JPS60136593A - 核酸合成器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、同相法、すなわち固体支持体粒子上での反応
によって、核酸を合成するための装置に関する。さらに
具体的には、本発明は、反応室の下部からの液相材料の
定量的吸引および攪拌用ガスの吸引を簡単に行なえるよ
うにした核酸合成器に関する。

先行技術 遺伝子工学の技術的基礎となる遺伝子操作に化学合成オ
リゴヌクレオチＦが使用され始めてから今日まで、遺伝
子操作の発展はめざましいものがあり、それに伴なう化
学合成オリゴヌクレオチドの果たした役割は太きいもの
と言える。

オリゴヌクレオチドの合成法には、ジエステル法（５ｃ
ｉｅｎｃｅ　、　２０３　、６１４（１９７９）　’）
、トリエステル法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　、　８　、２３３１（１９８０）、同旦
、　５１９３（１９８０）、同旦、　５４９１（１９８
０））、ホスファイト法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ　、　２２　、１８５９（１９８１）　）
、あるいは固相法（Ｎａｔｕｒｅ　、　２８１　、１８
（１９７９）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　１９８
０　、６０９６（１９８０）　）、液相法、あるいは酵
素を用いる方法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　、　８　、５７５３（１９８０）　）等があ
り、今日ではトリエステル法−固相法（Ｎｕｃｌｅｌｃ
　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　、　８　、５５０７（
１９８０）　）またはホスファイト法−固相法（Ｊ、Ａ
ｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　１０３　、３１８５−３
１９１（１９８１））　の組合せか最も一般的であって
、技術的にもかなり確立された方法となっている。そこ
で、これらの方法を用い、省力化を目的として完全に自
動化されたＤＮＡ合成装置がすでに数機種発売されてい
るが、いずれにせよ価格、持ち運び、配置ス啄−スなど
に問題が残されている。

一方、実際面においては、−回の遺伝子操作で必要とさ
れるオリゴヌクレオチドは、一般に鎖長１５マー（ｍａ
ｒ）から５マー（ｍｅ　ｒ＞程度のプライマー、ゾロー
ゾ、リンカ−など数体であり、量的にも多（て０，５０
Ｄ程度である。したがって、遺伝子操作などに用いられ
る程度のオリゴヌクレオチドの合成を随時ＥＪ能とした
安１曲でかつ簡易な核酸合成器が望まれていた。

発明の概要 要旨 本発明は、固相法によるオリゴヌクレオチド類の合成に
必要な一連の工程（たとえは、試薬等の吸入、攪拌、反
応（縮合、脱保権基、マスキング等）、排出および内容
物の洗浄乾燥等）を手動により可能とした核酸合成器を
提供するものである。

すなわち、本発明による固体支持体粒子上での反応によ
って核酸を合成するための核酸合成器は、着脱自在に連
結された下記の部材ＡおよびＢからなること、を特徴と
するものである。

（Ａ）　下記の部、４４’　（Ａ−１）〜（Ａ−１４）
からなる反応器。

（Ａ−１）該固体支持体粒子を収容して該反応を行なわ
せるのに十分な容積を有する円筒からなる反応室、 （Ａ−２）反応室（Ａ−１）の下方への延長部をなしか
つ反応室（Ａ−１）の下部より内径の小さい、該固体支
持体粒子保持用フィルターを取付けるだめの取付座、 （Ａ−３）取付座（Ａ−２）に取付けられた、該固体支
持体粒子保持用フィルター、 （Ａ−４）反応室（Ａ−１）のさらに取付座（Ａ〜２）
の下方への延長部をなす、冴応室（Ａ−１）へ該反応に
関与する液相材料を出入させるための給排液管、 （Ｂ）　下記の部材（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）からなる給
排気装置。

（Ｂ−１）上記反応室（Ａ−１）の上部において該反応
室と連通すべきシリンダー（Ｂ−１−ａ）とその内部に
設けられたピストン棒付きピストン（Ｂ−１−ｂ）とか
らなる正負圧発生装置、（Ｂ−２）ピストン（Ｂ−１−
ｂ）のピストン棒の延長としての、♂ストン駆動用棒部
材、 （Ｂ−４’）バネ部材（Ｂ−３）によって賦勢される棒
部材（Ｂ−２）の退行を所定位置に停止させる副送機構
。たｙし、この副送機構は、棒部材（Ｂ−２）に設けら
れた突起（Ｂ−２−ａ）とこれと係合する停止装置（’
Ｂ−４−ａ’）とからなり、突起（Ｂ−２−ａ）と停止
機構（Ｂ−４−ａ）とは棒部１（Ｂ−２）の上記停止位
置からの更なる退行を許容ししかもこの更なる退行の後
に再び上記停止位置への復帰を許容するよう構成された
ものである。

効果 このように、本発明は手動操作の可能な核酸合成器に関
するものであるが、本発明の核酸合成器ニヨって操作マ
ニュアルに従ってオリゴヌクレオチドの合成を行えば、
有機合成の経験者でなくとも簡単な操作で確実にしかも
高収率で所望のオリゴヌクレオチドを得ることができる
。また、本発明核酸合成器は、従来の自動化された核酸
合成装置で問題とされている価格、持ち運び性または配
置スペース等の点で解決されたものである。従って、本
発明によれば高価な自動化された核酸合成装置を使わな
くとも、遺伝子工学の分野において常用されるオリゴヌ
クレオチドであるゾライマー、プローブ、リンカ−等の
合成が可能であり、今後合成オリゴヌクレオチドの遺伝
子工学への利用に大きく貢献するものと思われる。

