DE4121753C2 - Verfahren zur Abtrennung von Synthesenebenprodukten und chromophoren Verunreinigungen in synthetischen Peptiden und Peptidderivaten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Synthesenebenprodukten und chromophoren Verunreinigungen in synthetischen Peptiden und Peptidderivaten gemäß den Patentansprüchen.

Die Herstellung biologisch aktiver Substanzen zur Verwendung als Wirkstoffe in Arzneimittel ist begleitet von ständig steigenden Anforderungen an ihre Reinheit. Das setzt in immer stärkerem Maße die gleichzeitige Entwicklung hochempfindlicher und ökonomisch effektiver chromatographischer Reinigungsverfahren voraus.

Ziel der Entwicklungen sind dabei solche Verfahren, die bei einem hohen Substanzdurchsatz eine gleichmäßig hohe Wiederfindungsrate und hohe Systemresolution aufweisen, und dies bei der Verwendung einfacher Träger- und Laufmittelsysteme, sowie die Möglichkeit eines hohen Automatisierungsgrades.

Die chromatographische Reinigung von Peptiden und Peptidderivaten erfordert auf Grund der geringen Ladungs- und Polaritätsunterschiede einer Vielzahl von Synthesenebenkomponenten die Anwendung aufwendiger Chromatographietechniken. Vorzugsweise kommen dabei HPLC-Verfahren und Mitteldruckchromatographieverfahren auf der Basis von RP-Kieselgelen (Kraus, HI, Leser, MI, Swiss Chem. 9 (1987) H. 5, 29-30; WO 89/01485) sowie Methoden der polaren Adsorptions- bzw. Verteilungschromatographie an Normalkieselgel (DE 28 04 566, DE 34 21 614) und Ionenaustauschtechniken (DE 26 17 646, DE 27 32 587, DD 242 813, DD 281 089) zum Einsatz.

Für die Herstellung von Wirkstoffen in pharmazeutischer Qualität werden in den letzten Jahren allgemein präparative HPLC-Techniken bzw. Methoden der präparativen Mitteldruck-Flüssigchromatographie an RP-Kieselgelen im Produktionsmaßstab favorisiert. Der hohe Investitionsaufwand für die Trägermaterialien und die Technologie sowie die Nachteile des relativ niedrigen Durchsatzes an Wirkstoff pro Volumeneinheit Trägermaterial, bei Peptiden in der Größenordnung von 1 bis 2 mg Rohpeptid pro ml Träger, und des zur Erzielung einer hohen Auflösung notwendigen Zusatzes von Salzen, Puffern oder Chelierungsmitteln, was einen zusätzlichen Schritt zur Entfernung dieser Hilfsstoffe erfordert (WO 89/01485), werden dabei durch die Möglichkeiten zur Automatisierung, den geringen Zeitaufwand und ausgefeilte Überladungsmethoden aufgewogen (Reese, W., Swiss Chem. 9 (1987) H. 6, 29-36, Kraus, H., Leser, M., Swiss Chem. 9 (1987) H. 8, 29-33; Meyer, V., Swiss Chem. 11 (1989) H. 10, 39-52; Seipke, G., Müller, G., Grau, V., Angew. Chem. 98 10 (1986) 530-548).

Wesentlich für die Erzielung hoher Zyklenzahlen pro Zeiteinheit und möglichst hoher Überladungsraten pro Zyklus ist dabei die Qualität des Syntheserohproduktes. Besonders störend wirken hier lipophile Nebenkomponenten, die in der RP-HPLC nach dem Zielprodukt eluieren und somit die möglichen Überladungsraten senken bzw. durch ihre schwere Eluierbarkeit zeit- und materialaufwendige Säulenkonditionierungsschritte erfordern.

Die Erfindung bezweckt, ein einfaches, hoch effektives chromatographisches Verfahren zur Abtrennung von unterschiedlichen, meist nicht definierten, lipophilen Verunreinigungen von synthetischen Peptiden und Peptidderivaten aufzuzeigen, das die vorstehend beschriebenen Mängel weitgehend vermeidet.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine effektive, wenig aufwendige Methode zur präparativen Abtrennung von lipophilen, meist nicht definierten Nebenkomponenten von synthetischen Peptiden und Peptidderivaten in einem Gehaltsanteil von bis zu 15% aufzuzeigen, die zu einer Produktreinheit <98% HPLC führt bzw. angewendet zur Reinigung von Zwischenprodukten der Peptidsynthese oder Vorreinigung von Syntheseprodukten die Feinreinigung der Syntheseprodukte mit kostenintensiven Methoden, wie präparativer HPLC, wesentlich erleichtert.

