JPS6331480B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
基礎及び応用研究の重要な方法論としての組み
換えDNA(デオキシリボ核酸)及び遺伝手術の出
現は、両者を一緒にして用いた場合に、10年も経
たない前は可能であると夢に思われていた遺伝物
質及び生細胞のずつと複雑な操作を可能にするい
くつかの実験技術の発達によつて可能になつた。
これらの技術によつて、ヒトのゲノムを個々の遺
伝子に分解し、該遺伝子を細菌等の微生物に転移
させることができる。そこで遺伝子は細菌によつ
て遺伝子の化学構造が定められ得るような量で再
生されることができる。その上、ヒトの遺伝子を
含有する微生物を誘発して遺伝子によつて暗号化
された多量のタンパク質産生物を産生し、こうし
てインターフエロン、生長ホルモン、インシユリ
ン等の希少なヒトのタンパク質を多量に産生する
ことができる。
換えDNA(デオキシリボ核酸)及び遺伝手術の出
現は、両者を一緒にして用いた場合に、10年も経
たない前は可能であると夢に思われていた遺伝物
質及び生細胞のずつと複雑な操作を可能にするい
くつかの実験技術の発達によつて可能になつた。
これらの技術によつて、ヒトのゲノムを個々の遺
伝子に分解し、該遺伝子を細菌等の微生物に転移
させることができる。そこで遺伝子は細菌によつ
て遺伝子の化学構造が定められ得るような量で再
生されることができる。その上、ヒトの遺伝子を
含有する微生物を誘発して遺伝子によつて暗号化
された多量のタンパク質産生物を産生し、こうし
てインターフエロン、生長ホルモン、インシユリ
ン等の希少なヒトのタンパク質を多量に産生する
ことができる。
遺伝手術の急速な発達にかぎとなる役割を果し
た実験技法の内の一つは、構造の明らかなオリゴ
ヌクレオチドの化学合成である。かかるオリゴヌ
クレオチドは一度に個々の生細胞によつて表現さ
れる何万〜何百万の遺伝子を収容するライブラリ
ーからただ1個の遺伝子を単離するプロセスの必
須部分になることがよくある。DNAの化学構造
は独特であるから、特有の配列を有するDNAの
一片は、違つた配列を有する複雑に混合した他の
全ての断片を顧みずに相補配列を有するただ一つ
の別の片を認識して結合する。従つて、化学的に
合成したDNAの小さい片を、適当な相補配列を
含有するDNAのずつと大きな片、遺伝子全体で
さえも捜し出す独特の分子プルーブとして用いる
ことができる。プルーブの中に取り込むべき正確
な構造は、遺伝暗号を用いてタンパク質配列を
DNA配列の中に翻訳することによつて遺伝子で
暗合化したタンパク質の構造から推論することが
できる。遺伝暗号は退化するので、即ち、タンパ
ク質配列中の化学単位の殆どはDNA配列中の化
学単位のいくつかの基によつて暗号化され得るの
で、所望の遺伝子に対し相補性の1つの配列を作
ることを確実にするために、関連するが同一でな
い配列を含有する一組のDNAプルーブを合成し
なければならない場合がよくある。このことは
DNAを合成するのに用いる方法を厳しく圧迫す
る。これらの方法が日常のように有用になるため
には、たつた1つの遺伝子を捜し出すのに何ダー
スもの種々の異るDNA分子を合成しなければな
らないことがよくあることから、これらの方法は
迅速で、簡単で、信頼性があつてかつ安価でなけ
ればならない。
た実験技法の内の一つは、構造の明らかなオリゴ
ヌクレオチドの化学合成である。かかるオリゴヌ
クレオチドは一度に個々の生細胞によつて表現さ
れる何万〜何百万の遺伝子を収容するライブラリ
ーからただ1個の遺伝子を単離するプロセスの必
須部分になることがよくある。DNAの化学構造
は独特であるから、特有の配列を有するDNAの
一片は、違つた配列を有する複雑に混合した他の
全ての断片を顧みずに相補配列を有するただ一つ
の別の片を認識して結合する。従つて、化学的に
合成したDNAの小さい片を、適当な相補配列を
含有するDNAのずつと大きな片、遺伝子全体で
さえも捜し出す独特の分子プルーブとして用いる
ことができる。プルーブの中に取り込むべき正確
な構造は、遺伝暗号を用いてタンパク質配列を
DNA配列の中に翻訳することによつて遺伝子で
暗合化したタンパク質の構造から推論することが
できる。遺伝暗号は退化するので、即ち、タンパ
ク質配列中の化学単位の殆どはDNA配列中の化
学単位のいくつかの基によつて暗号化され得るの
で、所望の遺伝子に対し相補性の1つの配列を作
ることを確実にするために、関連するが同一でな
い配列を含有する一組のDNAプルーブを合成し
なければならない場合がよくある。このことは
DNAを合成するのに用いる方法を厳しく圧迫す
る。これらの方法が日常のように有用になるため
には、たつた1つの遺伝子を捜し出すのに何ダー
スもの種々の異るDNA分子を合成しなければな
らないことがよくあることから、これらの方法は
迅速で、簡単で、信頼性があつてかつ安価でなけ
ればならない。
オリゴヌクレオチドの合成方法はカルザス等に
よつて発達された(エム・デイー・マツテウツ
チ、エム・エツチ・カルザス、J.Amer.Chem.
Soc.103、3185−3191、1981;エス・エル・ビユ
ーケージ、エム・エツチ・カルザス、Tet.
Lett.22、1859−1862、1981)。これらのオリゴヌ
クレオチドは、シリカゲル重合体支持体に共有付
着したデオキシヌクレオシドにモノデオキシヌク
レオシドを段階的に付加することによつて合成す
る。各々を付加する個々の工程は、活性ヌクレオ
シドをホスフアイトエステルとして縮合(工程
1)、未反応ヌクレオシド5′−ヒドロキシル基の
共有反応抑制(工程2)、ホスフアイトのホスフ
エートへの酸化(工程3)、各サイクルで付加し
たヌクレオシドから5′−ブロツキング基の除去
(工程4)を含む。所望の数の単量体が一旦成長
鎖に付加されたならば、反応完了したオリゴヌク
レオチドをシリカ支持体から取り去り、チオフエ
ノール及び水酸化アンモニウムで処理してオリゴ
ヌクレオチドから残留するブロツキング基を除
く。
よつて発達された(エム・デイー・マツテウツ
チ、エム・エツチ・カルザス、J.Amer.Chem.
Soc.103、3185−3191、1981;エス・エル・ビユ
ーケージ、エム・エツチ・カルザス、Tet.
