JPS6241676B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、DNA等微量自動合成装置に関
し、特にDNAまたはRNAの微量自動合成に好適
な装置を提供する。

DNAの合成法として、いわゆるホスホジエス
テル法、ホスホトリエステル法、ホスフアイト法
と改良発展がなされ、さらにこれらの方法を利用
し、固形支持体を用いる固相合成法が各種の利点
を有することから多用されるに到つている。一
方、固相合成法に用いられる反応器（反応カラ
ム）は、試薬溶液との混合・接触面からみて、固
形支持体を入れた反応器自体を振盪させるタイ
プ、同反応器に試薬溶液を循環させるタイプ、同
反応器に多量の試薬溶液を一過性に通過させるタ
イプの３種類が知られている。しかし、いずれの
タイプも種々の欠点がある。また、一方従来の自
動合成成装置では、固形支持体の量として100mg
以上用いるスケールがほとんどであり、合成すべ
きDNAの必要量、原料の保護基付ヌクレオチド
などの試薬が高価であることなどの観点から、よ
り小さなスケールでの自動合成装置が望まれてい
た。さらに、DNA合成では、水分もしくは湿気
の存在をさけることが必要な工程が含まれてお
り、従来法では、たとえば乾燥用溶媒としてピリ
ジン用い、真空下で水分を除去する方法や、乾燥
ガスス（たとえばN₂ガス）のみを用いてブロー
することにより除去する方法が知られていたが、
いずれも短所を有していた。

この発明の発明者は、種々検討の結果、公知の
自動合成装置を改良することに成功した。

かくして、この発明によれば、反応器が、上部
に試薬溶液等供給口を有し、内部下方にDNA等
合成用の固形支持体を載置可能でかつ試薬溶液を
透過しうるフイルタを有し、底部に排液口を有
し、フイルタ上方に容積80μ〜800μの反応
部空間を有する容器にて構成されると共に、反応
器に乾燥用揮発性溶媒供給手段および乾燥ガス供
給手段が接続され、さらに合成工程の直前に前記
乾燥用揮発性溶媒供給手段を作動して乾燥用揮発
性溶媒で反応器内を洗浄乾燥するとともに次いで
前記乾燥ガス供給手段を作動して乾燥ガスで反応
器内をブローし完全乾燥させる制御手段を具備し
てなるDNA等微量自動合成装置が提供される。

この発明の装置の主な特徴は、(i)反応器を振盪
させるなどの混合・接触のための特別な動作を行
わせる手段を不要にすること、(ii)固体支持体とし
て10mg〜50mg位のスケールで、またDNAとして
縮合10回位で0.3〜２μmol位のスケールでの合成
が可能な反応システムを提供できること、(iii)使用
する試薬溶液が固体支持体の体積に対し５〜７倍
程度ですみ、かつそれに適した供給手段を提供す
ること、(iv)最少量の試薬を最高の濃度で使用する
ことができ、短時間で高収率の反応が期待できる
こと、(v)比較的に湿度の高い環境下でも好適に微
量合成を行いうる反応システムを提供できること
にある。

以下、図に示す実施例に基いて、この発明を詳
説する。なお、これによりこの発明が限定される
ものではない。

第１図に示す１は、この発明を適用したホスホ
トリエステル法によるDNA微量自動合成装置で
である。

反応器２は内径８mm、高さ10mmの円筒状の本体
３の上方にすりばち状フランジ４を設けた容器で
ある。すりばち状フランジ３には、多数の試薬溶
液等供給用のノズルが挿着された栓５が装着され
ている。そこで、本体３の頭部開口が試薬溶液等
供給口６となる。本体３の内部下方にはガラスフ
イルタのごときフイルタ７が嵌着され、さらに底
部には排液口８が設けられている。フイルタ７
は、ポリスチレン、シリカビーズのごとき支持体
９を載置できる（透過させない）もので、試薬溶
液、溶媒、ガスを透過させるものである。フイル
タ７の上部空間が反応部１０になり、約450μ
の容積の空間である。