Die lipophilen Nebenkomponenten der synthetischen Peptide und Peptidderivate unterscheiden sich meist nicht in der Aminosäuresequenz und Ladung vom Zielpeptid, sind aber in unterschiedlichem Maße unpolarer und weisen in der Chromatographie an hydrophoben Phasen im Vergleich zum Zielpeptid Kapazitätsfaktoren im Bereich des 1,2- bis 5fachen Wertes auf.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß die chromatographische Abtrennung der lipophilen Nebenkomponenten der synthetischen Peptide und Peptidderivate mit bis zu zwanzig Aminosäurebestandteilen an hydrophoben Trägern, wie Adsorberpolymeren auf Acrylsäureester- Divinylbenzen-Basis oder Reversed-Phase-Kieselgelen, in sauren wäßrig-organischen Elutionssystemen hoher Ionenstärke durchgeführt wird. Bei einer für Adsorptionschromatographien unüblich hohen Beladung des Trägers mit 50 bis 150 mg Peptid/ml Säulenvolumen (üblich sind 1 bis 5 mg/ml Säulenvolumen) erfolgt erfindungsgemäß die Elution des Zielpeptids als temporärer Bestandteil des sauren wäßrig-organischen Elutionsmittels und Ionenbildner (durch Protonierung an den freien Aminogruppen bei pH-Werten <3,5) in Kombinationswirkung mit dem organischen Lösungsmittelanteil von max. 30% isokratisch im Säulendurchbruch nahezu ohne Retention, während die lipophilen Nebenkomponenten entsprechend ihren Kapazitätsfaktoren stark verzögert eluiert werden.

Dabei kann das zu reinigende Peptid in einer Konzentration bis zur Sättigung in bis zu zwei Säulenvolumen, vorzugsweise bis zu einem halben Säulenvolumen, temporärer Bestandteil des Elutionsmittels und Ionenbildner sein, was den sonst üblichen Zusatz von Salzen, Puffern und Chelierungsmitteln und deren in einem zusätzlichen Schritt erforderliche Entfernung vermeidet, und die Weiterführung der Elution mit peptidfreiem Elutionsmittel sonst gleicher Zusammensetzung erfolgen.

Vorteilhaft werden als hydrophobe Träger RP-Kieselgele oder organische Polymere, vorzugsweise CAE-Träger (Methacrylsäuremethylester-Divinylbenzen-Copolymerisat) auf Basis eines Copolymerisats von Acrylsäureestern mit Divinylbenzen eingesetzt.

Dabei gelingt es, trotz des im Vergleich zu bekannten Verfahren um 1 bis 2 Zehnerpotenzen höheren Durchsatzes an Peptid lipophile Verunreinigungen, die in der HPLC nur 1 bis 2 Minuten nach dem Zielpeptid eluieren, quantitativ abzutrennen bzw. weitgehend abzureichern. Da das Zielpeptid im Säulendurchbruch vor den Verunreinigungen eluiert, ist die Methode nahezu verlustlos.

Auf Grund der geringen Konzentrationen von flüchtigen Säuren im salzfreien Elutionssystem können die Peptide durch Einengen und anschließende Gefriertrocknung einfach und schonend mit hohen Reinheiten bis zu 0% Anteil (RP-HPLC) an lipophilen Nebenkomponenten und Verunreinigungen isoliert werden.

Im folgenden soll die Erfindung an einigen Beispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1 Abtrennung von 5 lipophilen Verunreinigungen von Ac-Arg-Lys(Ac)-Glu-Val-Tyr-OH

Auf eine Säule von 250 mm Länge und 9 mm Durchmesser (V = 15,9 ml), die als Trägermaterial das Adsorberpolymer CAE auf der Basis Acrylsäureester-Divinylbenzen der Korngröße 40 bis 60 µm enthält, werden 2,0 g Ac-Arg-Lys(Ac)-Glu-Val-Tyr-OH in 10 ml 10^-2 N HCl, 5% Acetonitril aufgetragen.

Die weitere Elution erfolgt mit 10^-2 N HCl, 5% Acetonitril bei einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/h. Ac-Arg-Lys(Ac)-Glu-Val-Tyr-OH eluiert nach dem Totvolumen der Säule von 12 ml in einem Volumen von 24 ml.
Wiederfindungsrate: <94%

HPLC-Bedingungen:
LiCrosorb RP 18, 5 µm, 20% Acetonitril, 0,05 M KH₂PO₄, pH 3,0

Beispiel 2 Abtrennung von 5 lipophilen Verunreinigungen von H-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂

Auf eine Säule von 250 mm Länge und 9 mm Durchmesser (V = 15,9 ml), die als Trägermaterial das Adsorberpolymer CAE auf der Basis Acrylsäureester-Divinylbenzen der Korngröße 40 bis 60 µm enthält, werden 0,5 g H-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂-Syntheseprodukt in 4 ml 0,5 N Essigsäure/5% Isopropanol aufgetragen.