Lett.22、1859−1862、1981)。これらのオリゴヌ
クレオチドは、シリカゲル重合体支持体に共有付
着したデオキシヌクレオシドにモノデオキシヌク
レオシドを段階的に付加することによつて合成す
る。各々を付加する個々の工程は、活性ヌクレオ
シドをホスフアイトエステルとして縮合(工程
1)、未反応ヌクレオシド5′−ヒドロキシル基の
共有反応抑制(工程2)、ホスフアイトのホスフ
エートへの酸化(工程3)、各サイクルで付加し
たヌクレオシドから5′−ブロツキング基の除去
(工程4)を含む。所望の数の単量体が一旦成長
鎖に付加されたならば、反応完了したオリゴヌク
レオチドをシリカ支持体から取り去り、チオフエ
ノール及び水酸化アンモニウムで処理してオリゴ
ヌクレオチドから残留するブロツキング基を除
く。
カルザス等のプロセスは次の特徴を有する:
(1) オリゴヌクレオチドを不溶性の重合体支持体
の上で合成する。多工程の合成を含まれるの
で、この発達は合成中間体の精製を簡単にす
る。成長重合体を除かずに溶剤で過剰の試薬及
び望ましくない反応副産生物の殆どを支持体か
ら洗い落とす。
の上で合成する。多工程の合成を含まれるの
で、この発達は合成中間体の精製を簡単にす
る。成長重合体を除かずに溶剤で過剰の試薬及
び望ましくない反応副産生物の殆どを支持体か
ら洗い落とす。
(2) 活性ヌクレオチドホスフアイトがオリゴヌク
レオチドの合成に用いる中間体である。これら
のホスフアイトは急速かつ高収率で反応する。
これらは重合体支持体上で環式縮合反応を完了
させる理想的な特性である。
レオチドの合成に用いる中間体である。これら
のホスフアイトは急速かつ高収率で反応する。
これらは重合体支持体上で環式縮合反応を完了
させる理想的な特性である。
(3) ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴチクレ
オチドから5′−ブロツキング基を選択的に除く
一連の試薬がカルザス等によつて発達された。
これらの試薬はZnBr2、BF3、AlCl3、TiCl4等
のリユーイス酸である。これらの試薬は、前も
つて成形されたオリゴヌクレオチドを劣化させ
ることなくエーテル保護基を有効に取り除く。
オチドから5′−ブロツキング基を選択的に除く
一連の試薬がカルザス等によつて発達された。
これらの試薬はZnBr2、BF3、AlCl3、TiCl4等
のリユーイス酸である。これらの試薬は、前も
つて成形されたオリゴヌクレオチドを劣化させ
ることなくエーテル保護基を有効に取り除く。
(4) 合成プロセス全体が極めて急速である。全て
の処理加工工程を含む各々のモノンデオキシヌ
クレオシドの添加は約2−1/2時間を要する。
の処理加工工程を含む各々のモノンデオキシヌ
クレオシドの添加は約2−1/2時間を要する。
(5) 活性モノヌクレオシドの各々で95%を超える
収率が観測される。
収率が観測される。
カルザス等のプロセスに用いられる重合体支持
体は、マクロポーラスなシリカゲルビーズに共有
結合した適当にブロツクした4つのヌクレオシド
の内の1つから成る。
体は、マクロポーラスなシリカゲルビーズに共有
結合した適当にブロツクした4つのヌクレオシド
の内の1つから成る。
カルザス等のプロセスの初期工程は活性ヌクレ
オシドの合成である。4つのヌクレオシドは全て
ジ−p−アニシルフエニルメチル(ジメトキシト
リチル、DMTr)エーテル等の5′−ブロツキング
基を含有する。しかし、その他の適当な5′−保護
基を任意に用いることができる。また、シトシ
ン、アデニン、グアニンのアミノ基を保護するの
が望ましい。ベンゾイル、イソブチリル又は類似
の基を使用することができる。従つて、5′−o−
ジメトキシトリチル−デオキシチミジン
(DMTrd(T))、5′−o−ジメトキシトリチル−
N−ベンゾイルデオキシシチジン(DMTrd
(bzC))、5′−o−ジメトキシトリチル−N−ベ
ンゾイルデオキシアデノシン(DMTrd(bzA))、
5′−o−ジメトキシトリチル−N−イソブチリル
デオキシグアノシン(DMTrd(ibG))が保護ヌ
クレオシドとして用いられてきた。
オシドの合成である。4つのヌクレオシドは全て
ジ−p−アニシルフエニルメチル(ジメトキシト
リチル、DMTr)エーテル等の5′−ブロツキング
基を含有する。しかし、その他の適当な5′−保護
基を任意に用いることができる。また、シトシ
ン、アデニン、グアニンのアミノ基を保護するの
が望ましい。ベンゾイル、イソブチリル又は類似
の基を使用することができる。従つて、5′−o−
ジメトキシトリチル−デオキシチミジン
(DMTrd(T))、5′−o−ジメトキシトリチル−
N−ベンゾイルデオキシシチジン(DMTrd
(bzC))、5′−o−ジメトキシトリチル−N−ベ
ンゾイルデオキシアデノシン(DMTrd(bzA))、
5′−o−ジメトキシトリチル−N−イソブチリル
デオキシグアノシン(DMTrd(ibG))が保護ヌ
クレオシドとして用いられてきた。
保護ヌクレオシドはカツプリングのために活性
にしなければならない。理想的には、活性ヌクレ
オシドは安定かつ取扱い容易でなければならず、
かつ同時にカツプルするヌクレオシドの未保護
5′−ヒドロキシル基に対する反応性が高くなけれ
ばならない。これらの要件は安定な一部活性にし
たホスフアイト基の合成によつて最もよく満足さ
れ、該ホスフアイト基を簡単な反応で現位置で所
望の反応性化合物に転化することができる。該化
合物は、カルザス等が説明するようにヌクレオシ
ドホスフアーアミダイト(phosphoramidite)を
含む。これらの化合物は次の手順で合成すること
ができる。DMTr−ヌクレオシド(1mモル)
を乾燥窒素で予備フラツシユ(preflush)した10
ml反応容器中の酸の存在しない乾燥したクロロホ
ルムとジイソプロピルエチルアミン(4mモル)
3mlに溶解する。溶液に窒素下室温で注射器によ
つてクロロ−N,N−ジアルキルアミノメトキシ
ホスフイン(2mモル、アルキル基はメチル、エ
チル、イソプロピルヌは類似化合物にすることが
できる)を滴下する(30−60秒)。15分後に溶液
を酢酸エチル35mlと共に125mlの分液漏斗に移す。
溶液を塩化ナトリウムの飽和水溶液(80ml)で4
回抽出する。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥
し、減圧下で蒸発してフオームにする。フオーム
をトルエン(10ml)又は酢酸エチル(10ml)で溶
解し、溶液を冷温ヘキサン(−78℃)50mlに激し
く撹拌しながら滴下する。冷温懸濁液をろ過し、
白色粉末を冷温ヘキサン(−78℃)75mlで洗浄す
る。白色粉末を減圧下で乾燥して窒素下で保存す
る。
にしなければならない。理想的には、活性ヌクレ
オシドは安定かつ取扱い容易でなければならず、
かつ同時にカツプルするヌクレオシドの未保護
5′−ヒドロキシル基に対する反応性が高くなけれ
ばならない。これらの要件は安定な一部活性にし
たホスフアイト基の合成によつて最もよく満足さ
れ、該ホスフアイト基を簡単な反応で現位置で所
望の反応性化合物に転化することができる。該化
合物は、カルザス等が説明するようにヌクレオシ
ドホスフアーアミダイト(phosphoramidite)を
含む。これらの化合物は次の手順で合成すること
ができる。DMTr−ヌクレオシド(1mモル)
を乾燥窒素で予備フラツシユ(preflush)した10
ml反応容器中の酸の存在しない乾燥したクロロホ
ルムとジイソプロピルエチルアミン(4mモル)
3mlに溶解する。溶液に窒素下室温で注射器によ
つてクロロ−N,N−ジアルキルアミノメトキシ
ホスフイン(2mモル、アルキル基はメチル、エ
チル、イソプロピルヌは類似化合物にすることが
できる)を滴下する(30−60秒)。15分後に溶液
を酢酸エチル35mlと共に125mlの分液漏斗に移す。
溶液を塩化ナトリウムの飽和水溶液(80ml)で4
