JPS6241678B2

JPS6241678B2 -

Info

Publication number: JPS6241678B2
Application number: JP7871182A
Authority: JP
Inventors: Yoshiaki Oosugi
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1982-05-10
Filing date: 1982-05-10
Publication date: 1987-09-03
Also published as: JPS58194896A

Description

【発明の詳細な説明】この発明はDNA等合成装置に関し、特に、不
安定な試薬溶液を用時調製して反応器に供給し、
DNAやRNA等を合成可能なDNA等合成装置に関
する。

DNAの合成法として、いわゆるジエステル
法、トリエステル法、ホスフアイト法と改良発展
がなされ、さらにこれらの方法を利用し、固形支
持体を用いる固形支持体法が各種の利点を有する
ことから多用されるに到つている。そしてこれら
の方法によつてDNA合成を行う装置も各種提案
されている。これらの装置は、いずれも反応器に
複数の試薬溶液を所定の手順で供給してDNAを
合成するという点で共通している。

一方、DNA合成に用いる試薬溶液には不安定
なものがある。たとえばホスホトリエステル法で
用いる縮合剤溶液、ホスホモノトリアゾリド法で
用いるヌクレオチド試薬溶液、ホスフアイト法で
用いるヌクレオチド試薬溶液などは不安定で、調
製後数時間以内に使用しなければならないもので
ある。

そこで、従来のこの種の装置では、DNAの合
成を始める際にその都度オペレータが試薬溶液を
調製し、装置にセツトしなければならない不便が
あつた。もつとも実際には前もつて調製し、セツ
トしておくことも行われていたが、その場合、安
定な合成を行えないおそれがあつた。

この発明の発明者は、鋭意研究の結果、公知の
DNA等合成装置を改良することに成功した。

かくして、この発明によれば、試薬溶液調製用
容器、内部隔壁破壊手段、送液手段および反応器
を具備し、前記試薬溶液調製用容器は容易に破壊
可能な内部隔壁によつて複数の密閉小室に区画さ
れかつそれら小室にそれぞれ試薬もしくは溶媒が
封入されたものであり、前記内部隔壁破壊手段は
前記内部隔壁を破壊して前記試薬もしくは溶媒を
１つの試薬溶液に調製せしめるものであり、前記
送液手段は前記調製された試薬溶液を前記反応器
に供給して反応器内でDNA等を合成せしめるも
のであるDNA等合成装置が提供される。

この発明の装置の主な特徴は、(i)装置自身が試
薬溶液調製のための手段を具備しており、これに
より装置内で用時調製可能となること、(ii)試薬溶
液調製を行う特定の構造の容器を具備しているこ
と、および(iii)その調製した試薬溶液が装置自身の
もつ供給手段により反応器に供給されることにあ
る。

以下、図に示す実施例に基いて、この発明を詳
説する。ただし、これによりこの発明が限定され
るものではない。

第１図に示す１は、この発明の一実施例であ
り、ホスホトリエステル法によるDNA微量自動
合成装置である。

反応器２は内径８mm、高さ10mmの円筒状の本体
３の上方にすりばち状フランジ４を設けた容器で
ある。すりばち状フランジ４には、多数の試薬溶
液等供給用のノズルが挿着された栓５が装着され
ている。そこで、本体３の頭部開口が試薬溶液等
供給口６となる。本体３の内部下方にはガラスフ
イルタのごときフイルタ７が嵌着され、さらに底
部には排液口８が設けられている。フイルタ７
は、ポリスチレン、シリカビーズのごとき支持体
９を載置できる（透過させない）もので、試薬溶
液、溶媒、ガスを透過させるものである。フイル
タ７の上部空間が反応部１０になり、約450μ
の容積の空間である。

１１〜１３は溶媒で、それぞれ反応用溶媒とし
てピリジン、乾燥用溶媒としてテトラヒドロフラ
ン（THF）、洗浄用溶媒としてイソプロパノール
と塩化メチレンの混合液である。

１４は保護基脱離用試液で、イソプロパノール
と塩化メチレンの混合溶媒に臭化亜塩を溶解した
溶液である。１５はマスキング用試薬で、無水酢
酸とピリジンの混合液である。１６はマスキング
用縮合剤で、ジメチルアミノピリジンとピリジン
の混合液である。

