DE3587315T2

DE3587315T2 - Automatisierter Polypeptidsyntheseapparat.

Info

Publication number: DE3587315T2
Application number: DE85301729T
Authority: DE
Inventors: John Bridgham; Timothy G Geiser; Michael W Hunkapiller; Stephen B H Kent; Mark P Marriott; Eric Scott Nordman; Paul Oliver Ramstad
Original assignee: Applied Biosystems Inc
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 1984-03-23
Filing date: 1985-03-13
Publication date: 1993-12-09
Anticipated expiration: 2005-03-14
Also published as: EP0503683A1; EP0156588B1; US4668476A; DE3587315D1; JPS60237097A; EP0156588A3; US4816513A; JPH0469640B2; EP0156588A2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur automatischen Synthese von Polypeptiden, und insbesondere auf eine Vorrichtung, um aktivierte Spezies von (alpha-aminogeschützten) Aminosäuren automatisch unmittelbar vor der Einführung in die feste Phase der Synthesereaktionen vorzuformen.
Seit dem Beginn in 1962 hat R. B. Merrifield's Konzept der Festphasen-Peptidsynthese viele Verbesserungen erfahren und sie ist nun ein gut eingeführtes Verfahren der Technik geworden. Buchstäblich Hunderte von Untersuchungen sind veröffentlicht worden, die chemische Einzelheiten des Verfahrens schildern (vgl. z. B. Merrifield, R. B. : Science 150, 178 (1965); Merrifield, R.B.: Sci. Amer. 218, 56 (1968); Stewart, J. M., Young, J. D.: In: Solid Phase Peptide Synthesis. San Francisco, Kalifornien: Freeman 1969; und Frickson, B. W., Merrifield, R. B.: in: The Proteins (eds. Neurath, R. L. Hill), III. Ed., Vol. 2, pp 255-527. New York: Academic Press 1976).)
Üblicherweise beginnt die Festphasen-Peptidsynthese mit dem covalenten Befestigen des Carboxylendes einer (alpha-aminogeschützten) ersten Aminosäure in der Peptidsequenz durch einen organischen Verbindungsteil an einem unlöslichen Harztröpfchen (typischerweise 25-300 um im Durchmesser), illustriert durch die Formel: organisches Verbindungsteil Harz
= abnehmbare Schutzgruppe
Harz = synthetisches Harz
Ein allgemeiner Zyklus der Synthese weist dann die Entfernung des Schutzes der harzgebundenen Alpha-Aminogruppe, das Waschen (und Neutralisieren, falls notwendig), gefolgt durch die Reaktion mit einer gewissen aktivierten Carboxylform der nächsten (alpha-amino-geschützten) Aminosäure, um zu erhalten: organisches Verbindungsteil Harz
Die Wiederholung des Zyklusses an der n-ten Aminosäure ergibt sodann: organisches Verbindungsteil Harz
Am Ende der Synthese wird die Verbindung des Peptids zu seinem Polymerstützteil abgetrennt und das gelöste Peptid wird von dem unlöslichen Harz getrennt und gereinigt.
Obgleich dieses Verfahren im Prinzip einfach ist, kann es in der Praxis sehr kompliziert sein, Peptide zu erhalten, die über ungefähr 30 Aminosäuren lang sind und eine ausreichende Reinheit haben. Der Grund hierfür ist, daß das durchschnittliche Ergebnis einer Stufe einen profunden Einfluß auf die Reinheit des Produktpeptids hat, wie dies durch die Werte in der folgende Tabelle für die Synthese von einem Peptid mit 30 Aminosäuren hervorgeht.

