JP4101757B2 - 大麦品種の選抜方法、大麦β−アミラーゼ遺伝子及び麦芽アルコール飲料の製造方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、発酵性の高い大麦品種の選抜方法及び当該大麦を用いた麦芽アルコール飲料の製造方法に関する。
背景技術
従来、大麦の育種は伝統的な交配技術を用いて行われてきた。すなわち、異なる遺伝子型を有する個体同士を交配し、得られた後代系統について農業特性、環境適応性、耐病性等の栽培特性に基づいて望ましい系統を選抜し、選抜された系統について育成することにより遺伝的に固定した大麦を得るというものである。この過程には、通常５〜６年もの期間を要する上、その後に、前記の遺伝的に固定された大麦からさらに醸造特性に優れた大麦品種のみを選抜する必要があり、麦芽アルコール飲料に好適な大麦を選抜するには膨大な時間を費やす必要があった。
また、このような大麦の育種は、育種家がその経験に基づいて行う必要があり、優れた醸造特性を有すると考えられる大麦を選抜するには経験豊富な育種家の主観的な判断で育種を行う必要があった。
一方、ビール、発泡酒（ｌｏｗ−ｍａｌｔ ｂｅｅｒ）等の麦芽アルコール飲料の原料として用いられている大麦はα−アミラーゼやβ−アミラーゼ等の糖化酵素類を含有しており、製麦や糖化の際には、これらの糖化酵素類の作用によって大麦種子中の炭水化物が低分子糖類に分解される。
このようなアミラーゼの性質と大麦品種間との相関関係について、ＷＯ９９／００５１５号公報において、本発明者らは、大麦麦芽中の炭水化物のうち発酵に利用される部分の比率である外観最終発酵度はβ−アミラーゼの熱安定性が高いものほど優れることを報告している。しかしながら、４種類に分類される様々な大麦品種のβ−アミラーゼ熱安定性は、最も熱安定性の優れるものであっても５７．５℃で３０分間の熱処理によって４５〜５０％の残存活性を示すにとどまり、栽培大麦においてはそれを上回る熱安定性品種は見出されなかった。
一方、Ｅｇｌｉｎｔｏｎら（Ｅｇｌｉｎｔｏｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｐ．Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ ａｎｄ Ｄ．Ｅ．Ｅｖａｎｓ（１９９８）Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ａｌｌｅｌｅｓ ｏｆ ｂａｒｌｅｙ ｂｅｔａ−ａｍｙｌａｓｅ．Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８：３０１−３０９）は野生大麦（Ｈ．Ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）にβ−アミラーゼ熱安定性の高い系統を見出したが、野生種であることから育種利用に困難が伴うものであった。
発明の開示
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、麦芽アルコール飲料製造上の糖化効率を高めるべく、熱安定性の高いβ−アミラーゼを有する大麦品種を選抜する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、熱安定性の高いβ−アミラーゼを有する在来種大麦を見出すとともに、当該β−アミラーゼの構造遺伝子が新規遺伝子であることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の大麦品種の選抜方法は、
前記大麦の種子から抽出した粗酵素液を熱処理する熱処理工程と、
前記熱処理された粗酵素液中のβ−アミラーゼの酵素活性を測定する活性測定工程と、
前記活性測定の結果、残存活性が８５〜９０％であるβ−アミラーゼを含有する大麦品種を選択する選択工程と、
を含むことを特徴とする。
ここで、前記熱処理工程において、前記粗酵素液を、５５℃〜５８℃の範囲内の所定温度で１０分〜６０分の範囲内の所定時間熱処理することが好ましく、特に好ましくは前記粗酵素液を５７．５℃で３０分間熱処理することである。
また、本発明の大麦品種の選抜方法は、
前記大麦から抽出したゲノムＤＮＡからβ−アミラーゼ構造遺伝子領域を増幅する遺伝子増幅工程と、
前記遺伝子増幅工程で増幅されたβ−アミラーゼ構造遺伝子を制限酵素で切断して、所定の塩基数の遺伝子断片を検出する遺伝子検出工程と、
前記遺伝子検出工程で検出された遺伝子断片の塩基数に基づいて所定の大麦品種を選択する選択工程と、
を含むことを特徴とする。
ここで、前記遺伝子増幅工程において、増幅する遺伝子領域が大麦β−アミラーゼ遺伝子第２エクソンを含む遺伝子領域であり、前記遺伝子検出工程において、前記制限酵素がＭｓｐＩであることが好ましい。このような条件で遺伝子の検出を行った場合、本発明の新規β−アミラーゼが検出された場合には、検出される遺伝子断片は５３ｂｐの断片を含む一方、既知β−アミラーゼ遺伝子が検出された場合には５３ｂｐより大きなサイズの遺伝子断片が検出される。
さらに、本発明の大麦β−アミラーゼ遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の核酸配列を含むことを特徴とする。ここで、本発明の大麦β−アミラーゼ遺伝子は、前記核酸配列の一部からなるものであってもよい。
また、本発明の麦芽アルコール飲料の製造方法は、
前記の大麦品種の選抜方法によって選抜された大麦を製麦して麦芽を得る製麦工程と、
前記麦芽を糖化させて麦汁を得る仕込み工程と、
前記麦汁に酵母を添加して前記麦汁を発酵させ、麦芽アルコール飲料を得る発酵工程と、
を含むことを特徴とする。
このような製造方法により、糖化工程中の澱粉分解効率を高め、発酵性低分子糖を多く生成することが可能となる。その結果、製造上の発酵効率を高めることが可能となるとともに、仕込み工程の糖化温度を上げることが可能となり、工程時間の短縮やプロテアーゼ類等の働きを抑制しつつ麦芽アルコール飲料の製造を行うことが可能となる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本発明の大麦品種の選抜方法は、
前記大麦の種子から抽出した粗酵素液を熱処理する熱処理工程と、
前記熱処理された粗酵素液中のβ−アミラーゼの酵素活性を測定する活性測定工程と、
前記活性測定の結果、残存活性が８５〜９０％であるβ−アミラーゼを含有する大麦品種を選択する選択工程と、
を含むことを特徴とする。
先ず、本発明にかかる熱処理工程について説明する。
本発明にかかる熱処理工程は、選抜の対象となる大麦（以下、被験大麦という）の種子から抽出した粗酵素液を熱処理する工程である。
本発明にかかる被験大麦の種子としては、その生育ステージは特に制限されないが、好ましくは大麦完熟種子を用いる。ここで、用いる大麦の組織は特に制限はないが、具体的には、例えば、胚乳組織を用いることができる。胚乳組織を用いることにより、一粒種子の胚を含む部分を発芽生育させ、胚乳部分でβ−アミラーゼの形質を選抜することにより、戻し交配世代途中の個体選抜にも利用することが可能となる。
また、粗酵素液の抽出方法としては、β−アミラーゼの活性を阻害しない方法であれば特に制限はないが、例えば、１０ｍＭのジチオスレイトールを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて抽出した抽出溶液を遠心分離し、上清を粗酵素液とすればよい。
本発明にかかる熱処理工程においては、前記粗酵素液を、５５℃〜５８℃の範囲内の所定温度で１０分〜６０分の範囲内の所定時間熱処理することが好ましく、特に好ましくは前記粗酵素液を５７．５℃で３０分間熱処理することであるが、この温度及び時間の条件に限定されず、他の条件下で行ってもよい。
次に、本発明にかかる活性測定工程について説明する。