上記溶媒１１〜１３および試薬溶液１４〜１６
は、窒素ガス圧によつてそれぞれ弁１７〜２２を
介して反応器２に供給されうる。弁２３は窒素ガ
スを反応器２内へ直接供給する弁であり、２４は
排液弁、２５は排気弁である。これらの弁１７〜
２５は、マイクロコンピユータのごとき制御回路
２７でその作動を制御される。なお、窒素ガスは
塩化カルシウムのごとき乾燥剤２６で乾燥されて
いる。

オペレータは、操作卓２８を介して制御回路２
７と対話を行いうる。

調製用容器２９，２９′，２９″，………は、内
容量100μ〜500μ位の管状容器本体３０，３
０′，３０″，………とシリコンゴムセプタム３
１，３１′，３１″，………とからなつている。セ
プタム３１，３１′，３１″，………は、脱着自在
であり、かつ試薬溶液輪送用ニードル３９などを
外部から挿通しうるものである。これら調製用容
器２９，２９′，２９″，………は、制御回路２７
にて作動を制御されるターンテーブル４８上のホ
ルダー孔４９，４９′，………に保持されてい
る。

ターンテーブル４８によつて所定位置に移動さ
れた調製用容器２９には、ニードル上下機構３７
によつてニードル３８，３９，４５が挿通され
る。ニードル３８は窒素ガスの供給を行うもので
あり、ニードル３９は内部の溶液を取り出すもの
であり、ニードル４５は洗浄液を供給するもので
ある。

試薬調製用容器２９の容器本体３０は、第２図
に示すように、底部３２、胴部３３、頭部３４の
３つの容器構成体と、これらの間を仕切る内部隔
壁３５，３６とからなつている。容器構成体３
２，３３，３４はガラスや合成樹脂などで形成さ
れ、内部隔壁３５，３６は金属（たとえばアルミ
ニウム）箔や合成樹脂（たとえばテフロン）フイ
ルムなどで形成される。その他の試薬調製用容器
２９′，２９″………の溶器本体３０′，３０″……
…も同様の構造である。

試薬等の封入は、まず底部構成体３２内に結晶
状態の縮合剤〔２−４−６−トリメチルベンゼン
スルホニル−３−ニトロトリアゾリド
（MSNT）〕Ａを入れ、内部隔壁３５で蓋をする。
次に胴部構成体３３を底部構成体３２上に螺合
し、その胴部構成体３３内に結晶状態のヌクレオ
チド試薬Ｂを入れ、内部隔壁３６で蓋をする。次
に頭部構成体３４を胴部構成体３３上に螺合し、
その頭部構成体３４内にピリジンＣを入れ、セプ
タム３１で密封する。

封入するヌクレオチド試薬Ｂの量は、支持体に
結合しているヌクレオシドに対し３〜５当量が適
当である。たとえば支持体９がポリスチレン粉体
でヌクレオシドの結合量が0.1ｍmol／ｇの場合、
支持体１ｇ当りにモノマーで400mg、ダイマーで
700mg位が適当である。縮合剤Ａは同様の場合支
持体１ｇ当りに300mg位が適当であり、ピリジン
Ｃは同様の場合支持体１ｇあたりに５ml位とする
のが好ましい。

ヌクレオチド試薬Ｂは、塩基の違いによつてモ
ノマーの場合でも４種類あるが、これらを調製用
容器２９，２９′………に入れ分けておく順は目
的DNAの塩基配列のシーケンスと同じにしてお
く。ダイマーやトリマーあるいはこれらの混合物
を用いる場合も同様である。

上記ヌクレオチド試薬Ｂと縮合剤Ａのセツト
は、DNA合成を実際にスタートする時刻より以
前であれば任意に行つてよい。何故ならば、いず
れも結晶状態でセツトされるので、不安定でない
からである。

DNAの合成に際しては、前もつて反応器２内
にDNAの末端部分のみを結合した支持体９を入
れる。支持体９の量は、たとえば支持体９がポリ
スチレン粉体の場合には10mg〜50mgが適当であ
る。