Tabelle

Peptid mit 30 Aminosäuren

mittlerer Ertrag pro Stufe (%) Produkt-Reinheit (%)
95,0 21
99,5 86
99,7 91
Diese Ergebnisse sind für längere Peptide noch problematischer. Für ein Zielpeptid mit 101 Resten beispielsweise, ergibt ein Stufenertrag von 99% ein Produkt mit lediglich 36% Reinheit. In allen diesen Fällen sind die Nebenprodukte der Peptidsynthese eine komplizierte Mischung aus Molekülen, welche chemisch dem Zielpeptid ähnlich sind. Chromatographische Reinigungen können außergewöhnlich schwierig sein und brauchen viel Zeit, wenn der Relativanteil der Nebenproduktmoleküle beginnt, ungefähr 25% zu überschreiten.
Der Wirkungsgrad des Stufenertrages ist von vielen Faktoren abhängig, beispielsweise der Natur und der Qualität der geschützten Aminosäuren, der Lösungsmittelreinheit, der chemischen Integrität des Harzes, der chemischen Natur des organischen Verbindungsteils, der Form der aktivierten Carboxylverbindung der Aminosäure, dem Wirkungspfad der Waschstufen, dem Syntheseprotokoll und in einigen Fällen von der Identität der Aminosäure in Verbindung mit einem speziellen Sequenzsegment, an welchem diese angebracht wird.
Jeder der oben genannten Faktoren wird, wenn er nicht optimal gesteuert wird, zu einem bemerkenswerten Schritt bei der Verringerung des Ertrages in jeder Kupplungsstufe mit beitragen. Gegenwärtig ist die Komplexität dieser Faktoren derart, daß der mittlere Stufenertrag in der Festphasen- Peptidsynthese typischerweise im Bereich von 93-97% für manuelle und automatische Ausführungen liegt. Für praktische Anwendungen in einem wirtschaftlich vernünftigen Ausmaß, beispielsweise bei der Entwicklung von Pharmazeutika, Enzymensubstraten und von Inhibitoren, Hormonen, Impfstoffen und diagnostischen Reagenzien, bedeutet ein derartig niedriger Stufenertrag eine bemerkenswerte Erhöhung der Kosten der Herstellung und in vielen Fällen kann eine derartige Festphasensynthese von Peptiden unpraktikabel werden.
Bekannte Peptidsynthetisiereinrichtungen arbeiten im wesentlichen als "Waschmaschinen", welche die monotonen Flüssigkeitshandhabungen, das Entfernen des Schutzes, das Hinzufügen eines Kopplungsagents und das Waschen selbst automatisieren. In keinem Fall bilden im Handel erhältliche Peptidsynthetisiervorrichtungen eine aktivierte Aminosäurespezies außerhalb oder unabhängig von dem Reaktionsgefäß. Typischerweise werden geschützte Aminosäuren und DCC dem Reaktionsgefäß zugegeben, welches die harzgebundene Anfangspeptidkette enthält, so daß die Aktivierung der Aminosäure in der Gegenwart der ungeschützten Alpha-Amino- Gruppe stattfindet.
Diese Vorgehensweise begrenzt sowohl die Möglichkeit (als auch die Durchführbarkeit) der Optimierung der Aktivierungsbedingungen für einzelne Aminosäuren und erfordert weiterhin, daß irgendeine Modifikation der Aktivierungsbedingungen in Anwesenheit der ungeschützten Alpha- Amino-Gruppe und der wachsenden harzgebundenen Peptidkette durchgeführt werden muß. Diese Tatsache macht es schwierig, wenn nicht sogar unmöglich, die Aktivierungsparameter durch Analysieren der Bildungsraten und der relativen thermischen und Lösungsmittel-Stabilitäten der einzelnen aktivierten Aminosäurespezies zu optimieren. Auch kann die Möglichkeit, verschiedene thermische Eingänge während des Aktivierungsprozesses zu verwenden, lediglich bei Vorhandensein der Peptidkette durchgeführt werden.
Dementsprechend wird durch die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur Herstellung von Peptiden durch Synthese aus der festen Phase heraus geschaffen, welche aufweist:
Aktivierungseinrichtungen zur Aufnahme geschützter Aminosäuren, welche ein übliches Aktivierungsgefäß, in welchem jede einzelne Aminosäure aktiviert wird, und Lösemittel-Kopplungsmedium- Substitutionseinrichtungen umfassen;
ein Reaktionsgefäß zur Aufnahme des Substrates in irgendeinem zweckmäßigen Lösemittel;
Übertragungseinrichtungen, die mit den Aktivierungseinrichtungen und dem Reaktionsgefäß verbunden sind, um in der Vorrichtung eingesetzte Materialien zu übertragen; und
mit der Übertragungseinrichtung verbundene Rechnereinrichtungen, um die Übertragung von aufeinanderfolgenden Aliquots von Aminosäuren in einer vorgewählten Sequenz in die Aktivierungseinrichtungen hinein; um die Übertragung von entsprechenden folgenden Aliquots des Aktivierungsmediums in die Aktivierungseinrichtungen und die Übertragung von folgenden Aliquots von aktivierten Aminosäuren, die auf diese Art und Weise erzeugt worden sind, in der vorgewählten Sequenz in das Reaktionsgefäß hinein automatisch zu steuern, um auf diese Art und Weise dem Substrat einzeln aktivierte Aminosäuren in der vorgewählten Sequenz einzuführen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist eine Vorrichtung geschaffen worden, um automatisch ein Polypeptid hoher Reinheit mit bis zu 50 Aminosäuren Länge zu schaffen, wobei lediglich Einzelkopplungen verwendet werden. Die Vorrichtung weist ein Aktivierungssystem zur Aufnahme geschützter Aminosäuren auf, und zwar jeweils eine Art pro Zeit, welches ein gemeinsames Gefäß aufweist (ein Aktivatorgefäß), in welchem jede der Aminosäuren in derjenigen Reihenfolge, in der sie erhalten werden, aktiviert wird, um eine Sequenz von Aliquots aktivierter Spezies von jeder der Aminosäuren zu schaffen, wobei jedes Aliquot eine Art der Aminosäure und die Sequenz der Aliquots jeder Art der Aminosäure in der Reihenfolge vorliegen, die im Peptid gewünscht wird. Außerdem ist ein Reaktionsgefäß für ein Harz mit eingeschlossen, welches in der Peptidsynthese aus der festen Phase heraus verwendet wird, um an diesem eine Peptidkette zu befestigen. Ein Übertragungssystem ist außerdem vorgesehen, welches unter der Steuerung eines Computers arbeitet, um die aktivierte Spezies aus dem Aktivierungssystem in das Reaktionsgefäß zu übertragen und um die Aminosäuren, Reagenzien, Gase und Lösungsmittel von einem Teil der Vorrichtung in einen anderen zu übertragen. Das Aktivatorsystem weist außerdem einen temperaturgesteuerten Konzentrationsbehälter auf, in welchem ein Aktivatorlösemittel, welches in dem Aktivatorgefäß eingesetzt wird, wenn die aktivierten Spezies der Aminosäuren erzeugt werden, durch ein Kopplungslösungsmittel ersetzt wird, um die Kopplung der aktivierten Spezies an die Peptidkette in dem Reaktionsgefäß zu intensivieren. Dieser Austausch wird in einer kurzen Zeitperiode herbeigeführt (üblicherweise weniger als 30 Minuten), bevor die aktivierte Aminosäure in das Reaktionsgefäß eingeleitet wird, indem die Kopplungsflüssigkeit in das Konzentrationsgefäß zusammen mit den aktivierten Spezies und der Aktivatorflüssigkeit eingeleitet wird und in dem Gas durch die sich ergebende Lösung geleitet wird, um die Aktivatorflüssigkeit selektiv zu verdampfen, wobei die Aktivatorflüssigkeit mit einem-solchen Siedepunkt ausgewählt wird, der niedriger, als der Siedepunkt der Kopplungsflüssigkeit liegt. Das Konzentrationsgefäß wird, falls notwendig, erhitzt, um die Wärmeverluste bei der Verdampfung zu ersetzen.
Außerdem ist in dem Synthetisiersystem ein Verwirbelungsgerät vorgesehen, um die Gesamtwäsche der Materialien in dem Reaktionsgefäß zu bewirken, das Reaktionsgefäß selbst, ein automatisiertes Peptidharzprobensystem und ein selbstausgebendes System, um einzelne Behälter mit Aminosäure für den Synthetisierer in der Reihenfolge zur Verfügung stellen, die in der Peptidsequenz erwünscht ist. Auch ist ein Spezialbehälter zur Verwendung dem selbst abgebenden System vorgesehen, welches mit einem V-förmigen Bodenteil ausgebildet ist, um die Extraktion von so viel Aminosäuren zu ermöglichen, wie es praktikabel ist, um eine präzise Steuerung hinsichtlich der Stöchiometrie zu ermöglichen. Ein Flüssigkeitssensorsystem ist auch in dem System vorgesehen, um die Übergänge zwischen Gasen und Flüssigkeiten in speziellen Rohren in dem Synthetisierer zu überwachen, um Eingangssignale an das Computersystem für Steuerzwecke zu geben.
Die Computer-Software, welche die Arbeitsweise des Synthetisierers steuert, ist nach einer Reihe von Menüs organisiert, welche dem Bediener des Systems ermöglichen, individuelle Arbeitszyklen für jedes Gefäß in dem Synthetisierer auszuwählen. Zusätzlich kann jeder Zyklus benutzermäßig in einer Reihe von Funktionen definiert werden, von denen jede einem Standardsatz von Instruktionen für einzelne Ventile und andere geschaltete Systeme entspricht, die mit dem Synthetisierer zusammenarbeiten. Bei Verwendung des Menüsystems kann der Benutzer darüber hinausgehend abgewandelte individuelle Funktionen definieren.
Zusätzlich zu der menümäßig durchgeführten Steuerung ist ein Algorhythmus entwickelt worden, welcher sich auf die Organisation der Computersoftware in individuellen Zyklen für jedes Gefäß bezieht. Die Arbeitsweise des Synthetisierers gemäß dem Algorhythmus sorgt für einen optimalen Wirkungsgrad in der Produktion eines Peptids für irgendeine gegebene Wahl von Zyklen.
Fig. 1a und 1b stellen zusammengenommen einen Plan für die Peptidsynthesevorrichtung gemäß der Erfindung dar;
Fig. 1B zeigt die Gaszuleitungsverbindungen;
Fig. 2 zeigt das Computersystem, welches zur Steuerung der Vorrichtung verwendet wird;
Fig. 3 zeigt eine Draufsicht auf ein selbst ausgebendes System mit Einzelbehältern für die Synthesevorrichtung;
Fig. 4 ist eine Querschnittsansicht eines Reaktionsgefäßes gemäß der Erfindung, welches das Ergebnis der Vorverwirbelung von Flüssigkeiten zeigt, die in diesem Behälter vorhanden sind;
Fig. 5a, 5b und 5c sind drei Ansichten des in dem selbst ausgegebenen System verwendeten Behälters;
Fig. 6 ist eine Tabelle, die die Maße des in dem Ausgabesystem verwendeten Behälters wiedergibt;
Fig. 7a und 7b zeigen zwei Ansichten eines in der Vorrichtung verwendeten Flüssigkeitssensors;
Fig. 8 bis 16 dienen zur Erläuterung verschiedener Menüs in dem Computersystem, um Arbeitsvorgänge festzulegen, nach welchen die Synthetisiervorrichtung arbeiten soll;
Fig. 17a und 17b zeigen zusammengenommen ein Flußschema des Menüs;
Fig. 18 ist ein Diagramm, in welchem Definitionen zur Verwendung des Berechnungsschemas zur Optimierung der Produktion des Peptides gezeigt sind;
Fig. 19 zeigt ein Beispiel einer Rechnung zur Optimierung der Herstellung eines Peptides, welches drei Kopplungszyklen benötigt;
Fig. 20a und 20b zeigen grafisch und zahlenmäßig einen Vergleich von bekannten Ergebnissen mit Resultaten, die durch den Einsatz des Verfahrens und der Vorrichtung gemäß der Erfindung im Hinblick auf die Reinheit des synthetisierten Peptids erzielt werden können;
Bevor Einzelheiten der Vorrichtung gemäß der Erfindung beschrieben werden, ist es zunächst einmal nützliche den chemischen Lösungsweg der Pepdidsynthese aus der festen Phase heraus zu erläutern, welcher mit der Vorrichtung optimiert werden soll.
Für die vorliegende Erfindung liegt die bevorzugte Form der Synthese hauptsächlich in drei Phasen. In der ersten oder Aktivierungsphase geht es um die Herstellung von (alpha-aminogeschützter) Aminosäure-Anhydrid in symmetrischer Form, als acylierende Spezies:
wobei R verschiedene Aminosäureseitenketten darstellt.
Symmetrische Anhydride sind außergewöhnlich wirkungsvolle aktivierte Karboxylformen von Aminosäuren, da ihre Bindungsstellen im wesentlichen frei von optischen Inaktivierungen beim Fehlen einer Basis sind und da quantitative Einzelbindungsstellen für gewöhnlich für die meisten Aminosäurezusätze sichergestellt sind, jedoch mit der Ausnahme von Asparagin, Glutamin und Arginin, die jeweils wirksamer durch ein alternatives Aktivierungsverfahren gebunden werden, was nachfolgend erläutert wird. Die allgemein quantitative Natur von Bindungsstellen mit symmetrischen Anhydriden macht diese dort sehr brauchbar, wo automatische Synthesen die zweckmäßige stufenweise quantitative Überwachung ausschließen. Die hier beschriebene Vorrichtung synthetisiert automatisch symmetrische Anhydride unmittelbar vor der Einbindung in die Peptidkette. Wegen der Anlagerungsstabilität der symmetrischen Anhydride und der Schwierigkeit, sie in reiner Form zu isolieren, ist ihre Verwendung in der Vergangenheit auf die manuelle Vorformung beschränkt gewesen, welcher die Einführung in eine automatische Synthesevorrichtung folgt.
Das Verfahren zur Synthetisierung vorgeformter symmetrischer Anhydride (PSA) weist das Reagierenlassen von 0,5 Äquivalenten von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) mit 1,0 Äquivalenten geschützter Aminosäure in Dichlormethan (DCM) gemäß der folgenden Gleichung auf: DCC 0.5 Äquivalent Aminosäure
Dichlormethan ist ein optimales Lösungsmittel für die Synthese von PSA, insbesondere wo die alpha-aminoschützende Gruppe P die t-Butyloxicarbonylgruppe (t-BOC) ist. Die in der Reaktion gebildete DCU ist jedoch in Dichlormethan sehr unlöslich und fällt während der PSA-Reaktion aus. Nach Vervollständigung der Reaktion wird die PSA-DCM-Lösung von dem DCU-Ausfallprodukt abgefiltert, und es wird mit der zweiten oder Konzentrationsphase begonnen. In der Konzentrationsphase wird das DCM entfernt und durch ein polares aprotisches Lösungsmittel, vorzugsweise N,N-Dimethylformamid (DMF) ersetzt, um die Bindungswirksamkeit während späterer Reaktionen aus der festen Phase heraus zu erhöhen. Die dritte oder Reaktionsphase folgt dann dem allgemeinen oben beschriebenen Schema durch welches um eine zusätzliche Aminosäure an der Sequenz zu befestigen, das Carboxylende der PSA mit einer alpha-aminoungeschützten harzgebundenen Peptidkette reagiert.
Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Vorrichtung beschrieben, um die oben erläuterte Synthese durchzuführen, und zwar unter Bezugnahme auf die Fig. 1a und 1b, 2 und 3, welche jeweils ein Flüssigkeitsausgabesystem zum Hindurchleiten der verschiedenen Aminosäuren, Reagenzien, Lösemittel und Gase durch die Vorrichtung hindurch; ein Computersystem, um die automatische Steuerung über die zahlreichen Schalter durchzuführen, welche die Ventile, Sensoren, die Temperatur bestimmter Gefäße und die Motoren in der Vorrichtung steuern; und ein selbstausgebendes System für den Transport geschützter Aminosäure zur Vorrichtung in der Reihenfolge, die in der Peptidsequenz gewünscht wird, zeigen.
Das Flüssigkeitsführungssystem weist drei Hauptgefäße auf: Ein Aktivierungsgefäß 11, wo PSA gebildet wird; ein Konzentrationsgefäß 13, in welches die PSA-DCM-Lösung aus dem Aktivierungsgefäß so übergeben wird, daß DCM durch DMF ersetzt werden kann, um die Bindung zu erhöhen; und ein Reaktionsgefäß 15, welches die wachsende harzgebundene Peptidkette enthält.