本発明にかかる活性測定工程は、前記熱処理された粗酵素液中のβ−アミラーゼの酵素活性を測定する工程である。
熱処理工程で熱処理された粗酵素液中に含まれるβ−アミラーゼの活性測定の方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いて行うことができるが、具体的には、例えば、基質としてｐ−ニトロフェニルマルトペンタオサイドを用いた活性測定キットであるＢＥＴＡＭＹＬキット（メガザイム社製）を用いて行ってもよく、また、基質としてジクロロフェニルβ−マルトペンタサイド（小野薬品工業社製）を用い、この基質に３７℃で粗酵素液を反応させ、ジクロロフェノールの生成量を測定することによって行ってもよい。ここで、β−アミラーゼの活性測定の際に、対照として熱処理を行っていない大麦種子の粗酵素液についても活性測定を行っておく必要がある。
次に、本発明にかかる選択工程について説明する。
本発明にかかる選択工程は、前記活性測定の結果、残存活性が８５〜９０％であるβ−アミラーゼを含有する大麦品種を選択する工程である。
すなわち、被験大麦と対照となる大麦とのそれぞれから抽出された粗酵素液におけるβ−アミラーゼの活性測定結果に基づいて被験大麦由来のβ−アミラーゼの残存活性を算出し、その結果、残存活性が８５〜９０％であると認められた大麦を選択する。
次に本発明の第２の大麦品種の選抜方法について説明する。
本発明の第２の大麦品種の選抜方法は、
前記大麦の種子から抽出したゲノムＤＮＡからβ−アミラーゼ構造遺伝子領域を増幅する遺伝子増幅工程と、
前記遺伝子増幅工程で増幅されたβ−アミラーゼ構造遺伝子を制限酵素で切断して、所定の塩基数の遺伝子断片を検出する遺伝子検出工程と、
前記遺伝子検出工程で検出された遺伝子断片の塩基数に基づいて所定の大麦品種を選択する選択工程と、
を含むことを特徴とする。
すなわち、種子発現β−アミラーゼ遺伝子（以下、β−アミラーゼ遺伝子）には既に塩基配列が知られている既知遺伝子が存在するが（配列表の配列番号２）、本発明者らによって当該β−アミラーゼ遺伝子と少なくとも１塩基以上異なる新規β−アミラーゼ遺伝子が見出された（配列表の配列番号１）。なお、配列番号１の核酸は、新規β−アミラーゼ遺伝子の第２エクソンの塩基配列を示し、また、配列番号２に記載の塩基配列を有する既知β−アミラーゼ遺伝子において２９０〜６８８番目の塩基が第２エクソンを示す。
また、この新規β−アミラーゼ遺伝子領域型とβ−アミラーゼ熱安定性が一致することが本発明者らによって見出されている。従って、本発明の大麦品種の選抜方法によって大麦から抽出されたβ−アミラーゼ遺伝子を解析することにより、熱安定性の高いβ−アミラーゼを有する大麦品種を選抜することが可能となる。具体的には、両者の塩基配列の相違によって生成又は消滅する制限酵素切断部位が存在することから、被験大麦から抽出されたβ−アミラーゼ遺伝子について当該制限酵素切断部位を認識又は切断する制限酵素で切断し、その切断パターンを比較することにより大麦品種を識別することが可能となる。
先ず、本発明にかかる遺伝子増幅工程について説明する。
本発明にかかる遺伝子増幅工程は、被験大麦の種子から抽出したゲノムＤＮＡからβ−アミラーゼ構造遺伝子領域を増幅する工程である。
被験大麦からゲノムＤＮＡを抽出する方法としては特に制限はなく、公知の方法によって行うことができるが、具体的には、例えば、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４３２１−４３２５）やＥｔｈｉｄｉｕｍ ｂｌｏｍｉｄｅ法（Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｐｒａｋａｓｈ １９９１，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：６−１２）によって抽出することができる。ここで、ゲノムＤＮＡを抽出する組織は大麦種子のみならず、葉、茎、根等を用いることも可能である。例えば、葉を用いることで、戻し交配世代途中の多数の個体選抜に利用することが可能となる。
また、本発明にかかる新規β−アミラーゼ遺伝子は本発明者らによって見出された新規遺伝子であり、既知β−アミラーゼ遺伝子と比較して配列表の配列番号２における大麦β−アミラーゼ遺伝子第２エクソンの２５番目の塩基ＡがＣに置換されていることが特徴である。この塩基の置換により、既知β−アミラーゼ遺伝子には存在しなかった制限酵素ＭｓｐＩの切断部位が生成され、その結果、前記遺伝子増幅産物をＭｓｐＩで切断した際の切断パターンが既知β−アミラーゼ遺伝子である場合と異なるため、識別可能となる。
当該β−アミラーゼ構造遺伝子を増幅する方法としては特に制限はないが、例えば、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）によって行うことができる。ここで、ＰＣＲ法において用いられるプライマーは、β−アミラーゼ遺伝子を増幅させることができる領域に設定されているものであればその塩基配列は特に制限されないが、具体的には、例えば、β−アミラーゼ遺伝子において塩基数が１０〜６０個の連続した塩基であることが好ましく、１５〜３０個の連続した塩基であることがより好ましい。また、一般的には、プライマーの塩基配列におけるＧＣ含量が４０〜６０％であることが好ましい。さらに、ＰＣＲ法に用いる二つのプライマーのプライマー間のＴｍ値に差がない又は少ないことが好ましい。また、プライマー内で２次構造を取らないことが好ましい。
また、本工程で増幅される領域は、本発明者らが見出したＣＡＰＳマーカーに関する領域であることが好ましい。具体的には、本発明にかかるβ−アミラーゼゲノム構造遺伝子の翻訳開始コドン１〜１２３２ｂｐの領域をＰＣＲ法で増幅後、制限酵素ＭｓｐＩで切断することにより８６６ｂｐ、３１３ｂｐ及び５３ｂｐの核酸断片が形成されることを特徴とするＣＡＰＳマーカーに関する領域が挙げられる。さらに、本発明にかかる遺伝子増幅工程において増幅される領城は、前記β−アミラーゼ遺伝子第２エクソンの２５番目の塩基を含む領域であれば前記翻訳開始コドン１〜１２３２ｂｐより狭い範囲であってもよく、例えば、前記β−アミラーゼ遺伝子第２エクソンであることが好ましい。
次に、本発明にかかる遺伝子検出工程について説明する。
本発明にかかる遺伝子検出工程は、前記遺伝子増幅工程で増幅されたβ−アミラーゼ構造遺伝子を制限酵素で切断して、所定の塩基数の遺伝子断片を検出する工程である。
本発明にかかる新規β−アミラーゼ遺伝子は、上述したように既知のβ−アミラーゼ遺伝子と塩基配列に相違が認められるため、当該相違部分を認識する又は切断する制限酵素を用いて増幅産物を切断すれば、得られる核酸断片のサイズに相違が見られる。本発明にかかる制限酵素としては、このように前記相違部分を認識する又は切断するものであれば特に制限はないが、既にこのような作用を有することが判明している制限酵素ＭｓｐＩであることが好ましい。
また、所定の塩基数の遺伝子断片とは、前記相違部分が存在することにより、増幅産物を制限酵素で切断して得られる核酸断片のサイズに相違が見られるような遺伝子断片であればその塩基数は特に制限されない。例えば、増幅される領域を前述のＣＡＰＳマーカーに関する領域とし、前記制限酵素にＭｓｐＩを用いた場合には、所定の塩基数は８６６ｂｐ、３１３ｂｐ及び５３ｂｐとなる。この場合、既知のβ−アミラーゼ遺伝子には、前述したように配列表の配列番号２における３１４番目の塩基はＡであるため、ＭｓｐＩでは切断されない。すなわち、図２に示すように、本発明にかかる新規β−アミラーゼ遺伝子であればＭｓｐＩ処理によって生成されるべき５３ｂｐの核酸断片が生成されず、３６６ｂｐ及び８６６ｂｐの２つの核酸断片が生成されるにすぎない。
