이 다른 염기로 변이함으로써, 공지된 LOX-1 유전자에 존재하고 있는 제한효소 AfaI 및 RsaI의 절단 부위(5'-GTAC-3': 제5 인트론 60-63번째)가 소실되고 있다. 그 결과, 이러한 절단 부위를 포함하는 유전자 증폭 산물을 AfaI 및/또는 RsaI로 절단할 때의 절단 패턴이 공지된 LOX-1 유전자의 경우와 상이하므로 LOX-1 변이 유전자인지 여부를 판별할 수 있다.
또한, 소정의 염기수의 DNA 단편은 상위 부분이 존재함으로써 증폭 산물을 제한효소로 절단하여 수득되는 DNA 단편의 크기에 상위가 보이도록 하는 DNA 단편이면, 이의 염기수는 특별히 제한되지 않는다.
또한, 본 공정에 따른 검출이란 제한효소에 의해 절단된 DNA 단편이 검출될 수 있는 방법이면 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는 예를 들면, 아갈로스 겔 전기영동, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 검출되면 양호하다.
다음에 본 발명의 맥아 알코올 음료용 원료에 관해서 설명한다.
본 발명의 맥아 알코올 음료용 원료는 본 발명의 LOX-1 변이 유전자를 가지는 보리에 유래하는 종자, 맥아, 맥아 추출물, 보리 분해물 또는 보리 가공물인 것을 특징으로 하며 또한, 본 발명의 보리의 선별방법에 따라 선별된 보리에 유래하는 종자, 맥아, 맥아 추출물, 보리 분해물 또는 보리 가공물인 것을 특징으로 한다.
여기서, 맥아 추출물란 엿기름의 추출물을 가리키며 예를 들면, 맥아중의 당 성분이나 단백질 성분의 추출물 등을 들 수 있다. 보리 분해물이란 보리를 효소 등으로 분해처리한 것을 가리키며 보리 당화액 등이 이에 해당된다. 보리 가공물이란 맥아 알코올 음료의 부원료로서 사용되는 보리 분쇄물 등이 이에 해당된다.
본 발명의 맥아 알코올 음료용 원료는 LOX-1을 함유하지 않으므로 맥아 알코올 음료의 제조공정에서 리놀산로부터 9-하이드로퍼옥시옥타데카디엔산이 생성되기 어려워지며 따라서 THOD나 트랜스-2-노네날도 생성 억제가 기대되며, 향미 내구성과 거품 지속성이 향상된 맥아 알코올 음료를 수득하는 것을 기대할 수 있다.
다음에 본 발명의 맥아 알코올 음료의 제조방법에 관해서 설명한다.
본 발명의 맥아 알코올 음료의 제조방법은 본 발명의 맥아 알코올 음료용 원료를 사용하는 것을 특징으로 한다.
우선, 본 발명에 따른 보리 제조공정에 관해서 설명한다.
본 발명에 따른 보리 제조공정은 LOX-1 결실 보리를 사용하는 것을 특징으로 하는 맥아를 수득하는 공정이며, 보리 제조방법으로서는 특별히 제한되지 않으며 공지된 방법으로 실시하면 양호하다. 구체적으로는 예를 들면, 침맥도가 40% 내지 45%에 달하기까지 보리 침지후, 10 내지 20℃에서 3 내지 6일 동안 발아시켜 배조(焙燥)하여 맥아를 수득할 수 있다.
다음에 본 발명에 따른 숙성공정에 관해 설명한다.
본 발명에 따른 숙성공정은 맥아를 당화시켜 맥즙을 수득하는 공정이다. 구체적으로는 다시 하기의 제1 내지 제4의 공정으로 나누어진다.
즉, 제1 공정은 맥아를 함유하는 원료와 투입 용수를 혼합하며 수득된 혼합물을 가온함으로써 맥아를 당화시켜 당화된 맥아로부터 맥즙을 채취하는 숙성공정이다.
본 공정에서 사용되는 맥아는 보리에 수분과 공기를 제공하여 발아시키고 건조시켜 어린 뿌리를 제거한 것이 바람직하다. 맥아는 맥즙 제조에 필요한 효소원인 동시에 당화의 원료로서 주요한 전분원으로 된다. 또한, 맥아 알코올 음료 특유의 향미와 색소를 부여하기 위해 발아시킨 맥아를 배조한 것을 맥즙 제조에 사용한다. 또한, 추가로 원료로서, 맥아 이외에 본 발명에 따른 LOX-1 결실 보리 또는 일반 보리, 옥수수 전분, 콘 그릿츠, 쌀, 당류 등의 부원료를 첨가할 수 있다.
또한, 맥즙의 제조공정에서, 본 발명에 따른 LOX-1 결실 보리 또는 일반 보리에서 조제된 맥아 추출물 또는 보리 분해물, 보리 가공물을 투입용수와 혼합하여, 필요에 따라 상기 부원료를 첨가하여 맥즙을 수득하는 것도 할 수 있다.
맥아는 투입용수에 첨가한 후, 혼합된다. 부원료를 첨가하는 경우에는 여기에 혼합하면 양호하다. 당류의 경우에는 하기의 끓이기 전에 첨가할 수 있다. 또한, 투입용수는 특별히 제한되지 않으며 제조하는 맥아 알코올 음료에 따라 적합한 물을 사용하면 양호하다. 당화는 기본적으로 공지된 조건에서 실시하면 양호하다. 이와 같이 수득된 맥아 당화액을 여과한 후, 호프 또는 허브 등의 향, 쓴 맛 등을 부여할 수 있는 원료를 첨가하여 끓이기를 실시하고, 이것을 냉각함으로써 냉맥즙이 수득된다.
또한, 제2 공정은 냉맥즙에 효모를 첨가하여 발효시켜 맥아 알코올 음료 중 간품을 수득하는 공정이다.
여기서, 사용되는 효모는 맥아의 당화에 의하여 수득된 맥즙내의 당분을 대사하여 알코올이나 탄산가스 등을 생성하는 이른바 알코올 발효를 하는 주류 효모이면 어떤 것도 양호하며, 구체적으로는 예를 들면, 사카로마이세스·세레비지에, 사카로마이세스·우바르무 등을 들 수 있다.
발효는 숙성공정에서 수득된 맥즙을 냉각하여, 여기에 효모를 첨가하여 실시한다. 발효조건에 관해서는 기본적으로 공지된 조건과 다르지 않으며 예를 들면, 발효온도가 통상적으로 15℃ 이하, 바람직하게는 8 내지 10℃이며, 발효시간은 바람직하게는 8 내지 10일이다.
또한, 제3의 공정은 상기 발효공정에서 수득된 맥아 알코올 음료 중간품을 저장하는 술 저장공정이다.
본 공정에서는 알코올 발효가 종료된 발효액이 밀폐 탱크로 옮겨지고, 저장된다. 저장조건에 관해서는 기본적으로 공지된 조건과 다르지 않으며 예를 들면, 저장온도는 0 내지 2℃가 바람직하며 저장시간이 20 내지 90일인 것이 바람직하다. 발효 종료액을 저장함으로써 잔존 추출물의 재발효와 숙성이 실시된다.
그리고, 제4의 공정은 술 저장공정에서 수득된 맥아 알코올 음료 중간품을 여과하여 맥아 알코올 음료를 수득하는 여과공정이다.
여과조건에 관해서는 기본적으로는 공지된 조건과 다르지 않으며 예를 들면, 여과 조재로서 규조토, PVPP(폴리비닐폴리피롤리돈), 실리카 겔, 셀룰로스 파우더 등이 사용되며, 온도는 0±1℃에서 실시된다.
이와 같이 맥아 알코올 음료가 수득된다. 여과된 맥아 알코올 음료는 그대로 또는 무균 여과나 가열처리를 실시한 다음, 탱크 들이, 통 들이, 빈(bin) 들이 또는 통조림 포장되어 시장에 출하된다.
또한, 맥아 알코올 음료는 이의 제조에 사용되는 맥아의 사용 비율의 양은 특별히 제한되지 않으며 맥아를 원료로 하여 제조되는 알코올 음료이면 양호하다. 구체적으로는 예를 들면, 맥주나 발포주를 들 수 있다. 또한, 이른바 무알코올 맥주나 무알코올 발포주도, 맥주 등의 맥아 알코올 음료와 동일한 제법을 사용하는 점으로부터 맥아 알코올 음료이다.
본 발명에 따르면 원료중에 LOX-1을 함유하지 않으므로 맥아 알코올 음료의 제조공정에서 리놀산으로부터 9-하이드로퍼옥시옥타데카디엔산이 생성되기 어려워지며 따라서 THOD나 트랜스-2-노네날도 생성 억제가 기대되며 향미 내구성과 거품 지속성이 향상된 맥아 알코올 음료를 수득하는 것을 기대할 수 있다.
다음에 본 발명의 핵산 및 보리에서 LOX-1 활성의 부재를 검출하는 방법에 관해서 설명한다.
본 발명의 핵산은 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다. 서열번호 11은 LOX-1 활성이 결여된 보리 품종 SBOU2가 갖고 있는 변이형의 LOX-1의 게놈 서열을 나타내고 있다. 즉, 본 발명의 LOX-1 변이 유전자는 서열번호 11의 것임을 특징으로 한다. 통상적인 LOX-1 유전자에서는 3178번째에 상당하는 염기는 G이지만, 변이형의 LOX-1 유전자에서는 3178번째의 염기는 A로 변이되어 있다. 그리고, 통상적인 LOX-1 유전자에서는 이러한 염기는 제5 인트론의 1번째의 염기이며, 3178 내지 3179번째의 염기서열인 GT가 스플라이싱 공여 부위에 상당한다(도 5). 그러나 변이형의 LOX-1 유전자에서는 스플라이싱 공여 부위에 상당하는 3178 내지 3179번째의 염기서열이 AT이므로 스플라이싱 이상을 일으켜 스플라이싱이 생기지 않게 된다. 또한 3176 내지 3178번째의 염기서열은 TGA이며 종료 코돈이므로 여기서 해독이 종료되는 것이 된다.
이러한 변이형의 LOX-1 유전자로부터 생기는 변이형의 LOX-1 단백질은 제5 엑손에 상당하는 부분까지밖에 존재하지 않으며 통상적인 LOX-1 단백질과 비교하여 제5 엑손보다 C 말단측의 아미노산 잔기가 결여되어 있다. 분자량은 통상적인 LOX-1 단백질이 95Kd인데 대해 변이형의 LOX-1 단백질은 57Kd이다. 통상적인 LOX-1 단백질에서, 제5 인트론 근방의 엑손 영역에 상당하는 도메인은 식물 LOX의 활성 중심이라는 발견(Shibata and Axelrod(1995) J. Lipid Mediaters and Cell Signaling 12: 213-228)과 일치하는 바와 같이 변이형 LOX-1 단백질은 리폭시게나제 활성이 결여되어 있다.
