JPS6118013Y2 - - Google Patents

Description

【考案の詳細な説明】 この考案はDNA等合成装置に関し、特に、異
種のDNAもしくはRNAを並列して合成すること
が可能なDNA等合成装置を提供する。

DNAの合成法として、いわゆるホスホジエス
テル法、ホスホトリエステル法、ホスフアイト法
と改良発展がなされ、さらにこれらの方法を利用
し、固形支持体を用いる固相合成法が各種の利点
を有することから多用されるに到つている。そし
てこれらの方法によつてDNA合成を行う装置も
各種提案されている。

一方、多種の遺伝子の混合物から成る特定のタ
ンパク質を生産する遺伝子を分離する手法とし
て、そのタンパク質のアミノ酸配列からその遺伝
子の塩基配列を推測し、その塩基配列と相補的な
塩基配列を持つDNAを合成し、これにマークを
つけて混合物に加え、合成したDNAを目的遺伝
子に結合させたのちマークを目印にして、その目
的遺伝子をつり上げる手法がある。

ところがタンパク質の１つのアミノ酸に対して
多くの場合複数の遺伝暗号が存在し、その結果遺
伝子の塩基配列に数多くの可能性が生じる。この
場合には、可能性のある全てまたは一部のDNA
を合成し混合して用いるのが普通である。

しかし、従来のこの種の装置では、同時に多種
のDNAを合成することができなかつたので、複
数台のこの種の装置を必要とするか、もしくは１
台で順に異つたDNAを合成しなければならず、
非常に不便であつた。

この考案の考案者は、種々検討の結果、公知の
DNA等合成装置を改良することに成功した。

かくして、この考案によれば、反応器に試薬溶
液等供給手段が接続され、複数の試薬溶液等が所
定の手順で反応器に供給されてDNA等の合成が
行われる装置において、反応器を複数個具備する
とともに、それら反応器と試薬溶液供給手段とを
間に供給流路切換手段を介設して接続し、これに
より複数の反応器で並行してDNA等を合成可能
にしてなるDNA等合成装置が提供される。

この考案の装置の主な特徴は、(i)複数個の各々
独立の反応器を具備しており、それらの反応器で
並列して合成を行えること、および(ii)試薬溶液の
供給などは供給流路切換手段で流路を切換えて対
象とする反応器を選択して行うよう構成されてい
ることにある。

以下、図に示す実施例に基いて、この考案を詳
説する。ただし、これによりこの考案が限定され
るものではない。

第１図に示す１は、この考案の一実施例であ
り、ホスホトリエステル法によるDNA自動合成
装置である。

反応器２Ａ，２Ｂ，２Ｃは内径８mm、高さ10mm
の円筒状の本体3A，3B，3Cの上方にすりばち状
フランジ４Ａ，４Ｂ，４Ｃを設けた容器である。
すりばち状フランジ４Ａ，４Ｂ，４Ｃには、多数
の試薬溶液等供給用のノズルが挿着された栓５
Ａ，５Ｂ，５Ｃが装着されている。そこで、本体
３Ａ，３Ｂ，３Ｃの頭部開口が試薬溶液等供給口
６Ａ，６Ｂ，６Ｃとなる。本体３Ａ，３Ｂ，３Ｃ
の内部下方にはガラスフイルタのごときフイルタ
７Ａ，７Ｂ，７Ｃが嵌着され、さらに底部には排
液口８Ａ，８Ｂ，８Ｃが設けられている。フイル
タ７Ａ，７Ｂ，７Ｃは、ポリスチレン、シリカビ
ーズのごとき支持体Ａ，Ｂ，Ｃを載置できる（透
過させない）もので、試薬溶液、溶媒、ガスを透
過させるものである。フイルタ７Ａ，７Ｂ，７Ｃ
の上部空間が反応部９Ａ，９Ｂ，９Ｃであり、約
450μの容積の空間である。１０Ａ，１０Ｂ，
１０Ｃは排気弁、１１Ａ，１１Ｂ，１１Ｃは排液
弁である。

窒素ガスの供給流路切換手段１２は、３つの弁
１４，１５，１６で構成され、反応器２Ａ，２
Ｂ，２Ｃに窒素ガスを供給する。窒素ガスは塩化
カルシウムのごとき乾燥剤６６で乾燥されてい
る。

１３は、洗浄用溶媒等の供給流路切換手段であ
り、３つの切換コツク１７，１８，１９にて構成
され、洗浄用溶媒等を反応器２Ａ，２Ｂ又は２Ｃ
に供給可能にする。洗浄用溶媒等とは、詳しく
は、洗浄用溶媒のピリジン３５、洗浄乾燥用溶媒
のテトラヒドロフラン〔THF〕３６、洗浄用溶
媒のイソプロパノールと塩化メチレンの混合液３
７、保護基脱離剤溶液のイソプロパノールと塩化
メチレンの混合溶液に臭化亜鉛を溶解した溶液３
８、マスキング用試薬溶液の無水酢酸とピリジン
の混合液３９、およびマスキング用試薬のジメチ
ルミノピリジンのピリジン溶液４０である。これ
らは窒素ガス圧によつて送液される。