また、本工程にかかる検出とは、制限酵素によって切断された核酸断片が検出可能な方法であれば特に制限はないが、具体的には、例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出すればよい。
次に、本発明にかかる選択工程について説明する。
本発明の選択工程は、前記遺伝子検出工程で検出された遺伝子断片の塩基数に基づいて所定の大麦品種を選択する工程である。
本工程では、前記遺伝子検出工程で検出された核酸断片の塩基数を比較し、目的とする塩基数の核酸断片が見出された大麦品種を選択すればよい。
次に、本発明の大麦β−アミラーゼ遺伝子について説明する。
本発明の大麦β−アミラーゼ遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基数１２３２ｂｐの核酸を含む。当該遺伝子は、高い熱安定性を有するβ−アミラーゼをコードするゲノムＤＮＡであり、この塩基配列の一部からなる核酸も本発明に包含される。
なお、前記本発明の大麦β−アミラーゼ遺伝子の一部からなる核酸は、以下の条件を満たすものであることが好ましい。すなわち、既知のβ−アミラーゼ遺伝子（はるな二条）開始コドンから数えて２９１ｂｐのＡがＣに、２４１０ｂｐのＡがＴに、３２１６ｂｐのＧがＴに、３４３８ｂｐのＣがＴに、３４９３ｂｐのＣがＴに、３５９８ｂｐのＣがＧに、３６９６ｂｐのＣがＴにそれぞれ置換されているものが好ましい。
最後に、本発明の麦芽アルコール飲料の製造方法について説明する。
本発明の麦芽アルコール飲料の製造方法は、
上記の大麦品種の選抜方法によって選抜された大麦を製麦して麦芽を得る製麦工程と、
前記麦芽を糖化させて麦汁を得る仕込み工程と、
前記麦汁に酵母を添加して前記麦汁を発酵させ、麦芽アルコール飲料を得る発酵工程と、
を含むことを特徴とする。
本発明にかかる麦芽アルコール飲料は、その製造に用いられる麦芽の使用比率の多少は特に制限されず、麦芽を原料として製造されるアルコール飲料であればよい。具体的には、例えばビールや発泡酒（麦芽使用比率２５％未満の麦芽アルコール飲料）が挙げられる。
先ず、本発明にかかる製麦工程について説明する。
本発明にかかる製麦工程は、上記の大麦品種の選抜方法によって選抜された大麦を製麦して麦芽を得る工程である。上記のように選抜された大麦を用いる以外は製麦の方法としては特に制限されず公知の方法で行えばよいが、具体的には、例えば、浸麦度が４０〜４５％に達するまで浸麦後、１０〜２０℃で３〜６日間発芽させ、焙燥して麦芽を得ることができる。
次に、本発明にかかる仕込み工程について説明する。
本発明にかかる仕込み工程は、前記麦芽を糖化させて麦汁を得る工程である。具体的には、さらに以下の第１〜第４の工程に分けられる。
すなわち、第１の工程は、麦芽を含む原料と仕込用水とを混合し、得られた混合物を加温することにより麦芽を糖化させ、前記糖化された麦芽から麦汁を採取する仕込工程である。
本工程において用いられる麦芽は、大麦に水分と空気を与えて発芽させ、乾燥して幼根を取り除いたものであることが好ましい。麦芽は麦汁製造に必要な酵素源であると同時に糖化の原料として主要なデンプン源となる。また、麦芽アルコール飲料特有の香味と色素を与えるため、発芽させた麦芽を焙燥したものを麦汁製造に用いる。さらに、原料として麦芽以外にホップ、コーンスターチ、コーングリッツ、米、糖類等の副原料を添加してもよい。
また、前記麦汁の製造工程において、市販または別途調製されたモルトエキスを仕込用水と混合し、必要に応じて前記副原料を添加し麦汁を得ることもできる。
前記麦芽は仕込用水に添加した後、混合される。前記副原料を添加する場合には、ここで同時に混合すればよい。また、前記仕込用水は特に制限されず、製造する麦芽アルコール飲料に応じて好適な水を用いればよい。糖化は基本的に既知の条件で行えばよいが、例えば、前記混合された麦芽と仕込用水とを６５〜７５℃に加温して行うことが好ましく、これによって麦芽中のアミラーゼによる糖化が進行する。こうして得られた麦芽糖化液をろ過することにより麦汁が得られる。
また、第２の工程は、前記麦汁に酵母を添加して発酵させ麦芽アルコール飲料中間品を得る発酵工程である。
ここで用いられる酵母は、前記麦芽の糖化によって得られた麦汁内の糖分を代謝してアルコールや炭酸ガス等を産生するいわゆるアルコール発酵を行う酒類酵母であればいずれでもよく、具体的には、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ウバルム等が挙げられる。
発酵は、上記仕込工程で得られた麦汁を冷却し、ここに前記の酵母を添加して行う。発酵条件については基本的には既知の条件と変わらず、例えば発酵温度が通常１５℃以下、好ましくは８〜１０℃であり、発酵時間が好ましくは８〜１０日である。
さらに、第３の工程は、前記発酵工程で得られた麦芽アルコール飲料中間品を貯蔵する貯酒工程である。
本工程では、アルコール発酵が終了した発酵液が密閉タンクに移され、貯蔵される。貯蔵条件については基本的に既知の条件と変わらず、例えば貯蔵温度は０〜２℃が好ましく、貯蔵時間が３０〜９０日間であることが好ましい。発酵終了液を貯蔵することにより残存エキスの再発酵と熟成が行われる。
また、第４の工程は、前記貯酒工程で得られた麦芽アルコール飲料中間品をろ過し麦芽アルコール飲料を得るろ過工程である。
ろ過条件については基本的には既知の条件と変わらず、例えばろ過助材として珪藻土、ＰＶＰＰ（ポリビニルポリピロリドン）、シリカゲル、セルロースパウダー等が用いられ、温度は０±１℃で行われる。こうして麦芽アルコール飲料（例えばビールまたは発泡酒）が得られる。ろ過された麦芽アルコール飲料はそのまま、または無菌ろ過や加熱処理を行った後、タンク詰め、たる詰め、ビン詰めまたは缶詰めされ市場に出荷される。
このようにして選抜された大麦を用いて麦芽アルコール飲料の製造を行い、その発酵効率測定試験を行った結果、外観最終発酵度が向上することが判明した。ここで、外観最終発酵度とは、麦汁エキスのうち発酵で利用されるエキスの割合を百分率で表したものをいう。
従って、本発明の麦芽アルコール飲料の製造方法によって麦芽アルコール飲料を製造することにより、その仕込み工程において高い効率で発酵性糖を得ることが可能となり、その麦汁を用いて発酵を行うことにより、従来よりも高い効率で大麦中の炭水化物がアルコールに変換される。また、当該大麦品種を用いて麦芽アルコール飲料の製造を行うことにより、糖化工程中の澱粉分解効率を高め、発酵性低分子糖を多く生成することが可能となる。その結果、製造上の発酵効率を高めることが可能となるとともに、仕込み工程の糖化温度を上げることが可能となり、工程時間の短縮やプロテアーゼ類等の働きを抑制しつつ麦芽アルコール飲料の製造を行うことが可能となる。
さらに、本発明の大麦品種の選抜方法によって得られた大麦を他品種の大麦と交配することにより、熱安定性の高いβ−アミラーゼを含有する大麦を育種することが可能となる。この場合、育種方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いて行うことができる。
また、本発明の大麦β−アミラーゼ遺伝子を用いることにより、遺伝子組み換え技術を用いた熱安定性の高いβ−アミラーゼを含有する大麦の製造ができる可能性がある。本発明の大麦β−アミラーゼ遺伝子を大麦に導入する方法としては特に制限はなく、公知の方法により実施することができる。
［実施例］
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１
（高度熱安定性β−アミラーゼ形質の熱処理測定による選抜方法）
先ず、大麦種子より粗酵素液を抽出した。大麦完熟種子１粒をハンマーで粉砕し、４００μｌの１０ｍＭのジチオスレイトールを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて、４℃で１２時間１００ｒｐｍの往復振とうで抽出した。抽出液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を粗酵素液とした。