試薬溶液は全部で８種類ある。１１，１４はヌ
クレオチド試薬で、それぞれ塩基にアデニン、シ
トシン、グアニン、チミンを有している。１５は
縮合剤溶液で、メシチレンスルホニル−３−ニト
ロトリアゾリド（MSNT）のピリジン溶液であ
る。３９は保護基脱離剤で、イソプロパノールと
塩化メチレンの混合溶媒に臭化亜鉛を溶解した溶
液である。４０はマスキング用試薬で、無水酢酸
とピリジンの混合液である。４１はマスキング用
試薬で、ジメチルアミノピリジン溶液である。

シリンジポンプ２１〜２５は、それぞれ切換コ
ツク１６〜２０を介して上記試薬溶液１１〜１５
を吸入し、反応器２へ供給しうる。

シリンジポンプ２１〜２５のプランジヤはそれ
ぞれプランジヤ駆動機構２６〜３０で駆動され
る。

プランジヤ駆動機構２６は、パルスモータ３１
と、それにより回転されるネジ軸３２と、そのネ
ジ軸３３の回転により移動してプランジヤ２１ａ
を上下させるナツト３３とからなつており、パル
スモータ３１はマイクロコンピユータのごとき制
御回路３４でパルス制御されている。他のプラン
ジヤ駆動機構２７〜３０も同様の構造である。

３６〜３８は溶媒で、それぞれ乾燥用揮発性溶
媒のテトラヒドロフラン（THF）、洗浄用溶媒の
ピリジン、同じく洗浄用溶媒のイソプロパノール
と塩化メチレンの混合液である。これら溶媒３６
〜３８および前記試薬溶液３９〜４１は、窒素ガ
ス圧によつてそれぞれ弁４２〜４７を介して反応
器２に供給されうる。

弁４８は、窒素ガスで反応器２内をブローする
ために、窒素ガスを直接反応器２へ供給するもの
である。窒素ガスは塩化カルシウムのごとき乾燥
剤４９で乾燥されている。

制御回路３４は、前述のようにプランジヤ制御
機構２６〜３０を制御する外に、切換コツク１６
〜２０、弁４２〜４８、排液弁５０および排気弁
５１の作動を制御する。また、操作卓３５を介し
てオペレータと対話を行う。

DNA合成に際しては、まず栓５をはずして反
応器２内に、DNA分子の末端部分のみを結合し
た支持体９を入れる。この量は、たとえば支持体
９がポリスチレン粉体の場合には10mg〜50mgが好
適である。栓５を元に戻した後、入れた支持体９
の量などを操作卓３５を介して制御回路３４に入
力し、ついでスタート指令を入力する。

すると制御回路３４は、弁４４，４８，５０，
５１を作動してイソプロパノールと塩化メチレン
の混合溶媒３８を反応器２に供給し、支持体９を
洗浄する。つまり、弁４４，５１を開いて溶媒３
８を供給し、弁４４，５１を閉じたのち、しばら
くおいて弁４８，５０を開いて排液し、弁４８，
５０を閉じる。これを数回行う。この洗浄のの
ち、弁４５，５１を作動して保護基脱離剤３９を
反応器２に供給し、所定時間おいたのち、弁４
８，５０を作動して排液する。

支持体９に結合されていたDNA分子の末端部
分の反応基は、あらかじめ保護基としてジメトキ
シトリチル基（DMTr）をつけられてブロツクさ
れているが、上記動作によつて所定部位のDMTr
が脱離される。

この後制御回路３４は、再び弁４４，４８，５
０，５１を作動してイソプロパノールと塩化メチ
レンの混合溶媒３８を反応器２に供給し、支持体
９を洗浄する。さらに弁４３，４８，５０，５１
を作動してピリジン３７で反応器２内を洗浄す
る。