ヌクレオチド試薬溶液等供給流路切換手段１
３′は、３つの切換コツク２０，２１，２２にて
構成されており、アデニン、シトシン、グアニ
ン、チミンをそれぞれ塩基にもつ４種のヌクレオ
チド試薬溶液４１，４２，４３，４４、もしくは
縮合剤溶液であるメシチレンスルホニル−３−ニ
トロトリアゾリド（MSNT）のピリジン溶液４５
を、反応器２Ａ，２Ｂ又は２Ｃに供給可能にす
る。これらの試薬溶液４１〜４５は各々シリンジ
ポンプ５１〜５５にて所定量だけ供給される。

シリンジポンプ５１〜５５のプランジヤは、た
とえばパルスモータ６１とネジ軸６２とナツト６
３とから構成されるプランジヤ駆動機構５６〜６
０によつて駆動される。

６５はマイクロコンピユータのごとき制御回路
であつて、弁１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ，１１Ａ，
１１Ｂ，１１Ｃ，１４，１５，１６，３３，３
４、切換コツク１７〜３２，４６〜５０、および
プランジヤ駆動機構５６〜６０の作動を制御す
る。また操作卓４６を介してオペレータと対話を
行う。

DNA合成に際しては、まず各反応器２Ａ，２
Ｂ，２Ｃの栓５Ａ，５Ｂ，５Ｃをはずして、
DNA分子の末端部分のみを結合した支持体Ａ，
Ｂ，Ｃを入れる。この量は、たとえば支持体Ａ，
Ｂ，Ｃがポリスチレン粉体の場合には10mg〜50mg
が好適である。栓５Ａ，５Ｂ，５Ｃを元どおりに
戻した後、各反応器２Ａ，２Ｂ，２Ｃに入れた支
持体Ａ，Ｂ，Ｃの量や各反応器２Ａ，２Ｂ，２Ｃ
で合成すべき目的DNAを塩基配列などを操作卓
６４を介して制御回路６５に入力し、ついでスタ
ート指令を入力する。

これにより制御回路６５は、弁や切換コツクな
どを作動して、反応器２Ａ，２Ｂ，２Ｃでそれぞ
れ並行して目的DNAの合成を行う。

すなわち、初期状態では全ての弁は“閉”であ
り全ての切換コツクは図中破線の流路位置になつ
ているが、スタート指令によつて制御回路６５
は、まず切換コツク１７および２４を図中実線の
流路位置としかつ弁１０Ａを開く。これによつて
洗浄用溶媒３７が反応器２Ａに供給される。所定
時間後、切換コツク１７，２４および弁１０Ａを
初期状態に戻し、しばらくして弁１１Ａおよび１
４を開く。これによつて洗浄用溶媒３７が反応器
２Ａから排液される。所定時間後、弁１１Ａ，１
４を閉じる。この動作を数回繰返して、第２図の
７０に示す洗浄処理を行う。以下同様に反応器２
Ａにおいて第２図の７１〜７５を行う。

次に切換コツク１８，２４および弁１０Ｂ，１
１Ｂ，１５を作動し、反応器２Ｂにおいて第２図
の７０の処理を行う。また同様に反応器２Ｂにお
いて第２図の７１〜７５の処理を行う。

このように反応器２Ｂにおいて第２図の７０〜
７５の処理を行うのと同時に、制御回路６５は切
換コツク２８〜３１のいずれか１つと切換コツク
２０とを図中実線の流路位置とする。たとえば塩
基としてアデニンをもつヌクレオチドがDNAの
塩基配列として次に必要ならば、切換コツク２８
〜３１のうち２８を図中実線の流路位置とし、切
換コツク４６およびプランジヤ駆動機構６６を作
動してヌクレオチド試薬溶液４１を所定量だけ反
応器２Ａに供給する。ヌクレオチド試薬溶液供給
後、切換コツクを元に戻し、次に切換コツク３２
および２０を図中実線の流路位置とし、シリンジ
ポンプ６０にて縮合剤溶液４５を所定量だけ反応
器２Ａに供給する。

ヌクレオチド試薬溶液と縮合剤溶液の供給量
は、それらの合計量が支持体を膨張するのに充分
な最低量となるように制御される。具体的にはた
とえば支持体がポリスチレン粉体の場合には支持
体１ｇ当りに、ヌクレオチド試薬溶液約３ml、縮
合剤溶液約３mlとする。これによつて支持体は約
５〜７倍に膨潤する。言うまでもなく、これら最
低量の試薬溶液中に充分に試薬を含むように濃度
調整しておくことが必要である。

反応器２Ｂにおいて第２図７０〜７５の処理が
終了すると、洗浄用溶媒等供給流路切換手段１３
は次に反応器２Ｃを選択し、同様に第２図７０〜
７５の処理を行う。このとき同時にヌクレオチド
試薬溶液等供給流路切換手段１３′は反応器２Ｂ
を選択し、第２図の７６の処理を行う。