따라서 변이형 LOX-1 유전자를 갖는 보리를 원료로 하여 맥아 알코올 음료를 제조하면, 원료중에 LOX-1 단백질을 함유하지 않으므로 맥아 알코올 음료의 제조공정에서 리놀산으로부터 9-하이드로퍼옥시옥타데카디엔산이 생성되기 어려워지며 따라서 THOD나 트랜스-2-노네날도 생성 억제가 기대되며, 향미 내구성과 거품 지속성이 향상된 맥아 알코올 음료가 수득된다. 이와 같이 향미 내구성과 거품 지속성이 향상된 맥아 알코올 음료를 수득하는 데에 본 발명의 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 핵산은 대단히 유용하다.
본 발명의 핵산은 또한, 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 핵산에서 3178번째의 염기를 포함하는 10 내지 60개의 연속된 염기서열로 이루어진 핵산을 제공한다. 이러한 핵산을 프로브로서 사용하는 것으로 보리가 갖는 LOX-1 유전자가 정상형 또는 변이형인가를 분별할 수 있다. 요컨대, 정상형의 LOX-1 유전자의 3178번째의 염기는 G인 점으로부터 생기는 불일치(mismatch)를 이용하여 혼성화의 차이로부터 정상형 또는 변이형인가를 분별할 수 있다. 예를 들면, 이러한 핵산과 LOX-1 유전자의 혼성화를 형성시켜 서서히 온도를 상승시킴으로써 혼성체(hybrid)의 융해온도를 측정하면, 정상형 LOX-1 유전자와 변이형 LOX-1 유전자에서 나타나는 융해온도가 상이하므로 용이하게 양쪽을 분별할 수 있다. 기타 당업자에 있어서 공지된 방법에 따라 이러한 핵산을 이용하여 LOX-1 유전자의 형(정상형/변이형)을 분별할 수 있다. 특이성의 관점로부터 이러한 핵산은 3178번째의 염기를 함유하는 20 내지 50개의 연속된 염기로 이루어지며 또한 3178 내지 3181번째의 염기를 함유하고 있는 것이 바람직하다. 또한, 이러한 핵산은 형광물질이나 방사성 동위원소 등으로 표지될 수 있다.
본 발명의 보리에서 LOX-1 활성의 부재를 검출하는 방법은 보리 샘플로부터 게놈을 분리하는 공정과, 서열번호 11의 염기서열의 3178번째의 염기를 검출하고 이의 염기의 존재를 당해 보리의 LOX-1 활성의 부재의 지표로 하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이러한 방법에 따르면 검사 대상의 보리가 LOX-1 활성 결실 형질을 갖는지 여부를 분별할 수 있다.
보리 샘플은 보리 종자에 한하지 않으며 잎, 줄기, 뿌리 등을 사용할 수 있다. 핵산의 분리는 공지된 방법으로 할 수 있으며 예를 들면, CTAB법이나 에티디움 브로마이드법 등을 이용할 수 있다.
또한, 서열번호 11의 염기서열의 3178번째의 염기의 검출은 당업자에 있어서 공지된 방법에 따라 할 수 있다. 예를 들면, 필요에 따라 PCR법 등의 핵산 증폭방법에 따라 서열번호 11의 염기서열의 3178번째의 염기를 포함하는 핵산을 증폭시킨다. 분리된 핵산 또는 증폭된 핵산 단편에 대해 예를 들면, 상기한 바와 같이 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 핵산에서 3178번째의 염기를 포함하는 10 내지 60개의 연속된 염기서열로 이루어진 핵산을 사용함으로써 3178번째의 염기의 종류를 판별할 수 있다.
그러나 LOX-1 유전자의 3178 내지 3181번째의 염기의 차이를 이용하여 3178번째의 염기를 검출하는 방법이 보다 간편하고 효율이 양호하다. 3178 내지 3181번째의 부위는 정상형의 LOX-1 유전자에서는 제한효소 AfaI/RsaI의 절단 부위로 되어 있는 데 대해 변이형의 LOX-1 유전자에서는 3178번째의 염기가 A이므로 제한효소 AfaI/RsaI의 절단 부위가 아니다(도 5). 요컨대, 분리된 핵산 또는 증폭된 핵산 단편을 AfaI/RsaI로 제한효소 처리를 실시하면 정상형 LOX-1의 핵산은 절단되는데 대해 변이형 LOX-1의 핵산은 절단되지 않는다. 제한효소 처리를 실시한 핵산 샘플을 전기영동으로 분석하면, 영동패턴의 차이에 의해 LOX-1 유전자의 형(정상형/변이형)을 분별할 수 있으며 3178번째의 염기의 종류를 판별할 수 있다. 또한, 기타, 3178 내지 3181번째의 염기를 포함하는 10 내지 60개의 연속된 염기서열로 이루어진 핵산을 프로브로서 사용하여, 제한효소 처리를 실시한 핵산과 혼성화 등을 시킴으로써 LOX-1 유전자의 형을 분별할 수 있으며 3178번째의 염기의 종류를 판별할 수 있다.
이와 같이 3178번째의 염기를 판별한 결과, 염기가 G이면 검사대상의 보리는 LOX-1 활성을 갖고 있는 것으로 되며, 향미 내구성과 거품 지속성을 향상시킨 맥아 알코올 음료의 원료에는 적합하지 않다고 판단할 수 있다. 한편, 염기가 A이면 검사대상의 보리는 LOX-1 활성을 갖지 않게 되며 향미 내구성과 거품 지속성을 향상시킨 맥아 알코올 음료의 원료에는 적합하다고 판단할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산은 서열번호 10의 1 내지 1554번째의 염기의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다. 서열번호 10은 LOX-1 활성이 결여된 보리 품종 SBOU2에 발현되어 있는 변이형의 LOX-1의 cDNA 서열을 나타내고 있다. 이중에서 1 내지 1554번째의 염기의 염기서열이 암호화 영역이다. 이미 기재한 바와 같이 이러한 cDNA가 암호화되는 변이형 LOX-1 단백질은 통상적인 LOX-1 단백질과 비교하여 제5 엑손보다 C 말단측의 아미노산 잔기가 결실되어 있으며 이의 분자량은 57Kd이며 또한, 리폭시게나제 활성이 결여되어 있다.
따라서 이러한 핵산이 발현되고 있는 보리를 원료로 하여 맥아 알코올 음료를 제조하면, 상기한 바와 같이 향미 내구성과 거품 지속성이 향상된 맥아 알코올 음료가 수득된다.
이하, 실시예에 따라 본 발명의 내용을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발 명은 이들 실시예로 한정되는 것이 아니다.
탐색 시험 1(LOX-1 효소 활성 측정에 의한 LOX-1 결실 보리의 탐색)
하기 방법에 따라 LOX-1 효소 활성 측정을 실시하며, 보리 유전자 자원 중에서 LOX-1 결실 보리의 탐색을 실시한다.
우선, 하기 방법에 따라 보리 종자에서 조(粗)효소액을 추출한다. 완숙 보리 종자 1알을 해머로 파쇄하고, 500μL의 추출 완충액[0.1M 아세트산나트륨 완충액(pH 5.5)]을 사용하여, 4℃에서 30분 동안 진탕하여 추출한다. 수득된 추출액을 15000rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상등액을 조효소액으로 한다.
다음에 조효소액 10μL에 5μL의 기질액[40mM 리놀산, 1.0%(W/V) Tween 20 수용액] 및 85μL의 추출 완충액을 가하여 혼화한 다음, 24℃에서 5분 동안 반응시킨다. 반응의 정지는 100μL의 반응 정지액(80mM 2,6-디-t-부틸-p-크레졸 메탄올 용액)을 첨가하여 혼화하는 것으로 실시한다. 반응액을 -20℃에서 30분 동안 정치한 후, 3000rpm에서 20분 동안 원심분리하여, 상등액을 다음 발색반응에 사용한다. 수득된 상등액 20μL에 200μL의 발색액[4mM 2,6-디-t-부틸-p-크레졸, 25mM 황산, 0.25mM 황산암모늄철(II) 6수화물, 100mM 크실레놀 오렌지, 90% 메탄올 수용액)을 첨가하여, 30분 동안 정치한 다음, 파장 550nm의 흡광도를 측정한다. 또한, 음성 대조군으로서는 조효소액을 100℃에서 5분 동안 열처리하여, LOX-1을 불활성화시킨 것을 동일하게 반응시킨 것을 사용하며 양성 대조군으로서 보리 품종 Kendall의 종자의 조효소액을 사용한다.
유전자 자원의 탐색 결과, 도 1에 도시된 바와 같이 SBOU2의 종자에는 유의적인 LOX-1 활성이 확인되지 않는 것으로 판명됐다. 이러한 SBOU2는 재래종인 점으로부터 인위적으로 돌연변이 유발을 실시한 계통이 아닌 자연 돌연변이체이다.
증명 시험 1(SBOU2 조효소액에 LOX-1 억제활성이 없음을 확인)
다음에 SBOU2 조효소액의 LOX-1 억제활성의 유무에 관해 조사한다.
LOX-1 활성을 나타내는 조효소액(양성 대조군: PC)에 SBOU2의 조효소액(10μL, 20μL, 50μL)을 첨가하여 LOX-1 활성의 변화를 조사한 바, SBOU2의 조효소액의 첨가에 의해서도 LOX-1 활성은 변화되지 않으며 SBOU2 조효소액에 LOX-1 억제활성은 확인되지 않는다(도 2). 이러한 점으로부터 SBOU2의 LOX-1 활성 결실의 원인은 LOX 활성 억제물질에 기인하는 것은 아니라고 생각된다.
증명 시험 2(SBOU2 종자중의 LOX-1 단백질 발현량의 확인)
다음에 항 LOX-1 항체를 사용하여, SBOU2의 종자에 LOX-1 단백질이 발현되는지 여부를 조사한다.
우선, 항 LOX-1 항체를 제조한다. 항원으로서 사용되는 LOX-1 단백질은 대장균으로 발현시킨 LOX-1 단백질을 정제하는 것으로 수득한다[Kuloda et. al.(2002) J. Bioscience and Bioengineering 93: 73-77]. 정제된 단백질을 토끼에 면역 반응시켜, LOX-1 항체를 작제한다. 본 항체는 LOX-1 및 LOX-2를 인식한다.
