JPS59205395A - 化学化合物の改良された合成装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 基礎及び応用研究の重要な方法論としての組み換えＤ　
Ｎ　Ａ　（デオキシリボ核酸）及び遺伝手術の出現は、
両者を一緒にして用いた場合に、１０年も経たない前は
可能であると夢に思われていた遺伝物質及び生細胞のず
っと複雑な操作を可能にするいくつかの実験技術の発達
によって可能になった。これらの技術によって、ヒトの
ゲノムを個々の遺伝子に分解し、該遺伝子を細菌等の微
生物に転移させることができる。そこで遺伝子は細菌に
よって遺伝子の化学構造が定められイＵるような量で再
生されることができる。その上、ヒトの遺伝子を含有す
る微生物を誘発して遺伝子によって暗号化された多量の
タンパク質産牛物を産生じ、こうしてインターフェロン
、生長ホルモン、インシュリン等の希少なヒトのタンパ
ク質を多量に産生することができる。

遺伝手術の急速な発達にかぎとなる役割を果した実験技
法の内の一つは、構造の明らかなオリゴヌクレオチドの
化学合成である。かかるオリゴヌクレオチドは一度に個
々の生細胞によって表現される何方〜何百万の遺伝子を
収容するライブラリーからただ１個の遺伝子を単離する
プロセスの必須部分になることがよくある。ＤＮＡの化
学構造は独特であるから、特有の配列を有するＤＮＡの
一片は、違った配列を有する複雑に混合した他の全ての
断片を顧みずに相補配列を有するただ一つの別の片を認
識して結合する。従って、化学的に合成したＤＮＡの小
さい片を、適当な相補配列を含有するＤＮＡのずっと大
きな片、遺伝子全体でさえも捜し出す独特の分子プルー
ブとして用いることができる。プルーブの中に取り込む
べき正確な構造は、遺伝暗号を用いてタンパク質配列を
ＤＮＡ配列の中に翻訳することによって遺伝子で暗合化
したタンパク質の構造から推論することができる。遺伝
暗号は退化するので、即ち、タンパク質配列中の化学単
位の殆どはＤＮＡ配列中の化学単位のいくつかの基によ
って暗号化され得るので、所望の遺伝子に対し相補性の
１′つの配列を作ることを確実にするために、関連する
が同一でない配列を含有する一組のＤＮＡプルーブを合
成しなければならない場合がよくある。このことはＤＮ
Ａを合成するのに用いる方法を厳しく圧迫する。これら
の方法が日常のように有用になるためには、たった１つ
の遺伝子を捜し出すのに何ダースもの種類の異るＤＮＡ
分子を合成しなげればならないことがよくあることから
、これらの方法は迅速で、簡単で、信頼性があってかつ
安価でなげればならない。

オリゴヌクレオチドの合成方法はカルザス等によって発
達された（エム・ディー・マツチラッチ。

エム・エッチ−カルブ、；ｔ、　、　Ｊ、　Ａｍｅｒ、
Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ＋１０３．３１８５−３１９１，１９
８１；ニス・エル・ビューケージ、エム・エッチ・カル
ザス。

Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔ、２２．１８５９−Ｉ　ＦＪＳ２．１
９８１）。

これらのオリゴヌクレオチドは、シリカゲル重合体支持
体に共有付着したデオキシヌクレオシドにモノデオキシ
ヌクレオシドを段階的に付加することによって合成する
。各々を付加する個々の工程は、活性ヌクレオシドをホ
スファイトエステルとして縮合（工程１）、未反応ヌク
レオシドダーヒトロキシル基の共有反応抑制（工程２）
、ホスファイトのホスフェートへの酸化（工程３）、各
サイクルで付加したヌクレオシドから５′−ブロッキン
グ基の除去（工程４）を含む。所望の数の単量体が一旦
成長鎖に付加されたならば、反応完了したオリゴヌクレ
オチドをシリカ支持体から取り去り、チオフェノール及
び水酸化アンモニウムで処理してオリゴヌクレオチドか
ら残留するブロッキング基を除く。

カルザス等のプロセスは次の特徴を有する：（１）オリ
ゴヌクレオチドを不溶性の重合体支持体の上で合成する
。多工程の合成が含まれるので、この発達は合成中間体
の精製を簡単にする。成長重合体を除かずに溶剤で過剰
の試薬及び望ましくない反応副産生物の殆どを支持体か
ら洗い落とす。