次に、β−アミラーゼの熱処理を行った。１％ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．１）で粗酵素液を１／１００倍に希釈し、その３０μｌを２００μｌサンプリングチューブに入れ５７．５℃の湯浴中で３０分間処理した。
次に、ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオサイド（ＢＥＴＡＭＹＬキット；メガザイム社製）を基質としてβ−アミラーゼ活性を測定した。熱処理区と無処理区の酵素液それぞれ１０μｌを２００μｌ容のサンプリングチューブに入れ、湯浴で４０℃に余熱後、メガザイム社キットの基質／酵素液１０μｌを添加し正確に５分間反応させた。この反応液に１％トリス液１５０μｌを添加して反応を停止させた。この反応液１００μｌをマルチプレートに移し、ＢＩＯ−ＲＡＤ社プレートリーダにてＡｂｓ４０５を測定した。処理区の値を無処理区の値で除し百分率で表した値が８５〜９０％であることでＣＳ１８８のβ−アミラーゼ酵素が種子中に存在することを確認した。
このように、大麦遺伝資源より選択したＣＳ１８８は、図１に示すように従来の大麦（はるな二条（Ａ型）、Ｒｏｂｕｓｔ（ＢＩＩ型）、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ（ＢＩ型）、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ（Ｃ型））の熱安定性を大きく上回る熱安定性のβ−アミラーゼを有することが判明した。ここで、前記Ａ型、Ｂ型、Ｃ型とは、大麦から抽出された粗酵素液を５７．５℃で３０分間の熱処理を行った際に、残存活性が３５％以上のものをＡ型、１０〜３５％のものをＢ型、１０％未満のものをＣ型と分類した。また、Ｂ型は大麦に含まれるβ−アミラーゼの等電点に基づいてさらに２種類に分類され、ｐＩ６．５のバンドを持つタイプをＢＩ、持たないタイプをＢＩＩと分類した。
実施例２
（高度熱安定性β−アミラーゼ形質のＤＮＡ多型選抜）
ＣＳ１８８から抽出したβ−アミラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡをダイターミネーター法により解読した。図２に示すように、翻訳開始コドンより２９１ｂｐの塩基が、既知β−アミラーゼ遺伝子の場合はＡであるのに対して、ＣＳ１８８から単離したβ−アミラーゼ遺伝子ではＣに変化しており、制限酵素ＭｓｐＩの認識部位である塩基配列ＣＣＧＧが形成されていることを確認した。
ＣＳ１８８と通常品種の芽生え緑葉よりＳＤＳ−プロパノール法にてゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとして５’−プライマー（５’−ＡＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＣＣＡＧＣＡＴＣＣＡＣＡＡＴＧＧＡＧＧ−３’：配列番号３）と３’−プライマー（５’−ＣＡＣＴＣＡＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＧＡＴＧＣＣＴＧＧＧＡ−３’：配列番号４）を各５０μＭ、ＤＮＡ１μｌを加え、プレミックスＥｘＴａｑを加えて５０μｌスケールでＰＣＲで増幅（９４℃×１分、５５℃×２分、７２℃×３分：３０サイクルした後７２℃×７分）を行なった。得られたＰＣＲ産物５μｌを制限酵素ＭｓｐＩで切断し３％Ｎｕｓｉｅｖｅ（宝酒造製）ゲルで電気泳動しバンド型を観察した。なお、上記ＰＣＲ法におけるアニリング条件は５０℃から６５℃とした。
通常の大麦から抽出したβ−アミラーゼ遺伝子では、５’末端から３６７ｂｐ付近のＭｓｐＩ制限酵素認識部位により８６６ｂｐと３６６ｂｐの２本のバンドが形成され、一方、ＣＳ１８８型β−アミラーゼ遺伝子はこの３６６ｂｐ付近のＭｓｐＩ制限酵素認識部位に加え３１３ｂｐ付近に特異的にＭｓｐＩ制限酵素認識部位を持つことから８６６ｂｐ、３１３ｂｐ、５３ｂｐの３本のバンドが形成された。従って、電気泳動像では、図３に示すように、３６７ｂｐと３１４ｂｐのバンド位置の違いによって高度熱安定性β−アミラーゼ形質を選抜することが出来た。なお、電気泳動に用いたマーカーは１００ｂｐラダーＤＮＡである。
次に、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ×ＣＳ１８８交配Ｆ２種子４８粒を胚を含む部分と含まない部分に半切し、胚を含まない部分からは実施例１の方法で熱安定性を調査した。ただし、熱処理温度は５８℃とした。また、胚を含む部分から発芽させた芽生えからＤＮＡを抽出し、β−アミラーゼ遺伝子型を調査した。
その結果、図４に示すように、４８個体全てにおいて、ＣＳ１８８遺伝子ホモ型はＣＳ１８８と同等程度の活性を示し、Ｓｃｈｏｏｎｅｒホモ型はＳｃｈｏｏｎｅｒと同様に活性を失い、Ｈｅｔｅｒｏ型はその中間の熱安定性を示した。従って、β−アミラーゼ構造遺伝子多型をβ−アミラーゼ熱安定性の選抜指標にできることが確認された。
実施例３
（麦芽アルコール飲料の製造方法）
高度熱安定性β−アミラーゼ大麦であることが確認されたＣＳ１８８と、対照品種としてβ−アミラーゼ熱安定性がＡ型であるＯＵＣ５７＋を浸麦度４２．５％に達するまで浸麦後、１５℃で６日間発芽させた後、焙燥し麦芽を得た。麦芽を粉砕後、図５に示すダイヤグラムの糖化工程で麦汁を製造した。
図５に示すように、糖化中のβ−アミラーゼ活性の失活程度は、ＣＳ１８８では温度の上昇する糖化の後期まで高い活性を有しており、効率的に糖化が進むことが予想された。
次に、得られた麦汁を用いてＥＢＣ標準法に従って小規模発酵試験を行ない、外観最終発酵度を測定した。その結果、ＣＳ１８８の外観最終発酵度は７７．８％と対照のＯＵＣ０５７＋の７７．０％と比較して高い外観最終発酵度であったことから、優れた発酵効率を達成することができると考えられた。
産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明の大麦品種の選抜方法、大麦β−アミラーゼ遺伝子及び麦芽アルコール飲料の製造方法によれば、麦芽アルコール飲料製造上の糖化効率を高めるべく、熱安定性の高いβ−アミラーゼを有する大麦品種を選抜する方法を提供することが可能となる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、各種の大麦系統の種子に含まれるβ−アミラーゼの熱失活曲線を示すグラフである。
図２は、既知種子発現β−アミラーゼ遺伝子部分の塩基配列と本発明の新規β−アミラーゼ遺伝子の塩基配列を示した図である。
図３は、各種の大麦のβ−アミラーゼ遺伝子のＣＡＰＳ多型を示す電気泳動写真である。
図４は、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ×ＣＳ１８８交配Ｆ２種子から抽出されたβ−アミラーゼの熱安定性を示すグラフである。
図５は、麦芽アルコール飲料の製造における糖化過程のダイアグラムとβ−アミラーゼの熱失活曲線を示すグラフである。
本発明は、発酵性の高い大麦品種の選抜方法及び当該大麦を用いた麦芽アルコール飲料の製造方法に関する。
背景技術
従来、大麦の育種は伝統的な交配技術を用いて行われてきた。すなわち、異なる遺伝子型を有する個体同士を交配し、得られた後代系統について農業特性、環境適応性、耐病性等の栽培特性に基づいて望ましい系統を選抜し、選抜された系統について育成することにより遺伝的に固定した大麦を得るというものである。この過程には、通常５〜６年もの期間を要する上、その後に、前記の遺伝的に固定された大麦からさらに醸造特性に優れた大麦品種のみを選抜する必要があり、麦芽アルコール飲料に好適な大麦を選抜するには膨大な時間を費やす必要があった。