다음에 하기 방법으로 웨스턴 블로팅을 실시하여, SBOU2의 종자에서 LOX-1 단백질의 발현에 관해서 조사한다. SBOU2로부터 0.1M 아세트산나트륨 완충액(pH 5.5)을 사용하여 추출한 전체 가용성 단백질 3μg을 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분획한 다음, PVDF 막(밀리포어사)에 블로팅한다. 이러한 막을 TTBS[20mM Tris-HC1(pH 7.5), 0.15M 염화나트륨, 0.05%(w/v) Tween 20, 0.05%(w/v) 아지드화나트륨)]으로 세정한 다음, LOX-1 항체액(10O0배 희석/TTBS)으로 30분 동안 반응시킨다. 막의 TTBS 세정을 5분 3회 실시한 다음, 알칼리포스파타제 표지 염소 항토끼 IgG 항체액(Santa Cruz사제, 1000배 희석 TTBS 용액)으로 30분 동안 반응시킨다. 막을 TTBS로 5분 ×2회 세정을 실시하고, 다시 AP9.5[10mM Tris-HC1(pH 9.5), 0.1M 염화나트륨, 5mM 염화마그네슘]으로 5분×1회 세정을 실시한 다음, 알카리포스파타제 기질액(1mg/ml 니트로블루테트라졸리움, 0.5mg/ml BCIP, AP9.5 용액)과 반응시켜 발색시킨다. 그 결과, 대조 품종(Kendall)에서는 약 95Kd의 분자량을 가지는 강한 밴드가 수득된 데 대해 SBOU2 계통종자로서는 약 95Kd 및 약 57Kd의 분자량 영역에 대단히 얇은 밴드가 검출된다(도 3A).
또한, 이러한 추출 샘플을 PhastSystem(Amersham Pharmacia사제)를 사용하여, 등전점 전기영동(IEF, pI 3-9)를 실시한 다음, 동일하게 웨스턴 해석한다. 그 결과, SBOU2에서는 LOX-2의 pI의 위치에 밴드가 검출되지만, LOX-1의 pI의 위치에는 명료한 밴드는 확인되지 않는다(도 3B). 이러한 점으로부터 SBOU2의 종자 추출 단백질로 확인된 약 95Kd의 밴드는 LOX-2 단백질이라고 생각된다.
이상의 결과로부터 SBOU2의 종자에는 정상인 LOX-1 단백질이 거의 발현되지 않는 것이 확인된다.
증명 시험 3(SBOU2의 종자의 LOX-1 RNA의 해석)
SBOU2의 등숙(登熟) 약 4주간째의 종자 및 발아 3일째의 종자로부터 추출한 전체 RNA를 주형으로 하여 RT-PCR을 실시한다. 반응은 시판하는 키트(로슈다이아그노스틱사제, 퍼킨엘마사제)를 사용하여, 키트의 매뉴얼에 따라 실시한다. 프라이머는 기존의 서열(DNA 데이터 뱅크: 기탁번호 L35931)에 기초하여 5'-GGAGAGGAGGCCAAGAACAAGATG-3'(서열번호 3) 및 5'-GGTTGCCGATGGCTTAGAT-3'(서열번호 4)에 설계한다. PCR은 94℃ 2분을 1회, 94℃ 1분, 60℃ 2분, 72℃ 4분의 반응을 31회 반복한 다음, 72℃에서 7분의 신장반응을 실시한다.
증폭된 DNA를 전기영동한 바, 대조군(품종 Kendall)보다는 약간 증폭량이 적지만, 성숙 중 및 발아중의 RNA에 대해 약 2.5Kb의 밴드의 증폭이 검출된다(도 4). 이러한 점은 LOX-1 유전자가 정상으로 전사되고 있는 것을 나타내고 있다.
이상, SBOU2의 종자에서 (1)LOX-1 활성이 확인되지 않는 것, (2)LOX-1 항체에 반응하는 항원 단백질이 미량으로 밖에 존재하지 않는 것, (3)약 57Kd의 분자량의 단백질의 존재가 확인된 것, (4)LOX-1의 mRNA가 확인되는 점 등으로부터 SBOU2의 LOX-1 활성이 결여되고 있는 메카니즘은 전사 이후의 이상에 기인한다고 생각된다.
증명 시험 4(SBOU2의 LOX-1 유전자 인트론 영역의 구조 해석)
LOX-1 유전자의 인트론 및 엑손 영역의 구조를 해석하기 위해 전체 엑손을 포함하는 영역의 게놈 DNA를 분리한다. 주형에는 SBOU2의 전체 DNA를 사용한다. 프라이머는 기존의 서열(DNA 데이터 뱅크: 기타번호 U83904, L35931)에 기초하여 설계한다[5'-CACGTCGCCGTCCGATCCATC-3'(서열목록 서열번호 5), 5'-GGTTGCCGATGGCTTAGAT-3'(서열목록 서열번호 4)]. PCR은 94℃ 1분, 65℃ 2분, 72℃ 3분의 반응을 31회 반복한 다음, 72℃에서 7분의 신장반응을 실시한다. 수득된 DNA 단편을 pCR2.1에 클로닝하여(pGLXABAL1), 구조 해석의 주형으로 한다. 구조 해석은 ABI사의 서열분석기를 사용하며 서열분석 반응은 다이터미네이터법을 사용한다. 전체 구조는 서열목록의 서열번호 11에 기재한다.
서열목록의 서열번호 1은 기존의 LOX-1 유전자의 염기서열(WO 02053721) 중에서 제5 인트론이 있는 영역의 구조를 나타낸다. 스플라이싱의 공여 부위는 60-61번째의 염기서열 5'-GT-3'이다.
한편, 해석의 결과로부터 알 수 있는 SBOU2의 대응하는 영역의 염기서열을 서열번호 2에 나타낸다. SBOU2에서는 스플라이싱 공여 부위인 60번째의 구아닌이 아데닌으로 변이되어 있는 것이 명백해졌다.
또한, 서열번호 2의 60번째의 염기가 아데닌으로 치환됨으로써 종료 코돈이 신규하게 형성되며(서열목록의 서열번호 2의 58-60번째의 염기서열 5'-TGA-3'), 스플라이싱 부위의 5' 상류에서의 변화가 생기지 않는 경우에는 LOX-1 단백질의 해독은 여기서 종료된다고 생각한다(도 5).
제5 인트론 근방의 엑손 영역은 식물 LOX의 활성중심인 것이 공지되어 있으 며(Shibata and Axelrod(1995) J. Lipid Mediaters and Cell Signaling 12: 213-228), 상기 스플라이싱 이상은 LOX-1 효소 활성에 큰 영향을 미친다고 생각된다.
증명 시험 5(제5 인트론에서 스플라이싱의 해석)
제5 인트론에서 실제로 스플라이싱 이상이 일어나고 있는 것을 확인하기 위해 RT-PCR에 의한 해석을 실시한다.
발아중의 SBOU2 및 Kendall에서 전체 RNA를 추출하고 시판하는 키트(로슈다이아그노스틱사제)를 사용하여 cDNA를 합성하고 주형 DNA로 한다. 게놈 DNA에서, 증폭 단편이 제3 인트론(106bp), 제4 인트론(132bp) 및 제5 인트론(79bp)를 함유하도록 설계한 2종류의 프라이머[5'-CCATCACGCAGGGCATCCTG-3'(서열목록 서열번호 6), 5'-GCGTTGATGAGCGTCTGCCG-3'(서열목록 서열번호 7)]를 사용하여 PCR을 실시한다. PCR은 94℃ 1분, 65℃ 2분, 72℃ 3분의 반응을 31회 반복한 다음, 72℃에서 7분의 신장반응을 실시한다. 증폭된 DNA 단편을 아갈로스 겔 전기영동한 바, SBOU2의 증폭 단편은 Kendall의 증폭 단편보다 약 80bp 염기수가 크다(도 6A). 또한, SBOU2의 게놈 DNA에 대하여는 약 1.2Kb의 단편이 증폭되어 있으며 상기 RT-PCR의 결과는 발현되고 있는 RNA에 대한 결과라고 생각된다.
다음에 제3 인트론(106bp), 제4 인트론(l32bp) 및 제5 인트론(79bp)의 어느 하나의 인트론이 스플라이싱 이상을 일으키고 있느냐를 조사하기 위해 증폭 단편을 제4 인트론(132bp)과 제5 인트론 간의 엑손 영역에 존재하는 제한효소 StuI 부위로 소화시킨다. 그 결과, 제5 인트론을 포함하는 DNA 단편은 게놈 DNA의 증폭 단편의 이동도와 동등한 점으로부터 제5 인트론의 스플라이싱이 이상을 일으키고 스플라이싱되지 않거나 또는 스플라이싱 부위가 3'측에 어긋나는 것이 명백해진다(도 6B). 즉, 도 5에 도시된 새롭게 된 종료 코돈에 의해 SBOU2의 LOX-1 단백질의 해독은 이러한 코돈에서 종료되며, LOX-1 활성을 잃는 것이 명백해진다.
증명 시험 6(SBOU2의 LOX-1 cDNA의 구조 해석)
SBOU2 유래의 LOX-1의 구조를 밝히기 위해 상기와 동일한 방법으로 cDNA를 분리한다. 증폭은 BamHI 부위와 개시 코돈을 포함하는 프라이머[5'-GGATCCATGCTGCTGGGAGGGCTG-3'(서열번호 8)] 및 HindII 부위와 종료 코돈을 포함하도록 설계한 프라이머[5'-AAGCTTTTAGATGGAGATGCTGTTG-3'(서열번호 9)]를 사용한다. 증폭된 단편은 pT7 Blue T-Vector(Novagen)에 클로닝한 후(pBDC1), 구조 해석한다. 구조 해석의 결과, 수득된 cDNA의 염기서열을 서열번호 10에 나타낸다. 본 cDNA 클론은 제5인트론 전체 영역(서열번호 10의 1554번째에서 1632번째)를 포함하는 것이 명백해진다.