この装置１の基本的な動作はホスホトリエステ
ル法を用いた公知のこの種の装置と原理的に同じ
であるので全般的説明は省略し、特徴のある合成
工程の動作についてのみ詳説する。

合成工程では、制御回路２７は、ニードル上下
機構３７を作動してニードル３８，３９，４５を
調製用容器２９に挿入する。ニードル３９は、ま
ずシリコンゴムセプタム３１を挿通し、次に内部
隔壁３６を破る。この時点でニードル３９の下降
を一時停止すれば、頭部小室４２内に封入されて
いたピリジンＣが胴部小室４１に流下してヌクレ
オチド試薬Ｂを溶解する。その後、さらにニード
ル３９を下降して内部隔壁３５を破れば、ヌクレ
オチド試薬Ｂのピリジン溶液が底部小室４０に流
下して縮合剤Ａを溶解する。第１図はこのときの
状態をあらわしている。

所定時間後には調製用容器２９内は、ヌクレオ
チド試薬Ｂと縮合剤Ａとを含む試薬溶液Ｄとなる
ので、弁４３，４７を作動してその試薬溶液Ｄを
反応器２に供給する。

これによつて反応器２内で縮合反応が生じ、新
たなヌクレオチドがDNAの末端部分に連結され
ることになる。

その後、弁４４，４７を作動して洗浄を行い、
次にニードル上下機構３７を作動してニードル３
８，３９，４５を調製用容器２９から引抜き、タ
ーンテーブル４８を回転して次の調製用容器２
９′を所定位置に移動し、次の合成工程のために
ニードル３８，３９をその調製用容器２９′に挿
入する。

さて上記実施例のDNA微量自動合成装置１に
よれば、縮合剤のMSNT Ａは安定な結晶状態で
ストツクされ、不安定な溶液状態にされるのは使
用される直前である。従つて任意の時間にDNA
合成を始めても確実に安定な合成が行われること
になり、大変便利になる。すなわちDNA合成を
始める都度試薬溶液を調製しなくてもすむように
なり保守が格段に容易になる。

なお、上記装置１では、反応器２の反応部１０
を小型化すると共に、フイルタ７の上に支持体９
を載置し、上方から試薬溶液１１〜１５を供給
し、底部から排液するように反応器２を構成して
いる。そこで排液弁２４を閉じたまま試薬溶液を
上方から供給すれば、その試薬溶液は支持体９に
含まれてこれを膨潤すると共にフイルタ７より上
の反応部１０内にとどまつて下方へ落ちない。従
つて、供給した全ての試薬溶液が反応に参加し、
デツドスペースに溜まるものが無くなる。この結
果、供給量は最低量（支持体体積の５〜７倍位）
で充分になり、また反応を促進するために反応器
を振盪するなどの混合・接触操作も無用になつて
いる。また、新たなヌクレオチドを連結する反応
の前に反応器２内を乾燥用溶媒たとえばTHF１
２で洗浄乾燥すると共に乾燥ガスでブローして短
時間で反応器２内を完全乾燥できるように構成さ
れており、この結果、縮合反応を阻害する水分を
完全に除去できるので反応効率が下がらず、余分
な試薬を必要としない。

変形例としては、反応器２をロート状にしたも
の、樽状にしたもの、また反応部の内容積を80μ
〜800μの間で変化したものが挙げられる。
また固体支持体としてKel−Ｆ・ｇスチレン、シ
リカゲル、ポリアクリルモルフオリドなどを用い
たものが挙げられる。これらの支持体は粒径30〜
300μｍ程度のものが好ましい。

他の変形例としては、試薬溶液輸送用ニードル
３９で内部隔壁３５，３６を破らずに他に専用の
内部隔壁破壊ニードルを設けてこれで破るように
したもの、ピリジンＣを容器２９，２９′………
内に封入せずに洗浄用ピリジンの供給流路にプラ
ンジヤポンプのごとき定量ポンプを設けてこれに
よりピリジンＣを容器２９，２９′………に定量
供給するようにしたものなどが挙げられる。