Der Aktivator 11 ist für gewöhnlich zylindrisch, hat ein Volumen von 40 ml und wird vorzugsweise aus Glas hergestellt, um der Bedienungsperson der Vorrichtung die Möglichkeit zu geben, den Fortschritt der Reaktionen oder auch die Reinigungsarbeitsvorgänge visuell zu überwachen. Am Boden des Aktivatorgefäßes befindet sich ,eine Glasfritte 17 mit grober Porengröße, welche verwendet wird, um die DCU-Ausfällung aus der PSA-DCM-Lösung herauszufiltern, wenn die Lösung zum Konzentrationsgefäß 13 übertragen wird. Der Aktivator 11 enthält außerdem eine Überkopfdüse 19, welche nach oben zeigt, um ein vollständiges Auswaschen des Kopfraumes und der Wände, nachdem jede Aminosäure aus dem Kessel heraustransportiert worden ist, zu erreichen. Der Aktivator 11 ist mit dem selbstausgebenden System verbunden und hat Anschlüsse für verschiedene Gase und Reagenzien, wie sie über einen Ventilblock 23 gezeigt sind, wobei es sich um eine Anordnung von Ventilen mit einem toten Volumen von Null handelt, etwa in der Art, wie dies in dem US-Patent 4 008 736 beschrieben worden ist, welches am 22.02.1977 ausgegeben worden und mit VALVE ARRANGEMENT FOR DISTRIBUTING FLUIDS durch Wittman-Liebold, et al bezeichnet ist. Dieser Ventilblock entspricht allem anderen Ventilblöcken des Systems. Der Ventilblock 23 wird unter der Steuerung des Computersystems betätigt, wie dies auch für alle anderen Ventilblöcke und Gasventile der Vorrichtung der Fall ist. Der Aktivator 11 ist über die Düse 19 mit einem weiteren Ventilblock 25 verbunden, welcher den Fluß oder die Strömung von Methanol und DCM in das Gefäß hinein steuert, um die DCU- Ausfällung zu Reinigungszwecken zu lösen, und welcher den Druck im Innern des Behälters steuert, um die Übertragungen von Materialien in den Behälter hinein und aus diesem heraus vom Ventilblock 23 her zu steuern. Übertragungen aus dem Boden des Gefäßes finden durch ein lichtdurchlässiges Rohr 29 statt, das üblicherweise aus Teflon gefertigt worden ist, wobei die Übertragungen durch das Computersystem vermittels eines Flüssigkeitssensors 27 überwacht werden, welcher den Übergang im Rohr 29 zwischen Gasen und Flüssigkeiten detektiert. Das Rohr 29 und andere Rohre in dem System; an welchen entsprechende Flüssigkeitssensoren angebracht sind, haben einen grob kalibrierten Flüssigkeitswiderstand und arbeiten bei einem festen bekannten Druck während der Übertragungsvorgänge, so daß die Zeitdauer, die für die Übertragung erforderlich ist, direkt dem übertragenen Materialvolumen entspricht. Für DCC und HOBT, welche spezielle Volumina benötigen, ist eine kalibrierte Förderschleife vorgesehen, um eine höhere Genauigkeit zu erhalten. Demzufolge kann das Computersystem in genauer Weise alle Strömungen in den Aktivator hinein und aus diesem heraus nachhalten. Obgleich Einzelheiten des Flüssigkeitssensors später beschrieben werden, ist es bedeutsam zu betonen, daß die Verwendung von Flüssigkeitssensoren für die Arbeitsweise der Vorrichtung nicht erforderlich ist. Sie sind jedoch nützlich, um eine bessere Systemsteuerung zu erhalten.
Der nächste Hauptabschnitt des Flüssigkeitsfördersysteins ist das Konzentrationsgefäß 13. Sein Aufbau ist im wesentlichen dergleiche wie der des Aktivators 11. Er enthält eine Überkopfdüse 31 und eine Glasfilterfritte 35 am Boden. Zusätzlich weist jedoch das Konzentrationsgefäß darüber hinaus ein Bandheizgerät 37 auf, das an diesem angebracht ist, und welches verwendet wird, um die Temperaturen im Innern des Gefäßes über die Anwendung eines Thermistors zu steuern, wenn DCM in der PSA-DCM-Lösung durch DMF ersetzt wird. An dem Konzentrationsgefäß 13 sind ein Ventilblock 33 und ein durchsichtiges Übertragungsrohr 39 befestigt, welches durch einen Flüssigkeitssensor 40 überwacht wird. Übertragungen durch das Rohr 39 werden durch das Computersystem mit Hilfe des Ventilblocks 41 gesteuert.
Der nächste Abschnitt des Flüssigkeitsfördersystems stellt das Reaktionsgefäß 15 dar, bei welchem es sich in der bevorzugten Ausführungsform um einen geradlinigen kreisförmigen Zylinder handelt, welcher vertikal ausgerichtet und aus einem bearbeitetem Fluorkohlenwasserstoffpolymer hergestellt worden ist, beispielsweise Teflon oder KEL-F. Das Gefäß ist am oberen Teil durch einen Ventilblock 43 mit Ventilen versehen, während am Boden ein Ventilblock 45 vorgesehen ist, wobei jedes Ventil durch ein Filter, beispielsweise eine Membrane 47 bzw. 49 isoliert worden sind, welche typischerweise aus einem Material wie ZITEX, welches von der Firma Chemplast Inc. of Wayne, N. J. hergestellt wird, obgleich auch Glasfritten verwendet werden könnten. Das Reaktionsgefäß ist so ausgestaltet, daß es in zweckmäßiger Weise geöffnet werden kann, und zwar sowohl zur anfänglichen Beladung mit beladenem Harz als auch für die periodische Entnahme von Aliquotproben. Dies wird dadurch ermöglicht, daß der obere Teil und der untere Teil des Reaktionszylinders durchpassend ausgestaltete Gewindekappen verschraubt werden. Die Schraubkappen werden auch verwendet, um die Membrane an Ort und Stelle zu halten, wobei jede Kappe so ausgestaltet ist, um ein Rohr aufzunehmen, damit dieses Flüssigkeit in den Behälter hinein und aus diesem heraus übertragen kann. Das typische Volumen für den Reaktionsbehälter kann in einem weiten Maße variieren, was von der Länge der zu synthetisierenden Peptidkette und weiterhin vom Gewicht und der Aminosäurebeladung des Syntheseharzes abhängt. Für Ketten von bis zu 50 Aminosäureeinheiten in der Länge, wobei man mit 0,5 g Harz (0.5 m Mol Aminosäure) beginnt, beträgt die bevorzugte Größe ungefähr 40 ml. Für den Fachmann der Synthese als der festen Phase heraus ist ersichtlich, daß das Harz um das Dreibis Fünffache zufolge Lösungsmittelaufnahme während der Synthese anschwellen kann. Massenerhöhung als Ergebnis des Wachstums der Peptidkette kann eine Erhöhung in dem belegten Volumen des Reaktionsgefäßes von anfänglich 10% bis mehr als 80% am Ende der Synthese führen, was von der Länge der Peptidkette abhängt.
Um die wirksame Bindung zu fördern und die Verklumpung der Harzkügelchen zu verhindern, ist es bedeutsam, das Reaktionsgefäß zu verschiedenen Arbeitsstufen im Reaktionszyklus zu bewegen oder zu rütteln. Es ist außerdem ganz bedeutsam, daß die gesamte innere Oberfläche des Reaktionsgefäßes 15 während jedes Waschzyklusses vollständig zwischen den Hinzufügungen von PSA aus dem Konzentrationsgefäß gereinigt wird. Um diese Bewegungen herbeizuführen, wird der Boden des Reaktionsgefäßes auf einem Kreis, welcher einen Radius von ungefähr 2,36 mm (0,093 in.) hat, um seine Mittelachse mit ungefähr 1500 U/min mit Hilfe eines Motors 48 bewegt, welcher mit einer Antriebsscheibe über einen Exzenter am Boden des Reaktionsgefäßes verbunden ist. Dies findet unter der Steuerung des Computer-Systems statt, während die Mitte des oberen Teils des Reaktionsgefäßes im wesentlichen ortsfest gehalten wird, beispielsweise in der Art einer nachgiebigen oder flexiblen Kupplung, welche eine gewisse Bewegung zuläßt, das Gefäß selbst jedoch an einer Drehung gehindert wird. Das Ergebnis ist eine keglige oder konische Rotationsbewegung der Flüssigharzmischung in dem Reaktionsgefäß um die vertikale Achse, welche das Aussehen eines Vortex bietet.
Diese Vortexschüttlung ermöglicht den Einsatz sehr kleiner Volumenmenge an Waschlösungsmittel für alle Waschvorgänge, und auf diese Art und Weise wird der Wirkungsgrad der Entfernung der verwendeten Reagenzien und der Reagenzbei- und -nebenprodukte von dem Syntheseharz erhöht, da es wirkungsvoller ist, diese Materialien durch aufeinanderfolgendes Aufteilen, als durch einen einzigen Extraktionsvorgang zu extrahieren. Die Möglichkeit, kleine Volumenmengen zu verwenden, ist ein Ergebnis des Winkelmomentes, der Flüssigharzmischung, der dieses durch die konische Bewegung erteilt wird. Dieser Vortexvorgang erzeugt eine Flüssigkeitsverteilung in dem Gefäß, so wie diese in Fig. 4 wiedergegeben ist, wobei die Flüssigkeit in dem Reaktionsgefäß veranlaßt werden kann, mit allen inneren Flächen des Reaktionsgefäßes in Kontakt zu gelangen, und zwar mit sehr kleinen Volumenmengen des Lösungsmittels bei richtiger Auswahl der Rotationsgeschwindigkeit. Das Ergebnis ist ein effizienteres Waschen des Harzes mit kleineren Volumina teurer Lösemittel.
Außerdem vermeidet diese Art der Bewegung oder Schüttelung die Klumpenbildung des Harzes und erlaubt eine Gesamtflüssigkeit- Harz-Wechselwirkung ohne die Verwendung von Rührern mit mechanischer Rührung. Bei mechanischer Rührung bewirken die Scher- und Harzablösevorgänge, die durch den Drehteil herbeigeführt werden, einen Bruch der Harztröpfchen in immer kleiner werdende Partikel, welche letztendlich zur Verklebung der Filter führen, beispielsweise der Membrane 47 und 49, was zu einer Unterbrechung des Synthesevorganges zwingt. Eine solche Unterbrechung kann direkte Einflüsse auf die Synthese nehmen, das heißt zur Verringerung der Strömung (aus dem Reaktionsgefäß heraus) führen und könnte während der Entfernung des Säure-Schutzes auftreten, wodurch das harzgebundene Peptid Zersetzungseinflüssen bei überlanger Säureaussetzung ausgesetzt wird. Mit dem Vortexmischer werden keine derartigen Scher- und Schlagbeanspruchungen auf die Harztröpfchen ausgeübt. Für den Fachmann ist es jedoch selbstverständlich, daß in der bevorzugten Ausführungsform das Reaktionsgefäß in der Gestalt eines geradlinigen kreisförmigen Zylinders aufgebaut ist, wenngleich andere Formen auch verwendet werden können, vorausgesetzt, daß sie nicht der relativ gleichmäßigen Aufwirbelung der Flüssigkeit im Gefäß entgegenwirken, beispielsweise scheint eine Form in der Art eines Weinglases, wünschenswerte Vorteile für den Waschzyklus zu haben. Außerdem ist zu Zwecken der maximalen Wirksamkeit die Vorrichtung typischerweise mit drei Reaktionsgefäßen 15 ausgerüstet, während lediglich ein Konzentrationsgefäß 13 und ein Aktivator 11 verwendet werden, wobei die Flüssigkeitsverteilung von diesen beiden letztgenannten Gefäßen in zweckmäßiger Weise durch Ventile herbeigeführt wird, die mit den drei Reaktionsgefäßen und den entsprechenden Ventilblöcken 43 und 45 zusammenarbeiten. Es ist jedoch selbstverständlich, daß jedes dieser Reaktionsgefäße einem separaten sequenziellen Prozeß zur Erzeugung eines Peptids entspricht, das heißt, das erste Peptid wird in dem ersten Reaktionsgefäß gebildet, sodann das zweite Peptid im zweiten Reaktionsgefäß, woraufhin das dritte Peptid in dem dritten Gefäß gebildet wird.
Um das Fortschreiten der Synthese in dem Reaktionsgefäß zu überwachen, ist ein Harzprobengebersystem 51 vorgesehen. Das Gebersystem weist ein Rohr 53 auf, welches mit dem Innenraum des Reaktionsgefäßes verbunden ist, um aus diesen Materialien zu extrahieren, wobei der Fluß durch das Rohr durch ein computergesteuertes Ventil 55 geregelt wird, üblicherweise ein spulenbetätigtes Absperrventil. Das Rohr 53 erstreckt sich in den Bodenteil des Harzprobenbehälters 57 hinein, welcher eine Membrane 59 aufweist, welche üblicherweise aus ZITEX gebildet ist und an dem oberen Teil angeordnet ist.
Ebenfalls mit dem oberen Teil des Behälters 57 an der der Membran 59 gegenüberliegenden Seite ist eine Leitung 61 angeschlossen, die mit dem Ventilblock 45 verbunden ist. Vom Boden des Behälters erstreckt dich eine weitere Leitung 65, welche über ein Ventil 67, wobei es sich ebenfalls typischerweise um ein elektromagnetisch betätigtes Abklemmventil handelt (um ein totes Volumen mit dem Wert Null zu erreichen), betätigt ist, um von dem Behälter her Fraktionen aufzufangen.
Das Gasverteilungssystem, um die gewünschten Übertragungen innerhalb der Vorrichtung zu erhalten, ist sowohl in Fig. 1a als auch in Fig. 1b gezeigt und weist drei Gasverzweigungen, nämlich die Verzweigung C, die Verzweigung CC und die Verzweigung D auf, wobei zugehörige Regeleinrichtungen zur Steuerung der Verteilung aus den Flaschen über die Ventilblöcke vorgesehen sind. Ebenfalls sind kleinere Verzweigungen, eine Verzweigung 70 zur Verteilung von DCM über die Vorrichtung und eine Verteilung 71 für die Verteilung von DMF zu dem Aktivator und das Konzentrationsgefäß vorgesehen. Gasströmungen durch das System werden durch das Computersystem mit Hilfe von elektromagnetischen Ventilen gesteuert, beispielsweise dem Ventil 73 (es handelt sich zum Beispiel um Fluorkohlenwasserstoffventile, die durch die Firma Angar, Incorporated hergestellt werden und durch Ventilblöcke, die bereits diskutiert worden sind.
Um beispielsweise CH&sub2;Cl&sub2; in den Aktivator 11 hineinzuübertragen, wird die Gasverzweigung C verwendet, um den Druck in den CH&sub2;Cl&sub2;-Flaschen (unten in Fig. 1a) zu erhöhen, um die Verzweigung 70 zum Ventilblock 25 zu öffnen und um den Ventilblock 25 zu den CH&sub2;Cl&sub2;-Einlässen in den Aktivator 11 zu öffnen. Um Flüssigkeit vom Aktivator 11 zum Konzentrationsgefäß 13 zu transportieren, wird der Druck im Aktivator 11 durch Öffnen des Gaszulaufs des Ventilblocks 25 erhöht, der Zulauf, der der fünften Leitung an den Ventilblöcken 23 und 41 entspricht, wird geöffnet, der Zulauf zur Leitung 39 wird geöffnet und die Belüftung am Ventilblock 33 wird geöffnet. Alle anderen Ventile sind geschlossen. In entsprechender Weise wird die Übertragung von PSA/DMF von dem Konzentrationsgefäß zum Reaktionsgefäß durchgeführt, indem Gasdruck an das Konzentrationsgefäß über den Block 33 angelegt wird und die Blöcke 41 und 45 die Leitung 4 zwischen dem Konzentrationsgefäß und dem Reaktionsgefäß öffnen.
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung des Computersystems, welches einen auf einem Mikroprozessor basierenden Mikrocomputer 81 aufweist, der mit einer arithmetischen Einheit 87 ausgestattet ist. Weiterhin ist eine Massenspeichereinrichtung 84, beispielsweise ein Floppy Disk, vorgesehen, ein RAM Speicher mit wahlfreiem Zugriff 83 für Hochgeschwindigkeitsarbeiten; eine Ausgabevorrichtung 85, beispielsweise ein Drucker; und ein Touch Screen-Bildschirm 82, welcher in der bevorzugten Ausführungsform als einziger Eingang der Vorrichtung arbeitet, der dem Benutzer direkt zugänglich ist. Das System betätigt eine Schalteinrichtung 89, wobei ein Schalter die Haupt Ein/Aus-Schalteinrichtung ist, welche die Bedienungsperson einsetzt, um die Ventile, die Mischer, das Selbstausgabesystem 90 und die Heizeinrichtung 37 zu steuern. Üblicherweise ist eine 1:1 Korrespondenz zwischen den Einrichtungen und den Schaltern im System so vorgesehen, daß jede Einrichtung einer bestimmten Schalterzahl entspricht. So kann sich beispielsweise Schalter 0 bis 63 auf die Ventilnummern 0-63, die Heizeinrichtung kann durch den Schalter 64 gesteuert werden und dergl. Um außerdem andere Elemente der automatischen Steuerung zu realisieren, empfängt der Mikrocomputer 81 Eingangssignale von den Flüssigkeitssensoren, um die Zeitpunkte der Übergänge Gas-Flüssig und Flüssig-Gas zu identifizieren, und um Informationen von einem Barcodeleser 108 zu erhalten, der an dem Selbstausgabesystem angeordnet ist, um die Identifizierung der in den Synthetisierer eingegebenen Aminosäuren nachzuprüfen.
In Fig. 3 ist eine Draufsicht auf das Selbstausgabesystem gezeigt. Das System weist eine Führung 101 auf, welche als eine Spur oder dergl. dient, um die Bewegungsrichtung einer Reihe von Kartuschen festzuhalten und zu steuern, beispielsweise einer Kartusche 105. Jede Kartusche in der Anordnung enthält eine spezielle geschützte Aminosäure und wird in der Anordnung in der Reihenfolge plaziert, die der gewünschten Sequenz in dem zu synthetisierenden Peptid entspricht. Zweckmäßigerweise ist die Führung zur visuellen Inspektion der Anordnung offen und ist so orientiert worden, daß sie dem Peptid mit dem Carboxylende an der rechten Seite entspricht, was der üblichen Art und Weise der Beschreibung von Peptiden in der Literatur entspricht und den Vergleich der Sequenz in der geladenen Führung mit derjenigen des gewünschten Peptids erleichtert. Um die Reihe oder Anordnung der Kartuschen festzuhalten, drückt ein Druckblock 103 gegen die letzte Kartusche der Reihe, indem eine Federtrommel 107 typischerweise über ein Stahlband 110 verwirklicht ist, welches über eine Riemenscheibe wirkt. Dies gestattet die Bewegung des Druckblocks längs der Führung, wobei ständig eine im wesentlichen konstante Kraft auf die Reihe der Kartuschen einwirkt, damit auf diese Art und Weise eine Anpassung an unterschiedliche Längen möglich ist, welche Peptiden unterschiedlicher Längen entsprechen. Zusätzlich kann mehr als ein Peptid aus einer einzigen Anordnung von Kartuschen synthetisiert werden. Am Ende der Führung, dem Block 103 gegenüberliegend, befindet sich ein Ejektorsystem 115, welches über einen Luftzylinder 113 angetrieben wird, um die Kartuschen in der Probenahmeposition 117 zu haltern, so wie dies für die Kartusche mit der Nummer 2 gezeigt worden ist, und um die Kartuschen auszuwerfen, wenn die Aminosäuren, die in ihnen enthalten sind, ausgetreten sind. Die Position 111 für die Kartusche mit der Nummer 1 erläutert die Auswerfposition des Ejektorsystem 115, aus welcher die benutzte Kartusche in einen nicht gezeigten Sammler herabfällt und entnommen werden kann. Wenn der Ejektor in seine Normalstellung nach dem Auswerfen zurückkehrt, wirkt die konstante Kraft der Feder 107 über den Druckblock 103 und drückt die nächste Kartusche in die Abgabeposition.