本発明核酸合成器をその構成要素の面からみた場合の一
つの特色は、反応室の下部から所謂ピペットの原理で同
相合成に必要な反応体、溶媒等の液相材料を反応室へ吸
引するためのシリンダー／ピストン装置がピストンの二
段階退行可能のように構成されているということである
。すなわち、このような吸引装置によれば、第一段階の
ピストンの退行で所定量の液相材料を吸引し、第二段階
のピストンの退行で空気（または不活性ガス）を吸引し
てその気泡で固相反応系を攪拌することができ、両操作
を極めて容易に実行することができる。

合成器の概要 本発明による核酸合成器は、固体支持体樹脂粒子上での
反応によって、すなわち固相法によって、核酸を合成す
るのに使用する装置であって、前記の部材Ａ−１〜Ａ−
４およびＢ−１〜Ｂ−４からなるものである。本発明装
置の可動部分は、主として給排気装置（Ｂ）であるが、
この部分の駆動は電動によりあるいは合成操作をコンピ
ューター管理の下に行なうことも勿論可能であるけれど
も、実験者が手動でこれを操作することが本発明装置を
利用するうえで最も好ましい。

本発明による合成器の一具体例は、第１図にその側断面
図で示した反応器と第２図の側断面図で示した給排気装
置とを連結してなるものである。

反応室（Ａ−１） 反応室（Ａ−１’）は、第１図にその側断面を示しであ
るように、固相合成用固体支持体樹脂粒子を収容して該
反応を行なわせるのに十分な容積を有する円筒からなる
。ここで１−円筒」とは、断面が実質的に円形であって
、直径（断面が真円でな（・場合は相当直径）に比べて
長さが十分に太きいもの（特に、長さが少なくとも直径
と同一であるもの）を意味する。また、その断面の形状
ないし大きさは長さ方向に関して同一でなくてもよ（、
必要に応じて内部に突起を有するものであってもよい。

反応室（Ａ−１）の上部には、反応室を給排気装置（Ｂ
）（詳細後記）と着脱自在に連結するための手段、たと
えば雄ネジの刻設（Ａ−５）（第１図）、が構じられて
いる。

一方、反応室（Ａ−１）の下部には、反応室円筒の内径
より小径のフィルター取付座（Ａ−２）が設けられてい
る（詳細後記）。

反応室部分の材質は有機溶媒に耐性のものであれば倒如
なるものでもよく、ステンレス鋼、テフロン、ガラス等
Ω材質が適当なものとして考えられる。反応の状態や樹
脂の状態が容易に確認できるということからは、ガラス
が好ましい。特に、反応室（Ａ−１）が透明であると、
ヌクレオチド等の反応器の内壁をシリコンで被覆するこ
とによってヌクレオチドの縮合反応に際して使用する樹
脂が付着しないようにすればさらに好ましい。なお、円
筒の内径としては通常１０ｍｍ程度であれば十分である
。

フィルター取付座（Ａ−２） 固体支持体樹脂粒子保持用フィルター（詳細後記）を取
付けるための取付座（Ａ−２）は、反応室（Ａ〜１）の
下方への延長部分をなし、かつ反応室（Ａ−１）の下部
より直径の小さい部材である。ここで［反応室（Ａ−１
）の下部より内径の小さい）ということは、このフィル
ターが取付けられている当該個所がこのフィルター取付
座（Ａ−２）が接続されている個所での反応室（Ａ−１
）の内径より小さければよいということを意味するもの
である。従って、反応室（Ａ−１）の上方にさらに小径
の部分が存在している場合を排除しないのであり、また
第１図に示したもののようにこのフィルター取付座（Ａ
−２）の内径が下方に向って連続的に減少する場合をも
またこのフィルター取付座（Ａ−２）の当該フィルター
取付個所より下方で拡径されている場合をも、包含する
ものである。

フィルター取付座（Ａ−２）の−具体例は、図示のよう
なロート状のものである。図示のものは直径に比べて上
下方向の寸法が比較的小さいが、図示のものよりも縦長
のロート状であっても勿論差支えない。また、ロートの
内径は続連的に減少（下方へ）していてもよいが、内径
の減少は段階的であってもよい。

フィルター（Ａ−３） フィルター（Ａ−３）は、固相合成法用の固体支持体樹
脂粒子を支承しかつ液相材料の通過を許容する構造のも
のであれば任意の形状、素材その他のものでありうる。

最も典型的なフィルターは、所謂ガラスフィルターとし
て知られている濾過部構造のものである。

また、セラミックもフィルタ一部材と考えられる。

フィルターとしての開孔度は、支持体樹脂粒子が逸出し
ないよう４０〜５０ミクロン程度（ガラスフィルターで
いえばＧ−２規格品程“度）であることが好ましい。

フィルターの他の具体例は、グラスウールである。

フィルターい−３）は取付座（Ａ−２）に取付けられて
いるが、ここで「取付けられた」ということは取付座か
ら着脱可能である場合と着脱不能の場合のいずれをも包
含するものとする。着脱可能である場合には、その下方
より進入してくる合成反応用液相材料によって上方に押
上げられないようにその取付は方に配慮すべきである。