また、このような大麦の育種は、育種家がその経験に基づいて行う必要があり、優れた醸造特性を有すると考えられる大麦を選抜するには経験豊富な育種家の主観的な判断で育種を行う必要があった。
一方、ビール、発泡酒（ｌｏｗ−ｍａｌｔ ｂｅｅｒ）等の麦芽アルコール飲料の原料として用いられている大麦はα−アミラーゼやβ−アミラーゼ等の糖化酵素類を含有しており、製麦や糖化の際には、これらの糖化酵素類の作用によって大麦種子中の炭水化物が低分子糖類に分解される。
このようなアミラーゼの性質と大麦品種間との相関関係について、ＷＯ９９／００５１５号公報において、本発明者らは、大麦麦芽中の炭水化物のうち発酵に利用される部分の比率である外観最終発酵度はβ−アミラーゼの熱安定性が高いものほど優れることを報告している。しかしながら、４種類に分類される様々な大麦品種のβ−アミラーゼ熱安定性は、最も熱安定性の優れるものであっても５７．５℃で３０分間の熱処理によって４５〜５０％の残存活性を示すにとどまり、栽培大麦においてはそれを上回る熱安定性品種は見出されなかった。
一方、Ｅｇｌｉｎｔｏｎら（Ｅｇｌｉｎｔｏｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｐ．Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ ａｎｄ Ｄ．Ｅ．Ｅｖａｎｓ（１９９８）Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ａｌｌｅｌｅｓ ｏｆ ｂａｒｌｅｙ ｂｅｔａ−ａｍｙｌａｓｅ．Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８：３０１−３０９）は野生大麦（Ｈ．Ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）にβ−アミラーゼ熱安定性の高い系統を見出したが、野生種であることから育種利用に困難が伴うものであった。
発明の開示
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、麦芽アルコール飲料製造上の糖化効率を高めるべく、熱安定性の高いβ−アミラーゼを有する大麦品種を選抜する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、熱安定性の高いβ−アミラーゼを有する在来種大麦を見出すとともに、当該β−アミラーゼの構造遺伝子が新規遺伝子であることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の大麦品種の選抜方法は、
前記大麦の種子から抽出した粗酵素液を熱処理する熱処理工程と、
前記熱処理された粗酵素液中のβ−アミラーゼの酵素活性を測定する活性測定工程と、
前記活性測定の結果、残存活性が８５〜９０％であるβ−アミラーゼを含有する大麦品種を選択する選択工程と、
を含むことを特徴とする。
ここで、前記熱処理工程において、前記粗酵素液を、５５℃〜５８℃の範囲内の所定温度で１０分〜６０分の範囲内の所定時間熱処理することが好ましく、特に好ましくは前記粗酵素液を５７．５℃で３０分間熱処理することである。
また、本発明の大麦品種の選抜方法は、
前記大麦から抽出したゲノムＤＮＡからβ−アミラーゼ構造遺伝子領域を増幅する遺伝子増幅工程と、
前記遺伝子増幅工程で増幅されたβ−アミラーゼ構造遺伝子を制限酵素で切断して、所定の塩基数の遺伝子断片を検出する遺伝子検出工程と、
前記遺伝子検出工程で検出された遺伝子断片の塩基数に基づいて所定の大麦品種を選択する選択工程と、
を含むことを特徴とする。
ここで、前記遺伝子増幅工程において、増幅する遺伝子領域が大麦β−アミラーゼ遺伝子第２エクソンを含む遺伝子領域であり、前記遺伝子検出工程において、前記制限酵素がＭｓｐＩであることが好ましい。このような条件で遺伝子の検出を行った場合、本発明の新規β−アミラーゼが検出された場合には、検出される遺伝子断片は５３ｂｐの断片を含む一方、既知β−アミラーゼ遺伝子が検出された場合には５３ｂｐより大きなサイズの遺伝子断片が検出される。
さらに、本発明の大麦β−アミラーゼ遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の核酸配列を含むことを特徴とする。ここで、本発明の大麦β−アミラーゼ遺伝子は、前記核酸配列の一部からなるものであってもよい。
また、本発明の麦芽アルコール飲料の製造方法は、
前記の大麦品種の選抜方法によって選抜された大麦を製麦して麦芽を得る製麦工程と、
前記麦芽を糖化させて麦汁を得る仕込み工程と、
前記麦汁に酵母を添加して前記麦汁を発酵させ、麦芽アルコール飲料を得る発酵工程と、
を含むことを特徴とする。
このような製造方法により、糖化工程中の澱粉分解効率を高め、発酵性低分子糖を多く生成することが可能となる。その結果、製造上の発酵効率を高めることが可能となるとともに、仕込み工程の糖化温度を上げることが可能となり、工程時間の短縮やプロテアーゼ類等の働きを抑制しつつ麦芽アルコール飲料の製造を行うことが可能となる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本発明の大麦品種の選抜方法は、
前記大麦の種子から抽出した粗酵素液を熱処理する熱処理工程と、
前記熱処理された粗酵素液中のβ−アミラーゼの酵素活性を測定する活性測定工程と、
前記活性測定の結果、残存活性が８５〜９０％であるβ−アミラーゼを含有する大麦品種を選択する選択工程と、
を含むことを特徴とする。
先ず、本発明にかかる熱処理工程について説明する。
本発明にかかる熱処理工程は、選抜の対象となる大麦（以下、被験大麦という）の種子から抽出した粗酵素液を熱処理する工程である。
本発明にかかる被験大麦の種子としては、その生育ステージは特に制限されないが、好ましくは大麦完熟種子を用いる。ここで、用いる大麦の組織は特に制限はないが、具体的には、例えば、胚乳組織を用いることができる。胚乳組織を用いることにより、一粒種子の胚を含む部分を発芽生育させ、胚乳部分でβ−アミラーゼの形質を選抜することにより、戻し交配世代途中の個体選抜にも利用することが可能となる。
また、粗酵素液の抽出方法としては、β−アミラーゼの活性を阻害しない方法であれば特に制限はないが、例えば、１０ｍＭのジチオスレイトールを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて抽出した抽出溶液を遠心分離し、上清を粗酵素液とすればよい。
本発明にかかる熱処理工程においては、前記粗酵素液を、５５℃〜５８℃の範囲内の所定温度で１０分〜６０分の範囲内の所定時間熱処理することが好ましく、特に好ましくは前記粗酵素液を５７．５℃で３０分間熱処理することであるが、この温度及び時間の条件に限定されず、他の条件下で行ってもよい。
次に、本発明にかかる活性測定工程について説明する。
本発明にかかる活性測定工程は、前記熱処理された粗酵素液中のβ−アミラーゼの酵素活性を測定する工程である。
熱処理工程で熱処理された粗酵素液中に含まれるβ−アミラーゼの活性測定の方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いて行うことができるが、具体的には、例えば、基質としてｐ−ニトロフェニルマルトペンタオサイドを用いた活性測定キットであるＢＥＴＡＭＹＬキット（メガザイム社製）を用いて行ってもよく、また、基質としてジクロロフェニルβ−マルトペンタサイド（小野薬品工業社製）を用い、この基質に３７℃で粗酵素液を反応させ、ジクロロフェノールの生成量を測定することによって行ってもよい。ここで、β−アミラーゼの活性測定の際に、対照として熱処理を行っていない大麦種子の粗酵素液についても活性測定を行っておく必要がある。
次に、本発明にかかる選択工程について説明する。