증명 시험 7(대장균의 형질전환과 발현 유도)
대장균에서 SBOU2와, 야생형 LOX-1을 보유하는 품종 Steptoe 유래의 LOX-1을 발현시키기 위해 Steptoe 유래 cDNA도 상기와 동일하게 분리하여, 클로닝한다(pSDC1). pSDC1 및 pBDC1의 양쪽 클론에서 BamHI-HindIII 단편을 각각 절단 인출하고 대장균 발현 벡터 pQE80L(Qiagen)의 BamHI-HindIII 부위에서 수득된 단편을 각각 삽입하여, 대장균 발현 벡터로 한다[pSQE1(Steptoe의 cDNA를 삽입), pBQE1(SBOU2의 cDNA를 삽입)]. 이들 벡터를 대장균 JM109로 형질전환한 후, Qiagen사의 매뉴얼에 따라 IPTG에 의한 발현 유도를 실시한다. 그 결과, pSQE1/JM109에서는 약 95Kd의 밴드가 발현 유도된 데 대해 pBQE1/JM109에서는 약 57Kd의 밴드가 발현 유도된다(도 7). 또한, 이들 대장균을 초음파에 의해 파쇄한 다음, 조효소액을 추출하여 LOX 활성을 측정한다. 그 결과, pSQE1/JM109에서는 높은 LOX 활성이 확인되는 데 대해 pBQE1/JM109에서는 LOX 활성은 확인되지 않는다(도 8). 이들 결과는 SBOU2의 식물체에서 LOX-1 활성 및 LOX-1 단백질의 해석 결과와 완전하게 일치하며 대장균에서 SBOU2의 LOX-1 결실을 재현할 수 있는 것을 나타내고 있다.
증명 시험 8(교환 삽입 및 발현실험)
다음에 pBQE1의 제5 인트론 스플라이싱 공여 부위의 변이를 포함하는 PstI-StuI 단편(StuI 부위는 서열번호 10의 1502 내지 1507번째의 염기, PstI 부위는 서열번호 10의 2048 내지 2053번째의 염기)를 야생형인 pSQE1의 PstI-StuI 단편과 서로 교환 삽입하고(pSQE1+BPS, pBQE1+SPS), 상기와 동일하게 대장균에서 발현 유도를 실시한다. 그 결과, pSQE1에 pBQE1 유래의 제5 인트론 스플라이싱 공여 부위의 변이를 포함하는 PstI-StuI 단편을 교환 삽입한 pSQE1+BPS/JM109에서는 pBQE1/JM109와 동일하게 약 57Kd의 단백질이 유도되며(도 7), LOX 활성을 잃고 있다(도 8). 반대로 pBQE1에 pSQE1 유래의 PstI-StuI 단편을 교환 삽입한 pBQE1+SPS/JM109에서는 pSQE1/JM109와 동일하게 약 95Kd의 단백질이 유도되며(도 7), LOX 활성이 부활된다(도 8). 또한, pBQE1의 PstI-StuI 단편의 염기서열은 야생형 LOX-1 유전자와 제5 인트론 스플라이싱 공여 부위 이외에는 완전하게 동일하다(서열번호 10의 1554번째의 G가 A). 이상의 결과로부터 SBOU2의 제5 인트론 스플라이싱 공여 부위의 변이의 유무가 LOX-1 활성의 유무를 결정하고 있는 것이 명백해진다.
증명 시험 9(제5 인트론 변이를 사용하는 보리 교배계통의 맵핑과 선별)
기존의 LOX-1 염기서열에서는 제5 인트론의 스플라이싱 공여 부위를 포함하는 서열은(서열목록 서열번호 1의 60-63번째: 5'-GTAC-3'), GTAC 서열을 인식하는 제한효소 AfaI(RsaI)로 소화할 수 있다. 한편, SBOU2 계통에서는 이의 영역의 서열에서 변이가 있으며(서열목록 서열번호 2의 60-63번째: 5'-ATAC-3'), AfaI 및/또는 RsaI로 소화할 수 없게 되어 있는 것(도 5)을 이용하여, LOX-1 결실 유전자의 맵핑를 실시한다. 보리 품종 Kendall과 SBOU2의 잡종 제2 세대(F2) 144개체의 잎으로부터 DNA를 추출하며 증폭 단편이 이러한 AfaI 부위를 포함하도록 설계한 2종류의 프라이머[5'-CCATCACGCAGGGCATCCTG-3'(서열목록 서열번호 6), 5'-GCGTTGATGAGCGTCTGCCG-3'(서열목록 서열번호 7)]를 사용하여, PCR을 실시한다. PCR은 94℃ 1분, 65℃ 2분, 72℃ 3분의 반응을 31회 반복한 다음, 72℃에서 7분의 신장반응을 실시한다. 증폭된 단편을 AfaI로 절단하여, 2.5% 아갈로스 겔 전기영동으로 분석한다(이상을 AfaI법이라고 호칭한다). 그 결과, SBOU-2형, Kendall형 및 헤테로형을 용이하게 분별할 수 있다(도 9). AfaI법 다형 조사에 추가하여, LOX-1 유전자가 자리잡고 있는 보리 4H 염색체의 LOXA 유전자 자리 근방의 DNA 마커(JBC 970)에 관해서도, 각 계통의 다형 조사를 실시한다(도 10).
다음에 이러한 F2 개체에 결실된 종자를 사용하여, 종자 LOX 활성을 조사한다. LOX 활성이 확인되지 않은 계통에 관해서는 다시 복수 종자(4 내지 7알)의 활성 측정을 실시한다(도 10).
이상의 F2 세대의 AfaI법 다형 조사와 F3 종자의 LOX 활성 측정의 결과, SBOU2의 LOX-1 결실 형질의 분리는 상기 AfaI법 다형의 분리와 완전하게 일치한다. 즉, SBOU2의 LOX-1 결실 유전자가 LOXA 유전자 자리에 있는 것이 이들 일련의 유전자 조사로부터 명백해진다.
또한, 이 결과는 DNA 변이를 이용한 보리 선별법의 한가지 예인 AfaI법을 사용하면, LOX-1 결실의 교배계통을 보리 성육 초기의 잎의 단계에서 선별할 수 있으며 종자가 결실하는 것을 기다릴 필요는 없는 것을 나타내고 있다.
실시예 1(다른 보리 품종의 AfaI 다형 조사)
일반적인 보리 품종/계통을 사용하여, AfaI법 다형 조사를 실시한다. 사용하는 품종은 미카모골덴, 골덴 멜론, 하루나니조, 묘기니조, 사키다마니조, 와세도리니조, 아그리모치, 하루핀니조, 료후우, 호쿠이쿠 33호, 호쿠이쿠 35호, Prior, Schooner, Sloop, Lofty Nijo, Franklin, Betzes, Harrington, Manley, B1251, CDC Kendall, CDC Stratus, CDC Copeland, Hanna, Merit, AC Metcalfe, TR145, Chariot, Stirling, Proctor, Koral, Heartland, 합계 32품종/계통이다. AfaI법 다형 조사의 결과, 시험된 이들 품종은 SBOU2형이 아니며 제5 인트론의 스플라이싱 공여서열을 포함하는 제한효소 AfaI 부위(서열목록 서열번호 1의 60-63번째: 5'-GTAC-3')가 소화되어 있다(도 11). 이러한 점은 이들 육성계통에서 AfaI 부위(서열목록 서열번호 1의 60-63번째: 5'-GTAC-3')에 DNA 변이가 확인되지 않는 것을 나타내는 것이며, 교배계통의 LOX-1 결실 유전자의 선별에 이러한 AfaI법이 효과적으로 이용될 수 있다.
실시예 2(유전자 자원의 탐색)
오카야마 대학이 보존하는 세계의 보리 유전자 자원(재래종)에 대해서 AfaI법에 의한 조사를 실시한다. 그 결과, 새로운 5계통에서 제5 인트론의 스플라이싱 공여서열을 포함하는 제한효소 AfaI 부위(서열목록 서열번호 1의 60-63번째: 5'-GTAC-3')가 소화되지 않는 계통을 찾아냈다(오카야마 대학이 보존하는 SBOU1, SBOU3, SBOU4, SBOU5 및 SBOU6)(도 12).
다음에 이들 계통의 종자의 LOX-1 활성을 탐색 시험 1에 기재된 방법으로 측정한다. 또한, SBOU5 및 SBOU6에 관해서는 활성 측정을 반응 5분으로 실시하고(도 13A), SBOU1, SBOU3 및 SBOU4에 관해서는 보다 활성의 유무를 명백하게 할 수 있도록 반응시간을 90분으로 연장하여 활성 측정한다(도 13B). 그 결과, 이들의 모든 계통에서 유의적인 활성은 확인되지 않는다(도 13).
이러한 점으로부터 SBOU2 및 SBOU1, SBOU3, SBOU4, SBOU5 및 SBOU6(SBOU2형 LOX-1 결실 보리)는 LOX-1 결실 보리인 것이 명백해졌다. 이들 계통은 모두 재래종이며, 인위적으로 변이 유발을 실시한 계통이 아닌 점으로부터 LOX-1 유전자에 관해서 자연 돌연변이체이다.
이상의 결과로부터 DNA 변이를 이용한 보리 선별법의 한가지 예인 AfaI법은 LOX-1 결실 보리 교배 후대계통의 선별 뿐만 아니라, 보리 유전자 자원으로부터도 효율적으로 LOX-1 결실 보리의 선별을 할 수 있게 하는 기술인 것이 명백해진다.
실시예 3(시험 양조용 보리의 육성)
보리 품종 다이쇼 보리와 SBOU2를 교배하여, 수득된 잡종 제1대(F1)를 자가 증식하여 수득되는 F2 세대에서 탐색 시험 1에 기재된 LOX-1 효소 활성 측정법 및 증명 시험 9에 기재된 AfaI법에 의해 LOX-1 결실 형질을 확인하며 LOX-1 결실 계통군, LOX-1 보유 계통군을 집단으로 하여 이후의 종자 증식을 시험한다.
종자 증식은 각 계통(집단)마다 실시하며 F4 종자가 얻어질 때까지 균일한 포장(圃場) 또는 온실을 사용하여 실시한다. F4 종자에 관해서 LOX-1 효소 활성을 측정한 바, F2 개체에서 판별된 LOX-1 활성의 유무를 유지하고 있으며 이 결과로부터 LOX-1 결실 형질은 안정적으로 후대에 전달되는 것이 명백하다.
이후의 맥아 제조시험 및 맥아 알코올 음료 제조시험에는 이러한 F4 종자를 시험한다.
실시예 4(시험 양조용 맥아의 제조)
상기 다이쇼 보리×SBOU2의 교배에 유래하는 LOX-1 활성을 갖지 않는 보리 종자로 이루어진 LOX-1 결실 보리 F4 집단(LOX-F4)과, LOX-1을 갖는 보리 종자로부터 LOX 활성 보유 보리 F4 집단(LOX+F4)을 만들어, 보리 제조에 사용한다.
보리 제조는 Automatic Micromalting System(Phenix Systems사제)를 사용하여, 보리 침지 16℃에서 합계 82시간(5시간 습윤/7시간 건조 사이클), 발아 15℃에서 139시간, 배조 29시간(55℃ 13.5시간, 65℃ 8시간, 75℃ 3.5시간, 83℃ 4시간)의 조건으로 실시한다.