給排液管（Ａ−４） 給排液口は、反応室（Ａ−１）のさらに取付座（Ａ−２
）の下方への延長部をなして存在する。

給排液管（Ａ−４）の開口部は、ゴムキャップ（Ａ−６
）によって封じることができる。

なお、（Ａ−１’）〜（Ａ−４）からなる反応器は、本
発明者らの先行発明（昭和露年１２月１９日特許出Ｈ）
にかＮるものである。

給排気装置フレーム（Ｂ−０） 本発明核酸合成器は上記反応器体）と給排気装置（Ｂ）
とからなるが、給排気装置の各部材は第２図にその側断
面図で示すようにフレーム（Ｂ−０）内に設けることが
好ましい。

フレーム（Ｂ−０）は、図示の例では、金属、合成樹脂
等で一体に形成したものであるカベその内部への部材の
収容ないし取外しのために適宜分割しうる構造であって
もよいことはいうまでもない。

フレーム（Ｂ−０）の下端部（第２図）には、前記反応
室上部の雄ネジ部（Ａ−５）と係合して反応室をフレー
ム下部に連結するための雌ネジ環（Ｂ−０−ａ）が設け
られている。

フレーム（Ｂ−０）への反応室（Ａ−１）の連結は、シ
リンＩＩ”　−（Ｂ−１−ａ）　（詳細後記）と連通ず
るクレーム延長部（Ｂ−０−ｂ）にパツキン（Ｂ−０−
ａ）を嵌装したうえ、このノぞツキン（Ｂ−０−ｃ）に
反応室（Ａ−５）の上部を当接させてこれを雌ネジ環（
Ｂ−０−ａ）によって螺着すればよい。

第３図は、本発明による核酸合成器、特にフレーム、の
−例の外観を示す説明図である。

正負圧発生装置（Ｂ−１） 正負圧装置発生装置（Ｂ−１）は、前記反応室（Ａ−１
）と連通ずるシリンダー（Ｂ−１−ａ）とその内部に設
けられたピストン棒付きピストン（Ｂ−１−ｂ）とから
なる。

シリンダー（Ｂ−１−ａ）の長さは、ピストン（Ｂ−１
−ｂ）が退行して（すなわち、第２図の場合は上方へ移
動して）所定の排気量、すなわち所定量の液相材料を吸
引し、さらに空気をも吸引するための負圧を発生しうる
量、が実現できるのに十分なものでなければならない。

前記の内径１０ｍｍ程度の反応室に対しては、シリンダ
ーの大きさは内径１０ｍｍ程度×長さ３０ｍｍ程度で十
分である。

ピストンにはピストン棒（Ｂ−１−ｃ）が付属しており
、これはその延長としてのピストン駆動用棒部材（Ｂ−
２）へとつながる。

ピストン駆動装置用ハウジング（Ｂ−５）ピストン棒（
Ｂ−１−ｃ）は、シリンダー（Ｂ−１−ａ）の上部でフ
レームに設けられた貞孔（Ｂ−０−ｂ）を貫通して上部
へ延びてピストン駆動用棒部材（Ｂ−２）となる。

ピストン駆動用棒部材（Ｂ−２）は、その賦勢用バネ部
材（Ｂ−３３（詳細後記）等と共に、フレーム（Ｂ−０
）内に設けられたハウジング（Ｂ−５）内に収容されて
いる。従って、ハウジング（Ｂ−５）は、フレームの貫
孔（Ｂ−０−ｄ）を弁してシリンダー（Ｂ−１−ａ）と
連結されている。

ハウジング（Ｂ−’５）は、シリンダー（Ｂ−１へａ）
と同１（）のシリンダー状のものであることがふつうで
ある。

ピストン）ｔＭ　（Ｂ−１−ｃ）およびその延長として
の棒ｍ制（Ｂ−２１とは中実のものであってもよいが、
反応室（Ａ−１）内に外部から乾燥用あるいは反応雰囲
気用のガス（たとえば窒素ガス）を供給するため、合に
は、反応室（Ａ−１）と外界との連通を断つべく適当な
弁装置たとえばニードル弁（Ｂ−２−ｅ）およびそのカ
バー（Ｂ−２−、ｆ）、ならびにガス源との継手（Ｂ−
２−ｇ）を設けることが好ましい。また、棒部材（Ｂ−
２）、ひいてはピストン（Ｂ−１−ｃ）、の退行量を本
合成器外部から知るために、ピストン棒（Ｂ−１−Ｃ）
ないし棒部材（Ｂ−２）の側面に数字、記号ないし目盛
’）　（Ｂ−１−ｄ）を記して、これをフレーム（Ｂ−
０）に設けた覗き孔（Ｂ−０−ｅ）（第３図）から見ら
れるようにすることもできる。

ことは、たとえばコイルバネ部材（Ｂ−３）の一端を棒
部材（Ｂ−２）　に、他端をフレーム上の固定点に保止
させて、コイルバネの反発力あるいは収縮力によって棒
部材（Ｂ−２）を退行（第２図では上方）させるように
したことを意味するものである。第２図の具体例はその
典型的なものであって、蓄勢されたコイルバネの反発力
によって、棒部材（Ｂ−２）を退行させるようになって
いる。

ピストンを退行させるべくバネ部材を棒部材に係止させ
るためには、棒部材には適当なノ々ネ係止具な設ける必
要があるが、その代表的なものはコイルバネを接受して
押圧力を伝えるＡネ座である。