In dem Selbstausgabesystem ist auch ein Barcodeleser 108 mit eingeschlossen. In der bevorzugten Ausführungsform. Ist jede Kartusche mit einem ganz bestimmten Barcode versehen, der der Aminosäure entspricht, die sie enthält. Wenn eine Kartusche längs der Führung zur Position des Barcodelesers hinbewegt wird, liest der Leser das Barcode-Etikett und sendet die Information zum Computersystem. Falls der Computer vorangehend bereits auf ein spezielles Polypeptid eingestellt worden ist, führt er einen Übereinstimmungscheck durch, um sicherzustellen, daß die Kartusche sich in der richtigen Stellung in der Sequenz des Polypeptids befindet. Falls der Computer noch nicht auf ein spezielles Polypeptid eingestellt worden ist, durchläuft das System eine offene Schleife und der Computer verwendet die Information vom Barcodeleser, um das Syntheseprotokoll aufzurufen, welches für die spezielle Aminosäure in der Kartusche verwendet wird, und um die verwendete Aminosäure zu registrieren. Jede Kartusche enthält darüber hinaus eine stöchiometrisch korrekte Menge der Aminosäure.
Um Aminosäure aus einer Kartusche freizugeben, ist das System mit zwei Spritzen-Nadeln (in Fig. 1 gezeigt) ausgestaltet, einer Nadel 121, um Gasdruck zuzuführen bzw. um zu belüften, und einer Nadel 123, um DCM zu der Kartusche zu liefern, um die Aminosäure zu lösen und um die gelöste Aminosäure und DCM freizugeben. Die beiden Nadeln sind typischerweise vertikal ausgerichtet und mit einem (nicht gezeigten) Luftzylinder versehen, um die Nadeln nach oben und aus dem Weg herauszubewegen, wenn eine neue Kartusche an die Stelle gebracht wird, und um die Nadeln durch den oberen Teil der Kartusche nach unten zu bewegen, um Misch- oder Ausgabevorgänge durchzuführen.
Die Fig. 5a, 5b und 5c zeigen Einzelheiten typischer Kartuschen 105, die in dem Selbstausgabesystem verwendet werden. In der bevorzugten Ausführungsform ist der Behälter aus geblasenem hochdichten Polyethylen hergestellt und hat einen Körperteil 180 von in wesentlichen rechteckigem Querschnitt, so daß insgesamt ungefähr 7 ul aufbewahrt werden können. Die Kartusche hat darüber hinaus einen Halsteil 133, auf welchem eine serumdichte Kappe 135 befestigt ist, welche eine einstückige Wand oder ein Septum 137 aufweist, welche der zwangsweisen Versiegelung der Kappe auf dem Hals dient. Wie in den Fig. 4a und 4b gezeigt, beträgt die Abmessung D1 ungefähr 1,4 cm oder 0,56 in., was typischerweise beträchtlich kleiner als die Dimension D2 ist (2,85 cm oder 1,12 in.), so daß eine relativ große Zahl von Kartuschen (bis zu 50) in einer Anordnung auf der Führung 101 eingesetzt werden kann, ohne daß die Länge der Anordnung unhandbar groß wird. Um die richtige Positionierung in der Anordnung zu fördern, ist die Kartusche mit zwei im wesentlichen flachen Oberflächen 134 und 136 an jeder Seite ausgebildet.
Der Boden der Kartusche ist in der Form von zwei geneigten Ebenen 140 und 141 ausgebildet, die sich in einem Winkel schneiden, um einen V-förmigen Behälter zu schaffen. Wenn die Kartusche sich in der Probenabgabeposition in dem selbstausgebenden System befindet, ragt die Nadel 123 sehr dicht bis zur Schnittlinie 143 der beiden Ebenen herab, was dem Ort der Punkte entspricht, die die niedrigste Erhöhung in der Kartusche haben, d. h. im Boden des Behälters. Die Nadel in der Nähe des tiefsten Punktes der Kartusche anzuordnen, hilft sicherzustellen, daß das gesamte Material in der Kartusche ausgegeben wird, so daß eine genaue Steuerung der Stöchiometrie möglich gemacht wird. Um die Kartusche, wenn sie in der Führung 101 sitzt, zu stabilisieren, erstreckt sich ein Flansch 145 quer über den Boden der Kartusche in einer Richtung zur Schnittlinie 143 senkrechten Richtung. Der V-Boden und der Flansch 145 ermöglichen es der Kartusche, in einer stabilen Aufrechtlage ohne Unterstützung stehen zu können. Die Kartusche weist außerdem eine Einbuchtung 147 um ihren Außenumfang herum auf, um die genaue Anordnung eines Barcodeetiketts zu fördern, um die Genauigkeit des Arbeitens des Barcodelesers 108 beim Ablesen des Etiketts sicherzustellen.
Fig. 6 zeigt eine Tabelle, die die einzelnen Dimensionen der Flasche wiedergibt.
In den Fig. 7a und 7b sind Schnittansichten eines typischen Flüssigkeitssensors gezeigt, der im Synthesizer verwendet wird. Die Draufsicht nach Fig. 7b zeigt die Einrichtung symmetrisch zur Mittellinie, so daß die obere Hälfte der Fig. 7b der Unteransicht der oberen Hälfte der Vorrichtung entspricht, und die untere Hälfte der Fig. 7b entspricht der Draufsicht der unteren Hälfte der Vorrichtung. Die Vorrichtung ist als ein wäscheklammerähnliches Rohrhaltergehäuse ausgebildet, welches einen oberen Teil 222 und einen unteren Teil 220 aufweist, wobei diese Teile typischerweise aus glasgefülltem Polyamid oder Kunststoff gebildet sind, und jeder von ihnen mit einer Nut 229 mit einer Doppelkurvenform ausgebildet ist, die sich über ihre jeweilige Breite erstreckt, um sie an ein durchsichtiges Rohr anzupassen. Die Doppelkurvenform ist vorgesehen, um dem oberen und dem unteren Teil zu ermöglichen, mit zwei unterschiedlichen Rohrdurchmessern in Zwangseingriff treten zu können, wobei in der bevorzugten Ausführungsform typischerweise der Außendurchmesser 3,18 oder ungefähr 1,59 mm beträgt (ein Achtel oder ein Sechszehntel in.) . Die Teile können aus Teflon hergestellt worden sein. Der obere und der untere Teil 222 und 220 sind über Stifte 212, 213, 214 und 215 mit zwei Trägern 209 bzw. 211 jeweils befestigt, welche typischerweise als gedruckte Stromkreisplatten ausgebildet sind (Phenolic) . An dem Ende, welches dem Rohrhalter gegenüberliegt, werden die Grundträger über zwei Nieten 240 und 241 von im wesentlichen der gleichen Länge im festen Abstand zueinander gehalten. Indem eine Dicke des Rohrhaltergehäuses, von oben nach unten, sichergestellt wird, welche dicker ist als die Länge der Nieten, können die Grundträger eine federähnliche Kraft ausüben, um den oberen und den unteren Teil des Gehäuses zusammenzuhalten, um dadurch einen festen Halt des Rohres innerhalb der Nut 229 zu schaffen. Um die genaue Ausrichtung des oberen und des unteren Teils sicherzustellen, ist eine Keilanordnung vorgesehen, welche aus Keilen 228 und 226 gebildet ist, die an jeder Seite des oberen Teils angeordnet sind und in Ausnehmungen 227 (nicht gezeigt wegen des in Fig. 7b weggeschnittenen Teils) und 228 hineinpassen, welche in dem unteren Teil 220 angeordnet sind. In der Seitenansicht der Fig. 7a ist der untere Teil 220 weggeschnitten, um eine Ausnehmung 250 freizulegen, in welcher eine Fotodiode 270 untergebracht ist. Unmittelbar gegenüberliegend zur Ausnehmung 250 auf der anderen Seite der Nut 229 befindet sich eine identische Ausnehmung 251, die im oberen Teil 222 angeordnet ist, so daß sie einen Fotodetektor 271 aufnimmt, welcher verwendet wird, um die Veränderung in der Intensität des Lichtes festzustellen, welches von der Fotodiode her erhalten wird, wenn die Grenzfläche zwischen einer Flüssigkeit und einem Gas oder zwischen einem Gas und einer Flüssigkeit sich im Rohr herabbewegt, welches in der Nut 229 gehalten ist, wobei die Veränderung in der Intensität eine Folge des Unterschieds in der Fokussierung der Lichtstrahlen ist, die als Folge der Differenz der Brechungseigenschaften von Flüssigkeit und Gas entsteht. Außerdem ist eine Ausnehmung 252 im oberen Teil 222 vorgesehen, welche an einen Halter für den Fotodetektor angepaßt ist, und eine entsprechende Ausnehmung 253 ist im unteren Teil 220 vorgesehen, die der Aufnahme der Fotodiode dient. In ähnlicher Weise ist eine Leitung 260 durch den Bodenteil 220 und eine Leitung 261 durch den oberen Teil 222 vorgesehen, um Wege für die elektrischen Leiter von der Diode bzw. dem Detektor vorzusehen, die zu Lötpunkten 230 und 231 führen, welche an den Enden von elektrischen Läuferbahnen 233 und 234 und an der Außenseite angeordnet sind und als Leiter für Detektorsignale dienen. Energie wird der Fotodiode und dem Detektor über Anschlüsse 235 und 236 zugeführt. Anschlüsse 237 und 238 bilden eine gemeinsame Erdung sowohl für die Fotodiode als auch den Detektor.
Die Synthese eines Peptids wird zuerst einmal durch Beladen des Reaktionsgefäßes mit Harz begonnen, typischerweise eines Harzes, an welchem die erste Aminisäure der Sequenz befestigt ist, und durch Eingeben der gewünschten Aminisäuresequenz in den Computer. Die Bedienungsperson lädt dann die Aminosäurekartuschen in das Selbstausgabesystem in der linearen Sequenz bzw. Kette, die der Aminosäuresequenz des gewünschten Peptids entspricht.
Ein Aktivierungszyklus beginnt, wenn die Nadeln 121 und 123 das Septum der ersten Kartusche durchstechen und die Nadel 123 eine genau festgelegte Menge an DCM injiziert. Gasspritzer aus der Nadel 121 werden verwendet, um die geschützte Aminosäure in DCM zu mischen oder zu lösen. Nach der Lösung der geschützten Aminosäure wird diese ausgegeben und in den Aktivator gegeben. Um sicherzustellen, daß die gesamte Menge der geschützten Aminosäure übertragen wird, wird ein zweites (und vielleicht ein drittes) Volumen an DCM in die Kartusche gegeben und sodann zum Aktivator befördert. Sodann wird, basierend auf der Aminosäure 0,5 Äquivalente von DCC in DCM in den Aktivator gegeben, und die Lösung wird durch periodische Gasstöße von beispielsweise Argon oder Stickstoff gemischt. Nach einer vorbestimmten Zeitspanne, die ausreichend ist, um die Umwandlung der Aminosäure in symmetrische Anhydride zu vervollständigen, wird die Gasleitung am Ventilblock 25 geöffnet und die DCM-Lösung der PSA wird unter Druck durch den Ventilblock 23 zum Konzentrationsgefäß gefördert. Die Fritte 17 am Boden des Aktivatorgefäßes hält die gesamte DCU- Ausfällung zurück, die als Nebenprodukt in dem Aktivator gebildet wird. Unter Softwaresteuerung können die PSA- Reaktionszeiten individuell für jede Aminosäure eingestellt werden, um die PSA-Bildung zu optimieren und das Maximum an DCU Ausfällung zu erhalten. Nach Übertragung der PSA/DCM-Lösung in das Konzentrationsgefäß wird eine Volumenmenge DMF zugegeben. Die Belüftung des Ventilblocks 33 wird sodann geöffnet und ein Inertgasstoß durch den Ventilblock 41 hindurch beginnt damit, DCM zu verflüchtigen. Dies wird ohne bemerkenswerte Reduzierung des anfänglichen DMF-Volumens durchgeführt, wobei DMF einen bemerkenswert höheren Siedepunkt als DCM hat. Hitze wird mit Hilfe des Bandheizgerätes 37 zugeführt, um die Wärmeverluste durch Verdampfung von DCM zu ersetzen. Während dieses Lösungsmittelaustauschprozesses können unterschiedliche maximale interne Temperaturen automatisch auf die speziellen thermischen Stabilitäten der verschiedenen geschützten Aminosäure-PSA-Verbindungen unter Verwendung von Thermistoren eingestellt werden. Gleichzeitig mit dem Lösungsmittelaustauschprozeß im Konzentrationsgefäß wird die DCU-Ausfällung in dem Aktivator durch aufeinanderfolgende Waschvorgänge mit einer Alkohol-DCM-Mischung über das obere Ventil (Ventilblock 23) und die Überkopfwaschdüse 19 entfernt. Der Aktivator wird mit Dichlormethan in Vorbereitung für die nächste PSA-Reaktion endgültig gewaschen. In dem Konzentrationsgefäß wird, nachdem das Dichlormethan entfernt worden ist, die PSA-DMF-Lösung unter Druck aus dem Konzentrationsgefäß in das Reaktionsgefäß übertragen, welches die harzgebundene alpha-aminio-ungeschützte wachsende Peptidkette enthält.
Die PSA-DMF-Lösung, welche aus dem Konzentrationsgefäß in das Reaktionsgefäß gebracht worden ist, reagiert mit der ungeschützten Alpha-Amino-Funktion des harzgebundenen Peptids während einer Zeitspanne, die ausreichend ist, um die Reaktion vollständig durchzuführen (typischerweise mehr als 99%). Danach werden das verbrauchte Reagenz und das Lösungsmittel durch aufeinanderfolgende Lösungsmittelwaschvorgänge unter Einsatz einer Wirbel bzw. Rüttelbehandlung ausgewaschen.
Um mit einem neuen Zyklus der Synthese im Reaktionsgefäß zu beginnen, ist es zuerst notwendig, die Alpha-Amino-Schutzgruppe der letzten Aminosäure zu entfernen, welche an der Kette gebunden ist. In dem speziellen Fall von t-BOC-geschützten Aminosäuren wird eine Lösung aus Trifluorsäure (TFA) und DCM, üblicherweise 65% TFA, unter Druck in das Reaktionsgefäß übertragen und der mechanische Rührvorgang wird zwecks wirksamer Vermischung periodisch durchgeführt. Nach einer Zeitspanne, die ausreichend ist, um die t-BOC-Alpha-Amino- Schutzgruppen (üblicherweise um 15 Minuten) vollständig zu entfernen, wird die Flüssigkeit unter Druck durch den Ventilblock 45 in den Abfallsammler geleitet. Das Harz wird dann rasch mit kleinen Volumeneinheiten von DCM gewaschen, welche entweder durch das obere oder das untere Ventil während der mechanischen Behandlung eingeleitet wird. Die Neutralisation wird durch Einführen von Diisopropylethylamin (DIEA) und DMF oder DCM durchgeführt wird, wobei gerührt wird und danach eine Abgabe in den Abfallsammelbehälter unter Druck erfolgt. Die Neutralisation wird für gewöhnlich einmal wiederholt. Das Harz wird dann durch aufeinanderfolgende Zugaben von DCM (oder DMF) in kleinen Volumeneinheiten durch den Ventilblock 45 gewaschen, wobei das obere Ventil (Ventilblock 43) zum Abfallbehälter geöffnet ist, währenddessen gerüttelt wird (der Rüttelvorgang kann kontinuierlich stattfinden oder intermittierend ausgeführt werden). Nach sorgfältigem Waschen der ungeschützten Aminoharzverbindung, wird die nächste Aminosäure-PSA/DMF-Mischung unter Druck aus dem Konzentrationsgefäß in das Reaktionsgefäß heraus übertragen.
Um das Harz während der Synthese oder bei Vervollständigung des Peptids aufzusammeln, wird das erste Ventil 55 geöffnet und die Leitung 61 wird durch den Ventilblock 45 geöffnet, wodurch dieser zum Abfallsammelbehälter hin entlastet wird, während das Ventil 67 geschlossen bleibt. Das Reaktionsgefäß wird sodann aus dem oberen Bereich unter Druck gesetzt, während es geschüttelt wird, so daß das Harz und die Reaktionslösung in den Probenbehälter 57 gefördert werden. Dies drückt das Harz gegen die Membrane 59. Das Ventil 45 wird sodann geschlossen, das Ventil 67 geöffnet und die Abfalleitung des Ventilblocks 45 wird geschlossen. DCM wird über die Leitung 61 vom Ventilblock 45 zurückgeführt, um die Membrane von dem Harz zu befreien und um die Harz/DCM-Mischung in einem Fraktionssammler 64 abzulegen. Der Probenbehälter und seine zugehörige Rohrleitung wird dann durch Schließen des Ventils 67 gewaschen, wobei das Reaktionsgefäß belüftet wird und die DCM über die Leitung 61 vom Ventil 45 durch das Ventilblock 45 in das Reaktionsgefäß übertragen wird.