실시예 5(맥아 및 맥즙의 분석)
맥아의 분석은 EBC 표준법[European Brewery Convention편, Analytica EBC(4th Ed), 1987]에 따라서 실시한다. 그 결과, LOX-F4와 LOX+F4를 사용하는 맥아에는 맥아 분석치에 큰 차이가 없으며 LOX-1 활성의 유무를 비교할 목적의 맥아 알코올 음료 양조에 문제없이 사용할 수 있는 것이 명백해진다(도 14).
다음에 맥아 50g을 사용하여, 콘그레스법[European Brewery Convention편, Analytica EBC(4th Ed), 1987]에 의해 맥즙을 제조하며 맥즙중의 지질 산화물을 분석한다.
우선, 맥즙중의 트랜스-2-노네날량을 하기 방법으로 측정한다. 맥즙 샘플 8mL를 바이알에 투입하고 3g의 NaCl을 첨가하여 캡핑을 한다. 다음에 스펠코제 폴리디메틸실록산 SPME 섬유를 삽입하여, 40℃에서 15분 동안 인큐베이트한 후, 가스 크로마토그래피로 시험한다.
가스 크로마토그래피·질량 분석은 캐피러리 칼럼으로서 J&W사제 DB-1(30m×0.25mm, 필름 두께 1μm), 캐리어 가스로서 헬륨(1mL/분)을 사용하며 오븐조건은 60℃로부터 225℃(5℃/분)로 하며, 선택 이온모드(m/z: 70)로 트랜스-2-노네날의 정량을 실시한다. 또한, 정량에는 시그마사제 트랜스-2-노네날을 표준품으로 하는 표준 첨가법을 사용한다.
그 결과, LOX-F4, LOX+F4를 사용하여 제조한 맥즙의 트랜스-2-노네날 농도는 각각 0.36ppb와 3.85ppb이다. 따라서 본 발명에 따른 맥아를 사용하여 맥즙을 제조하면, 종래의 맥아를 사용하는 경우과 비교하여, 트랜스-2-노네날 생성량을 1/10 이하로 억제할 수 있는 것이 명백해진다.
또한, 맥즙 노네날 포텐셜은 하기 방법으로 측정한다. 우선, Drost 등의 방법(Drost, B.W., van den Berg, R., Freijee, F.J.M., van der Velde, E.G., and Hollemans, M., J. Am. Soc. Brew. Chem., 48, 124-131, 1990)에 의해 맥즙을 2시간 동안 끓이기한다. 다음에 상기 트랜스-2-노네날의 측정방법에 따라 샘플중의 트랜스-2-노네날의 양을 측정하여, 맥즙중의 노네날 포텐셜을 산출한다.
그 결과, LOX-F4, LOX+F4를 사용하여 제조한 맥즙의 노네날 포텐셜은 각각 2.74ppb와 11.9ppb이다. 노네날 포텐셜은 제품 노화를 예측할 수 있는 지표로서 공지된 점으로부터(Drost, B.W, et al., J. AM. Soc. Brew. Chem., 48, 124-131, 1990, Ueda et. al.(2001) EBC-proceedings 55: p3 28th Congress), 본 발명에 따른 보리로부터 제조한 맥아를 이용하여, 맥아 알코올 음료를 양조하면, 맥아 알코 올 음료의 향미 내구성을 크게 개선할 수 있다.
또한, LOX-F4를 사용하여 제조한 맥즙의 트랜스-2-노네날 농도와 노네날 포텐셜을, 시판하는 맥아를 사용하여 제조한 맥즙의 경우와 비교한 것이 도 15이다. 도 15에 도시된 결과로부터 명백한 바와 같이 본 발명에 따른 맥즙은 종래의 보리에서는 달성할 수 없던 분석치를 나타낸다.
이상의 결과로부터 본 발명에 따른 보리를 이용하면, 종래품에는 없는 품질을 갖는 맥아를 제조할 수 있는 것이 명백해진다.
또한, 맥즙중의 THOD 농도를 고속 액체 크로마토그래피 질량 분석으로 측정한다. 고속 액체 크로마토그래피의 조건은 하기와 같다. 이동상의 유속 0.3mL/분으로 하고, 이동상에는 0.5% 아세트산(A액)과 아세토니트릴(B액)의 혼합액을 사용하며 A액:B액= 35:65(0분)-A액:B액= 5:95(30분)의 선형 농도 구배의 조건으로 실시한다. 또한, 칼럼은 워터즈사제 Assymetry(N0.106005; C18, 3.5μm: 2.1×150mm)를 사용하고 칼럼 온도는 50℃로 하며 휴렛 패커드사제 1100형 고속 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 5μL의 맥즙 또는 맥아 알코올 음료 샘플을 분리한다. 질량 분석은 워터즈 ZQ를 사용하고, ES 이온화 네가티브 모드로 질량 329를 모니터링한다. 또한, THOD의 표준액은 맥주 추출 샘플을 이용한다(Kobayashi, N., et al., J. Biosci. Bioeng., 90, 69-73, 2000).
그 결과, LOX-F4, LOX+F4를 사용하여 제조한 맥즙의 THOD 농도는 각각 6.5ppm과 14.7ppm이며, 본 발명에 따른 맥아를 사용하여 맥즙을 제조하면 맥즙 THOD 농도를 1/2 이하로 억제할 수 있는 것이 명백해진다.
상기한 바와 같이 THOD는 숙성공정에서 맥아 LOX-1과 보리 퍼옥시다제 유사 활성의 작용에 의해 리놀산으로부터 변환됨으로써 생성되지만 맥아 퍼옥시다제 유사 활성이 THOD 생성의 율속단계라고 생각되므로(Kuroda, H., et AL., J, Biosci. Bioeng., 93, 73-77, 2002), 맥아 LOX-1 활성을 저하시킨 경우, THOD의 생성이 어느 정도 억제되는가는 명백하지 않았다. 그러나 본 실시예의 결과로부터 LOX-1 활성이 없는 보리 종자로부터 제조되는 맥아를 사용하면, 맥즙중의 THOD 양이 감소하는 것이 증명되었다. THOD는 효모에 의해 대사되지 않고 최종 제품으로 이행하는 점으로부터[Kobayash, N., et al., J. Inst. Brew., 106, 107-110(2000)], 본 발명에 따른 보리 유래의 맥아를 이용하면, 향미 품질이나 거품 품질이 양호한 맥아 알코올 음료의 제조를 할 수 있게 되는 것이 명백해진다.
실시예 6(맥아 알코올 음료시험 양조)
1.냉맥즙의 제조와 분석
실시예 4에서 수득된 LOX-F4 맥아와 LOX+F4 맥아의 두가지에 관해서, 50L 스케일 투입설비에 의해 발포주 사양(맥아 사용율 24%)에서의 투입을 실시한다. 투입조건은 하기와 같다.
각각의 맥아 1.5kg을 단일용으로 15L의 투입용수에 의해 50℃, 20분→ 65℃, 30분→ 75℃, 3분의 다이아그램에 따라 투입하고 로이터 설비에 의해 맥즙 여과를 실시하고, 최종적으로 35L의 여과 맥즙을 수득한다.
수득된 여과 맥즙은 액당(당분 75%) 5kg과 혼합하고, 호프 펠렛[쓴 맛 분석 치 87.0BU(EBC)] 13g을 첨가하여 70분 동안 끓여서 10℃까지 냉각하고, 가수에 의한 추출물 조정에 의해 추출물 함량 11.6 내지 11.8%의 냉맥즙으로 한다.
수득된 냉맥즙의 분석은 EBC 표준법[European Brewery Convention편, Analytica EBC(4th Ed), 1987]에 따라서 실시한다. 분석치를 표 1에 기재한다. 표1에 기재한 바와 같이 일반적인 분석 항목에 관해서는 LOX-F4와 LOX+F4 간에 명백한 차이는 확인되지 않는다.
2.맥아 알코올 음료(발포주)의 제조
상기 1에서 수득된 냉맥즙을 증기 살균한 30L 스케일의 실린드로코니컬형 탱크에 옮기고 초기 농도 세포수 3000만개/mL로 되도록 효모를 첨가하여, 13℃에서 주발효를 실시한다. 발효액의 추출물이 2.5%까지 마감된 단계에서 동형의 탱크로 옮겨 바꾸고 술 저장공정을 실시한다. 술 저장공정은 최초의 6일 동안은 13℃에서, 이후의 2주 동안은 0℃에서 실시한다.
술 저장공정이 종료된 발효액은 맥주 여과설비 및 충전설비로, 맥아 알코올 음료를 여과하여, 술병에 충전을 한다.
3.맥아 알코올 음료의 분석
상기 2에서 수득된 맥아 알코올 음료의 분석을 아래와 같이 실시한다.
우선, EBC 표준법에 따라서 분석을 실시한 바, 지질 산화물 분석치 이외의 일반 분석치에 관해서는 LOX-F4와 LOX+F4 간에 명백한 차이는 확인되지 않는다(표2).
다음에 하기 방법에 따라 상기 2에서 수득된 맥아 알코올 음료의 거품 지속성에 관해서 분석을 실시한다.
거품 지속성 분석은 NIBEM법을 이용한다. Haffmans사의 FOAM STABILITY TESTER를 사용하여, 거품 지속성을 분석한 바(표 3), LOX-F4 보리는 LOX+F4 보리와 비교하여, NIBEM치가 21포인트 높으며 높은 거품 지속성을 갖는 것이 명백해진다.
또한, 실시예 5에 기재한 방법에 따라 THOD 농도를 측정한 결과, LOX-F4는 LOX+F4와 비교하여 절반 이하로 감소하고 있다(표 3).
이상의 결과로부터 본 발명의 맥아 알코올 음료 제조방법에 의해 제조되는 맥아 알코올 음료는 THOD의 축적을 억제할 수 있으며 제품의 거품 지속성을 개선할 수 있는 것이 명백해진다.
다음에 아래와 같이 13명의 패널에 의한 관능검사를 실시하여, 상기 2에서 수득된 맥아 알코올 음료의 향미 내구성을 비교한다.
우선, LOX-F4 및 LOX+F4의 맥아 알코올 음료를 37℃에서 1주 동안 보존한다. 다음에 이것을 통상적인 음용 온도에서 컵에 주입한 것을 패널의 관능검사에 제공하며, 노화 냄새, 종합 노화도(노화 냄새, 노화미를 가미하여 평가)의 2항목에 관해서 0 내지 4까지의 평점(노화가 진행될수록 평점이 높다)으로 평가한다(표 4A, B).
그 결과, 노화 냄새에 관해서는 13명중 10명이 LOX-F4의 쪽에 낮은 평점을 주고 있으며 LOX-F4는 LOX+F4와 비교하여, 낮은 평점(평균치)를 나타낸다. 이의 차이는 t검정에 의해 5%의 위험율로 유의적이라고 판정된다(표 4A).