バネ座は棒部材そのものに設けてもよいが、第２図の具
体例に示したように、棒部材（Ｂ−２’）にネジ（Ｂ〜
２−〇）を介して嵌装されたスリーブ（Ｂ−２−ｂ）に
円板状（Ｂ−２−ａ）に設けることが好ましく・。この
ようにすれば、スリーブ（Ｂ−２−ｂ）をフレーム外の
つまみ（Ｂ−２−ｄ’）により回転させて、／マネ座（
Ｂ−２−Ｃ）の位置を上下させることができ、それによ
って副送機構（Ｂ−４）　（詳細後記）によるピストン
退行量の調節をすることができる。なお、スリーブ（Ｂ
−２−ｂ）上の円板（Ｂ−２−ａ）は棒部材（Ｂ−２）
と剛体的に連結されているのであるから、このような円
板（Ｂ−２−ａ）をも本発明では「棒部材（Ｂ−２）に
設けられた突起」というものとする。

副送機構（Ｂ−４） バネ部材（Ｂ−３）によって賦勢される棒部材（Ｂ−２
）の退行を所定位置に停止させて所定量の給気量を保証
し、しかもその位置から更なる退行を許容する副送機構
（Ｂ−４）は、先ず、棒部材（Ｂ−２）に設げられた突
起（Ｂ−２−ａ）とこれと係合する停止装置（Ｂ−４−
ａ）とからなるものである。ここで、部材（Ｂ−２−ａ
）は停止装ｆｉｔ　（Ｂ−４）と係合するという点では
突起であるが、これがコイルバネを接受するものである
場合は円板であり、しかもスリーブ（Ｂ−２−ｂ）を介
して間接的に棒部材（Ｂ−２）に設けられたものであっ
てもよいことは前記した通りである。

停止機構（Ｂ−４−ａ）は、突起（Ｂ−２−ａ）との関
係において、棒部材の上記停止位置からの更なる退行を
許容し、しかもこの更なる退行の後に再び上記停止位置
への復帰を許容するように構成されて（・る。

そのような構成の停止機構の一つの具体例は、第２図に
その側断面図を示したような、一方向係止爪（Ｂ−４−
ａ）を有する機構のものである。すなわち、係止爪（Ｂ
−４−ａ’）は、突起（Ｂ−２−ａ’）の先端が移動の
際に描く軌跡に対して直角に、換言すれば棒部拐（Ｂ−
２）に設けられた突起（Ｂ−２−ａ）が初動接触するハ
ウジング（Ｂ−５）の側壁に直角に設けられた孔内に出
入自在にかつ該係止爪の頂部がハウジング（Ｂ−５）内
に突出するようバネ機構（詳細後記）で押圧されるよう
に、構成されている。係止爪は模形頂部を持つ棒状態か
らなり、その頂部は、棒部材（Ｂ−２）の突起（Ｂ−２
−ａ）がバネ（Ｂ−３）によって−Ｉ一方に押圧された
ときに該係止爪によって棒部材（Ｂ−２）の退行を停止
させるようにその下部（第２図の位置関係での下部）が
水平に、上部が傾斜していて該突起（Ｂ−２−ａ）が上
記停止位置から更に退行した位置から再び該停止位置へ
戻る（下向きに移ｄＪＪ）ときに該係止爪を係止爪孔へ
押込むような分力が働くように、構成されている。

係止爪（Ｂ−４−ａ）は、本発明に従って、棒部材（Ｂ
−２）、ひいてはピストン（Ｂ−１−ｂ）、の退行を一
旦停止させ、そののち停止状態を解除するものでなけれ
ばならず、またその操作は手動で可能であることが望ま
しい。従って、係止爪（Ｂ−４−ａ）はフレーム（Ｂ−
０）の外側からそのような操作が可能なものでなければ
ならない。第２図に示したものはそのように配慮された
係止爪の一具体例であって、係止爪（Ｂ−４−ａ）は操
作ノブ（Ｂ−４−ｂ’）との間にビニオン（Ｂ−４−ｃ
’）を介して所謂「ラックおよびビニオン」の関係で保
合している。操作ノブ（Ｂ−４−ｂ）はスフリング（Ｂ
−４−ｄ）によってフレーム（Ｂ−０）　外へと押圧さ
れている。このような構成において、操作ノブ（Ｂ−４
−ｂ）を押込めば、係止爪（Ｂ−４−ａ）は引込まれて
、棒部材突起（Ｂ−２−ａ）との保合関係が解除されて
、俸部拐の更なる退行か実現される。その後、棒部Ｕ（
Ｂ−２）をフレームＣＢ−（］）内に押込めば、突起（
Ｂ−２−ａ）によって係止爪（Ｂ−４−ａ）か押込まれ
て（その際、操作ノブ（Ｂ−４−ｂ）も引込まれること
になる）、突起（Ｂ−２−ａ）は係止爪（Ｂ−４−ａ）
を乗り越えることになる。

操作ノブ（Ｂ−４７ｂ）は、図示の具体例では、ビニオ
ン（Ｂ−４−ｅ）を介して係止爪（Ｂ−４−ａ）と係合
していて、該ノブを押込むことによって係止爪（Ｂ−４
−ａ）と突起（Ｂ−２−ａ）との係合関係を解除するこ
とができるので、実験操作上好都合である。このように
操作ノブを押込むことによって所期の目的を達成するた
めには、図示のような「ラックおよびビニオン−１の機
構によらなくても、操作ノブと係止爪との間をレバー機
構、「滑車およびひも」機構その仙台目的的な機構を採
用しうろことは当業者にとって自明であろう。