回抽出する。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥
し、減圧下で蒸発してフオームにする。フオーム
をトルエン(10ml)又は酢酸エチル(10ml)で溶
解し、溶液を冷温ヘキサン(−78℃)50mlに激し
く撹拌しながら滴下する。冷温懸濁液をろ過し、
白色粉末を冷温ヘキサン(−78℃)75mlで洗浄す
る。白色粉末を減圧下で乾燥して窒素下で保存す
る。
所望のオリゴヌクレオチドの合成を始めるため
に、初めの単量体を固体支持体、典型的には大き
な表面積を有するマクロポーラスな支持体である
高性能液体クロマトグラフイー用シリカゲル或は
定細孔ガラスにカツプルさせなければならない。
初めに支持体を誘導化して単量体を付着させる。
カルザス等はシリカと(3−アミノプロピル)ト
リエトキシシランとの反応、アミノ誘導化シラン
と無水コハク酸との反応、残留シラノール基の全
ての塩化トリメチルシリルによる抑制を含む適当
な手順について説明した。次いで、無水ピリジン
中のジシクロヘキシルカルボジイミドを用いてシ
リカに付着したカルボキシル基に所望のDMTr
−ヌクレオシドをカツプルさせる。40時間処理し
た後に残る残留カルボキシル基を初めにn−ニト
ロフエノール、次いでモルホリンで処理してブロ
ツクする得られた産生物はシリカ1グラム当りお
よそ50マイクロモルのヌクレオシドを含有する。
に、初めの単量体を固体支持体、典型的には大き
な表面積を有するマクロポーラスな支持体である
高性能液体クロマトグラフイー用シリカゲル或は
定細孔ガラスにカツプルさせなければならない。
初めに支持体を誘導化して単量体を付着させる。
カルザス等はシリカと(3−アミノプロピル)ト
リエトキシシランとの反応、アミノ誘導化シラン
と無水コハク酸との反応、残留シラノール基の全
ての塩化トリメチルシリルによる抑制を含む適当
な手順について説明した。次いで、無水ピリジン
中のジシクロヘキシルカルボジイミドを用いてシ
リカに付着したカルボキシル基に所望のDMTr
−ヌクレオシドをカツプルさせる。40時間処理し
た後に残る残留カルボキシル基を初めにn−ニト
ロフエノール、次いでモルホリンで処理してブロ
ツクする得られた産生物はシリカ1グラム当りお
よそ50マイクロモルのヌクレオシドを含有する。
次の及び続くヌクレオシドを付着する際に伴な
う工程を以下に要約する。
う工程を以下に要約する。
初めに、酸(典型的にはニトロメタン中の
ZnBr2又はクロロホルム中のトリクロロ酢酸)で
処理して付着したヌクレオシドから5′−DMTr基
を除く。次に、シリカを溶剤で洗浄して開裂試薬
を除く。これらの溶剤は、ZnBr2の場合にはテト
ラヒドロフラン中のn−ブタノール及び2,6−
ルチジンに続いてテトラヒドロフラン、トリクロ
ロ酢酸の場合にはニトロメタン続いてメタノール
続いてアセトニトリルを含む。次に、所望のホス
フアアミダイトをテトラゾール10〜20モル等量で
処理して活性にし、シルカゲルに加えてそれが含
有するヌクレオシドの遊離5′−ヒドロキシル基に
カツプルさせる。活性ヌクレオシドとテトラゾー
ルの両方をアセトニトリル等の溶剤に溶解する。
一旦カツプリング反応が完了したら、典型的には
1〜10分、過剰の試薬をテトラヒドロフラン、ア
セトニトリル等の溶剤でシリカから洗い落とす。
所望の場合には、未反応5′−ヒドロキシル基を全
て溶剤洗浄に先立つて2,6−ルチジン/テトラ
ヒドロフラン中の無水酢酸で処理してブロツクす
ることができるが、この工程は合成に必須のもの
ではない。次に、このカツプリング手順で作られ
たホスフアイトエステルを、水、2,6−ルチジ
ン、テトラヒドロフランの混合物中のヨウ素で酸
化してホスフエートエステルに転化する。次に、
メタノールで、次いでニトロメタンで抽出して過
剰のヨウ素溶液をシリカから除いて次の5′−
DMTr除去に備える。
ZnBr2又はクロロホルム中のトリクロロ酢酸)で
処理して付着したヌクレオシドから5′−DMTr基
を除く。次に、シリカを溶剤で洗浄して開裂試薬
を除く。これらの溶剤は、ZnBr2の場合にはテト
ラヒドロフラン中のn−ブタノール及び2,6−
ルチジンに続いてテトラヒドロフラン、トリクロ
ロ酢酸の場合にはニトロメタン続いてメタノール
続いてアセトニトリルを含む。次に、所望のホス
フアアミダイトをテトラゾール10〜20モル等量で
処理して活性にし、シルカゲルに加えてそれが含
有するヌクレオシドの遊離5′−ヒドロキシル基に
カツプルさせる。活性ヌクレオシドとテトラゾー
ルの両方をアセトニトリル等の溶剤に溶解する。
一旦カツプリング反応が完了したら、典型的には
1〜10分、過剰の試薬をテトラヒドロフラン、ア
セトニトリル等の溶剤でシリカから洗い落とす。
所望の場合には、未反応5′−ヒドロキシル基を全
て溶剤洗浄に先立つて2,6−ルチジン/テトラ
ヒドロフラン中の無水酢酸で処理してブロツクす
ることができるが、この工程は合成に必須のもの
ではない。次に、このカツプリング手順で作られ
たホスフアイトエステルを、水、2,6−ルチジ
ン、テトラヒドロフランの混合物中のヨウ素で酸
化してホスフエートエステルに転化する。次に、
メタノールで、次いでニトロメタンで抽出して過
剰のヨウ素溶液をシリカから除いて次の5′−
DMTr除去に備える。
所望のヌクレオシドを加えて上述のプロセスを
繰り返して正しいオリゴヌクレオチド配列を得
る。次いで、チオフエノール/トリエチルアミ
ン/ジオキサン(容積で1/1/2の混合物)で
45分間室温において処理してホスホトリエチステ
ルの上に含有されるメチル基を除く。この工程に
続いて、室温において3時間濃水酸化アンモニウ
ムで処理してオリゴヌクレオチドの3′端を支持体
に結合させるエステルを加水分解し、開裂したオ
リゴヌクレオチドから支持体をろ過し、ろ液を50
℃で12時間暖める。次に、オリゴヌクレオチドを
高性能液体クロマトグラフイーで精製し、クロマ
トグラフイーの間に5′−DMTr基を標識として残
し、最終的に5′−DMTr基を80%酢酸で処理して
除く。代りに、クロマトグラフイー法をポリアク
リルアミドゲル電気泳動に代える場合には、精製
に先立つて5′−DMTr基を除くことができる。
繰り返して正しいオリゴヌクレオチド配列を得
る。次いで、チオフエノール/トリエチルアミ
ン/ジオキサン(容積で1/1/2の混合物)で
45分間室温において処理してホスホトリエチステ
ルの上に含有されるメチル基を除く。この工程に
続いて、室温において3時間濃水酸化アンモニウ
ムで処理してオリゴヌクレオチドの3′端を支持体
に結合させるエステルを加水分解し、開裂したオ
リゴヌクレオチドから支持体をろ過し、ろ液を50
℃で12時間暖める。次に、オリゴヌクレオチドを
高性能液体クロマトグラフイーで精製し、クロマ
トグラフイーの間に5′−DMTr基を標識として残
し、最終的に5′−DMTr基を80%酢酸で処理して
除く。代りに、クロマトグラフイー法をポリアク
リルアミドゲル電気泳動に代える場合には、精製
に先立つて5′−DMTr基を除くことができる。
カルザス等のプロセスの主要な利点の内の一つ
はその潜在的速さである。プロセスを通して高い
収率を保つことができ、このため合成することが
できる配列の長さを伸ばすことができ、かつ中間
精製工程を必要としない。しかし、それは極めて
労働集約的であり、プロセスにおける種々の工
程、特に成長鎖に単量体を付加的に繰り返しカツ
プリングさせる工程を自動操作にするのが望まし
い。カルザス等は合成を行う手動操作装置につい
て説明したが、この装置はカツプリングさせる直
前に完全に活性にしたヌクレオシドを現位置で形
成する手段を含まないが故に完全な自動化に適し
ていない。これは、これらの化合物の取扱いに伴
う不安定の故に重要な制約となる。本発明は、一
部活性にしたヌクレオシドを完全に活性にした後
直ちにオリゴヌクレオチドを合成させる固体支持
体を収容する主反応容器に導入する予備反応容器
を具体化することによつてこの制約を克服する。