또한, 종합 노화도에 관해서는 13명중 11명이 LOX-F4의 쪽에 낮은 평점을 주고 있으며 LOX-F4는 LOX+F4와 비교하여, 낮은 평점(평균치)를 나타내며, 이의 차이는 t 검정에 의해 5%의 위험율로 유의적이라고 판정된다(표 4B).
이상의 관능검사와 통계분석에 의해 LOX-F4는 LOX+F4와 비교하여, 노화 냄새가 감소되며 낮은 종합 노화도를 갖는 것이 명백해진다.
또한 37℃, 1주간 보존 전후에 상기 2에서 수득한 맥아 알코올 음료의 트랜스-2-노네날 농도를 측정한 결과, LOX-F4는 보존전이라도 트랜스-2-노네날 농도가 LOX+F4와 비교하여 감소하며 보존후에는 LOX+F4의 약 1/3로 억제할 수 있는 것이 명백해진다(표 5).
이상, 관능검사의 결과와 맥아 알코올 음료중의 트랜스-2-노네날 농도의 해석 결과로부터 본 발명의 맥아 알코올 음료의 제조방법에 따라 맥아 알코올 음료를 제조하면, 향미 내구성이 개선된 맥아 알코올 음료가 수득되는 것이 명백해진다.
최후에 상기 2에서 수득된 맥아 알코올 음료의 진한 맛과 시원한 맛에 관해서 관능검사와 지질막 센서에 의해 해석을 한다.
우선, 13명의 패널에 의한 관능검사를 실시하여 향미 품질을 비교한다. LOX-F4 및 LOX+F4의 맥아 알코올 음료를 관능검사에 제공하며, 진한 맛와 시원한 맛의 2항목에 관해서 0 내지 4까지의 평점(진한 맛이 강하거나 시원한 맛이 양호할수록 평점이 높다)으로 평가를 실시한다(표 6).
진한 맛에게 관해서는 LOX-F4와 LOX+F4 간에 유의차(5%의 위험율)는 볼 수 없다(표 6A).
시원한 맛에 관해서는 13명중 8명이 LOX-F4쪽에 높은 평점을 주었다(표 6B). 또한, LOX-F4는 LOX+F4와 비교하여 높은 평점(평균치)를 나타내며, 이의 차이는 t 검정에 의해 5%의 위험율로 유의적이라고 판정된다.
이상의 결과로부터 LOX-F4를 사용하여 맥아 알코올 음료를 양조하면 진한 맛에 영향을 주지 않고 시원한 맛을 개선할 수 있는 것이 명백해진다.
또한 가네다 등의 방법에 의해(Kaneda, H. et al., J. Biosci. Bioeng., 92, 221-226, 2001.), 지질막 센서를 사용하여 제품의 진한 맛과 시원한 맛을 평가한다(표 7).
진한 맛은 지질막에서의 흡착성에 따라 평가되고 그 결과, LOX-F4와 LOX+F4의 흡착성 간에 통계적 유의차(위험율 5% 수준)가 확인되지 않는다(표 7A).
한편, 시원한 맛은 지질막에서의 잔존성에 의해 평가되지만(시원한 맛이 감소될수록 높은 잔존성을 나타낸다), LOX-F4는 LOX+F4와 비교하여 약 1/4의 잔존성을 나타내며, 위험율 1% 수준에서의 유의차가 확인된다(표 7B).
(단위: Hz. 위험율 5% 수준에서의 유의차는 확인되지 않음)
(단위: Hz. 위험율 5% 수준에서의 유의차는 확인되지 않음)
지금까지, 맥아 LOX-1 활성과 숙성공정에서 THOD 생성량에는 상관이 보이지 않으며(Kobayash, N. et al.,(2000). J. Biosci. Bioeng. 90: 69-73.), 맥아 LOX-1의 억제에 의해 어느 정도 THOD 생성이 억제되는가는 불명확하다. 또한, 억제된 결과, 과연 시원한 맛을 개선할 수 있을까는 종래 기술에서는 예상할 수 없었다. 그러나 본 실시예의 관능검사 결과와 지질막 센서를 이용한 제품의 진한 맛와 시원한 맛의 해석 결과에서 본 청구 유전자를 이용한 맥아를 이용하면, 제품의 진한 맛에 영향을 주지 않고 제품의 시원한 맛을 개선하는 것이 처음으로 실증되었다.
실시예 7(보리 가공물을 사용하는 맥아 알코올 음료 시험 양조)
1.냉맥즙의 제조와 분석
실시예 3에서 수득된 계통의 후대인 LOX-F5 및 LOX+F5의 보리 가공물을 부원료로서 사용하고 50L 스케일 투입설비에 의해 발포주 사양(맥아 사용율 24%, 보리 가공물 사용율 76%)에서의 투입을 실시한다. 투입조건은 하기와 같다.
시판하는 맥주 양조용 맥아 1.2kg과, 각각의 보리 가공물 3.8kg을 20L의 투입용수에 의해 50℃, 30분→ 65℃, 60분→ 75℃, 3분의 다이아그램에 따라 투입(보리 가공물 사용비율이 높으므로 투입시에는 α아밀라제, β글루카나제 등의 효소제를 병용한다), 로이터 설비에 의해 맥즙 여과를 실시하며, 최종적으로 40L의 여과 맥즙을 수득한다.
수득된 여과 맥즙은 호프 펠렛[쓴 맛 분석치 25.6BU(EBC)] 53g을 첨가하여 80분 동안 끓여서 10℃까지 냉각하고, 가수에 의한 추출물 조정에 의해 추출물 함량 7.5 내지 7.6%의 냉맥즙으로 한다.
수득된 냉맥즙의 분석은 EBC 표준법에 따라서 실시한다. 분석치를 표 8에 기재한다. 표 8에 기재한 바와 같이 일반적인 분석 항목에 관해서는 LOX-F5와 LOX+F5 간에 명백한 차이는 확인되지 않는다.
2.맥아 알코올 음료(발포주)의 제조
상기 1에서 수득된 냉맥즙을 증기 살균한 30L 스케일의 실린드로코니컬형 탱크에 옮기고 초기 농도 세포수 3000만개/mL로 되도록 효모를 첨가하여, 15℃에서 주발효를 실시한다. 발효액의 추출물이 1.3%까지 마감된 단계에서 동형의 탱크로 옮겨 바꾸며 술 저장공정을 실시한다. 술 저장공정은 최초의 5일 동안은 13℃에서, 다음의 2주간은 0℃에서 실시한다.
술 저장공정이 종료된 발효액은 맥주 여과설비 및 충전설비로, 맥아 알코올 음료를 여과하여, 병에 충전한다.
3.맥아 알코올 음료의 분석
상기 2에서 수득된 맥아 알코올 음료의 분석을 아래와 같이 실시한다.
우선, EBC 표준법에 따라 분석을 실시한 바, 지질 산화물 분석치 이외의 일반 분석치에 관해서는 LOX-F5와 LOX+F5 간에 명백한 차이는 확인되지 않는다(표 9).
다음에 하기 방법에 따라 상기 2에서 수득된 맥아 알코올 음료의 거품 지속성에 관해서 분석을 한다.
거품 지속성 분석은 NIBEM법을 이용한다. Haffmans사의 FOAM STABILITY TESTER를 사용하여, 거품 지속성을 분석한 바(표 10), LOX-F5 보리는 LOX+F5 보리와 비교하여, NIBEM치가 17포인트 높으며 높은 거품 지속성을 갖는 것이 명백해진다.
또한, 실시예 5에 기재한 방법에 따라 맥아 알코올 음료 중의 THOD 농도를 측정한 결과, LOX-F5는 LOX+F5와 비교하여 절반 이하로 감소하고 있다.
이상의 결과로부터 본 발명의 맥아 알코올 음료 제조방법에 따라 제조되는 맥아 알코올 음료는 THOD의 축적을 억제할 수 있으며 제품의 거품 지속성을 개선할 수 있던 것이 명백해진다.
※ THOD의 값은 내부 표준물질의 피크 면적을 100으로 한 상대치
다음에 아래와 같이 13명의 패널에 의한 관능검사를 실시하여, 상기 2에서 수득된 맥아 알코올 음료의 향미 내구성을 비교한다. 관능검사의 구체적인 방법은 실시예 6에 기재된 방법과 동일하다.
그 결과, 노화 냄새에 관해서는 13명중 11명이 LOX-F5의 쪽에 낮은 평점을 주고 있으며 LOX-F5는 LOX+F5와 비교하여, 낮은 평점(평균치)를 나타낸다. 이의 차이는 t검정에 의해 5%의 유의 수준에서 유의적이라고 판정된다(표 11A).
또한, 종합 노화도에 관해서는 13명중 12명이 LOX-F5의 쪽에 낮은 평점을 주고 있으며 LOX-F5는 LOX+F5와 비교하여, 낮은 평점(평균치)를 나타내며, 이의 차이는 t 검정에 의해 5%의 유의 수준으로 유의적이라고 판정된다(표 11B).
이상의 관능검사와 통계분석에 의해 LOX-F5는 LOX+F5와 비교하여, 노화 냄새가 감소되며 낮은 종합 노화도를 갖는 것이 명백해진다.
또한 37℃, 1주간 보존 전후에 상기 2에서 수득한 맥아 알코올 음료의 트랜스-2-노네날 농도를 측정한 결과, LOX-F5는 보존전의 트랜스-2-노네날 농도는 LOX+F5와 동등하지만, 보존후에는 LOX+F5의 약 1/2정도로 억제할 수 있는 것이 명백해진다(표 12).
실시예 8(맥아 알코올 음료 시험 양조)
1.냉맥즙의 제조와 분석
실시예 4와 동일한 방법으로 수득된 LOX-F4 보리 및 LOX+F4 보리의 두가지에서 제조한 맥아를 사용하고 50L 스케일 투입설비에 의해 맥아를 원료로 하여 사용하는 맥주 사양(맥아 사용율 71%)에서의 투입을 실시한다. 투입조건은 하기와 같다.
상기한 시험 맥아 5.0kg과, 합계 2.0kg의 부원료(옥수수 전분, 콘 그릿츠, 분쇄 쌀)를 23L의 투입용수에 의해 50℃, 20분→ 65℃, 40분→ 75℃, 3분의 다이아그램에 따라 투입하고 로이터 설비에 의해 맥즙 여과를 실시하며, 최종적으로 40L의 여과 맥즙을 수득한다.