操作ノブと係止爪とは上記のように運動方向が逆（すな
わち、操作ノブを右方向へ押すと係止爪か左方向へ引込
む）である必要はない。従って、Ｉ係止爪の基部側を延
長して、この延長部を操作ノブとして利用するように構
成することができる。

一端の係止爪側かハウジング（Ｂ−５）内に臨み、他端
の操作ノブ側がフレーム（Ｂ−０）外に臨むようにフレ
ーム（Ｂ−０’）を貫通する係止爪／操作ノブ一体部品
な係止爪頂部か常にハウジング（Ｂ−５）内に突出する
よ５に押圧するバネＦＡ構は当業者にとって自明であろ
う。

図示の停止機構は、停止機構側が突起（Ｂ−２−ａ）と
の停止位置での係合関係を解除すべく動くという方式の
ものである。しかし、本発明で［突起（Ｂ−２−ａ）と
停止機構（Ｂ−４−ａ）とは棒部材（Ｂ−２）の上記停
止位置からの更なる退行を許容ししかもこの更なる退行
の後に再び上記停止位置への復帰を許容するよう構成さ
れたものである」と定義される副送機構（Ｂ−１４）は
、突起（Ｂ−２−ａ　）側か係止爪（Ｂ−４−ａ）との
係合関係を解除すべく動くものである場合をも包含する
ものである。このような副送機構（Ｂ−４）の−具体例
は、係止爪が固定されており、一方突起（Ｂ−２−ａ）
が円板からなっていて、その周辺部にこの係止爪によっ
て係止されない凹欠部を設けたものであるもの、である
。このような構成において、係止爪（Ｂ−４−ａ）と円
板状突起（Ｂ−２−ａ）とは定常相互関係では係合して
いて突起（Ｂ−２−ａ）は停止しているが、棒部材（Ｂ
−２）をある回転角でもって回転させれば、係止爪と当
接する部分が円板突起に設けた凹欠部となって、＃部材
の更なる退行が許容される。この更なる退行の後での停
止位置への復帰は、上記と逆のことを行なえばよいこと
は当業者にとって自明であろう。

副送機構（Ｂ−４）は、要するに、ある部材の所定方向
への移動を阻止するが反府方向への移動は許容し、しか
も上記の所定方向への移動阻止を必要に応じて解除しう
るような機能を持つもの、である。従って、前記の諸具
体例の外にも、解除機構つきラチェット装置が一般に利
用可能である。

核酸の合成 本発明の核酸合成器を使用して行なうオリゴヌクレオチ
ドの合成は、下記の内容のものである。

なお、下記は好ましい具体例についてのそれである。

核酸合成の概要 本発明は、アミノメチルポリスチレン、シリカゲルまた
はポリアクリルモルホリドなどの種々の不溶性固体支持
体（以下、樹脂で代表させる）粒子に、ヌクレオシドを
固定化し、順次ヌクレオチド鎖の延長を行なう固相合成
法を用いた核酸合成器であり、ホスホジエステル法、ホ
スホトリエステル法、ホスファイト法が適用可能である
力瓢望ましくは、ポリスチレン樹脂を用いたホスホトリ
エステル法−固相法が用いられる。

すなわち、アミノ基を有するポリスチレン樹脂などをヌ
クレオシドのコハク酸誘導体とを縮合させる周知の方法
（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８　、５４
７３−５４８９（１９８０）　）により合成された固定
化ヌクレオシド類（それぞれ、塩基としてアデニン、シ
トシン、グアニン、チミン、またはウラシルを有する）
か、または市販のヌクレオシド樹脂（ＤＭＴ−ｄＡ−（
Ｎ−Ｂｚ）−８ｕａ−ＡＰ　ＸＤＭＴ−ｄＣ（Ｎ−Ｂｚ
）−８ｕｅ−ＡＰ　。

ＤＭＴ−ｄＧ−（Ｎ−１Ｂｕ）−８ｕｅ−ＡＰ　ＳＤＭ
Ｔ　−Ｔ−８ｕｅ　−ＡＰ　０いずれもバイオサーチ社
製）等を反応室（Ａ−１）に入れ、この反応器体）を給
排気装置（Ｂ）と連結し、あらかじめジクロロメタン等
の適当な溶媒を吸入し約Ｉ分程度放置することにより、
内容樹脂の膨潤を行ない、その後、下記に示す工程を順
次繰り返すことで、目的とするオリゴヌクレオチドを合
成していくものである。

脱トリチル化 ５′−水酸基の保護基として慣用されているジメトキシ
トリチル基の除去には、一般にベンゼンスルホン酸、Ｚ
ｎＢｒ２　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　、
　１０　、１７５５−１７６９（１９８２）　）、トリ
ククロロアセテート（兎以下ＴＣＡと略す）等が使用可
能である。この場合、遊離されたトリチル基による発色
（橙〜黄）で脱トリチルが確認できるため、発色しなく
なるまで脱トリチル化剤の吸入、攪拌、排出を行なうこ
とで、トリチル基の除去を行なうことができる。