（２）活性ヌクレオチドホスファイトがオリゴヌクレオ
チドの合成に用いる中間体である。これらのホスファイ
トは急速かつ高収率で反応する。これらは重合体支持体
上で環式縮合反応を完了させる理想的な特性である。

（３）　　ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレ
オチドから５′−ブロッキング基を選捩的に除く一連の
試薬がカルザス等によって発達された。これらの試薬は
ＺｎＢｒ　　、　ＢＰ　　、　ＡｌＣｌ　　、　ＴｉＣ
ｌ４等のり２　　　　　３　　　　　　　　５ ニーイス酸である。これらの試薬は、前もって成形され
たオリゴヌクレオチドを劣化させることなくエーテル保
護基を有効に取り除く。

（４）合成プロセス全体が極めて急速である。全ての処
理加工工程を含む各々のモノデオキシヌクＶオシド添加
は約２−４時間を要する。

（５）活性モノヌクレオシドの各々で９５％を超えろ収
率が観測される。

カルザス等のプロセスに用いられる重合体支持体は、マ
クロポーラスなシリカゲルビーズに共有結合した適当に
ブロックした４つのヌクレオシドの内の１つから成る。

カルザス等のプロセスの初期工程は活性ヌクレオシドの
合成である。４つのヌクレオシドは全てジ−ｐ−アユシ
ルフェニルメチル（ジメトキシトリチル、ＤＭＴｒ）エ
ーテル等の５１−ブロッキング基を含有する。しかし、
その他の適当な５′−保諌基を任意に用いることができ
る。また、シトシン、アデニン、グアニンのアミン基を
保護スるのが望ましい。ベンゾイル、インブチリル又は
類似の基を使用することができる。従って、５′−〇−
ジメトキシトリチルーデオキシチミジン（ＤＭＴｒｄ（
Ｔ））　、　ｓ’−ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−ペン
ゾイルチオキシシチジｙ　（ＩＩ）ＭＴｒｄ　（ｂ、Ｃ
）　）　。

５′−０−ジメトキシトリチル−Ｎ−ペンゾイルチオキ
シアデノシｙ（ＤＭＴｒｄ（ｂｚＡ））、５’−。

−ジメトキシトリチルーＮ−イソブチリルデオキシグア
ノシン（ＤＭＴｒｄ（ｉｂＧ））が保護ヌクレオシドと
して用いられてきた。

保護ヌクレオシドはカップリングのために活性にしなけ
ればならない。理想的には、活性ヌクレオシドは安定か
つ取扱い容易でなければならず、かつ同時にカップルす
るヌクレオシドの未保櫓５１−ヒドロキシル基に対する
反応性が高くなければならない。これらの要件は安定な
一部活性にしたホスファイト基の合成によって最もよく
満足され、該ホスファイト基を簡単な反応で現位置で所
望の反応性化合物に転化することができる。該化合物は
、カルザス等が説明するようにヌクレオシドホスファ−
アミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　）を含
む。

これらの化合物は次の手順で合成することができる。Ｄ
ＭＴｒ−ヌクレオシド（１ｍモル）を乾燥窒素で予備フ
ラッシュ（ｐｒｅｆｌｕｓｈ　）　　した１０ｍ１反応
容器中の酸の存在しない乾燥したクロロホルムとジイソ
プロピルエチルアミン（４ｍモル）３ｍｌに溶解する。

溶液に窒素下室温で注射器によってクロロ−Ｎ、Ｎ−ジ
アルキルアミノメトキシホスフィン（２ｍモル、アルキ
ル基はメチル、エチル、インプロピル又は類似化合物に
することができる）を滴下する（３ｏ−６ｏ秒）。１５
分後に溶液を酢酸エチル’！ｒ５ｍｌと共に１２５ｗＬ
ｌの分液漏斗に移す。溶液を塩化ナトリウムの飽和水溶
液（８０ｍ／りで４回抽出する。有機相を無水硫酸ナト
リウムで乾燥し、減圧下で蒸発してフオームにする。フ
オームをトルエン（１０１１１１）又は酢酸エチル（Ｉ
。

