JPS58194896A - Ｄｎａ等合成装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はＤＮＡ等合成装置に関し、特に、不安定な試
薬溶液を片時調製して反応器に供給し、ＤＮＡやＲＮＡ
等を合成可能なりＮＡ等合成装置に関する。

ＤＮＡの合成法として、いわゆるジエステル法、トリエ
ステル法、ホスファイト法と改良発展がなされ、さらに
これらの方法を利用し、固形支持体を用いる固形支持体
法が各種の利点を有することから多用されるに到ってい
る。　そしてこれらの方法によってＤＮＡ合成を行う装
置も各種提案されている。　これらの装置は、いずれも
反応器に複数の試薬溶液を所定の手順で供給してＤＮＡ
を合成するという点で共通している。

一方、ＤＮＡ合成に用いる試薬溶液には不安定なものが
ある。　たとえばホスホトリエステル法で用いる縮合剤
溶液、ホスホモノ）ＩＪチアゾリド法用いるヌクレオチ
ド試薬溶液、ホスファイト法で用いるヌクレオチド試薬
溶液などは不安定で、調製仮数時間以内に使用しなけれ
ばならないものである。

そこで、従来のこの種の装置では、ＤＮＡの合成を始め
る際にその都変オペレータが試薬溶液を調製し、装置に
セット１〜なければならない不便があった。　　もつと
も実際には前もって調製し、セットしておくことも行わ
れていたが、その場合。

安定な合成を行えないおそれがあった。

この発明の発明者は、絞量研究の結果、公知のＤＮＡ等
合成装置を改良することに成功した。

かくして、この発明によれば、試薬溶液調製用容器、内
部隔壁破壊手段、送液手段および反応器を具備し、前記
試薬溶液調製用容器は容易に破壊可能な内部隔壁によっ
て複数の密閉小室に区画されかつそれら小室にそれぞれ
試薬もしくは溶媒が封入されたものでちゃ、前記内部隔
壁破壊手段は前記内部隔壁を破壊して前記試薬もしくは
溶媒を１つの試薬溶液に調製せしめるものであり５前記
送液手段は前記調製された試薬溶液を前記反応器に供給
して反応器内でＤＮＡ等を合成せしめるものでおるＤＮ
Ａ等合成装置が提供される。

この発明の装置の主な特徴は、（Ｉ）装置自身が試薬溶
液調製のための手段を具備しておシ、これにより装置内
で片時調製可能となること、（１）試薬溶液調製を行う
特定の構造の容器を具備していること、および（■）そ
の調製した試薬溶液が装置自身のもつ供給手段に、ｃ！
１反応器に供給されることにある。

以下５図に示す実施例に基いて、この発明を詳説する。

　ただし、これによやこの発明が限定されるものではな
い。

第１図に示す（１）は、この発明の一実施例であり、１
７ホトリ”３テ“法によるＤＮＡ微量自動合成　　　　
　、。

装置である。

反応器（２）は内径ｇＭＭ、高さ１０１１１の円筒状の
本体（３）の上方にすりけち状フランジ（４）を設けた
容器である。　すりばち状フランジ（４）には、多数の
試薬溶液等供給用のノズルが挿着された栓（５）が装着
されている。　そこで１本体（３）の頭部開口が試薬溶
液等供給口（６）となる。　本体（３）の内部下方には
ガラスフィルタのごときフィルタ（７）が嵌着され、さ
らに底部には排液口（８）が設けられている。　フィル
タ（７）は、ポリスチレン、シリカビーズのごとき支持
体（９１を載置できる（透過させない）もので。

試薬溶液、溶媒、ガスを透過させるものである。

フィルタ（７）の上部空間が反応部Ｑ（ｊになり、約４
６０μｊの容積の空間である。

１１１〜０３は溶媒で、それぞれ反応用溶媒としてピリ
ジン、乾燥用溶媒としてテトラヒドロンラン（ＴＨＦ）
、洗浄用溶媒としてイソプロパツールと塩化メチレンの
混合液である。

０４）は保護基脱離用試液で、インプロパツールと塩化
メチレンの混合溶媒に臭化亜塩を溶解した溶液である。

　０９はマスキング用試薬で、無水酢酸とピリジンの混
合液である。　αυはマスキング用縮合剤で、ジメチル
アミノピリジンとピリジンの混合液である。

上記溶媒（１］）〜０９お工び試薬溶液０４）〜αυは
、窒素ガス圧によってそれぞれ弁［１７１−ｏを介して
反応器（２）に供給されつる。　弁のは窒素ガスを反応
器（２）内へ直接供給する弁であり、ｔ２４１は排液弁
、凶は排気弁である。　これらの弁ｔｔ７１−　（２５
１は、マイクロコンピュータのごとき制御回路＠でその
作＃を制御される。　なお、窒素ガスは塩化カルシウム
のごとき乾燥剤（社）で乾燥されている。