縮合 無水ピリジン等の適当な無水溶媒で樹脂粒子をよく洗浄
した後、ガス導入口Ｂ−２−ｇから不活性ガス（窒素、
ヘリウム、アルゴンなど）を流入させて（１０分〜加分
程度でよい）内容樹脂粒子の乾燥ヲ行すい、ソの後、メ
シチレンスルホニルニトロトリアゾリド（ＭＳＮＴ）ま
たはイソプロビルペンイマー、トリマー）の無水ピリジ
ン浴液な給排液管（Ａ−４）から吸入しくピストン（Ｂ
−１−ｂ）を退行させることによる）、吸入して室温で
放置（約（資）分〜１時間）することによって、固定化
ヌクレオシＦの５′−水酸基と、ヌクレオチドブロック
のリン酸残基とを脱水縮合させることができる。

未反応５′−水酸基の不活性化（マスキング）未反応物
の５′−水酸基の不活性化は、鎖長の短いオリゴマーの
混入を防ぎ、各サイクルの反応を定量的に進行させるた
めであり、通常無水酢酸等によるアセチル化によって行
なわれる。たとえば１％ジメチルアデニンホスフェイト
含有無水ピリジン浴液と無水酢酸の９；１溶液（ｖ／ｖ
）（以下ｌチＤＭＡＰ／　ａｂａ　Ｐｙと略す）を用い
た場合、室温で約５分〜１０分程度放置することで、未
反応５′−水酸基はアシル化されて、その後の縮合反応
に対して不活性化することができる。

精製 目的生成物の樹脂からの遊離及びトリチル基以外の保護
基の除去は、テトラメチルグアニジン−ピリジン−２−
アルドキシム（ＴＭＧ　−０ｘｉｍｓ　）（Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　、　２７２７−２７３０（１
９７８’）　）、　続いて濃アンモニア水処理によって
行ない、その後、８０％酢酸で処理してトリチル基を除
去し、ＤＦＪＡＥ−セルロース（ファルマシア）クロマ
トクラフィーまたはＰｅｒｍａｐｈａｓｅ’　ＡＡＸ　
（デュポン）等を用いた高速液体クロマトグラフィー（
以下ＨＰＬＣと略す）で精製するか、あるいはトリチル
−を除去する前の混合物をセファデックスＧ−５０（フ
ァルマシア）等により粗精製し、逆相カラムにょるＨＰ
ＬＣで精製することにより得られたトリチル体を８０チ
酢酸等で処理し、更に逆相カラムにがけ単離することに
よって、行なうことができる。

また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっても精製
可能である。この様にして得られたオリゴヌクレオチド
は、レイ・ウーらの塩基配列決定法（ＭｅｔｈｏＭｓ　
ｉｎ　＆ｚ％ｙｍｏｌｏｇｙ　、　６５　、　Ｐａｒｔ
　１　、６２０−６３８（１９８０））、またはマクサ
ム・ギルバート法（Ｍｅｔｈｏ）ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ　＋　６５　、　Ｐａｒｔ　１　、４９９
（１９８０））　により構造を４ｉｌ！認することがで
きる。

操作マニュアル １）反応用器は常に垂直に保持して操作を行なう。

Ｉ）試薬等の吸入を行なった際は、必ず操作ノブＢ−４
−ｂを押して内容物の攪拌を行なう。

２、ヌクレオチドの合成 アミノメチルポリスチレン樹脂−ヌクレオチド２１）　
ｍ　ｇを反応室（Ａ−１）に入れて給排気装置（Ｂ）と
接続し、前処理（樹脂の膨潤）を行なった後、ステップ
１（脱トリチル）、ステップ２（縮合）、ステップ３（
マスキング）を−サイクルとして、これを必要回数繰り
返し行なうことにより、ヌクレオチド鎖を延長していく
。

前処理（樹脂の膨潤） ジクロロメタンをあらかじめ三角フラスコ３本に取り、
それぞれＣＨ−１、ＣＨ−２、ＣＨ−３と印してオ＜（
ジクロロメタンはＣＨ２Ｃｌ２と表示）。

（イ）　Ｃ）Ｌ−３よりＣｆ（２Ｃ１２を１ｍｌ吸入し
てから排出する（以下この操作を法華と略す）。この操
作を２回行なう。

（ロ）　ＣＨ−３よりＣＨ２Ｃｌ２を１ｍｌ吸入して加
分放置し、排出する。

ステップ１（脱トリチル） （イ）　３チＴＣＡ含有ＣＨ２Ｃ１２浴液（以下３％Ｔ
ＣＡ　／ＣＨ２Ｃ１２と略す）を吸入して１分間放置し
、排出する。

（ロ）　ＣＨ−２のＣＨ２Ｃ１２より３回洗浄を行なう
。

（ハ）　３チＴＣＡ／ＣＨ２Ｃ１２で着色（橙〜黄色）
が見られなくなるまでヒ）、（ロ）の操Ａり返し行なう
（ただし、１回目より後はＴＣＡ処理時間を１υ秒とす
る）。