ｍｌ　）で溶解し、溶液を冷温ヘキサン（−７８℃）ｓ
ｏｍｅに激しく攪拌しながら滴下する。冷温懸濁液をろ
過し、白色粉末を冷温ヘキサン（−７８°Ｃ）７５ｍ／
で洗浄する。白色粉末を減圧下で乾燥して窒素下で保存
する。

所望のオリゴヌクレオチドの合成を始めるために、初め
の単量体を固体支持体、典型的には大きな表面積を有す
るマクロポーラスな支持体である高性能液体クロマトグ
ラフィー用シリカゲル或は定線孔ガラスにカップルさせ
なければならない。

初めに支持体を誘導化して単量体を付着させる。

カルザス等はシリカと（３−アミノプロピル）トリエト
キシシランとの反応、アミノ誘導化シランと無水コハク
酸との反応、残留シラノール基の全ての塩化トリメチル
シリルによる抑制を含む適当な手順について説明した。

次いで、無水ピリジン中のジシクロへキシルカルボジイ
ミドを用いてシリカに付着したカルボキシル基に所望の
ＤＭＴ　ｒ　−ヌクレオシドをカップルさせる。４０時
間処理した後に残る残留カルボキシル基を初めにｎ−ニ
ド四フェノール、次いでモルホリンで処理してブロック
する得られた産生物はシリカ１グラム当りおよそ５０マ
イクロモルのヌクレオシドを含有する。

次の及び続くヌクレオシドを付着する際に伴なう工程を
以下に要約する。

初めに、酸（典型的にはニトロメタン中のＺｎＢｒ２又
はクロロホルム中のトリクロロ酢酸）で処理して付着し
たヌクレオシドから５’−ＤＭＴｒ　基を除く。次に、
シリカを溶剤で洗浄して開裂試薬を除く。これらの溶剤
は、ＺｎＪ３ｒ２の場合にはテトラヒドロフラン中のｎ
−ブタノール及び２．６−ルチジンに続いてテトラヒド
ロフラン、トリクロロ酢酸の場合にはニトロメタン続い
てメタノール続いてアセトニトリルを含む。次に、所望
のホスファアミダイトをテトラゾール１０〜２０モル等
量で処理して活性にし、シリカゲルに加えてそれが含有
するヌクレオシドの遊離５１−ヒドロキシル基にカップ
ルさせる。活性ヌクレオシドとテトラゾールの両方をア
セトニトリル等の溶剤に溶解する。一旦カツブリング反
応が完了したら、典型的には１〜１０分、過剰の試薬を
テトラヒドロフラン、アセトニトリル等の溶剤でシリカ
から洗い落とす。

所望の場合には、未反応５′−ヒドロキシル基を全て溶
剤洗浄に先立って２．６−ルチジン／テトラヒドロフラ
ン中の無水酢酸で処理してブロックすることができるが
、この工程は合成に必須のものではない。次に、このカ
ップリング手順で作られたホスファイトエステルを、水
、２．６−ルチジン、テトラヒドロフランの混合物中の
ヨウ素で酸化してホスフェートエステルに転化する。次
に、メタノールで、次いでニトロメタンで抽出して過剰
のヨウ素溶液をシリカから除いて次の５’−ＤＭＴｒ除
去に備える。

所望のヌクレオシドを加えて上述のプロセスを繰り返し
て正しいオリゴヌクレオチド配列を得る。

次いで、チオフェノール／トリエチルアミン／ジオキサ
ン（容積で１　／１　／２の混合物）で４５分間室温に
おいて処理してホスホトリエステルの上に含有されるメ
チル基を除く。この工程に続いて、室温において３時間
濃水酸化アンモニウムで処理してオリゴヌクレオチドの
３１端を支持体に結合させるエステルを加水分解し、開
裂したオリゴヌクレオチドから支持体をろ過し、ろ液を
５０℃で１２時時間的る。次に、オリゴヌクレオチドを
高性能液体クロマトグラフィーで精製し、クロマトグラ
フィーの間に５’−ＤＭＴｒ基を標識として残し、最終
的に５’−ＤＭＴｒ基を８０％酢酸で処理して除く。代
りに、クロマトグラフィー法をポリアクリルアミドゲル
電気泳動に代える場合には、精製に先立って５’−ＤＭ
Ｔｒ基を除くことができる。