第２図の７７〜８０の処理についても同様であ
り、結局このようにして、反応器２Ａ，２Ｂ，２
Ｃでそれぞれ並行してDNA合成が行われる。

さて、上記実施例のDNA自動合成装置１で
は、複数の反応器２Ａ，２Ｂ，２Ｃにおいて並行
してDNA合成が可能になる利点の外に次のよう
な利点をもつている。

まず、上記装置１では、反応器２Ａ，２Ｂ，２
Ｃの反応部９Ａ，９Ｂ，９Ｃを小型化すると共
に、フイルタ７Ａ，７Ｂ，７Ｃの上に支持体Ａ，
Ｂ，Ｃを載置し、上方から試薬溶液等を供給し、
底部から排液するように反応器２Ａ，２Ｂ，２Ｃ
を構成している。そこで排液弁１１Ａ，１１Ｂ，
１１Ｃを閉じたまま試薬溶液等を上方から供給す
れば、その試薬溶液等は支持体Ａ，Ｂ，Ｃに含ま
れてこれを膨潤すると共にフイルタ７Ａ，７Ｂ，
７Ｃより上の反応部９Ａ，９Ｂ，９Ｃ内にとどま
つて下方へ落ちない。従つて、供給した全ての試
薬溶液が反応に参加し、デツドスペースに溜まる
ものが無くなる。この結果、DNAの微量合成が
可能となり、供給量は最低量で充分になり、また
反応を促進するために反応器を振盪するなどの混
合・接触操作も無用になつている。またこの装置
１は、新たなヌクレオチドを連結する反応の前に
反応器２Ａ，２Ｂ，２Ｃ内をTHF３６で洗浄乾
燥すると共に乾燥ガスでブローして短時間で反応
器２Ａ，２Ｂ，２Ｃ内を完全乾燥できるように構
成されている。この結果、縮合反応を阻害する水
分を完全に除去できるので反応効率が下がらず、
余分な試薬を必要としない。

変形実施例としては、第２図７１の反応時間が
10分位かかるのでこの間に他の反応器への試薬溶
液供給等の動作を行わせるようにしたもの、同じ
く第２図７８の反応時間が10分位かかるのでこの
間に他の反応器への動作を行わせるようにしたも
のなどが挙げられる。

また、窒素ガス供給流路切換手段１２の構成を
洗浄用溶媒等供給流路切換手段１３のように切換
コツク方式としてもの、あるいは逆に洗浄用溶媒
等供給流路切換手段１３およびヌクレオチド試薬
溶液等供給流路切換手段１３′の構成を窒素ガス
供給流路切換手段１２のように並列弁方式にした
ものが挙げられる。

さらに反応器２をロート状にしたもの、樽状に
したもの、また反応器部の内容積を80μ〜800
μの間で変化したものが挙げられる。また固体
支持体としてKel−Fg スチレン、シリカゲル、
ポリアクリルモリフオリドなどを用いたものが挙
げられる。これらの支持体は粒径30〜300μｍ程
度のものが好ましい。

他の実施例としては、ホスホモノトリアゾリド
法やホスフアイト法、あるいはホスホジエステル
法によるDNA等合成装置にこの考案を適用した
ものが挙げられる。

以上の説明から理解されるように、この考案の
DNA等合成装置によれば、複数の反応器で並行
してDNA等の合成を行うことができるので、
DNA等の合成能力が大幅に向上し特に異種の
DNA等を並行して合成することが可能になる。
このことが多種の遺伝子の混合物から特定の遺伝
子を分離する際に大変有用であることは先述した
とおりである。

さらに、長鎖のDNA（たとえば鎖長200）を合
成する場合に、収率と時間の観点から、これを連
続して合成することは通常行われず、鎖長20位の
DNAを複数個合成し、これらを連結することが
行われるが、この考案の装置によれば複数個の
DNAを並行して合成できるので、この場合にも
大変有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの考案のDNA等合成装置の一実施
例であるDNA自動合成装置の構成説明図、第２
図は同装置の動作のフローチヤート図である。 １……DNA自動合成装置、２Ａ，２Ｂ，２Ｃ
……反応器、１２……窒素ガス供給流路切換手
段、１３……洗浄用溶媒等供給流路切換手段、１
３′……ヌクレオチド試薬溶液等供給流路切換手
段。

Claims (1)

1. 【実用新案登録請求の範囲】 反応器に試薬溶液等供給手段が接続され、複数
   の試薬溶液等が所定の手順で反応器に供給されて
   DNA等の合成が行われる装置において、 反応器を複数個具備するとともに、それら反応
   器と試薬溶液供給手段とを間に複数の２方切換コ
   ツクを介設して接続し、これにより複数の反応器
   で並列してDNA等を合成可能にしてあるDNA等
   合成装置。