本発明にかかる選択工程は、前記活性測定の結果、残存活性が８５〜９０％であるβ−アミラーゼを含有する大麦品種を選択する工程である。
すなわち、被験大麦と対照となる大麦とのそれぞれから抽出された粗酵素液におけるβ−アミラーゼの活性測定結果に基づいて被験大麦由来のβ−アミラーゼの残存活性を算出し、その結果、残存活性が８５〜９０％であると認められた大麦を選択する。
次に本発明の第２の大麦品種の選抜方法について説明する。
本発明の第２の大麦品種の選抜方法は、
前記大麦の種子から抽出したゲノムＤＮＡからβ−アミラーゼ構造遺伝子領域を増幅する遺伝子増幅工程と、
前記遺伝子増幅工程で増幅されたβ−アミラーゼ構造遺伝子を制限酵素で切断して、所定の塩基数の遺伝子断片を検出する遺伝子検出工程と、
前記遺伝子検出工程で検出された遺伝子断片の塩基数に基づいて所定の大麦品種を選択する選択工程と、
を含むことを特徴とする。
すなわち、種子発現β−アミラーゼ遺伝子（以下、β−アミラーゼ遺伝子）には既に塩基配列が知られている既知遺伝子が存在するが（配列表の配列番号２）、本発明者らによって当該β−アミラーゼ遺伝子と少なくとも１塩基以上異なる新規β−アミラーゼ遺伝子が見出された（配列表の配列番号１）。なお、配列番号１の核酸は、新規β−アミラーゼ遺伝子の第２エクソンの塩基配列を示し、また、配列番号２に記載の塩基配列を有する既知β−アミラーゼ遺伝子において２９０〜６８８番目の塩基が第２エクソンを示す。
また、この新規β−アミラーゼ遺伝子領域型とβ−アミラーゼ熱安定性が一致することが本発明者らによって見出されている。従って、本発明の大麦品種の選抜方法によって大麦から抽出されたβ−アミラーゼ遺伝子を解析することにより、熱安定性の高いβ−アミラーゼを有する大麦品種を選抜することが可能となる。具体的には、両者の塩基配列の相違によって生成又は消滅する制限酵素切断部位が存在することから、被験大麦から抽出されたβ−アミラーゼ遺伝子について当該制限酵素切断部位を認識又は切断する制限酵素で切断し、その切断パターンを比較することにより大麦品種を識別することが可能となる。
先ず、本発明にかかる遺伝子増幅工程について説明する。
本発明にかかる遺伝子増幅工程は、被験大麦の種子から抽出したゲノムＤＮＡからβ−アミラーゼ構造遺伝子領域を増幅する工程である。
被験大麦からゲノムＤＮＡを抽出する方法としては特に制限はなく、公知の方法によって行うことができるが、具体的には、例えば、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４３２１−４３２５）やＥｔｈｉｄｉｕｍ ｂｌｏｍｉｄｅ法（Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｐｒａｋａｓｈ １９９１，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：６−１２）によって抽出することができる。ここで、ゲノムＤＮＡを抽出する組織は大麦種子のみならず、葉、茎、根等を用いることも可能である。例えば、葉を用いることで、戻し交配世代途中の多数の個体選抜に利用することが可能となる。
また、本発明にかかる新規β−アミラーゼ遺伝子は本発明者らによって見出された新規遺伝子であり、既知β−アミラーゼ遺伝子と比較して配列表の配列番号２における大麦β−アミラーゼ遺伝子第２エクソンの２５番目の塩基ＡがＣに置換されていることが特徴である。この塩基の置換により、既知β−アミラーゼ遺伝子には存在しなかった制限酵素ＭｓｐＩの切断部位が生成され、その結果、前記遺伝子増幅産物をＭｓｐＩで切断した際の切断パターンが既知β−アミラーゼ遺伝子である場合と異なるため、識別可能となる。
当該β−アミラーゼ構造遺伝子を増幅する方法としては特に制限はないが、例えば、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）によって行うことができる。ここで、ＰＣＲ法において用いられるプライマーは、β−アミラーゼ遺伝子を増幅させることができる領域に設定されているものであればその塩基配列は特に制限されないが、具体的には、例えば、β−アミラーゼ遺伝子において塩基数が１０〜６０個の連続した塩基であることが好ましく、１５〜３０個の連続した塩基であることがより好ましい。また、一般的には、プライマーの塩基配列におけるＧＣ含量が４０〜６０％であることが好ましい。さらに、ＰＣＲ法に用いる二つのプライマーのプライマー間のＴｍ値に差がない又は少ないことが好ましい。また、プライマー内で２次構造を取らないことが好ましい。
また、本工程で増幅される領域は、本発明者らが見出したＣＡＰＳマーカーに関する領域であることが好ましい。具体的には、本発明にかかるβ−アミラーゼゲノム構造遺伝子の翻訳開始コドン１〜１２３２ｂｐの領域をＰＣＲ法で増幅後、制限酵素ＭｓｐＩで切断することにより８６６ｂｐ、３１３ｂｐ及び５３ｂｐの核酸断片が形成されることを特徴とするＣＡＰＳマーカーに関する領域が挙げられる。さらに、本発明にかかる遺伝子増幅工程において増幅される領城は、前記β−アミラーゼ遺伝子第２エクソンの２５番目の塩基を含む領域であれば前記翻訳開始コドン１〜１２３２ｂｐより狭い範囲であってもよく、例えば、前記β−アミラーゼ遺伝子第２エクソンであることが好ましい。
次に、本発明にかかる遺伝子検出工程について説明する。
本発明にかかる遺伝子検出工程は、前記遺伝子増幅工程で増幅されたβ−アミラーゼ構造遺伝子を制限酵素で切断して、所定の塩基数の遺伝子断片を検出する工程である。
本発明にかかる新規β−アミラーゼ遺伝子は、上述したように既知のβ−アミラーゼ遺伝子と塩基配列に相違が認められるため、当該相違部分を認識する又は切断する制限酵素を用いて増幅産物を切断すれば、得られる核酸断片のサイズに相違が見られる。本発明にかかる制限酵素としては、このように前記相違部分を認識する又は切断するものであれば特に制限はないが、既にこのような作用を有することが判明している制限酵素ＭｓｐＩであることが好ましい。
また、所定の塩基数の遺伝子断片とは、前記相違部分が存在することにより、増幅産物を制限酵素で切断して得られる核酸断片のサイズに相違が見られるような遺伝子断片であればその塩基数は特に制限されない。例えば、増幅される領域を前述のＣＡＰＳマーカーに関する領域とし、前記制限酵素にＭｓｐＩを用いた場合には、所定の塩基数は８６６ｂｐ、３１３ｂｐ及び５３ｂｐとなる。この場合、既知のβ−アミラーゼ遺伝子には、前述したように配列表の配列番号２における３１４番目の塩基はＡであるため、ＭｓｐＩでは切断されない。すなわち、図２に示すように、本発明にかかる新規β−アミラーゼ遺伝子であればＭｓｐＩ処理によって生成されるべき５３ｂｐの核酸断片が生成されず、３６６ｂｐ及び８６６ｂｐの２つの核酸断片が生成されるにすぎない。
また、本工程にかかる検出とは、制限酵素によって切断された核酸断片が検出可能な方法であれば特に制限はないが、具体的には、例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出すればよい。
次に、本発明にかかる選択工程について説明する。
本発明の選択工程は、前記遺伝子検出工程で検出された遺伝子断片の塩基数に基づいて所定の大麦品種を選択する工程である。
本工程では、前記遺伝子検出工程で検出された核酸断片の塩基数を比較し、目的とする塩基数の核酸断片が見出された大麦品種を選択すればよい。
次に、本発明の大麦β−アミラーゼ遺伝子について説明する。
本発明の大麦β−アミラーゼ遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基数１２３２ｂｐの核酸を含む。当該遺伝子は、高い熱安定性を有するβ−アミラーゼをコードするゲノムＤＮＡであり、この塩基配列の一部からなる核酸も本発明に包含される。
