JP2002539913A

JP2002539913A - 異なる比重の液相の分離ならびにフッ素含有相有機合成のための装置および方法

Info

Publication number: JP2002539913A
Application number: JP2000595781A
Authority: JP
Inventors: マイケル・レブル
Original assignee: イルミナインコーポレイテッド
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2002-11-26
Also published as: EP1154848A2; EP1154848B1; CA2361223A1; AU2743100A; WO2000044491A3; AU771720B2; WO2000044491A2

Abstract

(57)【要約】有機化合物の大規模ライブラリーまたはメガアレイの高処理量コンビナトリアル有機合成または並行抽出において有用な、混合しないあるいは不完全に混合する液体の層を分離するための単純かつ有効な装置および方法を開示する。当該装置および方法は、コンビナトリアル有機合成または精製（抽出）のための自動、ロボット化または手動のシステムの一部として有用である。好ましい具体例において、マイクロタイタープレート型アレイの反応容器に適合した、混合しないかあるいは不完全に混合する液体の層を分離するための装置および方法が開示される。遠心分離に基づく液体除去のもう１つの適用例は、修飾された基質の生物学的アッセイまたは合成においてプレートを洗浄するためのものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本願は、１９９９年１月２８日出願の米国出願第６０／１１８３７７号の継続
出願である。

【０００２】発明の分野本発明は、化学合成、分析、および生物学的スクリーニングのためのデバイス
および方法に関する。より詳細には、本発明は、高処理量有機合成における、異
なる比重の混合しない、あるいは不完全に混合する液相の分離、あるいは容器か
らの液体の除去（洗浄）のための単純で効果的な装置および方法に関する。本発
明は、自動または手動手順の一部として、有機分子の高処理量コンビナトリアル
合成に特に適する。

【０００３】発明の背景有機分子の固相合成は、ライブラリーおよび化合物メガアレイの調製のための
一方法であり、現在、新たな薬剤または医薬リード化合物、すなわち、薬理学的
に目的とする特定の生物学的活性を示す化合物を見出すためのスクリーニングに
適用されており、目的とする特定の生物学的活性がヒトを含む動物への投与に適した薬理学的および毒物学的特性を有する薬剤化合物の選択および合成のための出
発点として役立ちうる。

【０００４】フッ素含有合成（fluorous synthesis）は固相合成と類似の原理に立脚する。
フッ素含有合成において、ある種の反応成分（出発物質、試薬、または生成物）
は、それが高フッ素含量であると優先的にフッ素原子含有相に保持される。通常
には、フッ素含有相は比重が高く、それゆえ、多相系において低比重相と分離さ
れうる。手動合成にはいくつかの比較的単純な試薬添加操作、インキュベーショ
ンおよび液相の分離の繰り返しが必要である。この合成プロセスの特徴は合成を
自動化に適したものとしている。

【０００５】固相合成を用いるコンビナトリアル合成のための自動化装置のいくつかの設計
が、特許および非特許文献中に出現した。しかしながら、濾過による単純な分離
原理が適用できないので、フッ素含有合成用に設計された装置はなかった。

【０００６】自動化装置の生産性は、ピペッティングあるいは貯蔵容器からの直接デリバリ
ーにより試薬が添加される使い捨て反応容器（マルチタイタープレートまたは試
験管アレイのごとき）の使用により劇的に改善されうる。最適貯蔵ビヒクルは科
学反応物質等に対して不活性な材料でできたシリンジ様装置、例えば、ガラスシ
リンジであり、溶液を大気に触れさせずに貯蔵でき、同時にデリバリー機構とし
ても役立ちうる。米国特許出願第０８／８１５９７５号参照。分離された層の表
面上から吸引することにより上層を除去することに基づくもう１つの方法は１０
０本までの吸引ニードルのアレイに限られる（固相合成における類似の状況につ
いては米国特許出願第０８／８１５９７５号参照）。本願は、ポリプロピレンメ
ッシュパケットにおける樹脂の置換およびこれらのパケットの開口部からの液体
の除去、あるいは遠心分離による多孔性織物様材料からの液体の除去、あるいは
傾いたプレートを遠心分離することによる固相からの液相の除去について記載さ
れた米国特許第５２０２４１８、５３３８８３１、５３４２５８５号、および米
国特許出願第０８／８１５９７５号に対する改良である。遠心分離による液体の
分離は記載されており、いくつかの出版物の主題となっている（The book "Aspe
cts of the Merrifield Peptide Synthesis" by Christian Birr in the series
Reactivity and Structure Concepts in Organic Chemistry vol. 8 K. Hafner
, J.-M. Lehn, C. W. Rees, P. von Rague, Schlyer, B. M. Trost, R. Zahradn
ik, Eds., Spronger-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1978およびドイ
ツ特許出願Ｐ２０１７３５１．７、Ｇ．７０１３２５６．８，１９７０参照）。
これらの文献は、周囲に濾過材を装備した同心円容器を軸を中心に回転させて該
容器中の固相のスラリーから液体を除去するための遠心分離の使用を記載してい
る。ＷＯ９９／２５４７０も参照（出典明示により本明細書に一体化させる）。