次に制御回路３４は、弁４２，５１を開いて乾
燥用揮発性溶媒のTHF３６を反応器２に供給
し、弁４２，５１を閉じたのち数秒おいて弁４
８，５０を開いて排液し、弁４８，５０を閉じ
る。これを数回行つて、反応器２内を洗浄乾燥す
る。ついで弁４８，５０，５１を開いて数分間ブ
ローし、反応器２内を完全乾燥する。完全乾燥
後、弁４８，５０，５１を閉じ、次の合成工程に
入る。

制御回路３４は、合成しようとするDNAの塩
基配列に基いて、異なる塩基をもつ４つのヌクレ
オチド試薬１１〜１４から１つのヌクレオチド試
薬を選択し、それに対応する切換コツクおよびプ
ランジヤ駆動機構を作動し、また排気弁５１を作
動してそのヌクレオチド試薬溶液を反応器２に供
給する。たとえば、塩基としてアデニンを持つヌ
クレオチドがDNAの塩基配列として次に必要な
らば、１１のヌクレオチド試薬溶液を選択し、切
換コツク１６およびプランジヤ駆動機構２６を作
動し、排気弁５１を作動して、シリンジポンプ２
１によつて１１を反応器２に供給する。

また同時に、切換コツク２０およびプランジヤ
駆動機構３０を作動し、シリンジポンプ２５によ
つて縮合剤１５を反応器２に供給する。

供給量は、ヌクレオチド試薬溶液と縮合剤の合
計量が支持体９を膨潤するのに充分な最低量とな
るように制御される。具体的にはたとえば支持体
９がポリスチレン粉体の場合には支持体１ｇ当り
に、ヌクレオチド試薬約３ml、縮合剤約３mlとす
る。言うまでもなく、これら最低量の試薬溶液中
に充分に試薬を含むように濃度調整しておくこと
が必要である。

上記動作によつて、支持体９に結合されていた
DNA分子の末端部分の所定部位に所望の塩基を
もつヌクレオチドが連結される。なお、そのヌク
レオチドの5′水酸基は、予め保護基のDMTrによ
り保護されている。

支持体９がポリスチレン粉末の場合、支持体１
ｇ当り約0.1ｍmolのDNA分子の末端部分が結合
されており、そのほとんどには上記のように新た
なヌクレオチドが連結される。しかしながら数％
程度は未反応で残る場合がある。このため制御装
置３４は次のように未反応の5′水酸基にマスキン
グを行う。すなわち、一定時間ののち、弁４３，
４８，５０，５１を作動してピリジン３７にて反
応器２内を洗浄する。次に弁４６，５１を作動し
てマスキング用試薬４０を反応器２に供給する。
また同時に弁４７を作動してマスキング用試薬４
１を反応器２に供給する。

上記動作によりマスキングを行つた後、制御回
路３４は、弁４３，４８，５０，５１を作動して
反応器２内をピリジン３７にて洗浄する。

ここまでの動作により、予め支持体９に結合さ
れていたDNA分子の末端部分に新たに１つのヌ
クレオチドを連続する１つのサイクルが終了す
る。

制御回路３４は、弁４４，４８，５０，５１を
作動して洗浄用溶媒であるイソプロパノールと塩
化メチレンの混合溶媒３８を供給する前記保護基
脱離動作から上記マスキング動作まぜのサイクル
を繰返し、操作卓３５で入力された目的DNAを
合成する。

さて、上記実施例のDNA合成装置１によれ
ば、従来と異なつて、試薬溶液１１〜１５は常に
支持体の量に基いて算出される最低量で供給され
て、かつ混合・接触操作は行わない。そこで試薬
消費量が節約されると共に混合・接触作用の装置
も不要になつている。

このように改良したのは、反応器２の反応部１
０を小型化すると共に、フイルタ７の上に支持体
９を載置し、上方から試薬溶液１１〜１５を供給
し、底部から排液するようにしたためである。す
なわち排液弁５０を閉じたまま試薬溶液を上方か
ら供給すれば、その試薬溶液は支持体９に含まれ
てこれを膨潤すると共にフイルタ７より上の反応
部１０内にとどまつて下方へ落ちない。従つて、
供給した全ての試薬溶液が反応に参加し、デツド
スペースに溜まるものが無くなる。この結果、供
給量は最低量で充分になり、また混合・接触操作
も無用になるわけである。