なお、前記本発明の大麦β−アミラーゼ遺伝子の一部からなる核酸は、以下の条件を満たすものであることが好ましい。すなわち、既知のβ−アミラーゼ遺伝子（はるな二条）開始コドンから数えて２９１ｂｐのＡがＣに、２４１０ｂｐのＡがＴに、３２１６ｂｐのＧがＴに、３４３８ｂｐのＣがＴに、３４９３ｂｐのＣがＴに、３５９８ｂｐのＣがＧに、３６９６ｂｐのＣがＴにそれぞれ置換されているものが好ましい。
最後に、本発明の麦芽アルコール飲料の製造方法について説明する。
本発明の麦芽アルコール飲料の製造方法は、
上記の大麦品種の選抜方法によって選抜された大麦を製麦して麦芽を得る製麦工程と、
前記麦芽を糖化させて麦汁を得る仕込み工程と、
前記麦汁に酵母を添加して前記麦汁を発酵させ、麦芽アルコール飲料を得る発酵工程と、
を含むことを特徴とする。
本発明にかかる麦芽アルコール飲料は、その製造に用いられる麦芽の使用比率の多少は特に制限されず、麦芽を原料として製造されるアルコール飲料であればよい。具体的には、例えばビールや発泡酒（麦芽使用比率２５％未満の麦芽アルコール飲料）が挙げられる。
先ず、本発明にかかる製麦工程について説明する。
本発明にかかる製麦工程は、上記の大麦品種の選抜方法によって選抜された大麦を製麦して麦芽を得る工程である。上記のように選抜された大麦を用いる以外は製麦の方法としては特に制限されず公知の方法で行えばよいが、具体的には、例えば、浸麦度が４０〜４５％に達するまで浸麦後、１０〜２０℃で３〜６日間発芽させ、焙燥して麦芽を得ることができる。
次に、本発明にかかる仕込み工程について説明する。
本発明にかかる仕込み工程は、前記麦芽を糖化させて麦汁を得る工程である。具体的には、さらに以下の第１〜第４の工程に分けられる。
すなわち、第１の工程は、麦芽を含む原料と仕込用水とを混合し、得られた混合物を加温することにより麦芽を糖化させ、前記糖化された麦芽から麦汁を採取する仕込工程である。
本工程において用いられる麦芽は、大麦に水分と空気を与えて発芽させ、乾燥して幼根を取り除いたものであることが好ましい。麦芽は麦汁製造に必要な酵素源であると同時に糖化の原料として主要なデンプン源となる。また、麦芽アルコール飲料特有の香味と色素を与えるため、発芽させた麦芽を焙燥したものを麦汁製造に用いる。さらに、原料として麦芽以外にホップ、コーンスターチ、コーングリッツ、米、糖類等の副原料を添加してもよい。
また、前記麦汁の製造工程において、市販または別途調製されたモルトエキスを仕込用水と混合し、必要に応じて前記副原料を添加し麦汁を得ることもできる。
前記麦芽は仕込用水に添加した後、混合される。前記副原料を添加する場合には、ここで同時に混合すればよい。また、前記仕込用水は特に制限されず、製造する麦芽アルコール飲料に応じて好適な水を用いればよい。糖化は基本的に既知の条件で行えばよいが、例えば、前記混合された麦芽と仕込用水とを６５〜７５℃に加温して行うことが好ましく、これによって麦芽中のアミラーゼによる糖化が進行する。こうして得られた麦芽糖化液をろ過することにより麦汁が得られる。
また、第２の工程は、前記麦汁に酵母を添加して発酵させ麦芽アルコール飲料中間品を得る発酵工程である。
ここで用いられる酵母は、前記麦芽の糖化によって得られた麦汁内の糖分を代謝してアルコールや炭酸ガス等を産生するいわゆるアルコール発酵を行う酒類酵母であればいずれでもよく、具体的には、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ウバルム等が挙げられる。
発酵は、上記仕込工程で得られた麦汁を冷却し、ここに前記の酵母を添加して行う。発酵条件については基本的には既知の条件と変わらず、例えば発酵温度が通常１５℃以下、好ましくは８〜１０℃であり、発酵時間が好ましくは８〜１０日である。
さらに、第３の工程は、前記発酵工程で得られた麦芽アルコール飲料中間品を貯蔵する貯酒工程である。
本工程では、アルコール発酵が終了した発酵液が密閉タンクに移され、貯蔵される。貯蔵条件については基本的に既知の条件と変わらず、例えば貯蔵温度は０〜２℃が好ましく、貯蔵時間が３０〜９０日間であることが好ましい。発酵終了液を貯蔵することにより残存エキスの再発酵と熟成が行われる。
また、第４の工程は、前記貯酒工程で得られた麦芽アルコール飲料中間品をろ過し麦芽アルコール飲料を得るろ過工程である。
ろ過条件については基本的には既知の条件と変わらず、例えばろ過助材として珪藻土、ＰＶＰＰ（ポリビニルポリピロリドン）、シリカゲル、セルロースパウダー等が用いられ、温度は０±１℃で行われる。こうして麦芽アルコール飲料（例えばビールまたは発泡酒）が得られる。ろ過された麦芽アルコール飲料はそのまま、または無菌ろ過や加熱処理を行った後、タンク詰め、たる詰め、ビン詰めまたは缶詰めされ市場に出荷される。
このようにして選抜された大麦を用いて麦芽アルコール飲料の製造を行い、その発酵効率測定試験を行った結果、外観最終発酵度が向上することが判明した。ここで、外観最終発酵度とは、麦汁エキスのうち発酵で利用されるエキスの割合を百分率で表したものをいう。
従って、本発明の麦芽アルコール飲料の製造方法によって麦芽アルコール飲料を製造することにより、その仕込み工程において高い効率で発酵性糖を得ることが可能となり、その麦汁を用いて発酵を行うことにより、従来よりも高い効率で大麦中の炭水化物がアルコールに変換される。また、当該大麦品種を用いて麦芽アルコール飲料の製造を行うことにより、糖化工程中の澱粉分解効率を高め、発酵性低分子糖を多く生成することが可能となる。その結果、製造上の発酵効率を高めることが可能となるとともに、仕込み工程の糖化温度を上げることが可能となり、工程時間の短縮やプロテアーゼ類等の働きを抑制しつつ麦芽アルコール飲料の製造を行うことが可能となる。
さらに、本発明の大麦品種の選抜方法によって得られた大麦を他品種の大麦と交配することにより、熱安定性の高いβ−アミラーゼを含有する大麦を育種することが可能となる。この場合、育種方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いて行うことができる。
また、本発明の大麦β−アミラーゼ遺伝子を用いることにより、遺伝子組み換え技術を用いた熱安定性の高いβ−アミラーゼを含有する大麦の製造ができる可能性がある。本発明の大麦β−アミラーゼ遺伝子を大麦に導入する方法としては特に制限はなく、公知の方法により実施することができる。
［実施例］
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１
（高度熱安定性β−アミラーゼ形質の熱処理測定による選抜方法）
先ず、大麦種子より粗酵素液を抽出した。大麦完熟種子１粒をハンマーで粉砕し、４００μｌの１０ｍＭのジチオスレイトールを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて、４℃で１２時間１００ｒｐｍの往復振とうで抽出した。抽出液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を粗酵素液とした。
次に、β−アミラーゼの熱処理を行った。１％ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．１）で粗酵素液を１／１００倍に希釈し、その３０μｌを２００μｌサンプリングチューブに入れ５７．５℃の湯浴中で３０分間処理した。
次に、ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオサイド（ＢＥＴＡＭＹＬキット；メガザイム社製）を基質としてβ−アミラーゼ活性を測定した。熱処理区と無処理区の酵素液それぞれ１０μｌを２００μｌ容のサンプリングチューブに入れ、湯浴で４０℃に余熱後、メガザイム社キットの基質／酵素液１０μｌを添加し正確に５分間反応させた。この反応液に１％トリス液１５０μｌを添加して反応を停止させた。この反応液１００μｌをマルチプレートに移し、ＢＩＯ−ＲＡＤ社プレートリーダにてＡｂｓ４０５を測定した。処理区の値を無処理区の値で除し百分率で表した値が８５〜９０％であることでＣＳ１８８のβ−アミラーゼ酵素が種子中に存在することを確認した。