カルザス等のプロセスの主要な利点の内の一つはその潜
在的速さである。プロセスを通して高い収率を保つこと
ができ、このため合成することができる配列の長さを伸
ばすことができ、かつ中間精製工程を必要としない。し
かし、それは極めて労力集約中であり、プロセスにおけ
る種々の工程、特に戊長鎖に単量体を付加的に繰り返し
カップリングさせる工程を自動するのが望ましい。カル
ザス等は合成を行う手動操作装置について説明したが、
この装置はカップリングさせる直前に完全に活性にした
ヌクレオシドを現位置で形成する手段を含まないが故に
完全な自動化に適していない。

これは、これらの化合物の取扱いに伴う不安定の故に重
要な制約となる。本発明は、一部活性にしたヌクレオシ
ドを完全に活性にした後直ちにオリゴヌクレオチドを合
成させる固体支持体を収容する主反応容器に導入する予
備反応容器を具体化することによってこの制約を克服す
る。

根本的には、カルザス等は段階的反応プロセスを採用す
るのに対１−１本発明は固体支持体を収容する主反応容
器から成る反応域で完全に活性にしたヌクレオシドを同
時に反応させるプロセスを提供する点で顕著に異る。

これはプロセスの完全自動化を可能にする。その上、手
動の活性化技術に比べて必要とされる高価な薬品の使用
量をずっと少くすることができる。

また、合成プロセスの任意のカップリング工程において
４つのヌクレオシド単量体の任意又は全部を簡単かつ確
実にとり込むことを可能にする。これは手動の活性化プ
ロセスを用いる場合には容易に達成されず、かつ類似の
配列を有するＤＮＡ分子の大規模の組を作らなければな
らない場合には必須になる。

カルザス等の装置の別の欠点は、シリカ支持体を収容す
る反応容器の中に液体を移動させて通すのに機械的ポン
プを使用することである。この機械系はポンプ室におけ
るガス気泡の生成或は沈殿によらて引き起こされる流体
の不安定をこうむる。

また、ポンプ作用は圧力の脈動をもたらし、該圧力の脈
動はシリカ支持体の破砕や反応容器及び管の閉塞に至り
得る。また、ポンプは反応容器の中に又は外に至る管に
かなりのデッド容積をもたらす。このデッド容積は、ガ
スを管の中に導入するのを避ける要件と共に、試薬の濃
度をかなり希釈させるか、或は１、代りに、デッド容積
を満たすのに高価な試薬をずっと多量に使用させること
になる。カルザス等の装置は循環バルブを導入して希釈
した試粗を再び吐出させかつ再び反応器の中に通させる
が、これは反応及び溶剤フラッシング時間を引き伸ばす
。本発明は試薬及び溶剤を保持する受僧内に空気ガス圧
を用いてこれらの薬品の反応器を通る移動を行わせる。

その−ヒ、本発明は極小化したデッド容積ゼロのバルブ
の使用を絹み入れて試薬の消費を最少にし、かつカップ
リングサイクル時間を１５分程に短縮させる。この機械
系はガス気泡による妨害を受けることなく（手裏、本発
明では溶剤によるパージングな完了するに先立って不活
性ガスを用いて過剰の試薬の殆どを管及び反応器からパ
ージする）、かつ本発明では脈動する機械ポンプを用い
ないから、シリカ支持体の物理的な破壊を与えることが
ない。

発明の要約 簡潔に言えば、本発明は一層簡単な化学化合物から一層
複雑なオリゴヌクレオチドを合成する新規な装置であっ
て、該一層簡ルな化学化合物の少くとも１種を反応室内
に配置した多数のビーズから成る固体マトリックスの上
に運び、続いて流れとなって室の中を通り抜けるその他
の多数の一層簡単な化学化合物に露呈させ、一層簡単な
化学化合物の間の相互作用を引き起こさせて前記一層複
雑な化合物を作る前記装置から成る。適当な反応性種を
発生させるために一層簡単な化学化合物の内のいくつか
を室の中に移すに先立って予備反応容器内で一緒にして
混合する。

別の面では、本発明は固体支持体を収容する主反応域に
完全に活性にした複数のヌクレオシドを導入し、該ヌク
レオシドを固体支持体の上で反応させてオリゴヌクレオ
シドを作る新規方法から成る。