Dieses integrierte System ermöglicht gleichzeitige Operationen in dem Reaktionsgefäß, in dem Aktivator und in dem Konzentrationsgefäß. Beispielsweise können das Ablösen des Schutzes, die Neutralisation, die Bindung und Waschvorgänge im Reaktionsgefäß zur gleichen Zeit stattfinden, wo die nächste Aminosäure-PSA in dem Aktivatorgefäß gebildet wird. Das Konzentrationsgefäß kann zur gleichen Zeit gereinigt werden, wo die Aktivierung im Aktivatorgefäß stattfindet, und das Aktivatorgefäß kann gereinigt werden, während das Konzentrationsgefäß mit dem Austausch des Lösemittels beschäftigt ist. Diese Gleichzeitigkeit von Operationen ermöglicht große Einsparungen in der Zykluszeit. Der Anhang A zeigt eine weitere mit Einzelheiten angereicherte Beschreibung dieser Gleichzeitigkeit durch Erläuterung der zeitlichen Steuerung der Operationen in jedem Gefäß während eines vollständigen Zyklus, um eine einzelne Aminosäure zu binden.
Das System erlaubt darüber hinaus die Verwendung verschiedener Synthesemethodologien. Obgleich der oben beschriebene Ansatz für die Peptidsynthese durch t-BOC-Aminosäure-PSA beschrieben worden ist, können abgewandelte Methoden eingesetzt werden, welche geschützte Aminosäuren-PSA-Verbindungen einsetzen, beispielsweise F-MNOC, und dies könnte auch ohne weiteres leicht realisiert werden. In entsprechender Weise könnte die Synthese durch andere aktive Karboxyl-Spezies realisiert werden, beispielsweise gemischte Anhydride, aktive Ester, Säuren auf Chlorbasis und dergl., welche die Aktivator- und Konzentrationsgefäße einsetzen, um die aktivierten Karboxyl- Spezies unmittelbar vor der Einführung in das Reaktionsgefäß vorformen, um auf diese Art und Weise die Notwendigkeit für Speicherbehälter für aktivierte Aminosäurenspezies zu beseitigen, welche über den Zeitrahmen der Peptidsynthese vorgehalten werden müssen.
Wie vorangehend bereits angegeben können spezielle Bindungsvorgänge für Asparagin, Glutamin und Arginin notwendig sein und in dem Aktivator- und Konzentrationsgefäß initiiert werden. In diesen Fällen sind Doppelbindungen mit Hydroxybenzotirazol (HOBT) und DCC allgemein erforderlich, bei welchen äquimolare HOBT und DCC in DMF oder DMF/DCM vorangehend ins Gleichgewicht gebracht worden sind und dann mit einem Äquivalent geschützter Aminosäure zwecks Reaktion im Reaktionsgefäß kombiniert werden.
Um dieses Ergebnis zu erzielen ist ein Ansatz, zuerst ein Äquivalent von jeweils HOBT/DMF und DCC/DCM in das Konzentrationsgefäß über die Ventilblöcke 23 und 41 zu transportieren. Dann werden zwei Äquivalente geschützter Aminosäure aus einer Aminosäurekartusche in das Aktivatorgefäß in zweckmäßigen Lösemitteln (DMF/DCM) übertragen. Darauffolgend wird die Hälfte des Materials im Aktivatorgefäß durch Zeit- Druck-Steuerung in das Konzentrationsgefäß zur Aktivierung (welches die vorher austarierte HOBT/DCC/DMF/DCM enthält) übertragen, wonach die aktivierte Mischung in das Reaktionsgefäß gebracht wird. Eine entsprechende Aktivierung wird für die zweite Bindung in der Nähe des Endes des ersten Bindungszyklusses durch erneutes Laden des Konzentrationsgefäßes mit einer zweiten gleichmolaren Mischung von HOBT/DCC begonnen, woraufhin die Zugabe des zweiten Äquivalentes an Aminosäure aus dem Aktivatorgefäß folgt.
Prinzipiell ist die Softwaresteuerung der Vorrichtung eine Angelegenheit des Stellens von Ventilen und anderer geschalteter Einrichtungen, und zwar zum richtigen Zeitpunkt entweder an oder aus, um die gewünschten Ströme der verschiedenen Materialien von einem Gefäß in ein anderes zu erhalten. Zur gleichen Zeit sind viele der verschiedenen Stufen in der Synthese aus der festen Phase heraus einfache Wiederholungen und in ihrer Zahl nicht außergewöhnlich häufig. Eine solche Situation führt praktisch von selbst zu einem komplizierteren Steuerkonzept, welches der Funktionssteuerung durch die Bedienungsperson dient, anstatt daß die Bedienungsperson in Einzelhalten die Arbeitsweisen der einzelnen Ventile vorschreibt, um das gewünschte Ergebnis zu erzielen. Beispielweise würde die Bedienungsperson dem System am häufigsten den Auftrag erteilen, die Inhalte des Aktivatorgefäßes zum Konzentrationsgefäß zu übertragen, anstatt eine viel detailliertere Reihe von Steuerbefehlen zu formulieren, wie beispielsweise (1) Überprüfen des Konzentrationsgefäßes, um zu sehen, ob es bereit ist, etwas aufzunehmen; (2) Öffnen des Ventils am Ventilblock 33; (3) Öffenen der Ventilblöcke 23 und 41 an der Verbindung der Übertragungsleitung zwischen den Gefäßen; (4) Öffnen des Gasventils, um das Aktivatorgefäß unter Druck zu setzen; (5) Absperren der Ventile nach einem Signal vom Flüssigkeitssensor 39, welches anzeigt, daß die Flüssigkeit übertragen worden ist. Um diese Art von benutzerfreundlichen Lösungen zu erhalten und dennoch die Möglichkeit der vollkommen unabhängigen Steuerung über jedes einzelne Elemente der Vorrichtung beizubehalten, wird das Softwaresteuersystem durch Touch Screen-Bildröhren realisiert, welche eine Reihe von Menüs einsetzen, welche dazu dienen, die Bedienungsperson mit einem breiten Spektrum von Möglichkeiten zu versorgen, wobei diese von einem Extrem des Einsatzes des Systems in einer vollständig automatischen Arbeitsweise zu dem anderen Extrem des Betriebs des Systems führt, in dem die einzelnen Ventile geschaltet werden.
Das Steuerkonzept, das eingesetzt wird, ist ein solches, daß jede einzelne Bindung einer Aminosäure zur Peptidkette drei vollständigen Zyklen entspricht: einem Zyklus im Aktivatorgefäß, einem Zyklus im Konzentrationsgefäß und einem Zyklus im Reaktionsgefäß. Jeder dieser Zyklen besteht aus Befehlssätzen von zeitlich individuell geregelten Stufen, von denen jeder einer Funktion entspricht, die in dem Gefäß stattfinden kann. Als eine allgemeine Definition kann eine Funktion als entsprechend einem mit Namen versehenen Satz von Schaltern betrachtet werden, welche gleichzeitig eingeschaltet werden (wobei die Normalstellung jedes Schalters der Aus- Zustand ist). In der Praxis ist es vorteilhaft, die verschiedenen Funktionen mit Zahlen zu versehen, und diese gefäßmäßig zu trennen. Eine Funktion könnte beispielsweise sein: DCM zum Aktivator. Eine derartige Funktion erfordert eine spezielle Konfiguration von offenen Ventilen, damit DCM zum Aktivator gebracht werden kann. In einem Zyklus des Aktivators kann diese Funktion mehrfach auftreten, das heißt, nachdem die große Menge des symmetrischen Anhydrids zum Konzentrationsgefäß übertragen worden ist, kann es vorteilhaft sein, das Aktivatorgefäß und die DCU-Ausfällung mehrfach mit DCM auszuwaschen, um jedweden Rest symmetrischer Anhydride zu entfernen. Jedesmal, wenn diese Funktion durchgeführt wird, entspricht sie einer unterschiedlichen Stufe in dem Reaktionszyklus, der in dem Aktivatorgefäß stattfindet, und entsprechendes gilt für andere Funktionen, die in jedem Zyklus erforderlich sind. Das Endergebnis ist, daß jeder Zyklus in einem Gefäß eine Reihe von Stufen aufweist, wobei jede Stufe einer Funktion entspricht, die dem Gefäß zugeordnet ist. Eine typische Liste von Funktionen ist im Anhang B gezeigt. Um dieses Konzept besser erläutern zu können, werden nunmehr die einzelnen Steuermenüs beschrieben werden.
Fig. 8 zeigt das Hauptmenü des Systems, so wie es auf dem Touch Screen-Bildschirm erscheint und dem unteren Teil eines Baumes (in Fig. 17 gezeigt) aus unterschiedlichen anderen mit weiteren Einzelheiten versehener Menüs entspricht. Jeder umgrenzte Block entspricht einem Bereich auf dem Bildschirm, durch welchen die Menüfolgen in dem Baum zugänglich sind. Das Berühren des Schirms beispielsweise im Block der, mit Peptide SEC. EDITOR beschriftet worden ist, initiiert eine weitere Darstellung, Fig. 9, welche alle Aminosäuren auflistet, und ermöglicht die Auswahl und die Darstellung der Reihenfolge der in dem zu synthetisierenden Peptid auftretenden Aminosäuren vom N-Ende bis zum C-Ende, indem einfach derjenige Block berührt wird, der den Namen der gewünschten Aminosäure in der gewünschten Sequenz enthält.
Berühren des Schirms im Block, der mit "PEPTIDE CHEMISTRY EDITOR" beschriftet ist, wenn das Hauptmenü dargestellt wird, bringt das PEPTIDE CHEMISTRY EDITOR-Menü, Fig. 10, welches der Bedienungsperson ermöglicht, entweder Zyklusspezifikationen in einem speziellen Gefäß oder die Arbeitsablaufspezifikation zu erzeugen oder auszugeben. Wenn beispielsweise ausgewählt worden ist, einen neuen Aktivatorzyklus zu kreieren oder auszugeben, erscheint ein Zykluseditor-Menü auf dem Schirm, welches dem Aktivatorgefäß entspricht (siehe Fig. 11). Dieses Menü ermöglicht der Bedienungsperson die Reihenfolge der Funktionen zu verändern, die in jedem Zyklus in dem Aktivator stattfinden und in entsprechender Weise Menüs zu verändern, die anderen Gefäßen entsprechen.
Allgemein hat ein gegebener Zyklus drei ihm zugeordnete Zeitfelder; Eine erforderliche Hauptzeit "TIME"; eine Zeit, die auf den Detektormessungen basiert, "MIN TIME" und "ERR MODE", und eine zusätzliche Zeit, die für spezielle Sätze von Stufen in dem Reaktionsgefäß hinzugefügt wird, "ADD TIME". TIME hat verschiedene Gründe. Wenn die Flüssigkeitsfeststellung nicht für die Stufe spezifiziert worden ist, entspricht TIME der Gesamtzeit für diese Stufe. Wenn die Flüssigkeitsfeststellung spezifiziert worden ist, ist die Hauptzeit die "Auszeit" oder die Maximalzeit, die zugelassen ist, bevor der Vorgang weiter durchgeführt wird, und zwar unabhängig davon, ob der zugehörige Übergang durch den Flüssigkeitssensor festgestellt worden ist oder nicht. Wenn die Flüssigkeitsfeststellung spezifiziert worden ist, muß die Bedienungsperson außerdem eine Minimumzeit, MIN TIME, spezifizieren, bevor der zugehörige Übergang (flüssig zu gasförmig oder gasförmig zu flüssig) registriert worden ist. Es ist bedeutsam, einen weiteren Effekt von TIME festzuhalten, wenn die Detektion spezifiziert worden ist. Wenn der Sensor anzeigt, daß der korrekte Übergang nach der spezifizierten minimalen Zeit stattgefunden hat, wird die angegebene Funktion beendet, d. h. die Schalter für diese Funktion werden ausgeschaltet. Die nächste Stufe wird jedoch nicht eingeleitet, bevor die Primärzeit verstrichen ist. Dies ist notwendig, um die richtige Ausrichtung der Zyklen in jedem Gefäß sicherzustellen, um den optimalen Durchsatz zu erhalten. ERR MODE wird in dem Fall eingesetzt, daß die Detektion spezifiziert worden ist und der spezifizierte Übergang nicht zu sehen ist, bevor die Hauptzeit verstrichen ist, d. h. falls ein Ventil blockiert oder ein spezieller Behälter leer ist. Diese Arbeitsweise kann verwendet werden, um Alarm zu geben oder, in einigen Fällen, eine Beendigung der Synthese ohne Zerstörung herbeizuführen. ADD TIME bezieht sich speziell nur auf das Reaktionsgefäß und entspricht dem Anteil der Zeit (in Zehntel Sekunden), die jedem der drei vorangehenden Felder als eine Funktion der Aminosäurezahl in der Sequenz des zu synthetisierenden Peptids hinzuzufügen ist. Da das in dem Reaktionsgefäß eingenommene Volumen sich mit jeder zusätzlichen Aminosäurebindung erhöht, erhöhen sich die Stufenzeiten des Reaktionsgefäßes ebenso. Falls der Wert 10 beispielsweise in dieses Feld eingegeben wird, wird eine Sekunde (10/10) der Hauptzeit für die zweite Aminosäure hinzugefügt, die in der Peptidsequenz zu binden ist. Für die dritte Aminosäure würde die Zeit um zwei Sekunden und sofort erhöht werden.
Falls es gewünscht ist, ein RUN FILE zu editieren, wird EDIT OLD im PEPTIDE CHEMISTRY EDITOR ausgewählt, wodurch das RUN FILE EDITOR-Menü, gezeigt in Fig. 12, dargestellt wird. Die darin dargestellte Tabelle entspricht derjenigen, die als statische Ablaufaufzeichnung bezeichnet wird. Diese Aufzeichnung bezeichnet drei Zyklen (jeweils einen für das Aktivatorgefäß, für das Konzentrationsgefäß und das Reaktionsgefäß), für jede von 26 Aminosäurewahlmöglichkeiten und erlaubt die unabhängige Einstellung der Konzentratortemperatur für jede Aminosäure. Die vorgesehenen 26 Aminosäurewahlmöglichkeiten werden von den 20 Standardaminosäuren umfaßt, wobei zusätzlich vier für den speziellen Gebrauch vorgesehen sind, der beispielsweise durch die Bedienungspersonen gewünscht sein kann, eine für den Beginn-Zyklus und den End-Zyklus vorgesehen sind, um die unabhängige Steuerung dieser Punkte in der Synthese zu erlauben. Die statische Ablaufaufzeichnung ist das Ergebnis der Spezifizierung der Chemie für jeden Zyklus durch die verschiedenen CYCLE EDITORS, welche bereits beschrieben worden sind. Darüber hinaus müssen alle durch die spezielle Ablaufaufzeichnung bezeichneten Zyklen auf einem Scheibenspeicher vorhanden sein, der fortwährend im System installiert ist, da der RUN FILE EDITOR lediglich die Wahl einer Liste von gespeicherten Zyklen erlaubt. Jede dieser drei Reaktionsgefäße kann darüber hinaus von einer unterschiedlichen (oder dergleichen) Ablaufaufzeichnung synthetisieren, da zu der Zeit, wo ein Ablauf eingestellt worden ist, die Ablaufaufzeichnung für das spezielle Gefäß in dem REACTION VESSEL MONITOR spezifiziert wird (was nachfolgend erläutert wird). Typischerweise kann die Bedienungsperson eine Zahl von Ablaufaufzeichnungen auf einer einzelnen Scheibe (bis zu 20) erzeugen, editieren und speichern. Es sollte auch bemerkt werden, daß, obgleich das System vorgesehen ist, um einen unterschiedlichen Zyklus für jede Aminosäuremöglichkeit zu schaffen, es in der Praxis sich herausgestellt hat, daß tatsächlich nicht einmal so viele Zyklen erforderlich sind, um ein effizientes Arbeiten zu ermöglichen.
Das nächste Menü, welches erläutert wird, ist das VESSEL FUNCTION EDITOR-Menü. Dieses Menü ist vom Hauptmenü her zugänglich und arbeitet auf der grundlegenden Basis des Synthesizers. Es beruht auf den einzelnen, erforderlichen Instruktionen, um eine spezielle Funktion in einem speziellen Gefäß durchzuführen. Falls es beispielsweise erwünscht ist, die Definition einer Funktion zu verändern oder hinzuzufügen oder Funktionen zu löschen, welche in dem Aktivatorgefäß durchgeführt werden sollen, wird der FUNCTION EDITOR, der in Fig. 13 gezeigt ist, für das Aktivatorgefäß aufgerufen. Der gesamte Satz von Funktionen für den Aktivator kann dann überprüft und verändert werden. Wie bereits vorangehend angegeben, ist eine Funktion ein mit Namen versehender Satz von Schaltern, die gleichzeitig eingeschaltet werden. Diese Funktionen erzeugen für gewöhnlich einen Strömungsweg für chemische Verbindungen durch das System hindurch. Die Funktion "DCC TO ACTIVATOR" kann beispielsweise dadurch definiert werden, daß die Schalter 114 (DCC Ausgabeventil), 119 (unter Druck setzen des DCC-Gefäßes) und 125 (Öffnen des Aktivators zum Abfallsammelbehälter) betätigt werden. Einige Funktionen beschreiben auch mechanische oder elektrische Vorgänge allein, beispielsweise "Heizung ein" (ein Schalter). Das System ist in drei Typen von Funktionen organisiert worden: ON/OFF, TOGGLE ON, TOGGLE OFF, und zwar spezifiziert durch Eingeben von 0, 1 bzw. 2. Eine ON/OFF-Funktion schaltet lediglich für eine gegebene Stufe in einem Zyklus die Schalter ein. Am Ende dieser vorgegebenen Stufe werden alle Schalter für diese Funktion zurückgestellt (ausgeschaltet), bevor die nächste Funktion aktiviert wird. Eine TOGGLE ON-Funktion richtet die Maschine so aus, um bestimmte Schalter einzuschalten und diese in der eingeschalteten Stellung zu belassen, bis eine entsprechende TOGGLE-OFF-Funktion diese abschaltet. Nachfolgende Funktionen werden den Zustand derjenigen Schalter nicht beeinflussen, die durch die TOGGLE-ON-Funktion eingeschaltet worden sind. Während der Erzeugung oder der Ausgabe von Funktionen ist es demzufolge bedeutsam, daß alle TOGGLE-ON-Funktionen eine entsprechende TOGGLE-OFF-Funktion haben. Beispiele der TOGGLE-ON-Funktionen sind "Heizung ein" für das Konzentrationsgefäß oder "VORTEX ON" für das Reaktionsgefäß.