さらに他の実施例としては、ホスホモノトリア
ゾリド法やホスフアイト法、あるいはジエステル
法によるDNA等合成装置にこの発明を適用した
ものが挙げられる。

ホスホモノトリアゾリド法に適用する場合を前
記装置１を基本にして説明すると、調製用容器２
９を頭部小室４２と底部小室４０の２段にし、そ
の頭部小室４２にリン酸化試薬液たとえばＯ−ク
ロロフエニルホスホロジトリアゾリドを入れ、底
部小室４０に(i)式のヌクレオチド誘導体を入れて
おく。

〔Base（塩基）はアデニン、グアニン、シトシン
もしくはチミン〕それぞれの量は、(i)式のヌクレオチド誘導体10
に対しＯ−クロロフエニルホスホロジトリアゾリ
ド９〜10とする。調製用容器２９′，２９″………
についても同様である。ただし、それぞれのヌク
レオチド誘導体の塩基は、容器２９，２９′……
…の並ぶ順が目的DNAの塩基配列のシーケンス
と合うように各々選定する。Ｏ−クロロフエニル
ホスホロジトリアゾリドと(i)式のヌクレオチド誘
導体とを加え合せたヌクレオチド試薬溶液は不安
定であるが、(i)式のヌクレオチド誘導体とＯ−ク
ロロフエニルホスホロジトリアゾリドはそれぞれ
単独では安定であるから所望の効果が得られる。

ホスフアイト法に適用する場合を同様に説明す
ると、調製用容器２９を頭部小室４２と底部小室
４０の２段にし、その頭部小室４２にTHFを入
れ、底部小室４０に(ii)式のヌクレオチド誘導体を
入れておく。

〔Base（塩基）はアデニン、グアニン、シトシン
もしくはチミン〕調製容器２９′，２９″………についても同様で
ある。ただし、それぞれのヌクレオチド誘導体の
塩基は、容器２９，２９′………の並ぶ順が目的
DNAの塩基配列のシーケンスと合うように選定
する。

以上の説明から理解されるように、この発明の
DNA等合成装置によれば、不安定な試薬溶液は
用時に調製されて使用されることになる。そこで
前もつて試薬類をセツテイングしておいても確実
に安定な合成を行える効果があり、保守面からも
望ましいものとなる。また途中で反応をストツプ
した場合も、残つた試薬の回収が可能であり、高
価な試薬を浪費することがない。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明のDNA等合成装置の一実施
例であるDNA微量自動合成装置の構成説明図、
第２図は同装置に使用される調製用容器の分解断
面図、第３図は第１図に示す装置の動作のフロー
チヤート図である。１……DNA微量自動調製装置、２……反応
器、２９……調製用容器、３５，３６……内部隔
壁、３７……ニードル上下機構、３８，３９，４
５……ニードル、４０，４１，４２……小室、Ａ
……縮合剤、Ｂ……ヌクレオチド試薬、Ｃ……ピ
リジン、Ｄ……試薬溶液。

Claims

【特許請求の範囲】１試薬溶液調製用容器、内部隔壁破壊手段、送
液手段および反応器を具備し、前記試薬溶液調製
用容器は容易に破壊可能な内部隔壁によつて複数
の密閉小室に区画されかつそれら小室にそれぞれ
試薬もしくは溶媒が封入されたものであり、前記
内部隔壁破壊手段は前記内部隔壁を破壊して前記
試薬もしくは溶媒を１つの試薬溶液に調製せしめ
るものであり、前記送液手段は前記調製された試
薬溶液を前記反応器に供給して反応器内でDNA
等を合成せしめるものであることを特徴とする
DNA等合成装置。２調製用容器の外壁の一部がゴムセプタム部に
形成され、内部隔壁破壊手段が前記ゴムセプタム
部に外部から挿通されて内部隔壁を破壊するニー
ドルであり、送液手段が前記ゴムセプタム部に外
部から挿通されて調製用容器の内部から試薬溶液
を吸入するニードルとその吸入した試薬溶液を反
応器内に吐出するノズルとを具備してなるもので
ある請求の範囲第１項記載の装置。