本発明の目的はオリゴヌクレオチドを合成する新規装置
を提供することにある。

より詳細には、本発明の目的はオリゴヌクレオチドを合
成する改良された装置を提供することにある。

また、本発明の目的は、相互反応性でかつ完全に活性に
した複数のヌクレオシドの反応域における同時反応によ
ってオリゴヌクレオシドを合成する新規方法を提供する
ことにある。

本発明のこれやあれやの目的及び利益は、添付図面と共
に行う以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

好適な実施態様の説明 今、図面を一層詳細に考察すれば、本発明の装置１０を
第１Ａ及び１Ｂ図に示す。

代表的には、溶剤容器１２はバルブ１４、圧力調節ｉ２
２、バルブブロック１Ｂと連絡する。圧力調節器２２と
共に与える管路２０はアルゴン等の不活性ガスを供給す
る。不活性ガスの源は図示していない。受槽２４は、好
ましくはテトラゾ−ル等の簡単な化学反応物を収容し、
かつまたバルブ２６、圧力調節器２８に連結させる。

受槽３０は単一の、保護され、一部活性にしたヌクレオ
シド誘導体、例えばアデノシン用のもの６ を収容する。同様に、受槽３２．３’　ｃ’ｒまその他
のヌクレオシド誘導体、例えば、それぞれチミン、グア
ニン、シトシン用のものを収容する。

受槽３０．３２．３４．３６にそれぞれバルブ３８．４
２．４６．５０を、及びそれぞれ圧力調節器４０．４４
．４８．５２を備える。

容器１２、受槽２４．３０．６２．３４．６６は、個々
にフローバルブ５４とフローバルブ調節器５６とを有し
て受槽を廃棄トラップ１１４にベントさせる。

バルブブロック１８は管路４０４を通して予備反応器５
８に供給する。バルブ６ｏ及び管路４００は予備反応器
５８を廃棄トラップにベントする。

予備反応器５８は管路４０２によってバルブブロック６
２と連絡する。不活性ガスを管路６４によってバルブブ
ロック６２に供給する。管路６６が廃棄トラップ１１４
にベントする。

予（＋＃ｉ反応した状態の簡単なヌクレオシドの混和物
カ管路７２を経てバルブブロック７０に移動する。

受槽８０．８２．８４．８６．８８はバルブブロック７
０と連絡する。

受槽８０．８２．８４．８６．８８は各々適当なバルブ
９０、圧力調節器９２、フローバルブ９４、フローバル
ブ調節器９６を有する。

（、−１９し 主反応器９８がサーモスタットで調温する環境・内に配
置されて入口１０４と出口１０６とを有する反応室１０
２を定める。

出口１０６はバルブブロック１０８に接続する。

バルブブロック１０８は両分収集器１１２と連絡スる。

バルブブロック１０８は、また、管路１９８か或は流れ
調節器２００及び管路２０２のどちらかを通して廃棄ト
ラップ１１４に連絡するバルブブロック１Ｂ、６２．７
０．１０８及びバルブ１４．２６．３８．４２．４６．
５０．５４．６０．９０．９４は制御ユニット６８によ
って電気的に制御される。

主反応器装置９８は第２及び３図に詳細に示され、要素
１２６．１２８．１３０．１３２を収容するスリーブ１
２４を支持するベース１２２から成る。

ベース１２２の下方にバルブブロック１０８が有り、該
バルブブロック１０８は上で第１Ａ及び１Ｂ図に関連し
て述べた。

要素１２２及び１２４を内にねじを切ったカラー１３４
によって一緒にして保持する。

上部カラー１３６は要素１３２をスリーブ１２４とシー
ルする関係に保つ。

孔を有するシリカ球から成るマクロポーラスなビーズで
室１０２を満たす。また、ビーズを他の方法で化学的に
変性することもできる。

予備反応器５８は第４図に詳細に示され、ガラスびん４
２０、スクリューキャップ囲い４１０、一連の接続管４
００．４０２．４０４及びシーリング座金４４０から成
る。管４００．４０２．４０４はそれぞれバルブブロッ
ク６０．６２．１８に通じる。ヌクレオシドの活性化は
ガラスびん４２０の内部のキャビティ４３０内で行われ
る。

４１０及び４２０にそれぞれ合うようにねじ山を切った
表面４１２及び４２２は座金４４０を表面４１４及び４
１６に圧縮させて接続管を除いてキャビティ４３０をシ
ールする。