Das Aufrufen der Funktion REACTION VESSEL MONITOR aus dem Hauptmenü bietet den Schirm so dar, wie dies in Fig. 14 gezeigt ist, was der Bedienungspersonen Einstellungen und die Überwachung der Synthese ermöglicht. Zwei Ansprechfelder erlauben der Bedienungsperson zwischen zwei Arbeitsweisen auszuwählen, einem ersten Modus, in welchem die Vorrichtung automatisch, basierend auf dem Eingang zu dem PEPTIDE SEQ. EDITOR und einen zweiten Satz vorprogrammierter Arbeitszyklen, die dynamischer Ablauf genannt werden, gesteuert wird; und einer zweiten Arbeitsweise, welche lediglich auf denjenigen Kartuschen basierend arbeitet (Arten der Aminosäure), die in das Selbstabgabesystem geladen sind und einen Satz vorprogrammierter Zyklen aus einer angegebenen statischen Verfahrensablaufdatei. Falls der erste Modus ausgewählt wird, initiiert der Computer eine Frage, nämlich ob die Bedienungsperson wünscht, die dynamische Ablaufdatei zu verändern. Falls dies so ist, bejaht die Bedienungsperson dies und eine Darstellung, wie in Fig. 15 wiedergegeben, wird auf den Bildschirm gebracht, was der Ausgabe der dynamischen Verfahrensablaufdatei entspricht. Diese Datei wird anfänglich intern erzeugt, wenn die Bedienungsperson die gewünschte Peptidsequenz in den PEPTIDE SEQ. EDITOR eingibt. Es handelt sich hierbei einfach um eine Tabelle, die die Aminosäuresequenz in der zu synthetisierenden Reihenfolge angibt, wobei die bezeichneten Zyklen für jede Aminosäure bereits von der bezeichneten statischen Verfahrensablaufdatei programmiert worden sind. Der Editor ist so gestaltet, daß die Bedienungsperson die für die speziellen Aminosäuren der Sequenz verwendeten Zyklen abändern kann, was davon abhängt, ob sie in der Peptidkette angeordnet sind, so daß die Bedienungsperson eine stellungsabhängige Kontrolle über die chemische Anordnung hat. Im Gegensatz zur statischen Verfahrensablaufdatei ist die dynamische Verfahrensablaufdatei nicht auf dem Scheibenspeicher gespeichert.
Nach der Modeauswahl im REACTION VESSEL MONITOR wird sodann eine Reihe von Fragen erzeugt, um sicherzustellen, daß die Vorrichtung genau eingestellt ist, um mit den Arbeitsvorgängen zu beginnen, d. h. es werden Checks durchgeführt, nämlich ob das Reaktionsgefäß geladen und ob der Autolader die gewünschte Zahl und Reihenfolge der Aminosäuren hat.
Zu dieser Reihe von Fragen folgend wird die endgültige Abfrage durchgeführt, nämlich ob mit den Arbeitsvorgängen begonnen werden soll, oder ob diese angehalten werden sollen. Als Teil der Funktion des REACTION VESSEL MONITORS wird auch der Zustand des Reaktionsgefäßes unter Einschluß des Namens der aktivierten Aminosäure dargestellt, die gerade einer Reaktion unterzogen wird, der Zeit, zu welcher die Peptidsynthese eingeleitet wurde und der Zeit, wann die Synthese vervollständigt wurde. Zusätzlich wird die gegenwärtige Bindung dargestellt und die Folge der Bindungen, die bereits vervollständigt worden sind, kann dargestellt und durch Zurückgehen oder Vorwärtsgehen auf dem Schirm überprüft werden.
Das Aufrufen des CYCLE MONITOR aus dem Hauptmenü bringt den Schirm zu der in Fig. 16 gezeigten Darstellung. Hier ist der gegenwärtige Zustand für jedes Gefäß in Echtzeit in Ausdrücken von verschiedenen Parametern dargestellt worden. In der ersten Zeile ist für jedes Gefäß die spezielle Zahl der Aminosäure in der Sequenz des Peptides wiedergegeben worden, welche sich gegenwärtig aktiv in dem Gefäß befindet, und zwar zusammen mit der Abkürzung des Namens der speziellen Aminosäure. Die zweite Zeile zeigt den speziellen Zyklusnamen, der gegenwärtig in jedem Gefäß stattfindet. Die dritte Zeile gibt die Stufe in der Sequenz der Stufen des speziellen Zyklusses an, welcher gerade in jedem Gefäß durchgeführt wird. In der vierten Zeile ist die Zahl der Funktion und der Funktionsname entsprechend der speziellen Stufe aufgelistet, die für das entsprechende Gefäß gilt. Auch wird die verstrichene Zeit in jedem Zyklus wiedergegeben, so wie der Zustand jedes Flüssigkeitssensors diesen wiedergibt.
Verschiedene andere Menüs können ebenfalls aus dem Hauptmenü unter der allgemeinen Kategorie MACHINE/STATUS SELECTIONS ausgewählt werden. Diese umfassen: RESERVOIR STATUS, welcher sich auf die Tatsache bezieht, daß die Vorrichtungsmonitoren das verwendete Volumen aus jedem Behälter während jedes Zyklusses so wiedergeben, daß, wenn ein Behälter einen niedrigen Stand erhält, ein Alarm registriert wird, um der Bedienungsperson von dem Problem Kenntnis zu geben; INSTRUMENT CONFig., was verwendet wird, um die Konfiguration der Maschine selbst darzustellen und einzustellen, d. h. die Tageszeit, die Energieversorgung - 120V bei 60 Hz u. dgl.; SYSTEM SELF TEST, durch welche alle elektronischen Funktionen im praktisch möglichen Rahmen getestet werden; CONTROL AND TEST, welches die manuelle Kontrolle der Vorrichtung in einem solchen Ausmaß ermöglicht, daß die Bedienungsperson jedes Ventil und jeden Schalter von Hand zu einem beliebigen Zeitpunkt betätigen kann, um das Auffinden von Störstellen zu erleichtern und die manuelle Intervention der Synthese zu ermöglichen, falls dies erforderlich sein sollte; und DISK UTILITIES, welche der Bedienungsperson ermöglichen, übliche Scheibenspeicherfunktionen durchzuführen, die für die Operation eines Computersystems notwendig sind, z. B. Einrichten von Dateien, Löschen von Dateien und das Versehen von Dateien mit neuen Namen.
Eine weitere Eigenschaft der Vorrichtung, welche durch die Software gesteuert wird, ist die Gleichzeitigkeit, mit der Operationen in dem Reaktionsgefäß, dem Konzentrationsgefäß und dem Aktivatorgefäß durchgeführt werden können. Durch Festhalten der verschiedenen Zeiten, die erforderlich sind, um jede Stufe eines Zyklusses in jedem Gefäß durchzuführen, kann ein automatisches Optimierungsschema aufgestellt werden, was nachfolgend als Zyklussammler bezeichnet worden ist, und ein solches ist entwickelt worden, um den maximalen Wirkungsgrad in der Synthese für jedes spezielle Peptid mit einer bestimmten chemischen Eigenschaft zu erzielen. Um diese Wirksamkeit zu erzeugen, ist es bedeutsam, zu erkennen, daß für jedes bestimmte Kesselereignis (Funktion) in Abhängigkeit von der Zeit, in jedem Zyklus, bestimmt wird, wann Übertragungen stattfinden können und wann das Gefäß bereit ist, den Vorgang einer weiteren Übertragung zu beginnen. Für das Aktivatorgefäß entsprechen diese Funktionen dem Beginn einer Übertragung, BOTA; dem Ende einer Übertragung EOTA.
In entsprechender Weise umfassen die Schlüsselfunktionen für den Konzentrationszyklus das Identifizieren, wann das Gefäß bereit ist, etwas zu empfangen, RC; sowie den Beginn einer Übertagung BOTC; das Ende einer Übertragung EOTC. Für das Reaktionsgefäß bezeichnen diese Funktionen den Zustand, wann das Gefäß bereit ist, etwas zu empfangen, RR. Unter Verwendung dieser Konzepte kann eine graphische Darstellung eines Zyklusses, so wie er in jedem Gefäß stattfindet, wie in Fig. 18 wiedergegeben ist, angefertigt werden. Aus dieser Figur ist es offensichtlich, daß eine der ersten Kriterien für diese Operation ist:
TBOTA=TRC und TBOTC=TRR;
das heißt, das Konzentrationsgefäß muß bereit sein, zu empfangen, wenn eine Übertragung von dem Aktivatorgefäß begonnen worden ist, und das Reaktionsgefäß muß zur Aufnahme bereit sein, wenn eine Übertragung von dem Konzentrationsgefäß begonnen worden ist. Die nächste Stufe ist dann, zu bestimmen, in welchem Gefäß Operationen zuerst begonnen werden sollten, um den Prozeß zu optimieren. Dies kann durch Berechnung der linken Seiten-Verzögerungen (aus Fig. 18) für jedes Gefäß herbeigeführt werden: TDLA, TDLC und TDLR. Diese linksseitigen Verzögerungen gehören zur Wartezeit, die zugelassen wird, bevor die Aufbereitung des Gefäßes für die Funktion stattgefunden hat, die gerade dort stattfindet, d. h. für das Aktivatorgefäß kann eine gewisse Wartezeit vor dem Durchführen der Übertragung der Aminosäure in das Gefäß und Bildung des symmetrischen Anhydrids zugelassen werden, und für das Reaktionsgefäß kann eine gewisse Wartezeit zugelassen werden, bevor mit dem Entfernen des Schutzes der harzgebundenen Peptidkette begonnen wird. Wenn diese linksseitigen Verzögerungen erst einmal berechnet worden sind, dann entspricht die kürzeste Verzögerung (d. h. die längste Vorbereitungszeit) demjenigen Zyklus, mit dem zuerst begonnen werden sollte und auf diese Art wird die Hauptzeit gleich Null für diesen Zyklus eingestellt. Die verschiedenen Verzögerungen können gemäß den folgenden Gleichungen berechnet werden. Zunächst einmal definiert
TMA (TEOTA-TBOTA) + (TBOTC-TRC)
TML MAX (TBOTA, TRC, TRX), TDLA = TML-TBOTA,
TRX TRR-TMA.
TDLC = TML-TRC,
TDLR = TML-TRX
Das Einstellen der Haupt zeit auf Null zu Beginn des in Fig. 18 gezeigten Zyklus beispielsweise könnte Verzögerungszeiten ergeben, beispielsweise von TDLA = O, TDLC = 5 und TDLR = 3, d. h. das Aktivatorgefäß würde zuerst bei der Zeit T = 0 beginnen, dann würde das Reaktionsgefäß 3 Sekunden später beginnen und das Konzentrationsgefäß würde 5 Sekunden später beginnen.
Das nächste Erfordernis für den optimalen Durchsatz ist die Berechnung der minimalen Trennung dieser drei Zyklen zu den drei Zyklen des nächsten Kopplungsvorganges. Um dieses Minimum zu errechnen, ist es bedeutsam, die Rechtsseitenverzögerungen des ersten Zyklus abzuschätzen:
TDRA = TBOX-TDLA-TAT;
TDRC = TBOX-TDLC-[TCT + (TEOTA-TBOTA)]:
TDRR = TBOX-TDLR-[TRT + (TEOTC-TBOTC)];
TBOX = MAX [(TAT + TDLA),
(TCT + (TEOTA-TBOX) + TDLC),
(TRT + (TEOTC-TBOTC) + TDLR)];
TAT, TCA und TRT entsprechen der Gesamtzeit für den Aktivierungszyklus, den Konzentrationszyklus bzw. den Reaktionsgefäßzyklus.
Diese Rechtsseitenverzögerungen müssen dann mit den verschiedenen Linksseitenverzögerungen für den nächsten Zyklus kombiniert werden, um zu einer minimalen Trennung für die drei Zyklen zu gelangen, nämlich
wobei Tsc2-c1 die minimale Trennung zwischen dem ersten und dem zweien Zyklus und TDLA2 und TDLC2, und TDLR2 die Linksseitenverzögerungen des zweiten Zyklus sind (berechnet unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie für die Linksseitenverzögerung im ersten Zyklus)
Diese minimale Trennung kann dann in die Wartezeiten übersetzt werden, die erforderlich sind, um den zweiten Zyklus in jedem Gefäß zu starten, d. h.
wobei TWA2, TWC2 und TWR2 die Wartezeiten für das Aktivatorgefäß, das Konzentrationsgefäß bzw. das Reaktionsgefäß von der letzten Stufe des ersten Zyklus zur ersten Stufe des zweiten Zyklus sind. Um den optimalen Wirkungsgrad zu erhalten, muß einer der drei größten TWA2, TWC2 und TWR2 Null sein, wie das der Fall war für die Linksseitenverzögerung im ersten Zyklus. Fig. 19 zeigt die Resultate der obigen Berechnung für eine Reihe von drei Zyklen.
Die Möglichkeit, symmetrische Anhydride von Aminosäuren in vorbestimmter Größe in das Reaktionsgefäß zu liefern, ermöglicht, daß die Bindungsreaktionen mit Ausbeuten ablaufen, die 99% überschreiten, wobei lediglich Einzelbindungen verwendet werden. Wegen dieser sehr hohen Ausbeute in jeder Stufe ist es möglich, Peptide mit sehr hohem Gesamtswirkungsgrad vollständig automatisch zu synthetisieren. Die Kombination des Aktivatorgefäßes und des Konzentrationsgefäßes mit einer thermisch umschlossenen Einrichtung, macht es möglich, die Bedingungen für die maximale symmetrische Anhydridbildung für einzelne geschützte Aminosäuren zu studieren und weiterzuentwickeln, indem einzeln die Stöchiometrie, die Reaktionszeiten in DCM, die Temperatur während des DMF-DCM-Austausches und der Zeitrahmen, während welcher der Lösemittelaustauschvorgang durchgeführt wird, modifiziert werden. Für jeden Typ einer Aminosäure ist es demzufolge möglich, die maximalen Bedingungen einzustellen, unter welchen eine maximale Menge symmetrischer Anhydride reproduzierbar dem Reaktionsgefäß zugeführt wird, welches das Peptidharz enthält.
Bei bekannten Peptidsynthetisierern ist die Fähigkeit nicht vorhanden, voraktivierte Aminosäuren zu bilden, und der Benutzer muß an jedem Rekationszyklus nach dem Bindungsvorgang anhalten, um den Grad der Bindung zu überwachen. Sodann, unter dem Zwang der Verbesserung der Ausbeute, können zweite oder sogar dritte Bindungen in Fällen stattfinden, wo die erste Bindungsreaktion relativ ineffizient war. Das Ergebnis ist eine Automation eines einzelnen Zyklus der Synthese unter Ausschluß der Automation von Zyklus zu Zyklus. Als Alternative gönnen vorhandene Synthesizer von Zyklus zu Zyklus automatisch eingesetzt werden, indem Mehrfachbindungen mit der in situ- Aktivierung in dem Reaktionsgefäß eingesetzt werden, welche das Peptidharz enthalten. Dies führt zu relativ ineffizienten Bindungen, da die Aktivierungsmethode nicht für dich allein für die einzelnen Aminosäuren bei Vorhandensein der reagierenden Aminogruppe der wachsenden Peptidkette optimiert werden kann.
Die in Fig. 20 gezeigten Resultate erläutern den entsprechenden Vorteil der beanspruchten Vorrichtung für die Synthese von Decapeptidacylträgerprotein (65-74). Die oberste Linie zeigt eine graphische Darstellung der einzelnen Zyklusergebnisse für jede Aminosäurezufügung während der Peptidkettenanordnung, so wie sie in der Vorrichtung gemäß der Erfindung durchgeführt wird. Mit Ausnahme für die Glutamine (symbolisiert durch Gln) sind alle Aminosäurezufügungen durch eine vollautomatische Sequenz von Einzelbindungen herbeigeführt worden: Glutamine erfordern ein spezielles chemisches Protokoll, welches in der Technik wohl bekannt ist, welches aus einer Doppelbindung mit HOBT-Aktivierung (Hydroxibenzotriazol) besteht. Alle anderen Bindungen werden mit Boc-Aminosäuresymmetrischen Anhydriden durchgeführt.
Die untere Linie beschreibt die Resultate der Synthese des gleichen Peptids auf einem Beckman 990 Peptidsynthesizer unter Verwendung von Boc-Aminosäure-symmetrischen Anhydriden, die außerhalb des Instrumentes von Hand vorgeformt worden sind. Veröffentlichung: Reza Arshady, Eric Atherton, Derek Clive und Robert C. Sheppard, J. Chem. Soc. Perkin, Trans 1, (1981), S. 529-537. Die Ergebnisse beweisen, daß die vollautomatische Synthese durch die Notwendigkeit ausgeschlossen war, von Hand die symmetrischen Anhydride vorzuformen, und daß die von Hand vorgeformten symmetrischen Anhydride nicht in optimaler Weise gebildet worden waren.
Einige Peptidaminosäuresequenzen zeigen einzigartige sequenzspezifische Bindungsprobleme, wo sogar zwei und drei Bindungen, typischerweise in DCM, verhindern, daß höher als 99% Bindungsresultate erzielt werden können, und zwar unabhängig von der aktivierten Form der Aminosäure (vergl. W.S. Hancock, D. J. Prescott, P.R. Vaglos und G.R. Marshall, J. Org. 38 (1973), S. 774). Jedoch erkennt der Fachmann, daß die sequenzabhängigen unvollständigen Bindungen, die in schlechten Lösungsmitteln durchgeführt werden, beispielsweise DCM, wesentlich verbessert werden können, falls sie ausschließlich in stärker polaren Lösungsmitteln, z. B. DMF, durchgeführt werden (vergl. S. Meister, S.B.H. Kent, Peptides, Structure & Function, Proceedings of the 8th American Peptide Symposium, S.
103-106). Das Acylträgerprotein-(65-74)-Decapeptid ist als solches eine bekannte Problemsequenz und die in der beanspruchten Vorrichtung erzielten hervorragenden Resultate durch Bindung mit Boc-Aminosäure-symmetrischen Anhydriden in DMF belegen einen der Hauptvorteile der Vorrichtung gemäß der Erfindung: Die optimale Bildung der aktivierten Aminosäure in DCM, jedoch die Bindung der aktivierten Aminosäure in DMF. Dieses automatisch durchgeführte Verfahren bietet eine allgemeine Lösung der Synthese von Problempeptidsequenzen.