はその潜在的速さである。プロセスを通して高い
収率を保つことができ、このため合成することが
できる配列の長さを伸ばすことができ、かつ中間
精製工程を必要としない。しかし、それは極めて
労働集約的であり、プロセスにおける種々の工
程、特に成長鎖に単量体を付加的に繰り返しカツ
プリングさせる工程を自動操作にするのが望まし
い。カルザス等は合成を行う手動操作装置につい
て説明したが、この装置はカツプリングさせる直
前に完全に活性にしたヌクレオシドを現位置で形
成する手段を含まないが故に完全な自動化に適し
ていない。これは、これらの化合物の取扱いに伴
う不安定の故に重要な制約となる。本発明は、一
部活性にしたヌクレオシドを完全に活性にした後
直ちにオリゴヌクレオチドを合成させる固体支持
体を収容する主反応容器に導入する予備反応容器
を具体化することによつてこの制約を克服する。
根本的には、カルザス等は段階的反応プロセス
を採用するのに対し、本発明は固体支持体を収容
する主反応容器から成る反応域で完全に活性にし
たヌクレオシドを同時に反応させるプロセスを提
供する点で顕著に異る。
を採用するのに対し、本発明は固体支持体を収容
する主反応容器から成る反応域で完全に活性にし
たヌクレオシドを同時に反応させるプロセスを提
供する点で顕著に異る。
これはプロセスの完全自動化を可能にする。そ
の上、手動の活性化技術に比べて必要とされる高
価な薬品の使用量をずつと少くすることができ
る。また、合成プロセスの任意のカツプリング工
程において4つのヌクレオシド単量体の任意又は
全部を簡単かつ確実にとり込むことを可能にす
る。これは手動の活性化プロセスを用いる場合に
は容易に達成されず、かつ類似の配列を有する
DNA分子の大規模の組を作らなければならない
場合には必須になる。
の上、手動の活性化技術に比べて必要とされる高
価な薬品の使用量をずつと少くすることができ
る。また、合成プロセスの任意のカツプリング工
程において4つのヌクレオシド単量体の任意又は
全部を簡単かつ確実にとり込むことを可能にす
る。これは手動の活性化プロセスを用いる場合に
は容易に達成されず、かつ類似の配列を有する
DNA分子の大規模の組を作らなければならない
場合には必須になる。
カルザス等の装置の別の欠点は、シリカ支持体
を収容する反応容器の中に液体を移動させて通す
のに機械的ポンプを使用することである。この機
械系はポンプ室におけるガス気泡の生成或は沈殿
によつて引き起こされる流体の不安定をこうむ
る。また、ポンプ作用は圧力の脈動をもたらし、
該圧力の脈動はシリカ支持体の破砕や反応容器及
び管の閉塞に至り得る。また、ポンプは反応容器
の中に又は外に至る管にかなりのデツド容積をも
たらす。このデツド容積は、ガスを管の中に導入
するのを避ける要件と共に、試薬の濃度をかなり
希釈させるか、或は、代りに、デツド容積を満た
すのに高価な試薬をずつと多量に使用させること
になる。カルザス等の装置は循環バルブを導入し
て希釈した試薬を再び吐出させかつ再び反応器の
中に通させるが、これは反応及び溶剤フラツシン
グ時間を引き伸ばす。本発明は試薬及び溶剤を保
持する受槽内に空気ガス圧を用いてこれらの薬品
の反応器を通る移動を行わせる。その上、本発明
は極小化したデツド容積ゼロのバルブの使用を組
み入れて試薬の消費を最少にし、かつカツプリン
グサイクル時間を15分程に短縮させる。この機械
系はガス気泡による妨害を受けることなく(事
実、本発明では溶剤によるパージングを完了する
に先立つて不活性ガスを用いて過剰の試薬の殆ど
を管及び反応器からパージする)、かつ本発明で
は脈動する機械ポンプが用いないから、シリカ支
持体の物理的な破壊を与えることがない。
を収容する反応容器の中に液体を移動させて通す
のに機械的ポンプを使用することである。この機
械系はポンプ室におけるガス気泡の生成或は沈殿
によつて引き起こされる流体の不安定をこうむ
る。また、ポンプ作用は圧力の脈動をもたらし、
該圧力の脈動はシリカ支持体の破砕や反応容器及
び管の閉塞に至り得る。また、ポンプは反応容器
の中に又は外に至る管にかなりのデツド容積をも
たらす。このデツド容積は、ガスを管の中に導入
するのを避ける要件と共に、試薬の濃度をかなり
希釈させるか、或は、代りに、デツド容積を満た
すのに高価な試薬をずつと多量に使用させること
になる。カルザス等の装置は循環バルブを導入し
て希釈した試薬を再び吐出させかつ再び反応器の
中に通させるが、これは反応及び溶剤フラツシン
グ時間を引き伸ばす。本発明は試薬及び溶剤を保
持する受槽内に空気ガス圧を用いてこれらの薬品
の反応器を通る移動を行わせる。その上、本発明
は極小化したデツド容積ゼロのバルブの使用を組
み入れて試薬の消費を最少にし、かつカツプリン
グサイクル時間を15分程に短縮させる。この機械
系はガス気泡による妨害を受けることなく(事
実、本発明では溶剤によるパージングを完了する
に先立つて不活性ガスを用いて過剰の試薬の殆ど
を管及び反応器からパージする)、かつ本発明で
は脈動する機械ポンプが用いないから、シリカ支
持体の物理的な破壊を与えることがない。
発明の要約
簡潔に言えば、本発明は一層簡単な化学化合物
から一層複雑なオリゴヌクレオチドを合成する新
規な装置であつて、該一層簡単な化学化合物の少
くとも1種を反応室内に配置した多数のビースか
ら成る固体マトリツクスの上に運び、続いて流れ
となつて室の中を通り抜けるその他の多数の一層
簡単な化学化合物に露呈させ、一層簡単な化学化
合物の間の相互作用を引き起こさせて前記一層複
雑な化合物を作る前記装置から成る。適当な反応
性種を発生させるために一層簡単な化学化合物の
内のいくつかを室の中に移すに先立つて予備反応
容器内で一緒にして混合する。
から一層複雑なオリゴヌクレオチドを合成する新
規な装置であつて、該一層簡単な化学化合物の少
くとも1種を反応室内に配置した多数のビースか
ら成る固体マトリツクスの上に運び、続いて流れ
となつて室の中を通り抜けるその他の多数の一層
簡単な化学化合物に露呈させ、一層簡単な化学化
合物の間の相互作用を引き起こさせて前記一層複
雑な化合物を作る前記装置から成る。適当な反応
性種を発生させるために一層簡単な化学化合物の
内のいくつかを室の中に移すに先立つて予備反応
容器内で一緒にして混合する。
別の面では、本発明は固体支持体を収容する主
反応域に完全に活性にした複数のヌクレオシドを
導入し、該ヌクレオシドを固体支持体の上で反応
させてオリゴヌクレオシドを作る新規方法から成
る。
反応域に完全に活性にした複数のヌクレオシドを
導入し、該ヌクレオシドを固体支持体の上で反応
させてオリゴヌクレオシドを作る新規方法から成
る。
本発明の目的はオリゴヌクレオチドを合成する
新規装置を提供することにある。
新規装置を提供することにある。
より詳細には、本発明の目的はオリゴヌクレオ
チドを合成する改良された装置を提供することに
ある。
チドを合成する改良された装置を提供することに
ある。
また、本発明の目的は、相互反応性でかつ完全
に活性にした複数のヌクレオシドの反応域におけ
る同時反応によつてオリゴヌクレオシドを合成す
る新規方法を提供することにある。
に活性にした複数のヌクレオシドの反応域におけ
る同時反応によつてオリゴヌクレオシドを合成す
る新規方法を提供することにある。
本発明のこれやあれやの目的及び利益は、添付
図面と共に行う以下の詳細な説明から明らかにな
るであろう。
図面と共に行う以下の詳細な説明から明らかにな
るであろう。
好適な実施態様の説明
今、図面を一層詳細に考察すれば、本発明の装
置10を第1A及び1B図に示す。
置10を第1A及び1B図に示す。
代表的には、溶剤容器12はバルブ14、圧力
調節器22、バルブブロツク18と連絡する。圧
力調節器22と共に与える管路20はアルゴン等
の不活性ガスを供給する。不活性ガスの源は図示
していない。受槽24は、好ましくはテトラゾー
ル等の簡単な化学反応物を収容し、かつまたバル
ブ26、圧力調節器28に連結させる。