수득된 여과 맥즙은 호프 펠렛[쓴 맛 분석치 44.9BU(EBC)] 40g을 첨가하여 90분 동안 끓여서 10℃까지 냉각하고, 가수에 의한 추출물 조정에 의해 추출물 함량 10.8 내지 11.1%의 냉맥즙으로 한다.
수득된 냉맥즙의 분석은 EBC 표준법에 따라서 실시한다. 분석치를 표 13에 기재한다. 표13에 기재한 바와 같이 일반적인 분석 항목에 관해서는 LOX-F4와 LOX+F4 간에 명백한 차이는 확인되지 않는다.
2.맥아 알코올 음료(맥주)의 제조
상기 1에서 수득된 냉맥즙을 증기 살균한 30L 스케일의 실린드로코니컬형 탱크에 옮기고 초기 농도 세포수 1500만개/mL로 되도록 효모를 첨가하여, 10.5℃에서 주발효를 실시한다. 발효액의 추출물이 2.5%까지 마감된 단계에서 동형의 탱크로 옮겨 바꾸며 술 저장공정을 실시한다. 술 저장공정은 최초의 8일 동안은 8℃에서, 다음의 2주간은 0℃에서 실시한다.
술 저장공정이 종료된 발효액은 맥주 여과설비 및 충전설비로, 맥아 알코올 음료를 여과하여, 병에 충전한다.
3.맥아 알코올 음료의 분석
하기 방법에 따라 상기 2에서 수득된 맥아 알코올 음료의 거품 지속성에 관해서 분석을 한다. 거품 지속성 분석은 NIBEM법을 이용한다. Haffmans사의 FOAM STABILITY TESTER를 사용하여, 거품 지속성을 분석한 바(표 14), LOX-F4 보리는 LOX+F4 보리와 비교하여, NIBEM치가 30포인트 높으며 높은 거품 지속성을 갖는 것이 명백해진다.
또한, 실시예 5에 기재한 방법에 따라 맥아 알코올 음료 중의 THOD 농도를 측정한 결과, LOX-F4는 LOX+F4와 비교하여 절반 이하로 감소하고 있다.
이상의 결과로부터 본 발명의 맥아 알코올 음료 제조방법에 따라 제조되는 맥아 알코올 음료는 THOD의 축적을 억제할 수 있으며 제품의 거품 지속성을 개선할 수 있던 것이 명백해진다.
※ THOD의 값은 내부 표준물질의 피크 면적을 100으로 한 상대치
다음에 아래와 같이 13명의 패널에 의한 관능검사를 실시하여, 상기 2에서 수득된 맥아 알코올 음료의 향미 내구성을 비교한다. 관능검사의 구체적인 방법은 실시예 6에 기재된 방법과 동일하다.
그 결과, 노화 냄새에 관해서는 13명중 11명이 LOX-F4의 쪽에 낮은 평점을 주고 있으며 LOX-F5는 LOX+F4와 비교하여, 낮은 평점(평균치)를 나타낸다. 이의 차이는 t검정에 의해 5%의 유의 수준에서 유의적이라고 판정된다(표 15A).
또한, 종합 노화도에 관해서는 13명중 12명이 LOX-F4의 쪽에 낮은 평점을 주고 있으며 LOX-F4는 LOX+F4와 비교하여, 낮은 평점(평균치)를 나타내며, 이의 차이는 t 검정에 의해 5%의 유의 수준으로 유의적이라고 판정된다(표 15B).
이상의 관능검사와 통계분석에 의해 LOX-F5는 LOX+F5와 비교하여, 노화 냄새가 감소되며 낮은 종합 노화도를 갖는 것이 명백해진다.
이상, 관능검사의 결과와 맥아 알코올 음료중의 트랜스-2-노네날 농도의 해석 결과로부터 본 발명의 맥아 알코올 음료의 제조방법에 따라 맥아 알코올 음료를 제조하면, 향미 내구성이 개선된 맥아 알코올 음료가 수득되는 것이 명백해진다.
유전자를 조작하지 않고 향미 내구성이나 거품 지속성을 개선한 맥아 알코올 음료를 제조하기 위해 유용한 LOX-1 변이 유전자, LOX-1 결실 보리의 선별방법, 선별에 의해 수득된 보리에서 유래하는 맥아 알코올 음료용 원료 및 맥아 알코올 음료용 원료를 사용하는 맥아 알코올 음료의 제조방법을 제공할 수 있다.
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<160> 11
<170> KopatentIn 1.71
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<212> DNA
<213> Hordeum vulgare
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tacgttctcc acggtcgatg tgattcagtc agtcgatgca caacaactga tcgaaatatg 120
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<213> Artificial
<220>
<223> primer for LOX-1 with BamHI site
<400> 8
ggatccatgc tgctgggagg gctg 24
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer for LOX-1 with HindIII site
<400> 9
aagcttttag atggagatgc tgttg 25
<210> 10
<211> 2668
<212> DNA
<213> Hordeum vulgare
<400> 10
atgctgctgg gagggctgat cgacaccctc acgggggcga acaagagcgc ccggctcaag 60
ggcacggtgg tgctcatgcg caagaacgtg ctggacctca acgacttcgg cgccaccatc 120
atcgacggca tcggcgagtt cctcggcaag ggcgtcacct gccagcttat cagctccacc 180
gccgtcgacc aagacaacgg cggtcgcggg aaggtgggcg cggaggcgga gctggagcag 240
tgggtgacga gcctgccgtc gctgacgacg ggggagtcca agttcggcct caccttcgac 300
tgggaggtgg agaagctcgg ggtgccgggc gccatcgtcg tcaacaacta ccacagctcc 360
gagttcctgc ttaaaaccat caccctccac gacgtccccg gccgcagcgg caacctcacc 420
ttcgtcgcca actcatggat ctaccccgcc gccaactacc gatacagccg cgtcttcttc 480
gccaacgaca cgtacctgcc gagccagatg ccggcggcgc tgaagccgta ccgcgacgac 540
gagctccgga acctgcgtgg cgacgaccag cagggcccgt accaggagca cgaccgcatc 600
taccgctacg acgtctacaa cgacctcggc gagggccgcc ccatcctcgg cggcaactcc 660
gaccaccctt acccgcgccg cggccgcacg gagcgcaagc ccaacgccag cgacccgagc 720
ctggagagcc ggctgtcgct gctggagcag atctacgtgc cgcgggacga gaagttcggc 780
cacctcaaga cgtccgactt cctgggctac tccatcaagg ccatcacgca gggcatcctg 840
ccggccgtgc gcacctacgt ggacaccacc cccggcgagt tcgactcctt ccaggacatc 900
atcaacctct atgagggcgg catcaagctg cccaaggtgg ccgccctgga ggagctccgt 960
aagcagttcc cgctccagct catcaaggac ctcctccccg tcggcggcga ctccctgctt 1020
aagctccccg tgccccacat catccaggag aacaagcagg cgtggaggac cgacgaggag 1080
ttcgcacggg aggtgctcgc cggcgtcaac ccggtcatga tcacgcgtct cacggagttc 1140
ccgccaaaaa gtagtctgga ccctagcaag tttggtgacc acaccagcac catcacggcg 1200
gagcacatag agaagaacct cgagggcctc acggtgcagc aggcgctgga aagcaacagg 1260
ctgtacatcc ttgatcacca tgaccggttc atgccgttcc tgatcgacgt caacaacctg 1320
cccggcaact tcatctacgc cacgaggacc ctcttcttcc tgcgcggcga cggcaggctc 1380
acgccgctcg ccatcgagct gagcgagccc atcatccagg gcggccttac cacggccaag 1440
agcaaggttt acacgccggt gcccagcggc tccgtcgaag gctgggtgtg ggagctcgcc 1500
aaggcctacg tcgccgtcaa tgactccggg tggcaccagc tcgtcagcca ctgatacgtt 1560
ctccacggtc gatgtgattc agtcagtcga tgcacaacaa ctgatcgaaa tatgattgat 1620
tgaaacgcgc aggctgaaca ctcacgcggt gatggagccg ttcgtgatct cgacgaaccg 1680
gcaccttagc gtgacgcacc cggtgcacaa gctgctgagc ccgcactacc gcgacaccat 1740
gaccatcaac gcgctggcgc ggcagacgct catcaacgcc ggcggcatct tcgagatgac 1800
ggtgttcccg ggcaagttcg cgttggggat gtcggccgtg gtgtacaagg actggaagtt 1860
caccgagcag ggactgccgg acgatctcat caagaggggc atggcggtgg aggacccgtc 1920
gagcccgtac aaggtgcggt tgctggtgtc ggactacccg tacgcggcgg acgggctggc 1980
gatctggcac gccattgagc agtacgtgag cgagtacctg gccatctact acccgaacga 2040
cggcgtgctg cagggcgata cggaggtgca ggcgtggtgg aaggagacgc gcgaggtcgg 2100
gcacggcgac ctcaaggacg ccccatggtg gcccaagatg caaagtgtgc cggagctggc 2160
caaggcgtgc accaccatca tctggatcgg gtcggcgctg catgcggcag tcaacttcgg 2220
gcagtacccc tacgcggggt tcctcccgaa ccggccgacg gtgagccggc gccgcatgcc 2280
ggagcccggc acggaggagt acgcggagct ggagcgcgac ccggagcggg ccttcatcca 2340
caccatcacg agccagatcc agaccatcat cggcgtgtcg ctgctggagg tgctgtcgaa 2400
gcactcctcc gacgagctgt acctcgggca gcgggacacg ccggagtgga cctcggaccc 2460
aaaggccctg gaggtgttca agcggttcag cgaccggctg gtggagatcg agagcaaggt 2520
ggtgggcatg aaccatgacc cggagctcaa gaaccgcaac ggcccggcta agtttcccta 2580
catgctgctc taccccaaca cctccgacca caagggcgcc gctgccgggc ttaccgccaa 2640
gggcatcccc aacagcatct ccatctaa 2668
<210> 11
<211> 4393
<212> DNA
<213> Hordeum vulgare
<400> 11
cacgtcgccg tccgatccat ctctccaaag ccgagcgcca caccaccggg accggacccg 60
gaccggccta taaattgccc ggaccgagct gcaagcagct cctcacacac actcacgcaa 120
cacacatcca tcttcactga aaagtgaaaa acagtgtgct ggtgccattg gttggagcag 180
tgaaagcgag gagaggaggc caagaacaag atgctgctgg gagggctgat cgacaccctc 240
acgggggcga acaagagcgc ccggctcaag ggcacggtgg tgctcatgcg caagaacgtg 300
ctggacctca acgacttcgg cgccaccatc atcgacggca tcggcgagtt cctcggcaag 360
ggcgtcacct gccagcttat cagctccacc gccgtcgacc aaggtaatca ctaccctcct 420
ccggccttct cctctgttta caagatatag tatttctttc gtgtgggccg gcggccatgg 480
atggatggat gtgtctggat cggctaaaga agataggata gctagccctg gccggtcgtc 540