に）ＣＨ−３のＣＨ２Ｃｌ２で３回洗浄を行なう。

ステップ２（縮合） 無水ピリジン（以下ａｂｓ　Ｐｙと略す）を三角フラス
コ３本に取り、それぞれＰｙ−１、Ｐｙ−２、Ｐｙ−３
と印し、ゴム栓でふたをしておく。

げ）　Ｐｙ−１０ａｂｓ　Ｐｙで３回洗浄を行なう。

（ｏ）　Ｐｙ−２０ａｂｓ　Ｐｙで３回洗浄を行なう。

（ハ）Ｐ７−３のａｂｓ〜で３回洗浄を行なう。

に）置素ボンベからのゴム管を接続口Ｂ−２−ｇに接続
し、ニードルバルブＢ−２−ｅを開き、３００ｍ１．／
分の流速で１０分間通気する。

Ｉｔ）　ａｂａ　Ｐｙ　０．３　ｍｌに溶かしたＭＳＮ
Ｔ　’Ａ）　ｍｇと乾燥ヌクレオチＰ（モノマー　２０
　ｒｒｇ　、ダイ−ｑ　−Ｚ５　ｍｇ　Ｓトリマー３５
．ｍｇ　）　との溶液を吸入し、ゴムキャップＡ−６を
はめて室温で３０分放置した後、排出する。

（へ）ステップ２の（イ）、（ロ）、（ハ）を繰り返す
。

ステップ３（マスキング） （イ）　１％ＤＭＡＰ含有無水ピリジン浴液（１チＤＭ
ＡＰ　／　ａｂｓ　Ｐｙ　）と、無水酢酸（ＡＣ２０）
との９対１浴液（ｖ／ｖ　）を１ｍｌ　吸入し、ゴムキ
ャップＡ−６を取りつけ、室温で５分間放置し、排出す
る。

呻）ステップ２の（イ）、（ロ）を繰り返す。

（ハ）ＣＨ−１のＣＨ２Ｃ１２で３回洗浄を行なう。

に）Ｃ）Ｉ−３のＣＨ２Ｃ１３で３回洗浄を行なう。

実　験　例 実験例１ ＤＭＴ−ｄＡ−（Ｎ−Ｂｚ）−８ｕｅ　−ＡＰ　（バイ
オサーチ）３０ｍｇを反応室（Ａ−１）に入れ、給排気
装置（Ｂ）と接続し、操作マニュアルに従がってヌクレ
オチドブロック（ＡＧｌＧＣ，ＧＴ、ＴＧのダイマー）
を２５　ｍ　ｇずつ縮合させて、ＴＧ−ＧＴ−ＧＣ−Ａ
Ｇ−Ａ−樹脂を合成した。反応終了後、樹脂を取り出し
て乾燥させ、０．５Ｍピコリンアルドキシム−テトラメ
チルグアニジンのピリジン−水（９：１）ｍ液３００μ
ｌ　を加えて、３７℃で一夜放置した。次に、漉アンモ
ニア水（４ｍｌ）を加え、５５℃で一佼放置後、濾過を
行なって樹脂を除去し、Ｐ液を水に醍解し、エーテルで
抽出を行なった（脱保護）。次に、セファデックス■Ｇ
−５０を用いてゲル濾過（浴出液は５０ｍＭ）リエチル
アンモニウムパイカーデネート、ｐＨ７，５）を行なっ
た。この際、各フラクションの２６０ｎｍの吸収を測定
し、最初に溶出したピークを集めて高速液体クロマトグ
ラフィー（）］、ＰＬＯ）を行ない、ついで８チ酢（９
２ｍ　ｌ中で室温１０分間反応させて５′−水酸基体と
して目的とする合成フラグメントを分取した。なお、カ
ラムはμＢｏｎｄａ−ｐａｋ　Ｃ１８（逆相）を用いた
。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列の確認は、レ
イ・ウーらの方法により行なって、ＴＧＧＴＧＣＡＧＡ
であることが確認できた（第４図）。また、反応の１サ
イクルの平均収率は、いずれも９０％以上であった。

実験例２ ＤＭＴ−ｄＧ−（Ｎ−ｉＢｕ）−８ｕｅ−Ａｐ　（バイ
オサーチ）３０ｍｇを反応室（Ａ−１）に入れて給排気
装置（Ｂ）と接続し、同様に操作マニュアルに従がって
、ヌクレオチドブロック（ＣＣ，ＴＣ，ＣＡＸＴＡ、Ｃ
Ａ、ＡＧ。

ＧＡＸＡＡＸＣＧ、ＴＴＳＡＧ、ＧＧ　のダイマー）を
２５ｍｇずつ縮合させて、ＧＧ−ＡＧ−ＴＴ−ＣＧ−Ａ
Ａ−ＧＡ−ＡＧ−ＣＡ−ＴＡ−ＣＡ−ＴＣ−ＣＣ−Ｇ−
樹脂を合成した。

反応終了後、樹脂を取り出して乾燥させ、０．５Ｍピコ
リンアルドキシム−テトラメチルグアニジンのピリジン
−水（９：１）浴液３００μｌ　を加えて１３７℃で一
夜放置した。次に、濃アンモニア水（４ｍｌ　）を加え
、５５℃で一夜放置後、濾過を行なって樹脂を除去し、
Ｆ液を水に＃解し、エーテルで抽出を行なった（脱保護
）。次に、セファデックス■Ｇ−５０を用いてグル濾過
（溶出液は５０ｍＭ　）リエチルアンモニウムパイカー
ゼネート、ｐＨ７，５）を行なった。この際、谷７ラク
シヨンの２６０　ｎｍの吸収を測定し、最初に浴出した
ピークを集めて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
”ｌを行ない、ついで８％酢酸２ｍｌ　中で室温１Ｏ分
間反応させて５′〜水酸基体として目的とする合成フラ
グメントを分取した。なお、カラムばμＢｏｎｄａｐａ
ｋＣ１８（逆相）を用いた。合成したオリゴヌクレオチ
ドの塩基配列の確認は、マクサム・ギルバート法により
行なって、ＧＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧＡＡＧＣＡＴＡＣＡ
ＴＣＣＣＧ　であることを確認できた（第５図）。