調節器22、バルブブロツク18と連絡する。圧
力調節器22と共に与える管路20はアルゴン等
の不活性ガスを供給する。不活性ガスの源は図示
していない。受槽24は、好ましくはテトラゾー
ル等の簡単な化学反応物を収容し、かつまたバル
ブ26、圧力調節器28に連結させる。
受槽30は単一の、保護され、一部活性にした
ヌクレオシド誘導体、例えばアデノシン用のもの
を収容する。同様に、受槽32,34,36はそ
の他のヌクレオシド誘導体、例えば、それぞれチ
ミン、グアニン、シトシン用のものを収容する。
ヌクレオシド誘導体、例えばアデノシン用のもの
を収容する。同様に、受槽32,34,36はそ
の他のヌクレオシド誘導体、例えば、それぞれチ
ミン、グアニン、シトシン用のものを収容する。
受槽30,32,34,36にそれぞれバルブ
38,42,46,50を、及びそれぞれ圧力調
節器40,44,48,52を備える。
38,42,46,50を、及びそれぞれ圧力調
節器40,44,48,52を備える。
容器12、受槽24,30,32,34,36
は、個々にフローバルブ54とフローバルブ調節
器56とを有して受槽を廃棄トラツプ114にベ
ントさせる。
は、個々にフローバルブ54とフローバルブ調節
器56とを有して受槽を廃棄トラツプ114にベ
ントさせる。
バルブブロツク18は管路404を通して予備
反応器58に供給する。バルブ60及び管路40
0は予備反応器58は廃棄トラツプにベントす
る。予備反応器58は管路402によつてバルブ
ブロツク62と連絡する。不活性ガスを管路64
によつてバルブブロツク62に供給する。管路6
6が廃棄トラツプ114にベントする。
反応器58に供給する。バルブ60及び管路40
0は予備反応器58は廃棄トラツプにベントす
る。予備反応器58は管路402によつてバルブ
ブロツク62と連絡する。不活性ガスを管路64
によつてバルブブロツク62に供給する。管路6
6が廃棄トラツプ114にベントする。
予備反応した状態の簡単なヌクレオシドの混和
物が管路72を経てバルブブロツク70に移動す
る。
物が管路72を経てバルブブロツク70に移動す
る。
受槽80,82,84,86,88はバルブブ
ロツク70と連絡する。
ロツク70と連絡する。
受槽80,82,84,86,88は各々適当
なバルブ90、圧力調節器92、フローバルブ9
4、フローバルブ調節器96を有する。
なバルブ90、圧力調節器92、フローバルブ9
4、フローバルブ調節器96を有する。
主反応器98がサーモスタツトで調温する環境
100内に配置されて入口104と出口106と
を有する反応室102を定める。
100内に配置されて入口104と出口106と
を有する反応室102を定める。
出口106はバルブブロツク108に接続す
る。
る。
バルブブロツク108は画分収集器112と連
絡する。バルブブロツク108は、また、管路1
98か或は流れ調節器200及び管路202のど
ちらかを通して廃棄トラツプ114に連絡する。
絡する。バルブブロツク108は、また、管路1
98か或は流れ調節器200及び管路202のど
ちらかを通して廃棄トラツプ114に連絡する。
バルブブロツク18,62,70,108及び
バルブ14,26,38,42,46,50,5
4,60,90,94は制御ユニツト68によつ
て電気的に制御される。
バルブ14,26,38,42,46,50,5
4,60,90,94は制御ユニツト68によつ
て電気的に制御される。
主反応器装置98は第2及び3図に詳細に示さ
れ、要素126,128,130,132を収容
するスリーブ124を支持するベース122から
成る。
れ、要素126,128,130,132を収容
するスリーブ124を支持するベース122から
成る。
ベース122の下方にバルブブロツク108が
有り、該バルブブロツク108は上で第1A及び
1B図に関連して述べた。
有り、該バルブブロツク108は上で第1A及び
1B図に関連して述べた。
要素122及び124の内にねじを切つたカラ
ー134によつて一緒にして保持する。
ー134によつて一緒にして保持する。
上部カラー136は要素132をスリーブ12
4とシールする関係に保つ。
4とシールする関係に保つ。
孔を有するシリカ球から成るマクロポーラスな
ビーズで室102を満たす。また、ビーズを他の
方法で化学的に変性することもできる。
ビーズで室102を満たす。また、ビーズを他の
方法で化学的に変性することもできる。
予備反応器58は第4図に詳細に示され、ガラ
スびん420、スクリユーキヤツプ囲い410、
一連の接続管400,402,404及びシーリ
ング座金440から成る。管400,402,4
04はそれぞれバルブブロツク60,62,18
に通じる。ヌクレオシドの活性化はガラスびん4
20の内部のキヤビテイ430内で行われる。4
10及び420にそれぞれ合うようにねじ山を切
つた表面412及び422は座金440を表面4
14及び416に圧縮させて接続管を除いてキヤ
ビテイ430をシールする。
スびん420、スクリユーキヤツプ囲い410、
一連の接続管400,402,404及びシーリ
ング座金440から成る。管400,402,4
04はそれぞれバルブブロツク60,62,18
に通じる。ヌクレオシドの活性化はガラスびん4
20の内部のキヤビテイ430内で行われる。4
10及び420にそれぞれ合うようにねじ山を切
つた表面412及び422は座金440を表面4
14及び416に圧縮させて接続管を除いてキヤ
ビテイ430をシールする。
バルブブロツク18,62,70,108は、
好ましくはデツド容積ゼロの構造に作られるマル
チユニツトバルブである。バルブブロツクは、例
えばウイツトマン等(米国特許4008736号)、ハン
カピラー、フツド(米国特許4252769号)、フツド
等(米国特許出願第380109号)、スターク(米国
特許出願第300184号)が容認できる。ブロツク中
の個々のバルブユニツトは、制御ユニツト68に
より個々の基準で電気的に制御される。
好ましくはデツド容積ゼロの構造に作られるマル
チユニツトバルブである。バルブブロツクは、例
えばウイツトマン等(米国特許4008736号)、ハン
カピラー、フツド(米国特許4252769号)、フツド
等(米国特許出願第380109号)、スターク(米国
特許出願第300184号)が容認できる。ブロツク中
の個々のバルブユニツトは、制御ユニツト68に
より個々の基準で電気的に制御される。
オリゴヌクレオチドを合成する代表的な操作
オリゴヌクレオチドを合成するのに上述した装
置を使用することは3つの基本的な手順から成
る:初めの結合ヌクレオシドを含有する固体支持
体を主反応器に装入し、各サイクルで望まれるよ
うな任意の又は全てのヌクレオシド誘導体を用い
て以下に説明するカツプリングサイクルを1回以
上行い、支持体結合の完了したヌクレオチドを主
反応器から取り出した後に、支持体から開裂し、
ヌクレオチドから保護基を取り去る。カツプリン
グサイクル操作を開始するに先立つてヌクレオシ
ド添加の順序のプログラムを制御ユニツト68に
組み込む。
置を使用することは3つの基本的な手順から成
る:初めの結合ヌクレオシドを含有する固体支持
体を主反応器に装入し、各サイクルで望まれるよ
うな任意の又は全てのヌクレオシド誘導体を用い
て以下に説明するカツプリングサイクルを1回以
上行い、支持体結合の完了したヌクレオチドを主
反応器から取り出した後に、支持体から開裂し、
ヌクレオチドから保護基を取り去る。カツプリン
グサイクル操作を開始するに先立つてヌクレオシ
ド添加の順序のプログラムを制御ユニツト68に
組み込む。
初めの結合ヌクレオシドを含有する支持体を主
反応器98の室102に装入するために、管材料
保持スクリユー103をゆるめ、順に上部カラー
136、固定環121、テフロン座金123、要
素132、多孔質テフロン座金127、要素13
0を要素128、多孔質座金125、要素126
と共に取り外して一部分解する。先に使用した支
持体物質を全て室102から出してからにし、多