オペレータは、操作卓（２）を介して制御回路（イ）と
対話を行いうる。

調製用容器（至）Ｉ　（２９１’、　＠”　＃・−は、
内容量１００μｊ〜５００μｊ位の管状容器本体（１）
、（至）”　（１［１１１１，・・・とシリコンゴムセ
プタムｅｌｌｌ、　Ｃ９１１’　、　酢’　、　、、、
とから“なっている。　セプタムａｌｌ、　ｅｌｌｌ”
　、　ｅｌｌｌｌ”　、・・・は、脱着自在であり、か
つ試薬溶液輸送用ニードル帥などを外部から挿通しうる
ものである。　これら調製用容器２９）　、　（２’ｌ
’　、　＠’“、・・・は、制御回路曽にて作動を制御
されるターンテーブル←８）上のホルダ一孔０９）。

［４９１’　、・・・に保持されている。

ターンテーブル囮によって所定位置に移動された調製用
容器器には、ニードル上下機構齢によってニードルｅ’
ｔ８１　（３９１（４θが挿通される。　ニードル６区
は空素ガスの供給を行うものであシ、ニードル−は内部
の溶液を取り出すものであり、ニードル（４θは洗浄液
を供給するものである。

試薬調製用容器（至）の容器本体ωは、第２図に示すよ
うに、底部（社）、胴部ｅ＋３＋　、頭部（３４１の８
つの容器構成体と、これらの間を仕切る内部隔壁ｆ３ｆ
Ｑ、ｅ１６）とからなっている。　容器構成体（社）、
　ｆ８３１．　ｍｌはガラスや合成樹脂などで形成され
、内部隔壁−９（社）は金Ｒ（たとオはアルミニウム）
箔や合成樹脂（たとえばテフロン）フィルムなどで形成
される。

その他の試薬調製用容器（至）ｌ　、　（２Ｑ）Ｉ＋・
−の容器本体■°。

田°°・・・も同様の構造である。

試薬等の封入は、オず底部構成体闘内に結晶状態の縮合
剤〔２−４−６−）！Ｊメチルベンゼンスルホニルー８
−ニトロトリアゾリド（ＭＳＮＴ））（３）を入れ、内
部隔壁Ｇθで蓋をする。　次に胴部構成体（を底部構成
体ｔ３ｚ上に螺合し、その胴部構成体酷内に結晶状態の
ヌクレオチド試薬の）を入れ、内部隔壁Ｍで蓋をする。

　次に頭部構成体ｌ２ＡＩを胴部構成体特上に螺合し、
その頭部構成体（’＋４１内にピリジン（Ｑを入れ、セ
プタム０りで密封する。

封入するヌクレオチド試薬（Ｂ）の量は、支持体に結合
しているヌクレオシドに対し８〜５当量が適当である。

　たとえば支持体（９１がポリスチレン粉体でヌクレオ
シドの結合量が０．１　ｍｍｏｌ　／　ｔの場合、支持
体１１当りにモノマーで４００ｑ、ダイマーで７００１
１Ｉｙ位が適当である。　縮合剤囚は同様の場合支持体
１？当りに８００り位が適当であり、ピリジン（Ｏは同
様の場合支持体１１１′あたりに５ｗ１位とするのが好
ましい。

ヌクレオチド試薬ＣＢ）は、塩基の違いによってモノマ
ーの場合でも４種類あるが、これらを調製用容器＠因°
・・・に入れ分けておく順は目的ＤＮＡの塩基配列のシ
ーケンスと同じにしておく。　ダイマーやトリマーある
いけこれらの混合物を用いる場合も同様である。

上記ヌクレオチド試薬ＣＢ）と縮合剤（４）のセットは
、ＤＮＡ合成を実際にスタートする時刻より以前であれ
ば任意に行ってよい。　何故ならば、いずれも結晶状態
でセットされるので、不安定でないからである。

ＤＮＡの合故に際しては、前もって反応器（２）内にＤ
ＮＡの末端部分のみを結合した支持体（９１を入れる。

　支持体（９）の量は、ｆｃとえは支持体（８１がポリ
スチレン粉体の場合には１０ｑ〜５０１ｑ／が適当であ
る。

この装置（１）の基本的なｌ１１１作はホスホトリエス
テル法を用いた公知のこの種の装置と原理的に同じであ
°るので全般的説明は省略し、特徴のある合成工程の動
作についてのみ詳説する。