Anhang A

Beispiel für einen typischen Zyklus für vorgeformte Aminosäuresymmetrische Anhydride.
Für alle Aminosäuren mit Ausnahme von Gln, Asn und Arg. Jede Zeile beschreibt einen separaten Typ einer Funktion. Eine Funktion öffnet spezielle Ventile für eine vorgegebene Operation.
DCM = Dichlormethan, DMF = N,N-Dimethylformaid;
DCC = N, N-Dicyclohexylcarbodimid;
TFA = Trifluoressigsäure
DIEA = Diisopropylethylamin Reaktionsgefäß Konzentrationsgefäß Aktivator Falls dies der erste Zyklus einer Reihe ist, dann wird das Harz dreimal mit DCM ausgewaschen (alle Waschvorgänge finden unter Rütteln statt). Vorstellen des Fraktionssammlers (für Harzsammler) Nadel nach unten DCM zur Kartusche, Mischen der Kartusche, Warten auf das Auflösen der Aminosäure, Übertragung der Aminosäure zum Aktivator, Reinigung der Kartusche (DCM( Übertragen des Reinigungsmittels zum Aktivator einmal wiederholt Ausspülen der Kartusche Ausspülen des Abfallsammelbehälters Reaktionsgefäß Konzentrationsgefäß Aktivator Hinzufügen von DCM zu RV (ungefähr 1,5 ml), Hinzufügen TVA zu RV (3 ml) (Dies ergibt ungefähr 65% Lösung von TFA in RV). Messen DCC zum Aktivator Reaktionszeit im Aktivator ungefähr 10 Minuten (abhängig von der Aminosäure) Entleeren von RV Wiederholen der oben genannten Beifügungen. 65% TFA wird sodann in RV gelassen. Dauer ungefähr 15 Min. bei Mischung zwecks Entfernung des Schutzes Serien von Warten und Mischen während dieser Zeit, falls das Mischen nicht in ungefähr 30 Sek. Intervallen stattfindet, bildet die Ausfällung einen Stöpsel, der nicht aufbricht. Diese Reaktions ist schneller in DCM als in DMF. Viermaliges Spülen des Ventilblocks, um TFA zu entfernen. Einblasen von Gas Übertragung des Inhalts des Aktivators zum Konzentrator zweimaliges Spülen des Aktivators und Abreinigen von DCM von oben her und Übertragung jeder Spülung zum Konzentrationsgefäß Reaktionsgefäß Konzentrationsgefäß Aktivator in die TFA-Flasche, so daß TFA nicht in der Leitung gegenüber dem Ventilblock vorhanden ist - Belüften der TFA-Flasche, so daß diese nicht unter Druck steht. Während der 15-Min.-TFA-Zeit wird die Harzprobenleitung mit DCM zweimal gespült Am Ende der 15 Minuten wird das Reaktionsgefäß entleert Hinzufügen von DCM für eine Schnellwäsche Drainage dreimal Einblasen von Stickstoffgas durch die Inhalte. Dies kühlt die Mischung rasch ab. Erhitzen des Konzentrationsgefäßes, so daß die Temperatur einen bestimmten Punkt (abhängig von der Aminosäure) nicht überschreitet. Zu verschiedenen Zeitintervallen Hinzufügen von DMF zum Konzentrationsgefäß, ungefähr 1 ml jeweils zur Zeit, so daß DCM wirksam mit DMF ausgetauscht wird. Dieser Prozeß wird zwischen 5 bis 10 Min. benötigen.*** Eine Kombination von DCM und Methanol werden dann hinzugefügt, um ungefähr 6/4 Verhältnis zu erhalten, um Dizyklohexylurea (Niederschlag) zu lösen. Diese Lösung braucht wenige Minuten mit einer dazwischenliegenden Mischung. Reinigung des Aktivators von oben her mit DCM, um Methanol zu beseitigen. Dies wird in einer Reihe von Reinigungen und Drainagen mit dazwischenliegender Mischung durchgeführt. Reaktionsgefäß Konzentrationsgefäß Aktivator Hinzufügen von DMF (9 ml) Hinzufügen von DIEA (1 ml) Konzentration 10% Mischen bei offenem Kopfventil, so daß die obere Leitung gereinigt wird (TFA wird neutralisiert) Hinzufügen von DIEA und DMF zur Harzprobenleitung (um irgendwelche TFA, die in die Leitung eingetreten sein könnte, zu neutrralisieren). Entleeren des Reaktionsgefäßes Wiederholen DIEA, DMF Hinzufügen von DMF Ablaufen lassen sechsmal wiederholen Gleichzeitig Spülen der Harzprobenleitung während dieser Zeit mit DMF Der Aktivator wartet dann auf den nächsten Zyklus Reaktionsgefäß Konzentrationsgefäß Aktivator Übertragung der Inhalte des Konzentrationsgefäßes (ungefähr 4-5 ml) zum Reaktionsgefäß Reaktionszeit von 30 Minuten (Periodisches Spülen der Harzprobenleitung während dieser Zeit) Am Ende der Reaktionszeit, Entleeren des Reaktionsgefäßes Waschen mit DCM Entleeren sechsmal Vor der letzten Leerung des Reaktionsgefäßes - Befreien der Harzprobenleitung vom Reaktionsgefäß und Übertragen zum Fraktionssammler Reinigen des Konzentrationsgefäßes mit DMF von oben her (2mal) und Übertragung jeder Waschung zum Reaktionsgefäß Auswaschen des Konzentrationsgefäßes sorgfältig mit DCM - Reihen von Waschvorgängen von oben her und Entleeren. Warten auf den nächsten Zyklus.

Bemerkungen:

Spülungen des Reaktionsgefäßes werden jeweils mit 10 ml durchgeführt. Starten des Rührens und Rüttelns bei Beginn der Zugabe von Waschlösemittel. Dies hilft mit, irgendwelche Harzverklumpungen aufzubrechen. Option: Spülen im Reaktionsgefäß von oben oder von unten her.
Ventilblöcke werden mit DCM gespült und gewaschen und mit Stickstoff nach den Übertragungen und Ausgaben bestimmter Reagenzien ausgeblasen.
* Das Harz, das verwendet wird, ist üblicherweise geladenes PAM-Harz (1% Styroldivinylbenzenharz). Die Carboxylend-Aminosäure wird durch einen organischen Verbindungsteil auf das Harz gegeben. Typischerweise werden 0,5m Mole geladenen Harz (ungefähr 1m Mol Aminosäure/g Polystyrol) verwendet.
** 10 Minuten werden für alle Aminosäuren mit Ausnahme von Gln, Asn und Arg eingesetzt. Jedoch können einzelne Variationen auf Verlangen der Bedienungsperson realisiert werden.
*** Für Tyrosin und Lysin sind 7 Minuten typisch und für alle anderen, mit Ausnahme von Gln, Asn und Arg sind 15 Minuten typisch.