孔質テフロン座金125及び127を捨てる。次
に、要素126、新しい多孔質テフロン座金12
5、要素128、要素130、初めの付着ヌクレ
オシドを含有する新しい支持体を室102の中
に、多孔質テフロン支持体127、要素132、
テフロン座金123、固定環121、上部カラー
136を順に再配置して再び組み立てる。管材料
保持スクリユー103をしつかり締めてアセンブ
リーを完了する。
反応器98の室102に装入するために、管材料
保持スクリユー103をゆるめ、順に上部カラー
136、固定環121、テフロン座金123、要
素132、多孔質テフロン座金127、要素13
0を要素128、多孔質座金125、要素126
と共に取り外して一部分解する。先に使用した支
持体物質を全て室102から出してからにし、多
孔質テフロン座金125及び127を捨てる。次
に、要素126、新しい多孔質テフロン座金12
5、要素128、要素130、初めの付着ヌクレ
オシドを含有する新しい支持体を室102の中
に、多孔質テフロン支持体127、要素132、
テフロン座金123、固定環121、上部カラー
136を順に再配置して再び組み立てる。管材料
保持スクリユー103をしつかり締めてアセンブ
リーを完了する。
代表的なカツプリングサイクルは次の工程から
成る: 工程1、時間:30秒。主反応器を通してニトロ
メタン(2.5ml)をフラツシユさせる。流出物を
管路198に通すように向ける。
成る: 工程1、時間:30秒。主反応器を通してニトロ
メタン(2.5ml)をフラツシユさせる。流出物を
管路198に通すように向ける。
工程2、時間:10秒。主反応器を通してアルゴ
ンをフラツシユさせてニトロメタンを除く。流出
物を管路198に通すように向ける。
ンをフラツシユさせてニトロメタンを除く。流出
物を管路198に通すように向ける。
工程3、時間:30秒。主反応器を通して3%ト
リクロロ酢酸を溶解したクロロホルム(1.5ml)
をフラツシユさせて脱トリチル化を行う。流出物
を画分収集器112に向ける。
リクロロ酢酸を溶解したクロロホルム(1.5ml)
をフラツシユさせて脱トリチル化を行う。流出物
を画分収集器112に向ける。
工程4、時間:10秒。主反応器を通してアルゴ
ンをフラツシユさせて酸溶液を除く。流出物を画
分収集器112に向ける。
ンをフラツシユさせて酸溶液を除く。流出物を画
分収集器112に向ける。
工程5、時間:20秒。主反応器を通してニトロ
メタン(1.5ml)をフラツシユさせる。流出物を
画分収集器112に向ける。
メタン(1.5ml)をフラツシユさせる。流出物を
画分収集器112に向ける。
工程6、時間:10秒。主反応器を通してアルゴ
ンをフラツシユさせてニトロメタンを除く。流出
物を画分収集器112に向ける。
ンをフラツシユさせてニトロメタンを除く。流出
物を画分収集器112に向ける。
工程7、時間:20秒。主反応器を通してメタノ
ール(1.3ml)をフラツシユさせる。流出物を管
路198に通すように向ける。
ール(1.3ml)をフラツシユさせる。流出物を管
路198に通すように向ける。
工程8、時間:10秒。主反応器を通してアルゴ
ンをフラツシユさせてメタノールを除く。流出物
を管路198に通すように向ける。
ンをフラツシユさせてメタノールを除く。流出物
を管路198に通すように向ける。
工程9、時間:30秒。ヌクレオシド受槽をアル
ゴンで加圧する。
ゴンで加圧する。
工程10、時間:15秒。主反応器を通してアセト
ニトリル(1.1ml)をフラツシユさせる。主反応
器からの流出物を管路198に通すように向け
る。アセトニトリル(0.2ml)中のヌクレオシド
ホスフアーアミダイトを予備反応器に送出する。
ニトリル(1.1ml)をフラツシユさせる。主反応
器からの流出物を管路198に通すように向け
る。アセトニトリル(0.2ml)中のヌクレオシド
ホスフアーアミダイトを予備反応器に送出する。
工程11、時間:5秒。主反応器を通してアセト
ニトリル(0.4ml)をフラツシユさせる。主反応
器からの流出物を管路198に通すように向け
る。予備反応器を通してアルゴンをフラツシユさ
せてヌクレオシドホスフアーアミジトを予備反応
器に押し入れる。
ニトリル(0.4ml)をフラツシユさせる。主反応
器からの流出物を管路198に通すように向け
る。予備反応器を通してアルゴンをフラツシユさ
せてヌクレオシドホスフアーアミジトを予備反応
器に押し入れる。
工程12、時間:30秒。テトラゾール受槽を加圧
する。
する。
工程13、時間:20秒。主反応器を通してアセト
ニトリル(1.4ml)をフラツシユさせる。主反応
器からの流出物を管路198に通すように向け
る。アセトニトリル(0.4ml)中のテトラゾール
を予備反応器に送出する。
ニトリル(1.4ml)をフラツシユさせる。主反応
器からの流出物を管路198に通すように向け
る。アセトニトリル(0.4ml)中のテトラゾール
を予備反応器に送出する。
工程14、時間:5秒。主反応器を通してアセト
ニトリル(0.4ml)をフラツシユさせる。主反応
器からの流出物を管路198に通すように向け
る。予備反応器を通してアルゴンをフラツシユさ
せてテトラゾールを予備反応器に押し入れる。
ニトリル(0.4ml)をフラツシユさせる。主反応
器からの流出物を管路198に通すように向け
る。予備反応器を通してアルゴンをフラツシユさ
せてテトラゾールを予備反応器に押し入れる。
工程15、時間:15秒。主反応器を通してアセト
ニトリル(1.1ml)をフラツシユさせる。主反応
器からの流出物を管路198の中に通すように向
ける。アルゴンを予備反応器の中にあわ立たせる
ように入れてヌクレオシドとテトラゾール溶液と
を混合し、カツプリングのためのヌクレオシドの
活性化を行わせる。
ニトリル(1.1ml)をフラツシユさせる。主反応
器からの流出物を管路198の中に通すように向
ける。アルゴンを予備反応器の中にあわ立たせる
ように入れてヌクレオシドとテトラゾール溶液と
を混合し、カツプリングのためのヌクレオシドの
活性化を行わせる。
工程16、時間:10秒。主反応器を通してアルゴ
ンをフラツシユさせてアセトニトリルを除く。流
出物を管路198の中に通すように向ける。
ンをフラツシユさせてアセトニトリルを除く。流
出物を管路198の中に通すように向ける。
工程17、時間:2秒。予備反応器をアルゴンで
加圧する。
加圧する。
工程18、時間:360秒。アルゴンを予備反応器
に向けて活性ヌクレオシドを予備反応器から主反
応器に通して押す。このプロセスは活性ヌクレオ
シドを主反応器中の支持体上のヌクレオチドにカ
ツプリングさせる。主反応器からの流出物をフロ
ー調節器200の中に通すように向ける。
に向けて活性ヌクレオシドを予備反応器から主反
応器に通して押す。このプロセスは活性ヌクレオ
シドを主反応器中の支持体上のヌクレオチドにカ
ツプリングさせる。主反応器からの流出物をフロ
ー調節器200の中に通すように向ける。
工程19、時間:5秒。予備反応器及び主反応器
を通してアルゴンをフラツシユさせて活性ヌクレ
オシドを除く。主反応器からの流出物を管路19
8の中に通すように向ける。
を通してアルゴンをフラツシユさせて活性ヌクレ
オシドを除く。主反応器からの流出物を管路19
8の中に通すように向ける。
工程20、時間:10秒。アセトニトリル(1.5ml)
を予備反応器に送出する。
を予備反応器に送出する。
工程21、時間:30秒。アルゴンを予備反応器に
向けてアセトニトリルを予備反応器から主反応器
に通して押す。主反応器からの流出物を管路19
8に通すように向ける。
向けてアセトニトリルを予備反応器から主反応器
に通して押す。主反応器からの流出物を管路19
8に通すように向ける。
工程22、時間:10秒。主反応器を通してアセト
ニトリル(0.7ml)をフラツシユさせる。主反応
器からの流出物を管路198に通すように向け
る。アセトニトリル(1.5ml)を予備反応器に送
出する。