Die weitere Elution erfolgt mit 0,5 N Essigsäure/5% Isopropanol bei einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/h. H-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ wird nach dem Säulentotvolumen von 12 ml in 20,4 ml Volumen eluiert.
Wiederfindungsrate: <97,2%

HPLC-Bedingungen:
LiChrosorb RP 18, 5 µm, 24% Acetonitril, 0,05 M KH₂PO₄, pH 2,2

Beispiel 3 Abtrennung von 4 lipophilen Verunreinigungen von H-Lys[Z(NO₂)]-Pro-OH

Auf eine Säule von 250 mm Länge und 9 mm Durchmesser (V = 15,9 ml), die als Trägermaterial das Adsorberpolymer CAE auf der Basis Acrylsäureester-Divinylbenzen der Korngröße 40 bis 50 µm enthält, werden 2 g H-Lys[Z(NO₂)]-Pro-OH-Syntheseprodukt in 5 ml 10^-3 N HCl, 20% Acetonitril aufgetragen.

Die weitere Elution erfolgt mit 10^-3 N HCl, 20% Acetonitril bei einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/h. H-Lys[Z(NO₂)]-Pro-OH wird nach dem Säulentotvolumen von 12 ml in 18 ml Volumen eluiert.
Wiederfindungsrate: <96%

Verunreinigungen:
keine lipophilen Verunreinigungen
HPLC-Bedingungen:
LiChrosorb RP 18, 5 µm, 32% Acetonitril, 0,05 M KH₂PO₄, pH 3,0

Beispiel 4

Wie Beispiel 3, mit Kieselgel RP 18 einer Korngröße von 20 bis 30 µm als Träger. Als Elutionsmittel wird 10^-3 N HCl, 22% Acetonitril verwendet.
Wiederfindungsrate: <96%

Verunreinigungen:
keine lipophilen Veränderungen
HPLC-Bedingungen:
LiChrosorb RP 18, 5 µm, 32% Acetonitril, 0,05 M KH₂PO₄, pH 3,0

Beispiel 5 Abtrennung von 3 lipophilen Verunreinigungen von p-Glu-His-Trp-OEt

Auf eine Säule von 250 mm Länge und 9 mm Durchmesser (V = 15,9 ml), die als Trägermaterial das Adsorberpolymer CAE auf der Basis Acrylsäureester-Divinylbenzen der Korngröße 40 bis 60 µm enthält, werden 1,5 g p-Glu-His-Trp-OEt in 7 ml 10^-1 N AcOH, 5% Isopropanol aufgetragen.

Die weitere Elution erfolgt mit 10^-1 N Essigsäure, 5% Isopropanol bei einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/h. p-Glu-His-Trp-OEt eluiert nach dem Säulentotvolumen von 12 ml in einem Volumen von 19 ml.
Wiederfindungsrate: <97%

HPLC-Bedingungen:
LiChrosorb RP 18, 5 µm, 24% Acetonitril, 0,05 M KH₂PO₄, pH 2,2

Beispiel 6 Abtrennung von 3 lipophilen Verunreinigungen von H-Pro-D-Phe-Pro-Gly-OH

Auf eine Säule von 250 mm Länge und 9 mm Durchmesser (V = 15,9 ml), die als Trägermaterial das Adsorberpolymer CAE auf der Basis Acrylsäureester-Divinylbenzen der Korngröße 40 bis 60 µm enthält, werden 2 g H-Pro-D-Phe-Pro-Gly-OH in 1,5 ml 10^-2 N HCl, 5% Acetonitril aufgetragen.

Die weitere Elution erfolgt mit 10^-2 N HCl, 5% Acetonitril bei einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/h. H-Pro-D-Phe-Pro-Gly-OH wird nach dem Säulentotvolumen von 12 ml in 9 ml Volumen eluiert.
Wiederfindungsrate: <97,2%

Verunreinigungen:
keine lipophilen Verunreinigungen
HPLC-Bedingungen:
LiChrosorb RP 8, 7 µm, 20% Acetonitril,0,05 M KH₂PO₄, pH 3,0

Claims (2)

1. Verfahren zur Abtrennung von bis zu 15% enthaltenen Synthesenebenprodukten und chromophoren Verunreinigungen in synthetischen Peptiden oder Peptidderivaten mit bis zu zwanzig Aminosäuren durch Flüssigkeitschromatographie an hydrophoben Trägern, dadurch gekennzeichnet, daß man die Peptide oder Peptidderivate in Konzentrationen bis zur Sättigung in bis zu zwei Säulenvolumen im sauren wäßrig-organischen Elutionsmittel und Ionenbildner hoher Ionenstärke mit einem organischen Lösungsmittelanteil von maximal 30% einsetzt, bei einer Beladung des Trägers mit 50 bis 150 mg Peptid oder Peptidderivat/ml Säulenvolumen und einem pH-Wert von <3,5 isokratisch ohne Retention eluiert und die Elution mit peptidfreiem Elutionsmittel gleicher Zusammensetzung weiterführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Peptide oder Peptidderivate bis zur Sättigung in bis zu einem halben Säulenvolumen einsetzt.