バルブブロック１８．６２．７０．１０８は、好ましく
はデッド容積ゼロの構造に作られるマルチユニットバル
ブである。バルブブロックは、例えばウィツトマン等（
米国特許４．００８．７３６号）、バンカピラー、フッ
ド（米国特許４．２５２．７６９号）、フッド等（米国
特許出願第３８０．１０９号）、スターク（米国特許出
願第３　［１０，１８４号）が容認できる。ブロック中
の個々のバルブユニットは、制御ユニット６８により個
々の基準で電気的に制御される。

オリゴヌクレオチドを合成する代表的な操作オリゴヌク
レオチドを合成するのに上述した装置を使用することは
３つの基本的な手順から成る：初めの結合ヌクレオシド
を含有する固体支持体を主反応器に装入し、各サイクル
で望まれるような任意の又は全てのヌクレオシド誘導体
を用いて以下に説明するカップリングサイクルを１回以
上行い、支持体結合の完了したヌクレオチドを主反応器
から取り出した後に、支持体から開裂１−、ヌクレオチ
ドから保護基を取り去る。カップリングサイクル操作を
開始するに先立ってヌクレオシド添加の順序のプログラ
ムを制御ユニット６８に組み込む。

初めの結合ヌクレオシドを含有する支持体を主反応器９
日の室１０２に装入するために、管材料保持スクリュー
１０３をゆるめ、順に上部カラー１３６、固定環１２１
、テフロン座金１２３、要素１６２、多孔質テフロン座
金１２７、要素１３０を要素１２８、多孔質座金１２５
、要素１２６と共に取り外して一部分解する。先に使用
した支持体物質を全て室１０２から出してからにし、多
孔質テフロン座金１２５及び１２７を捨てる。次に、要
素１２６、新しい多孔質テフロン座金１２５、要素１２
８、要素１３０、初めの付着ヌクレオシドを含有する新
しい支持体を室１０２の中に、多孔質テフロン支持体１
２７、要素１５２、テフロン座金１２３、固定環１２１
、上部カラー１３６を順に再配置して再び組み文てる。

管材料保持スクリュー１０３をしつかり締めてアセンブ
リーを完了する。

代表的なカップリングサイクルは次の工程から成る： 工程１、時間＝３０秒。主反応器を通してニトロメタン
（２，５ｍｌ　）をフラッシュさせる。流出物を管路１
９８に通すように向ける。

工程２、時間：１０秒。主反応器を通してアルゴンをフ
ラッシュさせてニトロメタンを除く。流出物を管路１９
８に通すように向ける。

工程３、時間：３０秒。主反応器を】ｍして３Ｘトリク
ロロ酢酸を溶解したり四ロホルム（ｔ５ｍ／）をフラッ
シュさせて脱トリチル化を行う。流出物を両分収集器１
１２に向ける。

工程４、時間：１０秒。主反応器を通してアルゴンをフ
ラッシュさせて酸溶液を除く。流出物を両分収集器１１
２に向けろ。

工程５、時間：２０秒。主反応器を通してニトロメタン
（１，５ｍ／）をフラッシュさせる。流出物を両分収集
器１１２に向ける。

工程６、時間＝１０秒。主反応器を通してアルゴンをフ
ラッシュさせてニトロメタンを除く。流出物を両分収集
器１１２に向ける。

工程７、時間：２０秒。主反応器を通してメタノール（
１５ｍ７）をフラッシュさせる。流出物を管路１９８に
通すように向ける。

工程８、時間：１０秒。主反応器を通してアルゴンをフ
ラッシュさせてメタノールを除く。流出物を管路１９８
に通すように向ける。

工程９、時間：３０秒。ヌクレオシド受槽をアルゴンで
加圧する。

工程１０、時間：１５秒。主反応器を通してアセトニト
リル（ｔ１ｍ／りをフラッシュさせる。主反応器からの
流出物を管路１９８に通すように向ける。アセトニトリ
ル（０，２ｍｌ　）中のヌクレオシドホスファ−アミダ
イトを予備反応器に送出する。

工程１１、時間：５秒。主反応器を通してアセトニトリ
ル（ｏ、　、ｉ　ｍｌ　）をフラッシュさせる。主反応
器からの流出物を管路１９Ｂに通すように向ける。予備
反応器を通してアルゴンをフラッシュさせてヌクレオシ
ドホスファ−アミシトを予備反応器に押し入れる。