なお、５′−末ソ１ｍｌのＧは検出することができない
。

また、反応の１ザイクルの平均収率は、いずれも（１０
チ以」−であった。

【図面の簡単な説明】

第１〜２図は、それぞれ本発明核酸合成器の反応器およ
び給排気装置を示す仰」断面図である。 第３図は、本発明核酸合成器の給排気装置を示す説明図
である。 第４図は、レイ・ウ−らの塩基配列決定法に従って行な
ったオートラジオダラムの模写図である。 第５図は、マクサム・ギルバート法により行なったオー
トラジオダラムの模写図である。 Ａ−１・・・反応室、Ａ−２・・・フィルター取付座、
Ａ−３・・・フィルター、Ａ−４・・・給排液管、Ｂ−
１・・・正負圧発生装置、Ｂ−１−ｂ・・・ピストン、
Ｂ−２・・・ピストン駆動棒部材、Ｂ−２−ａ・・・突
起、Ｒ−４−ａ・・・係止爪、Ｈ−４−ｂ・・・操作ノ
ブ。 出願人代理人　猪　股　消 ｂ　２　圀 ■［８−Ｏ−Ｃ ５３図 ｂ４　〆 ら　５　図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、看脱自在に連結された下記の部材ＡおよびＢからな
   ることを特徴とする、固体支持体粒子上での反応によっ
   て核酸を合成するための核酸合成器。 （Ａ）　下記の部材（Ａ−１）〜（Ａ−４）からなる反
   応器。 （Ａ−１）　該固体支持体粒子を収容して該反応を行な
   わせるに十分な容積を有する円 筒からなる反応室、 （Ａ−２）反応室（Ａ−１）の下方への延長部をなしか
   つ反応室（Ａ−１）の下部より内径の小さい、該固体支
   持体粒子保持用フィ ルターを取伺けるための取付座、 （Ａ−３）　取付座（Ａ−２）に取付けられた、該固体
   支持体粒子保持用フィルター、 （Ａ−４）　反応室（Ａ−１）のさらに取付が（Ａ−２
   ）の下方への延長部をなす、反応室 （Ａ−１）へ該反応に関与する液相材料を出入させるた
   めの給排液管、 （Ｂ）　下記の部材（Ｂ〜１）〜（Ｂ−４）からなる給
   排気装置。 （Ｂ−１）　上記反応室（Ａ−１）の上部において該反
   応室と連通すべきシリンダー（Ｂ−１−ａ）とその内部
   に設けられたピストン 棒付きピストン（Ｂ−１−ｂ）とからなる正負圧発生装
   置、 （ＢＬ２）　ピストン（Ｂ−１−ｂ）のピストン棒の延
   長としての、ピストン駆動用棒部材、 （Ｂ−４）　バネ部材（Ｂ−３）によって賦勢される棒
   部材（Ｂ−２）の退行を所定位置に停止させる副送機構
   。たｙし、この副送機 構は、棒部材（Ｂ−２）に設けられた突起（Ｂ−２−ａ
   ）とこれと係合する停止装置（Ｂ−４−ａ　）とからな
   り、突起（Ｂ−２−ａ）と停止機構（Ｂ−４−ａ）とは
   棒部材（Ｂ−２）の上記停止位置からの更なる退行を許
   容 ししかも更なる退行の後に再び上記停 止Ｅ位置への復帰を許容するよう構成されたものである
   。 ２、停止機構（Ｂ−４−ａ）が楔形頂部を持つ棒状部材
   からなっていて（１）その軸が棒部材（Ｂ−２）が退行
   するときの突起（Ｂ−２−ａ）の先端か描く軌跡に対し
   て直角となるようにかつ（２）該頂部が該軌跡を常に横
   切って突出するようにバネによって賦勢されているが該
   軌跡を横切らない位置まで手動で後退させ５るよ５に配
   設されたものであり、しかもこの楔形頂部の形状が（１
   ）退行してくる突起（Ｂ−２−ａ）に対してはその進行
   を停止させるが、（２）該突起（Ｂ−２−ａ）の更なる
   退行後の復帰時には該突起（Ｂ−２−ａ）によって前記
   軌跡を横切らない位置まで押戻されて、該突起の停止位
   置への復帰を保証するように定められている、特許請求
   の範囲第１項記載の核酸合成器。 ３、突起（Ｂ−２−ｇ）が、棒部材（Ｂ−２）に嵌装さ
   れたスリーブに設けられており、該スリーブがネジによ
   って棒部材との間の相対位置を変えられるようになって
   いるものである、特許請求の範囲第１〜２項のいずれか
   に記載の核酸合成器。 ４、ピストン棒およびその延長としての棒部材（Ｂ−２
   ）が、ピストンを介してシリンダー内部と本合成器の外
   界と連通ずる貫孔をその芯部に有する、特許請求の範囲
   第１〜３項のいずれか１項に記載の核酸合成器。