ニトリル(0.7ml)をフラツシユさせる。主反応
器からの流出物を管路198に通すように向け
る。アセトニトリル(1.5ml)を予備反応器に送
出する。
工程23、時間:25秒。主反応器を通してアセト
ニトリル(1.8ml)をフラツシユさせる。主反応
器からの流出物を管路198に通すように向け
る。予備反応器を通してアルゴンをフラツシユさ
せてアセトニトリルを除く。予備反応器からの流
出物を管路66に通すように向ける。
ニトリル(1.8ml)をフラツシユさせる。主反応
器からの流出物を管路198に通すように向け
る。予備反応器を通してアルゴンをフラツシユさ
せてアセトニトリルを除く。予備反応器からの流
出物を管路66に通すように向ける。
工程24、時間:10秒。主反応器を通してアルゴ
ンをフラツシユさせる。流出物を管路198に通
すように向ける。
ンをフラツシユさせる。流出物を管路198に通
すように向ける。
工程25、時間:60秒。主反応器を通してヨウ
素/水/2,6−ルチジン/テトラヒドロフラン
溶液(2.0ml)をフラツシユさせてホスフアイト
からホスフエートへの酸化を行わせる。流出液を
管路198に通すように向ける。
素/水/2,6−ルチジン/テトラヒドロフラン
溶液(2.0ml)をフラツシユさせてホスフアイト
からホスフエートへの酸化を行わせる。流出液を
管路198に通すように向ける。
工程26、時間:10秒。主反応器を通してアルゴ
ンをフラツシユさせてヨウ素溶液を除く。流出液
を管路198に通すように向ける。
ンをフラツシユさせてヨウ素溶液を除く。流出液
を管路198に通すように向ける。
工程27、時間:60秒。主反応器を通してメタノ
ール(3.0ml)をフラツシユさせる。流出物を管
路198に通すように向ける。
ール(3.0ml)をフラツシユさせる。流出物を管
路198に通すように向ける。
工程28、時間:10秒。主反応器を通してアルゴ
ンをフラツシユさせる。流出物を管路198に通
すように向ける。
ンをフラツシユさせる。流出物を管路198に通
すように向ける。
ひとたび、上述したカツプリングサイクルを所
望の回数くり返したなら、支持体と基材保護基と
の開裂を与えるために支持体結合の完了したオリ
ゴヌクレオチドを主反応器から取り出す。主反応
器からの取り出しは、新しいシリカ支持体を主反
応器に装入する上述した手順を繰り返すことによ
つて行う。次に、開裂及び脱ブロツキングプロセ
スは、装置10の外でカルザス等により説明され
るような方法で手動によつて行う。
望の回数くり返したなら、支持体と基材保護基と
の開裂を与えるために支持体結合の完了したオリ
ゴヌクレオチドを主反応器から取り出す。主反応
器からの取り出しは、新しいシリカ支持体を主反
応器に装入する上述した手順を繰り返すことによ
つて行う。次に、開裂及び脱ブロツキングプロセ
スは、装置10の外でカルザス等により説明され
るような方法で手動によつて行う。
標準のカツプリングサイクルの変更は、脱トリ
チル化工程にトリクロロ酢酸溶液よりもむしろ
ZnBr2(ニトロメタン中の飽和溶液)を使用する
ことを含むことができる。この場合、脱トリチル
化を10〜20分に延長しなければならない。別の変
更は、カツプリング工程の間に活性ヌクレオシド
を1種以上一次反応器に送出することである。こ
れは、2、3又は4つの一部活性にしたヌクレオ
シドを予備反応器に送出し(それぞれ、標準の1
つのヌクレオシド送出時間の1/2、1/3又は1/4を
用いる)、テトラゾールをヌクレオシド混合物に
加え、活性ヌクレオシドの混合物を主反応器に押
し通すことによつて行う。
チル化工程にトリクロロ酢酸溶液よりもむしろ
ZnBr2(ニトロメタン中の飽和溶液)を使用する
ことを含むことができる。この場合、脱トリチル
化を10〜20分に延長しなければならない。別の変
更は、カツプリング工程の間に活性ヌクレオシド
を1種以上一次反応器に送出することである。こ
れは、2、3又は4つの一部活性にしたヌクレオ
シドを予備反応器に送出し(それぞれ、標準の1
つのヌクレオシド送出時間の1/2、1/3又は1/4を
用いる)、テトラゾールをヌクレオシド混合物に
加え、活性ヌクレオシドの混合物を主反応器に押
し通すことによつて行う。
カツプリング反応の完了は、各サイクルにおい
て脱トリチル化、続いて溶剤フラツシユ工程から
の流出物を収集し、分光光度計でジメトキシトリ
チルカチオンの498nmにおける吸光度を測定す
ることによつて便宜に監視することができる。画
分収集器の各々続く管中に存在する吸光度の相対
量を用いてサイクルカツプリング収率を計算する
ことができる。典型的な収率は95%又はそれ以上
である。
て脱トリチル化、続いて溶剤フラツシユ工程から
の流出物を収集し、分光光度計でジメトキシトリ
チルカチオンの498nmにおける吸光度を測定す
ることによつて便宜に監視することができる。画
分収集器の各々続く管中に存在する吸光度の相対
量を用いてサイクルカツプリング収率を計算する
ことができる。典型的な収率は95%又はそれ以上
である。
発明を完全に説明したが、本発明は特許請求の
範囲によつてのみ制限するつもりである。
範囲によつてのみ制限するつもりである。
第1A及び1B図は、本発明の新規装置の図式
図である。第2図は第1B図に示す一次反応器の
断面図である。第3図は第2図の中央部分の拡大
部分断面図である。第4図は第1A図に示す予備
反応器の断面図である。
図である。第2図は第1B図に示す一次反応器の
断面図である。第3図は第2図の中央部分の拡大
部分断面図である。第4図は第1A図に示す予備
反応器の断面図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 複数の異なる活性化ヌクレオシドからの一層
複雑なオリゴヌクレオチド化合物の合成において
用いる装置であつて、 反応室と、 該活性化ヌクレオシドの内の少なくとも1つを
運ぶ空孔を中に収容し及び該反応室内に配置させ
た複数のビーズから成る固体マトリツクスと、 該反応室と流体連絡し及び該反応室の上流に配
置させた予備反応域と、 一部活性化されたヌクレオシドを完全に活性化
されたヌクレオシドに転化する該予備反応域内の
手段と、 一連の受槽であつて、いくつかは一部活性化さ
れた異なるヌクレオシドを保有し及び他の受槽は
溶媒を保有し、該受槽は全て該予備反応域より上
流に位置させ及び該予備反応域と流体連絡するも
のと、 一部活性化された複数のヌクレオシド及び溶媒
を連続流で該受槽から該予備反応域を通して該反
応室に及び該反応室を通して続けて送る手段であ
つて、該受槽と連絡する空気ガス圧手段を含んで
該一部活性化したヌクレオシド、溶媒、活性化し
たヌクレオシドを該装置に通して空気移動させる
もの とを含む装置。 2 デツド容積ゼロバルブを前記予備反応域の上
流及び前記予備反応域と前記反応室との間に設置
して流体流れを調節する特許請求の範囲第1項記
載の装置。 3 前記ビーズがマクロポーラスなシリカ球から
成る特許請求の範囲第1項記載の装置。 4 バルブを、また、前記反応室の下流に及び該
反応室と流体連絡させて設置し、該バルブは更に
画分収集器と連絡する特許請求の範囲第1項記載
の装置。 5 前記ビーズを、前記反応室の底部を形成する
多孔質ポリテトラフルオロエチレンシートによつ
て支持する特許請求の範囲第1項記載の装置。 6 (1) 反応域及び予備反応域を有する閉じた系
を確立し、該予備反応域は該反応域と流体連絡
し、 (2) 少なくとも1つの完全に活性化したヌクレオ
シドを結合させた固体のミクロポーラス支持体
を該主反応域に導入し、 (3) 一部活性化した保護ヌクレオシドをガス圧下
で該予備反応域に導入し、 (4) 該ヌクレオシドを該予備反応域において完全
に活性化し、 (5) 該反応域において、該完全に活性化したヌク
レオシドを直ちに少なくとも1つの十分に活性
化したヌクレオシドを結合させた該固体のミク
ロポーラスな支持体に接触させ、 (6) 該ヌクレオシドを同時に該支持体上で反応さ