このように、大麦遺伝資源より選択したＣＳ１８８は、図１に示すように従来の大麦（はるな二条（Ａ型）、Ｒｏｂｕｓｔ（ＢＩＩ型）、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ（ＢＩ型）、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ（Ｃ型））の熱安定性を大きく上回る熱安定性のβ−アミラーゼを有することが判明した。ここで、前記Ａ型、Ｂ型、Ｃ型とは、大麦から抽出された粗酵素液を５７．５℃で３０分間の熱処理を行った際に、残存活性が３５％以上のものをＡ型、１０〜３５％のものをＢ型、１０％未満のものをＣ型と分類した。また、Ｂ型は大麦に含まれるβ−アミラーゼの等電点に基づいてさらに２種類に分類され、ｐＩ６．５のバンドを持つタイプをＢＩ、持たないタイプをＢＩＩと分類した。
実施例２
（高度熱安定性β−アミラーゼ形質のＤＮＡ多型選抜）
ＣＳ１８８から抽出したβ−アミラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡをダイターミネーター法により解読した。図２に示すように、翻訳開始コドンより２９１ｂｐの塩基が、既知β−アミラーゼ遺伝子の場合はＡであるのに対して、ＣＳ１８８から単離したβ−アミラーゼ遺伝子ではＣに変化しており、制限酵素ＭｓｐＩの認識部位である塩基配列ＣＣＧＧが形成されていることを確認した。
ＣＳ１８８と通常品種の芽生え緑葉よりＳＤＳ−プロパノール法にてゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとして５’−プライマー（５’−ＡＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＣＣＡＧＣＡＴＣＣＡＣＡＡＴＧＧＡＧＧ−３’：配列番号３）と３’−プライマー（５’−ＣＡＣＴＣＡＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＧＡＴＧＣＣＴＧＧＧＡ−３’：配列番号４）を各５０μＭ、ＤＮＡ１μｌを加え、プレミックスＥｘＴａｑを加えて５０μｌスケールでＰＣＲで増幅（９４℃×１分、５５℃×２分、７２℃×３分：３０サイクルした後７２℃×７分）を行なった。得られたＰＣＲ産物５μｌを制限酵素ＭｓｐＩで切断し３％Ｎｕｓｉｅｖｅ（宝酒造製）ゲルで電気泳動しバンド型を観察した。なお、上記ＰＣＲ法におけるアニリング条件は５０℃から６５℃とした。
通常の大麦から抽出したβ−アミラーゼ遺伝子では、５’末端から３６７ｂｐ付近のＭｓｐＩ制限酵素認識部位により８６６ｂｐと３６６ｂｐの２本のバンドが形成され、一方、ＣＳ１８８型β−アミラーゼ遺伝子はこの３６６ｂｐ付近のＭｓｐＩ制限酵素認識部位に加え３１３ｂｐ付近に特異的にＭｓｐＩ制限酵素認識部位を持つことから８６６ｂｐ、３１３ｂｐ、５３ｂｐの３本のバンドが形成された。従って、電気泳動像では、図３に示すように、３６７ｂｐと３１４ｂｐのバンド位置の違いによって高度熱安定性β−アミラーゼ形質を選抜することが出来た。なお、電気泳動に用いたマーカーは１００ｂｐラダーＤＮＡである。
次に、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ×ＣＳ１８８交配Ｆ２種子４８粒を胚を含む部分と含まない部分に半切し、胚を含まない部分からは実施例１の方法で熱安定性を調査した。ただし、熱処理温度は５８℃とした。また、胚を含む部分から発芽させた芽生えからＤＮＡを抽出し、β−アミラーゼ遺伝子型を調査した。
その結果、図４に示すように、４８個体全てにおいて、ＣＳ１８８遺伝子ホモ型はＣＳ１８８と同等程度の活性を示し、Ｓｃｈｏｏｎｅｒホモ型はＳｃｈｏｏｎｅｒと同様に活性を失い、Ｈｅｔｅｒｏ型はその中間の熱安定性を示した。従って、β−アミラーゼ構造遺伝子多型をβ−アミラーゼ熱安定性の選抜指標にできることが確認された。
実施例３
（麦芽アルコール飲料の製造方法）
高度熱安定性β−アミラーゼ大麦であることが確認されたＣＳ１８８と、対照品種としてβ−アミラーゼ熱安定性がＡ型であるＯＵＣ５７＋を浸麦度４２．５％に達するまで浸麦後、１５℃で６日間発芽させた後、焙燥し麦芽を得た。麦芽を粉砕後、図５に示すダイヤグラムの糖化工程で麦汁を製造した。
図５に示すように、糖化中のβ−アミラーゼ活性の失活程度は、ＣＳ１８８では温度の上昇する糖化の後期まで高い活性を有しており、効率的に糖化が進むことが予想された。
次に、得られた麦汁を用いてＥＢＣ標準法に従って小規模発酵試験を行ない、外観最終発酵度を測定した。その結果、ＣＳ１８８の外観最終発酵度は７７．８％と対照のＯＵＣ０５７＋の７７．０％と比較して高い外観最終発酵度であったことから、優れた発酵効率を達成することができると考えられた。
産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明の大麦品種の選抜方法、大麦β−アミラーゼ遺伝子及び麦芽アルコール飲料の製造方法によれば、麦芽アルコール飲料製造上の糖化効率を高めるべく、熱安定性の高いβ−アミラーゼを有する大麦品種を選抜する方法を提供することが可能となる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、各種の大麦系統の種子に含まれるβ−アミラーゼの熱失活曲線を示すグラフである。
図２は、既知種子発現β−アミラーゼ遺伝子部分の塩基配列と本発明の新規β−アミラーゼ遺伝子の塩基配列を示した図である。
図３は、各種の大麦のβ−アミラーゼ遺伝子のＣＡＰＳ多型を示す電気泳動写真である。
図４は、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ×ＣＳ１８８交配Ｆ２種子から抽出されたβ−アミラーゼの熱安定性を示すグラフである。
図５は、麦芽アルコール飲料の製造における糖化過程のダイアグラムとβ−アミラーゼの熱失活曲線を示すグラフである。
Claims (3)
- β−アミラーゼ構造遺伝子の開始コドンから数えて２９１番目の核酸の塩基がアデニンからシトシンに変異しているβ−アミラーゼ構造遺伝子を有する大麦品種の選抜方法であって、
前記大麦から抽出したゲノムＤＮＡから配列表の配列番号２に記載の塩基配列の２９０〜６８８番目の核酸を含むＤＮＡ断片を増幅する遺伝子増幅工程と、
前記遺伝子増幅工程で増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＭｓｐＩで切断して、切断したＤＮＡ断片を検出する遺伝子検出工程と、
前記遺伝子検出工程で検出されたＤＮＡ断片に配列表の配列番号２に記載の塩基配列の２９０〜２９３番目及び４６８〜４７１番目の二箇所のＭｓｐＩ認識部位で切断されて得られる５３ｂｐのＤＮＡ断片が含まれる大麦品種をβ−アミラーゼ構造遺伝子の開始コドンから数えて２９１番目の核酸の塩基がアデニンからシトシンに変異しているβ−アミラーゼ構造遺伝子を有する大麦品種であるとして選択する選択工程と、
を含む大麦品種の選抜方法。 - 配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含む大麦β−アミラーゼ構造遺伝子。
- 請求項１に記載の大麦品種の選抜方法によって選抜された大麦を製麦して麦芽を得る製麦工程と、
前記麦芽を糖化させて麦汁を得る仕込み工程と、
前記麦汁に酵母を添加して前記麦汁を発酵させ、麦芽アルコール飲料を得る発酵工程と、
を含む麦芽アルコール飲料の製造方法。
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