工程１２、時間：３０秒。テトラゾール受槽を加圧する
。

工程１３、時間＝２０秒。主反応器を通してアセトニト
リル（１，４＋＋＋ｌ）をフラッシュさせる。主反応器
からの流出物を管路１９８に通すように向ける。アセト
ニトリル（０，４ｍｌ　）中のテトラゾールを予備反応
器に送出する。

工程１４、時間：５秒。主反応器を通してアセトニトリ
ル（０，４ｍｌ　）をフラッシュさせる。主尺゛応器か
らの流出物を管路１９８に通すように向ける。予備反応
器を通してアルゴンをフラッシュさせてテトラゾールを
予備反応器に押し入れる。

工程１５、時間：１５秒。主反応器を通してアセトニト
リル（ｔｌｍｌ）をフラッシュさせる。主反応器からの
流出物を管路１９８の中に通すように向ける。アルゴン
を予備反応器の中にあわ立たせるように入れてヌクレオ
シドとテトラゾール溶液とを混合し、カップリングのた
めのヌクレオシドの活性化を行わせる。

工程１６、時間：１０秒。主反応器を通してアルゴンを
フラッシュさせてアセトニトリルを除く。

流出物を管路１９Ｂの中に通すように向ける。

工程１７、時間＝２秒。予備反応器をアルゴンで加圧す
る。

工程１８、時間：３６０秒。アルゴンを予備反応器に向
けて活性ヌクレオシドを予備反応器から主反応器に通し
て押す。このプロセスは活性ヌクレオシドを主反応器中
の支持体上のヌクレオチドにカップリングさせる。主反
応器からの流出物を７四−調節器２００の中に通すよう
に向ける。

工程１９、時間＝５秒。予備反応器及び主反応器を通し
てアルゴンをフラッシュさせて活性ヌクレオシドを除く
。主反応器からの流出物を管路１９８の中に通すように
向ける。

工程２０、時間：１０秒。アセトニトリル（ｔ５＋＋＋
ｌ）を予備反応器に送出する。

工程２１、時間：３０秒。アルゴンを予備反応器に向け
てアセトニ）　ＩＪルを予備反応器から主反応器に通し
て押す。主反応器からの流出物を管路１９８に通すよう
に向ける。

工程２２、時間：１０秒。主反応器を通してアセトニト
リル（０，７ｍｅ）をフラッシュさせる。主反応器から
の流出物を管路１９８に通すように向ける。アセトニト
リル（１５ｍｌ）を予備反応器に送出する。

工程２３、時間：２５秒。主反応器を通してアセトニト
リル（１８ｍｌ）をフラッシュさせる。主反応器からの
流出物を管路１９Ｂに通すように向ける。予備反応器を
通してアルゴンをフラッシュさせてアセトニトリルを除
く。予備反応器からの流出物を管路６６に通すように向
ける。

工程２４、時間：１０秒。主反応器を通してアルゴンを
フラッシュさせる。流出物を管路１９８に通すように向
ける。

工程２５、時間：６０秒。主反応器を通してヨウ素／水
／２，６−ルチジン／テトラヒドロフラン溶液（２゜ｏ
　ｍｌ　）をフラッシュさせてホスファイトからホスフ
ェートへの酸化を行わせる。流出液を管路１９Ｂに通す
ように向ける。

工程２６、時間：１０秒。主反応器を通してアルゴンを
フラッシュさせてヨウ素溶液を除く。流出液を管路１９
８に通すように向ける。

工程２７、時間：６０秒。主反応器を通してメタノール
（３，ｏｍｌ）をフラッシュさせる。流出物を管路１９
８に通すように向ける。

工程２８、時間：１０秒。主反応器を通してアルゴンを
フラッシュさせる。流出物を管路１９Ｂに通すように向
ける。

ひとたび、上述したカップリングサイクルを所望の回数
くり返したなら、支持体と基材保護基との開裂を与える
ために支持体結合の完了したオリゴヌクレオチドを主反
応器から取り出す。主反応器からの取り出しは、新しい
シリカ支持体を主反応器に装入する上述した手順を繰り
返すことによって行う。次に、開裂及び脱ブロッキング
プロセスは、装置１０の外でカルザス等により説明され
るような方法で手動によって行う。