さらに加えて、新たなヌクレオチドを連結する
反応の直前に乾燥用溶媒たとえばTHF３６にて
反応器２内を洗浄乾燥し、さらに乾燥ガスでブロ
ーしているので、反応器２内は短時間で完全に乾
燥される。そこで縮合反応を強く阻害する水分が
試薬溶液などにまぎれて混入していても完全に排
除され、反応効率の低下が妨げることになる。こ
の結果、比較的に湿度の高い環境下でも好適に合
成反応を行えることになり、従つて余分に試薬溶
液を加える必要がなくなるから消費量を節約でき
ることになる。また、微量の合成も問題なく行え
るようになる。

変形実施例としては、乾燥用揮発性溶媒にアセ
トン、ジメチルホルムアミド、ジオキサンなどを
用いたものが挙げられる。要するに、揮発性つま
り低沸点のものであればよい。さらに好ましくは
無水にしやすいものがよい。なんとなれば、排液
された乾燥用揮発性溶媒から水分を除去して再利
用しやすいからである。この場合、たとえば排液
弁５０の後に切換コツクと乾燥剤を入れたカラム
とを直列に連結し、そのカラムの出口を乾燥用揮
発性溶媒のタンクへ接続してやればよい。切換コ
ツクは制御回路３４にて、用時のみカラムへ排液
を流し、それ以外は廃棄するように切換制御す
る。

また他の変形例としては、乾燥ガスにアルゴン
ガス等を用いてもよい。

他の実施例としては、ホスホモノトリアゾリド
法やホスフアイト法あるいはホスホジエステル法
によるDNA合成装置にこの発明を適用したもの
が挙げられる。

固体支持体９の他の例としては、Kel−Ｆ・ｇ
スチレン、シリカゲル、ポリアクリルモルフオリ
ドがある。この支持体９は粒径30〜300μｍくら
いのものが好ましい。

以上の説明から理解されるように、この発明の
DNA等微量自動合成装置によれば、高価な合成
用試薬の無駄な消費が抑えられてランニングコス
トが安価になる効果がある。また、混合・接触操
作も不要となる。さらに日本のように比較的に湿
度の高い環境下でも水分による効率の低下を招か
ず好適に合成反応を行えるようになる。またこの
結果、余分に試薬を必要とすることがなくなるの
で、さらに試薬の節約ができてランニングコスト
が安価になる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明のDNA等微量自動合成装置
の一実施例であるDNA微量自動合成装置の構成
説明図、第２図は制御回路のフローチヤートであ
る。 １……DNA微量自動合成装置、２……反応
器、３……本体、４……フランジ部、６……試薬
溶液等供給口、７……フイルタ、８……排液口、
９……支持体、１０……反応部、１１〜１５，３
９〜４１……試薬溶液、１６〜２０……切換コツ
ク、２１〜２５……シリンジポンプ、２６〜３０
……プランジヤ駆動機構、３４……制御回路、３
６〜３８……溶媒、４２〜４８，５０，５１……
弁。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 反応器が、上部に試薬容液等供給口を有し、
   内部下方にDNA等合成用の固形支持体を載置可
   能でかつ試薬溶液を通過しうるフイルタを有し、
   底部に排液口を有し、フイルタ上方に微量容積の
   反応部空間を有する容器にて構成されると共に、
   反応器に乾燥用揮発性溶媒供給手段および乾燥ガ
   ス供給手段が接続され、さらに合成工程の直前に
   前記乾燥用揮発性溶媒供給手段を作動して乾燥用
   揮発性溶媒で反応器内を洗浄乾燥するとともに次
   いで前記乾燥ガス供給手段を作動して乾燥ガスで
   反応器内をブローし完全乾燥させる制御手段を具
   備してなるDNA等微量自動合成装置。