合成工程では、制御回路□□□は、ニードル上下機構罰
を作動してニードルｆ３８１　ｅ４９１　ｉ４１’ｉｌ
を調製用容器＠に挿入する。　ニードルＧ９）は、まず
シリコンゴムセプタム（３１１を挿通し１次に内部隔壁
間を破る。　この時点でニードル（３９）の下降を一時
停止すれば１頭部小室＋４２ｉ内に封入されていたピリ
ジンＣ）が胴部小室間に流下してヌクレオチド試薬の）
を溶解する。

その後、さらにニードル睡を下降して内部隔壁（３θを
破れば、ヌクレオチド試薬ＣＢ）のピリジン溶液が底部
小室顛に流下して縮合剤（５）を溶解する。　第１図は
このときの状態をあられしている。

所定時間後には調製用容器器内は、ヌクレオチド試薬（
Ｂ）と縮合剤囚とを含む試薬溶液（２）となるので、弁
（４（至）、　ｎ’７１を作ＩＥＩＩＬ、てその試薬溶
液（２）を反応器〔２）に供給する。

これによって反応器（２）内で縮合反応が生じ、新たな
ヌクレオチドがＤＮＡの末端部分に連結されることにな
る。

その後、弁（４４１，ｆ４７１を作動して洗浄を行い５
次にニードル上下機構罰を作動してニードル（支）醸（
４四を調製用容器■から引抜き、ターンテーブル（４８
１を回転して次の調製用容器＠°を所定位置に移１１１
Ｌ、次の合成工程のためにニードルｅ１８１　（３９１
をその調製用容器の°に挿入する。

さて上記実施例のＤＮＡ微量自動合成装置（１）によれ
ば、縮合剤のＭＳＮＴ（５）は安定な結晶状態でストッ
クされ、不安定な溶液状態にされるのは使用される直前
である。　従って任意の時間にＤＮＡ合成を始めても確
実に安定な合成が行われることになり、大変便利になる
。　すなわちＤＮＡ合成を始める都度試薬溶液を調製し
なくてもすむようになり保守が格段に容易になる。

なお、上記装置（１）では１反応器（２）の反応部００
を小型化すると共に、フィルタ（７）の上に支持体（９
１を載置し、上方から試薬溶液（１１）〜＠を供給し、
底部から排液するように反応器（２）を構成している。

そこで排液弁翻を閉じたまま試薬溶液を上方から供給す
れば、その試薬溶液は支持体（９１に含１れてこれを膨
潤すると共にフィルタ（７）より上の反応部００内にと
どまって下方へ落ちない。　従って、供給した全ての試
薬溶液が反応に診加し、デッドスペースに溜まるものが
無くなる。　この結果、供給量は最低鮭（支持体体積の
５〜７倍位）で充分になり、また反応を促進するために
反応器を振盪するなどの混合φ接触操作も無用になって
いる。

また、新たなヌクレオチドを連結する反応の前に反応器
（２１内を乾燥用溶媒たとえばＴ　ＨＦ　ＣＩ２で洗浄
乾燥すると共に乾燥ガスでブローして短時間で反応器（
２）内を完全乾燥できるように構成されており、この結
果、縮合反応を１泪害する水分を完全に除去できるので
反応効率が下がらず５余分な試薬を必要としない。

変形例としては５反応器（２）をロート状にしたもの、
樽状にしたもの、′８１′に反応部の内容積を８０μｊ
〜８００μｌの間で変化したものが皐げられる。

捷た固体支持体としてＫｅｌ−Ｆ−ｇスチレン、シリカ
ゲル、ポリアクリルモルフオリドなどを用いたものが挙
げられる。　これらの支持体は粒径８０〜８００μｍ程
度のものが好ましい。

他の変形例としては、試薬溶液輸送用ニードル跡で内部
隔壁ｃ１υ跡を破らずに他に専用の内部隔壁破壊ニード
ルを設けてこれで破るようにしたもの、ピリジン（０を
容器＠■°−・内に封入せずに洗浄用ピリジンの供給流
路にプランジャポンプのごとき定量ポンプを設けてこれ
によりピリジン（Ｃ）を容器（２９■“・・に定量供給
するようにしたものなどが挙げられる。