標準のカップリングサイクルの変更は、脱トリチル化工
程にトリクロロ酢酸溶液よりもむしろＺｎＢｒ２にトロ
メタン中の飽和溶液）を使用することを含むことができ
る。この場合、脱トリチル化を１０〜２０分に延長しな
ければならない。別の変更は、カップリング工程の間に
活性ヌクレシドを１種以上−次反応器に送出することで
ある。

これは、２．３又は４つの一部活性にしたヌクレオシド
を予備反応器に送出しくそれぞれ、標準の１つのヌクレ
オシド送出時間の７２．１／３又は１／４を用いる）、
テトラゾールをヌクレオシド混合物に加え、活性ヌクレ
オシドの混合物を主反応器に押し通すことによって行う
。

カップリング反応の完了は、各サイクルにおいて脱トリ
チル化、続いて溶剤フラッジユニ程からの流出物を収集
し、分光光度計でジメトキシトリチルカチオンの４ｑＢ
ｎｍにおける吸光度を測定することＫよって便宜に監親
することができる。

両分収集器の各々続く管中に存在する吸光度の相対量を
用いてサイクルカップリング収率を計算することができ
る。典型的な収率ば９５％又はそれ以上である。

発明を完全に智明したが、本発明は特許請求の範囲によ
ってのみ制限するつもりである。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ及び１Ｂ図は、本発明の新規装置の図式第２図は
第１Ｂ図に示す一次反応器の断面図である。 第３図は第２図の中央部分の拡大部分断面図である。 第４図は第１Ａ図に示す予備反応器の断面図で１！ｆｒ
ｍｌ昭５９−２０５３９５　（１０）−１２９４− ＦＩＧ、４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｔ　簡単な化学化合物から複雑なオリゴヌクレオチドを
   合成する装置であって、該簡単な化学化合物の少くとも
   １種を反応室内に配置した多数のビーズから成る固体マ
   トリックスの上に運び、続いて室の中を流れて通る他の
   複数の簡単な化合物に露呈させ、簡単な化学化合物の間
   で化学相互作用を引き起こさせて核複雑な化合物を作る
   前記装置。 ２、予備反応器を前記反応室と共にかつ該反応室と流体
   連絡させて与え、かつ一部活性にしたヌクレオシドを該
   反応室に導入する直前に完全に活性にする特許請求の範
   囲第１項記載の装置。 五　試薬及び溶剤を保持する一連の受槽を前記反応室の
   上流に該反応室と流体連絡させて与え、かつ空気ガス圧
   手段を該受槽に関連させて与えてこれらの物質を該反応
   室に通して空気移動を行わせる特許請求の範囲第２項記
   載の装置。 ４、　試薬及び溶剤を保持する一連の受槽を、また、前
   記予備反応器の上流に該予備反応器と流体連絡させて与
   える特許請求の範囲第３項記載の装置。 ｉ　バルブブロックを前記予備反応器の上流で該予備反
   応器と前記反応室との間に与えて流体の流れを制御し、
   かつ該バルブブロックがデッド容積ゼロである特許請求
   の範囲第４項記載の装置。 ＆　前記ビーズが中に孔を含有するマクロポーラスなシ
   リカ球から成る特許請求の範囲第５項記載の装置。 ７　バルブブロックを、また、前記反応室の下流に該反
   応室と流体連絡させて与え、該バルブブロックが更に両
   分収集器と連絡する特許請求の範囲第１項記載の装置。 ８、前記マクロポーラスなシリカ球を、前記反応室の底
   部を形成する多孔質テフロンシートによって支持する特
   許請求の範囲第７項記載の装置。 ９　固体支持体を収容する主反応域に完全に活性にした
   複数のヌクレオシドを導入し、該複数のヌクレオシドを
   該支持体上で同時に反応させてオリゴヌクレオシドを作
   ることから成る方法。 １〇　一部活性にしたヌクレオシドを主反応域に導入す
   る直前に予備反応域において完全に活性にする特許請求
   の範囲第９項記載の方法。 １１、固体支持体がヌクレオチドを運び、かつ前記活性
   にした複数のヌクレオシドが該ヌクレオチドにカップル
   する特許請求の範囲第９項記載の方法。