せて該反応域内でオリゴヌクレオチドを形成す
る ことを含むオリゴヌクレオチドの合成方法。 7 (1) 反応域と、予備反応域と、複数の受槽と
を有する閉じた系を確立し、該予備反応域は該
反応域と流体連絡し、該受槽は該予備反応域と
流体連絡し、 (2) 一部活性化した異なる保護ヌクレオシドを該
受槽の各々の内で確立し、 (3) 少なくとも1つの十分に活性化したヌクレオ
シドを結合させた固体のミクロポーラスな支持
体を該主反応域に導入し、 (4) 該受槽の1つから一部活性化した保護ヌクレ
オシドをガス圧下で該予備反応域に導入し、 (5) 該ヌクレオシドを該予備反応域において完全
に活性化し、 (6) 該反応域において該完全に活性化したヌクレ
オシドを直ちに少なくとも1つの十分に活性化
したヌクレオシドを結合させた該固体のミクロ
ポーラスな支持体にガス圧下で接触させ、 (7) 該ヌクレオシドを同時に該支持体上で反応さ
せて該反応域内でオリゴヌクレオチドを形成
し、 (8) 該受槽の各々からの一部活性化したヌクレオ
シドを用いて該固体支持体上で任意の所望の鎖
の長さのオリゴヌクレオチドを生成するまで工
程(4)〜(7)を繰り返し、 (9) オリゴヌクレオチドが結合される固体のミク
ロポーラスな支持体を該反応域から取り出し、 (10) 該オリゴヌクレオチドを該固体のミクロポー
ラスな支持体と結合を断つて該オリゴヌクレオ
チドを回収することを含むオリゴヌクレオチド
の合成方法。 8 前記固体のミクロポーラスな支持体が中に空
孔を収容するミクロポーラスなシリカ球から成る
特許請求の範囲第6項記載の方法。 9 前記予備反応域内で形成した完全に活性化し
たヌクレオシドをガス圧によつて前記反応域に移
動させる特許請求の範囲第6項記載の方法。 10 ヌクレオシドがアデノシン、チミン、グア
ニン、シトシンである特許請求の範囲第6項記載
の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US48639383A | 1983-04-19 | 1983-04-19 | |
US486393 | 1983-04-19 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59205395A JPS59205395A (ja) | 1984-11-20 |
JPS6331480B2 true JPS6331480B2 (ja) | 1988-06-23 |
Family
ID=23931715
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP7676884A Granted JPS59205395A (ja) | 1983-04-19 | 1984-04-18 | 化学化合物の改良された合成装置 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS59205395A (ja) |
CA (1) | CA1220747A (ja) |
DE (1) | DE3415014A1 (ja) |
FR (1) | FR2544720B1 (ja) |
GB (1) | GB2138821B (ja) |
SE (1) | SE8402195L (ja) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6054398A (ja) * | 1983-09-02 | 1985-03-28 | Nippon Zeon Co Ltd | ポリヌクレオチド合成装置 |
JPS60105691A (ja) * | 1983-11-14 | 1985-06-11 | Nippon Zeon Co Ltd | ポリヌクレオチド合成装置 |
WO2001090225A1 (fr) * | 2000-05-22 | 2001-11-29 | Kabushiki Kaisya Advance | Nouveau procede de preparation de composition polymere |
US7872804B2 (en) | 2002-08-20 | 2011-01-18 | Illumina, Inc. | Encoded particle having a grating with variations in the refractive index |
US7901630B2 (en) | 2002-08-20 | 2011-03-08 | Illumina, Inc. | Diffraction grating-based encoded microparticle assay stick |
US7900836B2 (en) | 2002-08-20 | 2011-03-08 | Illumina, Inc. | Optical reader system for substrates having an optically readable code |
US7164533B2 (en) | 2003-01-22 | 2007-01-16 | Cyvera Corporation | Hybrid random bead/chip based microarray |
US7619819B2 (en) | 2002-08-20 | 2009-11-17 | Illumina, Inc. | Method and apparatus for drug product tracking using encoded optical identification elements |
US7508608B2 (en) | 2004-11-17 | 2009-03-24 | Illumina, Inc. | Lithographically fabricated holographic optical identification element |
US7923260B2 (en) | 2002-08-20 | 2011-04-12 | Illumina, Inc. | Method of reading encoded particles |
US20100255603A9 (en) | 2002-09-12 | 2010-10-07 | Putnam Martin A | Method and apparatus for aligning microbeads in order to interrogate the same |
US7092160B2 (en) | 2002-09-12 | 2006-08-15 | Illumina, Inc. | Method of manufacturing of diffraction grating-based optical identification element |
US7433123B2 (en) | 2004-02-19 | 2008-10-07 | Illumina, Inc. | Optical identification element having non-waveguide photosensitive substrate with diffraction grating therein |
CN101116086A (zh) | 2004-11-16 | 2008-01-30 | 伊路敏纳公司 | 读取编码微珠的方法和设备 |
US7830575B2 (en) | 2006-04-10 | 2010-11-09 | Illumina, Inc. | Optical scanner with improved scan time |
WO2014039077A1 (en) * | 2012-09-10 | 2014-03-13 | Boroomand Mohammad | Automated peptide synthesizer |
Citations (4)
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