tttacctgag catgggcata tgccatcgaa aaaagagaca acagcatgca tgcatggtgc 600
gcgcaccaga ccacgcagag caccggatgc tcgagacaaa gcaacacaac aagcaaggac 660
gacacgtcaa aagcaacaca acaagcaagg acggcacgtc aaaagcaaca caaacctaaa 720
ctaaagcaca aagacgtaag agcaagcaca caatcagcag gctataaaca gttgtcatca 780
aaaacaacgc tggaagagag agagaaggaa ggaagtagta gccatgaaaa attaaatcac 840
cgggcgttgc tctttgccca acaattaatc aagcagggta cgtggcatgt atagttcttg 900
taagtaaact aagcatgtga tatgagaagg tacgtggtgg tgcagacaac ggcggtcgcg 960
ggaaggtggg cgcggaggcg gagctggagc agtgggtgac gagcctgccg tcgctgacga 1020
cgggggagtc caagttcggc ctcaccttcg actgggaggt ggagaagctc ggggtgccgg 1080
gcgccatcgt cgtcaacaac taccacagct ccgagttcct gcttaaaacc atcaccctcc 1140
acgacgtccc cggccgcagc ggcaacctca ccttcgtcgc caactcatgg atctaccccg 1200
ccgccaacta ccgatacagc cgcgtcttct tcgccaacga cgtgcgtgga ttttcctcta 1260
ctttcctctc ctttcatttt caccgccttc gtcattcatg gtcgatcatt aagtcttgcc 1320
aggacaatag atgatgagct aggagtggtt accacttagc agtacgtaca ttatttattc 1380
cgtgttggta gaaaaggata tggtttggtg cagatcgaca caagattgaa tgaaagttgc 1440
accgtggcac cgtggcagcg tggtaggtga aaataactgt tgcacggatc cacccacatg 1500
attgttttca tgaataaact ttttaaggat gtgtctagcc acatctagat gcatgtcaca 1560
taattattgc ataccaaaac gattaaatta agcataaaaa gaaaaggaaa aaaatactca 1620
catatctcga cgtaagatca atgatatagt atttagatat gcaatattta tcttacatct 1680
aaacctttct tcattcctaa atataagaca tttgtaagat ttcactatgg acaacatacg 1740
aaacaaaatc agtggatctc tctatgcatt cattatgtag tctataataa aatctttaaa 1800
agatcgtata ttttgcaacg gagggagtaa aacataactt tttaatagta atgttgcacg 1860
gctccacact cgcagacgta cctgccgagc cagatgccgg cggcgctgaa gccgtaccgc 1920
gacgacgagc tccggaacct gcgtggcgac gaccagcagg gcccgtacca ggagcacgac 1980
cgcatctacc gctacgacgt ctacaacgac ctcggcgagg gccgccccat cctcggcggc 2040
aactccgacc acccttaccc gcgccgcggc cgcacggagc gcaagcccaa cgccagcgac 2100
ccgagcctgg agagccggct gtcgctgctg gagcagatct acgtgccgcg ggacgagaag 2160
ttcggccacc tcaagacgtc cgacttcctg ggctactcca tcaaggccat cacgcagggc 2220
atcctgccgg ccgtgcgcac ctacgtggac accacccccg gcgagttcga ctccttccag 2280
gacatcatca acctctatga gggcggcatc aagctgccca aggtggccgc cctggaggag 2340
ctccgtaagc agttcccgct ccagctcatc aaggacctcc tccccgtcgg cggcgactcc 2400
ctgcttaagc tccccgtgcc ccacatcatc caggagaaca agcaggcgtg gaggaccgac 2460
gaggagttcg cacgggaggt gctcgccggc gtcaacccgg tcatgatcac gcgtctcacg 2520
gtgagtcagc gattatttgt tcattgtgtg tgtatggtgt ccatggtgag aaagtgcaga 2580
tcttgatttg cgttgggtcg catgcacgca tgctgcatgc atgcaggagt tcccgccaaa 2640
aagtagtctg gaccctagca agtttggtga ccacaccagc accatcacgg cggagcacat 2700
agagaagaac ctcgagggcc tcacggtgca gcaggtaatt ggtccaagcc atcgacatca 2760
actatgattt acctaggagt aattggtagc tgtagataat ttggcttcgt tgcaattaat 2820
ttgatgctgg ccgatcaagt gatcgtattg ggtttgaaat ttgcaggcgc tggaaagcaa 2880
caggctgtac atccttgatc accatgaccg gttcatgccg ttcctgatcg acgtcaacaa 2940
cctgcccggc aacttcatct acgccacgag gaccctcttc ttcctgcgcg gcgacggcag 3000
gctcacgccg ctcgccatcg agctgagcga gcccatcatc cagggcggcc ttaccacggc 3060
caagagcaag gtttacacgc cggtgcccag cggctccgtc gaaggctggg tgtgggagct 3120
cgccaaggcc tacgtcgccg tcaatgactc cgggtggcac cagctcgtca gccactgata 3180
cgttctccac ggtcgatgtg attcagtcag tcgatgcaca acaactgatc gaaatatgat 3240
tgattgaaac gcgcaggctg aacactcacg cggtgatgga gccgttcgtg atctcgacga 3300
accggcacct tagcgtgacg cacccggtgc acaagctgct gagcccgcac taccgcgaca 3360
ccatgaccat caacgcgctg gcgcggcaga cgctcatcaa cgccggcggc atcttcgaga 3420
tgacggtgtt cccgggcaag ttcgcgttgg ggatgtcggc cgtggtgtac aaggactgga 3480
agttcaccga gcagggactg ccggacgatc tcatcaagag gtacgtacct ggtaaatgtt 3540
atgaatgtgt aaaacaaatt gggcgtctcg ctcactgaca ggaacgtggt aaaaaaaatg 3600
caggggcatg gcggtggagg acccgtcgag cccgtacaag gtgcggttgc tggtgtcgga 3660
ctacccgtac gcggcggacg ggctggcgat ctggcacgcc attgagcagt acgtgagcga 3720
gtacctggcc atctactacc cgaacgacgg cgtgctgcag ggcgatacgg aggtgcaggc 3780
gtggtggaag gagacgcgcg aggtcgggca cggcgacctc aaggacgccc catggtggcc 3840
caagatgcaa agtgtgccgg agctggccaa ggcgtgcacc accatcatct ggatcgggtc 3900
ggcgctgcat gcggcagtca acttcgggca gtacccctac gcggggttcc tcccgaaccg 3960
gccgacggtg agccggcgcc gcatgccgga gcccggcacg gaggagtacg cggagctgga 4020
gcgcgacccg gagcgggcct tcatccacac catcacgagc cagatccaga ccatcatcgg 4080
cgtgtcgctg ctggaggtgc tgtcgaagca ctcctccgac gagctgtacc tcgggcagcg 4140
ggacacgccg gagtggacct cggacccaaa ggccctggag gtgttcaagc ggttcagcga 4200
ccggctggtg gagatcgaga gcaaggtggt gggcatgaac catgacccgg agctcaagaa 4260
ccgcaacggc ccggctaagt ttccctacat gctgctctac cccaacacct ccgaccacaa 4320
gggcgccgct gccgggctta ccgccaaggg catccccaac agcatctcca tctaatttaa 4380
gccatcggca acc 4393
Claims (13)
- 보리 리폭시게나제-1 유전자 제5 인트론의 스플라이싱 공여 부위(5'-GT-3')의 구아닌이 다른 염기로 변이되어 있는 것을 특징으로 하는 보리 리폭시게나제-1 변이 유전자.
- 제1항에 있어서, 다른 염기가 아데닌인 것을 특징으로 하는 보리 리폭시게나제-1 변이 유전자.
- 보리 리폭시게나제-1 유전자 제5 인트론의 스플라이싱 공여 부위의 구아닌이 다른 염기로 변이되어 있는지 여부에 의해 보리 리폭시게나제-1 결실 보리를 판별하는 것을 특징으로 하는 보리 리폭시게나제-1 결실 보리의 선별방법.
- 제3항에 있어서, 다른 염기가 아데닌인 것을 특징으로 하는 보리 리폭시게나제-1 결실 보리의 선별방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 피검 대상인 보리로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출공정,추출한 게놈 DNA에서 보리 리폭시게나제-1 유전자 제5 인트론의 스플라이싱 공여 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시키는 DNA 단편 증폭공정 및DNA 단편 증폭공정에서 증폭된 보리 리폭시게나제-1 유전자 제5 인트론의 스플라이싱 공여 부위를 포함하는 DNA 단편을 제한효소로 절단하여 소정의 염기수의 DNA 단편을 검출하고, 스플라이싱 공여 부위의 구아닌이 다른 염기로 변이되어 있는지 여부에 의해 보리 리폭시게나제-1 결실 보리를 판별하는 DNA 단편 검출공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 보리 리폭시게나제-1 결실 보리의 선별방법.
- 제5항에 있어서, DNA 단편 검출공정에서 사용하는 제한효소가 염기서열 5'-GTAC-3'를 인식하는 AfaI 및/또는 RsaI인 것을 특징으로 하는 보리 리폭시게나제-1 결실 보리의 선별방법.
- 제1항에 기재된 보리 리폭시게나제-1 변이 유전자를 가진 보리에서 유래하는 종자, 맥아, 맥아 추출물, 보리 분해물 또는 보리 가공물인 것을 특징으로 하는 맥아 알코올 음료용 원료.
- 제3항에 기재된 선별방법에 따라 선별된 보리에서 유래하는 종자, 맥아, 맥아 추출물, 보리 분해물 또는 보리 가공물인 것을 특징으로 하는 맥아 알코올 음료용 원료.
- 제7항 또는 제8항에 기재된 맥아 알코올 음료용 원료를 사용하는 것을 특징으로 하는 맥아 알코올 음료의 제조방법.
- 서열번호 10의 1 내지 1554번째의 염기의 염기서열로 이루어진 핵산.
- 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 핵산.
- 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 핵산에서 3178번째의 염기를 포함하는 10 내지 60개의 연속된 염기서열로 이루어진 핵산.
- 보리 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하는 공정 및서열번호 11의 염기서열의 3178번째의 염기를 검출하고 이의 염기의 존재를 당해 보리의 리폭시게나제-1 활성의 부재의 지표로 하는 공정을 포함하는, 보리에서 리폭시게나제-1 활성의 부재를 검출하는 방법.
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