Anlage B:

Aufstellung der möglichen Funktionen für Peptidsynthesizer Schlüssel: T = oberer Ventilblock, B = unterer Ventilblock; 0 = aus; 1 = ein Reaktionsgefäßfunktionen (Reaktionsgefäß = RV)
DMC zum Abfall (T)
Extra zum Abfall (T)
Gas-VB (T)
Belüften RV (T)
Aufdrücken RV (T)
DCM zu RV (T)
DCM zum Abfall (B)
DMF zum Abfall (B)
DIEA zum Abfall (B)
DIEA Druck
TFA zum Abfall (B)
Gas-VB (B)
Entleeren RV (B)
Zurückblasen in TFA-Flasche
Belüften TFA-Flasche
TFA Druck
Verzweigungsdruck
Neutreulisierer Druck
Neutralisierer Ausgabe
Belüften RV (B)
Aufdrücken RV (B)
DCM zum RV (B)
DMF zum RV (B)
DIEA zum RRV (B)
TFA zum RV (B)
Gas zum RV (B)

Harzprobennehmer (RV-Funktionen)

Probennahme
DCM zum RV
DCM zum Fraktionssammler
DMF zum RV
DMF zum Fraktionssammler
Gas zum RV
Gas zum Fraktionssammler
DIEA zum RV

Gemischte RV-Funktionen

Vortex (0,1)
Fraktionssammler Weiterschalten

Konzentrationsgefäß (Conc)

DMF zum Abfall (T)
DMC zum Abfall (T)
Gas-VB (T)
Aufdrücken Conc (T)
Belüften (T)
Entleeren
DCM zum Conc (T)
DMF zum Conc (T)
DMF zum Abfall (B)
Extra zum Abfall (B)
Gas VB (B)
Aufdrücken Conc (B)
Belüften (B)
DMF zum Conc (B)
Extra zum Conc (B)
Verzweigungsdruck

Übertragungen

Conc zum Reaktionsgefäß
DMF Übertragungsleitung
Extra zur Übertragungsleitung
Gasübertragungsleitung

Gemische Conc Funktionen

Heizen (0,1)

Aktivator (Act)

MEOH zum Abfall (T)
DCM zum Abfall (T)
Gas VG (T)
Aufdrücken Act (T)
Entleeren Act
Belüften Act (T)
DCM zum Act (T)
MEOH zum Act (T)
DCM zum Abfall (B)
Extra-1 zum Abfall (B)
DMF zum Abfall (B)
Extra-2 zum Abfall (B)
AA zum Abfall (B)
Gas VB (B)
Messen DCC
Messen HOBT
Verzweigungsdruck
Aufdrücken Act (B)
Gas zum Mix (B)
DCM zum Act
DMF zum Act
DCC zum Act
HOBT zum Act
Aminosäure zum Act
Extra-1 zum Act
Extra-2 zum Act

Kartuschenausgabesystem

DCM zur Kartusche
DMF zur Kartusche
Extra-1 zur Kartusche
Extra-2 zur Kartusche
Aufdrücken Kartusche (Probennahme)
Aufdrücken Kartusche (Belüften)
Mischen Kartusche
Belüften Kartusche (Probennahme)
Belüften Kartusche (Belüften)

Übertragungen

Act zum Con
DCM Übertragungslinie
DMF Übertragungslinie
Extra-1-Übertragungslinie
Extra-2 Übertragungslinie
Gasübertragungslinie

Gemischte Funktionen

Nadel auf und ab (0,1)
Kartusche auswerfen organisches Verbindungs-Harz = abnehmbare Schutzgruppe Harz = synthet. Harz DCC 0.5 äquivalent Aminosäure

Claims

1. Vorrichtung zur Herstellung von Peptiden durch Synthese aus der festen Phase heraus, aufweisend:

Aktivierungseinrichtungen zur Aufnahme geschützter Aminosäuren, welche ein übliches Aktivierungsgefäß (11), in welchem jede einzelne Aminosäure aktiviert wird, und Lösemittel-Kopplungsmedium-Substitutionseinrichtungen (33, 41) aufweisen;

ein Reaktionsgefäß (15) zur Aufnahme des Substrates in irgendeinem zweckmäßigen Lösemittel;

Übertragungseinrichtungen (Fig. 1B), die mit den Aktivierungseinrichtungen und dem Reaktionsgefäß verbunden sind, um in der Vorrichtung eingesetzte Materialien zu übertragen;

und mit der Übertragungseinrichtung verbundene Rechnereinrichtungen (Fig. 2), um die Übertragung von aufeinanderfolgenden Aliquots von Aminosäuren in einer vorgewählten Sequenz in die Aktivierungseinrichtungen hinein; um die Übertragung von entsprechenden folgenden Aliquots des Aktivierungsmediums in die Aktivierungseinrichtungen und die Übertragung von folgendem Aliquot von aktivierten Aminosäuren, die auf diese Art und Weise erzeugt worden sind, in der vorgewählten Sequenz in das Reaktionsgefäß hinein automatisch zu steuern, um auf diese Art und Weise dem Substrat einzeln aktivierte Aminosäuren in der vorgewählten Sequenz zuzuführen.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Computersoftware, durch welche Temperaturen und Zyklusperioden für jede Aminosäure verändert werden können.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß (15) einen Rührer (48) enthält, der mit einer Wirbeleinrichtung arbeitet, um Harz- Agglomeration während der Reaktion mit jeder der aktivierten Spezies der Aminosäure zu verhindern.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß einen Behälter aufweist, der eine Rotationssymmetrieachse hat.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Rührer eine Rotationseinrichtung aufweist, die so angeordnet ist, daß das eine Ende des Behälters eine kreisförmige Bewegung um die Rotationssymmetrieachse ausübt, während das andere Ende im wesentlichen ortsfest gehaltert ist.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierungseinrichtung ein Konzentratorgefäß (13) aufweist, um das Aktivatorlösungsmittel und jede der aktivierten Spezies der Aminosäure aufzunehmen, und zwar jede Aminosäure einzeln von dem Aktivierungsgefäß, und daß die Übertragungseinrichtungen so angeordnet sind, um das Aktivatorlösungsmedium aus dem Konzentratorgefäß durch ein Kupplungsmedium zu ersetzen.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Übertragungseinrichtungen auch eine selbst ausgebende Einrichtung (Fig. 3) enthalten, die unter der Steuerung der Computereinrichtung die Aminosäuren jeweils einzeln, in der gewünschten Reihenfolge des Peptides an die Aktivierungseinrichtung abgeben,

die selbst ausgebende Einrichtung eine Einrichtung zum individuellen Weiterschalten der Behälter für die Aminosäuren in der gewünschten Reihenfolge des Peptides enthält, und

daß eine Extraktionseinrichtung (121, 123) vorgesehen ist, um die Inhalte der einzelnen Behälter einzeln zu extrahieren.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktionseinrichtung eine Nadeleinrichtung (121, 123) aufweist, um Lösemittel in jeden der Behälter abzugeben und um das Lösemittel zusammen mit der Aminosäure aus den Behältern herauszuziehen.

9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß einzelne Behälter (105) in einer Weiterschalteinrichtung angeordnet sind und daß jeder der Behälter mit einem Boden ausgebildet ist, der innen die Gestalt eines Troges hat.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Behälter (145) ohne äußere Vorkehrungen aufrechtstehend ausgebildet sind.

11. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Übertragungseinrichtungen eine erste Rohrleitung zwischen dem Aktivierungsgefäß und dem Konzentratorgefäß und einen ersten Ventilblock (23), der durch die Computereinrichtung gesteuert ist, um den Fluß von dem Aktivierungsgefäß in die erste Leitung zu steuern und einen zweiten Ventilblock (33) aufweisen, der durch die Computereinrichtung gesteuert ist, um den Fluß in das Konzentratorgefäß von der ersten Leitung her zu steuern.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Übertragungseinrichtungen auch eine zweite Rohrleitung zwischen dem Konzentratorgefäß und dem Reaktionsgefäß und einen dritten Ventilblock (45) aufweisen, der durch die Computereinrichtung gesteuert ist, um den Fluß in das Reaktionsgefäß hineinzusteuern, und wobei der zweite Ventilblock ebenfalls den Fluß von dem Konzentratorgefäß in die zweite Leitung hineinsteuert.

13. Vorrichtung nach Anspruch 11 bis 12, gekennzeichnet durch eine Flüssigkeitssensoreinrichtung (27, 40, 48), um Übergänge zwischen Gasen und Flüssigkeiten, die in der Leitung strömen, festzustellen.

14. Vorrichtung nach einen der Ansprüche 1 bis 13, gekennzeichnet durch einen Harzprobennehmer (59), der durch die Computereinrichtung gesteuert ist, um Materialien aus dem Reaktionsgefäß herauszuziehen.

15. Vorrichtung nach einen der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Computereinrichtung eine Menüeinrichtung zur Kategorisierung physikalischer und chemischer Operationen oder Vorgänge in der Vorrichtung aufweist, um die Steuerung über diese Vorgänge durch eine Bedienungsperson zu ermöglichen, wobei die Kategorisierung in einen Satz von Zyklen unterteilt ist und jeder Zyklus für einen kompletten Satz von Vorgängen in einem der Gefäße, dem Aktivierungsgefäß, dem Konzentratorgefäß und dem Reaktionsgefäß charakteristisch ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Computereinrichtung Speicher zur Speicherung eines Algorythmusses zur Berechnung der Tätigkeitszeitspannen für den ersten, den zweiten und den dritten Ventilblock aufweist, um die Produktion eines Polypeptides mit irgendeiner gegebenen speziellen Sequenz von Zyklen in jedem der Gefäße, dem Aktivierungsgefäß, dem Konzentratorgefäß und dem Reaktionsgefäß zu maximieren.

17. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Computereinrichtung eine Einrichtung zur Berechnung der Operationszeiten und der Schaltzeiten zur Betätigung des ersten, zweiten und dritten Ventilblocks in Übereinstimmung mit den Arbeitszeiten aufweist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Harz-Probennehmer aufweist:

ein Reservoir;

eine in dem Reservoir angeordnete Membrane zur Unterbrechung des Materialflusses oberhalb einer bestimmten Größe an der Stelle der Membrane in dem Reservoir;

eine erste Verbindungsleitung, die mit dem Reservoir an der einen Seite der Membrane verbunden ist;

ein erstes Ventil zur Steuerung des Flusses durch die Verbindungsrohrleitung;

eine zweite Verbindungsrohrleitung, die an das Reservoir an der Seite der ersten Verbindungsrohrleitung der Membrane angeschlossen ist;

ein zweites Ventil zur Steuerung des Flusses durch die zweite Verbindungsrohrleitung; und

eine dritte Verbindungsrohrleitung, die mit dem Reservoir an der gegenüberliegenden Seite der Membrane verbunden ist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeitssensoreinrichtung aufweist:

zwei im wesentlichen flache Substrate (217, 218), die aus einem nachgiebigen Material gebildet sind und in einer im wesentlichen gegenüberliegenden Lage relativ zueinander und in einem festen Abstand in der Nähe des ersten Endes gehaltert sind;

eine Halteeinrichtung (229), die am gegenüberliegenden Ende und zwischen den Substraten zur Halterung der Rohrleitung angeordnet ist, wobei die Dicke der Leitung und der Halteeinrichtung zusammen den festen Abstand überschreiten;

eine Belichtungseinrichtung (270), die durch die Halteeinrichtung gehaltert ist, um Strahlungsenergie von der einen Seite der Leitung her zur Verfügung zu stellen, und

einen Detektor (271), der durch die Halteeinrichtung an der der Belichtungseinrichtung gegenüberliegenden Seite der Leitung gehaltert ist, um die Strahlungsenergie aufzunehmen, die durch die Leitung von der Belichtungseinrichtung her übertragen worden ist, und um Veränderungen in der Intensität des durch die Leitung hindurchgegangenen Lichts festzustellen.

20. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Behälter aufweist:

zwei im wesentlichen zueinander parallele Seitenteile;

zwei weitere Seitenteile, die einander gegenüberliegend symmetrisch angeordnet sind und mit den beiden im wesentlichen parallelen Seitenteilen verbunden sind, um eine Kastenform zu bilden;

ein Bodenteil, der mit den Seitenteilen verbunden ist und eine innere Konfiguration eines V-förmigen Troges aufweist, wobei die Längserstreckung des Troges senkrecht zu den parallelen Seitenteilen steht und der Bodenteil einen äußeren Abschnitt in der Mitte des Troges aufweist, welcher im wesentlichen flach ausgebildet ist;

einen Flansch (145), der mit dem Bodenteil verbunden ist und zwischen den parallelen Seiten angeordnet ist, orthogonal zur Längserstreckung des Troges steht und eine flache Oberfläche aufweist, die im wesentlichen gleich erstreckend mit der flachen Oberfläche des Mittelteils des Troges ausgebildet ist; und

einen Oberteil, der mit einer Trennwand ausgebildet und mit den Seitenteilen verbunden ist, um einen geschlossenen Raum zu bilden.

21. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die selbstabgebende Einrichtung aufweist:

eine Spureinrichtung (101), um eine Anordnung einzelner Behälter (105) für Aminosäuren zu haltern und um die Bewegung der Kartuschen zu dirigieren;

eine Antriebseinrichtung, um die Anordnung der Kartuschen in einer Richtung längs der Spur zu bewegen;

eine Ejektoreinrichtung (113), die gegenüberliegend zur Antriebseinrichtung angeordnet ist und dem Antrieb entgegenwirkt, und um die Anordnung festzuhalten, wenn Aminosäuren aus einer Kartusche herausgenommen wird, und um eine Kartusche aus der Anordnung aus zugeben, wenn aus dieser Aminosäure extrahiert worden ist; und

eine Extraktionseinrichtung (121, 123), die in der Nähe der Spur angeordnet ist, um Aminosäure aus den Kartuschen zu extrahieren.