さらに他の実施例としては、ホスホモノトリアゾリド法
−やホスファイト法、あるいはジエステル法によるＤＮ
Ａ等合成装置にこの発明を適用したものが挙げられる。

ホスホモノトリアゾリド法に適用する場合を前記装置（
１）を基本にして説明すると２調製用容器器を頭部小室
（４ｆｆｉと底部小室００）の２段にし、その頭部小室
（・１ｚにリン酸化試薬液たとオばＯ−クロロフェニル
ホスホロジトリアゾリドを入れ、底部小室＋４＋１）ニ
（１）式のヌクレオチド誘導体を入れておく。

（Ｂａ５ｅ　（塩基）　ハアデ二ン、グアニン、シトシ
ンもしくはチミン〕 それぞれの１°は、（１）式のヌクレオチド誘導体１Ｏ
ｖｃ対しｏ−クロロフェニルホスホロジトリアゾリド９
〜ｌＯとする。　調製用容器（支）＋　（２ｐ＋・・・
につい　１８− ても同様である。　ただし、それぞれのヌクレオチド誘
導体の塩基は、容器器器°・・・の並ぶ順が目的ＤＮＡ
の塩基配列のシーケンスと合うように各々選定する。　
０−クロロフェニルボスホロジトリアゾリドと（＋）式
のヌクレオチド誘導体とを加えＮ 合せたヌクレオチド試薬溶液は不安定であるが、（１）
式のヌクレオチド誘導体とＯ−クロロフェニルホスホロ
ジトリアゾリドはそれぞれ単独では安定であるから所望
の効果が得られる。

ホスファイト法に適用する場合を同様に説明すると、調
製用容器器を頭部小室（１乞と底部小室顛の２段にし、
その頭部小室（４’２＋ＶＣＴＨＦを入れ、底部小室０
αに（８１式のヌクレオチド誘導体を入れておく。

Ｐ　−ＯＣＨａ ■ 〔Ｂａ５ｅ　（塩基）　ｎアデニン、グアニン、シトシ
ンもし、くはチミン〕 調製容器■ｌ器り・・・・・についても同様である。　
ただし、それぞれのヌクレオチド誘導体の塩基は、容器
ｅ！［１’・・・の並ぶ順が目的ＤＮＡの塩基配列のシ
ーケンスと合うように選定する。

以上の説明から理解されるように、この発明のＤＮＡ等
合成装置によれば、不安定な試薬溶液は片時に調製され
て使用されることになる。　そこで前もって試薬類をセ
ツティングしておいても確実に安定な合成を行える効果
があり、保守面からも望号しいものとなる。　捷だ途中
で反応をストップした場合も、残った試薬の回収が可能
であり。

高価な試薬を浪費することがない。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明のＤＮＡ等合成装置の一実施例で夕）
るＤＮＡ倣量目量自動合成装置成口り切回、第２図は同
装置に使用される調製用容器の分解断面図、第８図は第
１図に示す装置の１１作のフローチャート図である。 （１）・・ＤＮＡ微量目納調製装置、（２１・・反応器
、舗・・・調製用容器、　ｅ（ＩＩ（財））・・内部隔
壁、酔・・・ニードル上下機Ｉｆｉ　、　？８）ｆ３り
）ｍｎ　−ニードル、Ｆｉｒｌｌｋｌ）ｋ２　・・・小
室、（５）・・縮合剤、（Ｂ）・−・ヌクレオチド試薬
、　（Ｃ）・・・ピリジン。 （２）・・・試薬溶液。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試薬溶液調製用容器、内部隔壁破壊手段、送液手段
   および反応器を具備し、前記試薬溶液調製用容器は容易
   に破壊可能な内部隔壁によって複数の密閉小室に区画さ
   れかつそれら小室にそれぞれ試薬もしくは溶媒が封入さ
   れたものであり、前記内部隔壁破壊手段は前記内部隔壁
   を破壊して前記試薬もしくは溶媒を１つの試薬溶液に調
   製せしめるものであり、前記送液手段は前記調製された
   試薬溶液を前記反応器に供給１７て反応器内でＤＮＡ等
   を合成せしめるものであることを特徴とするＤＮＡ等合
   成装置。 ２　調製用容器の外壁の一部がゴムセプタム部に形成さ
   れ、内部隔壁破壊手段が前記ゴムセプタム部に夕１部か
   ら挿通されて内部隔壁を破壊するニードルであり、送液
   手段が前記ゴムセプタム部に外部から挿通されて調製用
   容器の内部から試薬溶液を吸入するニードルとその吸入
   した試薬溶液を反応器内に吐出するノズルとを具備して
   なるものである請求の範囲第１項記載の装置。