【０００７】「ポケット」（そこからは遠心力により物質が除去されない）を創設すること
によって軽い方の液体層を除去することによる、異なる比重の２つ（またはそれ
以上）の混合しない、あるいは不完全に混合する液体の分離に関する先行技術は
ない。複数の生成物が並行して抽出される状況（例えば、コンビナトリアル合成
の生成物の並行精製）においてこの方法を使用することができる。しかしながら
、有機分子のフッ素含有層合成の間に液相を分離するための単純で効果的な手段
、特に、かかる合成のための自動的方法における使用に適した方法が必要である
。

【０００８】さらにそのうえ、「逆傾斜（reverse tilt）」（回転軸から離して傾斜してい
る）の状態で取り付けられたウェルのアレイを遠心分離することによる複数の容
器からの完全な液体の除去は、表面に結合した試薬または細胞の高速繰り返し洗
浄が必要な生物学的アッセイにおいて用途が見出され、反応容器の表面に対して
直接合成が行われる場合に用途が見出される。

【０００９】発明の概要上記目的によれば、本発明は、液体または液体混合物を入れた複数の反応容器
を遠心ローターの周囲のホルダー中に置くことを特徴とする、反応容器からの液
相の除去のための方法を提供する。ホルダー、よって反応容器は、回転軸から離
れた傾いた位置に保持される。ついで、容器から液体が排出される速度でロータ
ーを回転させる。固相有機合成中、例えば、ペプチドまたは核酸の合成中にこの
除去方法を用いることができる。これらの工程を繰り返してもよい。同様に、反
応容器がマイクロタイタープレート中に含まれていてもよく、あるいは反応容器
がマイクロタイタープレートであってもよい。

【００１０】容器から排出された液体を集め、保持するに十分な容量を有するホルダー中の
収集ポケット中に排出された液体を集めることができ、あるいは遠心分離機の中
または外側の廃液リザーバー中に集めることもできる。

【００１１】さらなる態様において、本発明は、容器自体に連結された第１の構成ブロック
（boulding block）を含む反応容器を用意することを特徴とする、化合物の合成
方法を提供する。ついで、遠心ローター周囲のホルダーに容器を置く。第１およ
び第２の構成ブロックが連結される条件下で第２の構成ブロックを容器に付加し
、容器から液体が排出される速度でローターを回転させる。当該手順を繰り返す
さらなる工程または洗浄工程を加えてもよい。構成ブロックはアミノ酸およびヌ
クレオチドを含んでいてもよい。

【００１２】さらなる態様において、本発明は、液体を入れた複数の反応容器を、遠心ロー
ターの周囲のホルダー中に置くことを特徴とする、混合しない、あるいは不完全
に混合する少なくとも２つの液体の分離方法を提供する。ついで、多層系の下層
が容器の「ポケット」に保持され、上層が容器から排出される速度でローターを
回転させる。

【００１３】さらなる態様において、本発明は、反応容器を回転軸から傾いた位置に保持す
るように設計されたローターと、反応容器から排出された液体を保持するための
遠心分離機に接続された廃液リザーバーとを含む遠心分離機を含む装置を提供す
る。１の具体例において、廃液リザーバーは管によって遠心分離機に接続される
。装置は液体分配システムおよびコンピュータープロセッサーを含んでいてもよ
い。

【００１４】５．発明の詳細な記載開示内容を限定するためではなく明確にするために、本発明の要素の好ましい
実施態様を説明する図に関して本発明の詳細な記載をここに提供する。しかしな
がら、本発明は、提供された開示内容の全体から当業者に明らかである類似の方
法で類似の機能を果たすこれらの要素の別の実施態様も包含する。さらに、本明
細書に記載した全ての参考文献は、出典明示によりそれらの全体を本明細書の記
載とする。

【００１５】本発明は、並行抽出法および／またはフッ素含有相有機合成法に用いられる、
密度が異なる２種類（またはそれ以上）の不混和性または部分混和性液体の分離
のための簡単で能率的な手段、例えば、液体の上層（単数または複数）を下層か
ら取り出す手段に基づいている。本発明の一の実施態様において、フッ素含有相
有機合成プロトコールは、マイクロタイター型プレートのような広範囲に利用可
能な使い捨て反応容器アレイを使用する。本発明の別の実施態様において、該合
成プロトコールは、軸のまわりを回転して多相系の下層を保持する「ポケット」
を創造する内向リップ（lip facing inward）を有する容器を使用する（図２を
参照のこと）。しかしながら、本発明によると、遠心器の外周上に傾斜位置で置
くことができる容器、または複数の容器からなるアレイまたは複数の容器からな
る複数のアレイを本発明の方法に使用することができる。並行抽出法および／ま
たはフッ素含有相有機合成法の間に密度が異なる２種類（またはそれ以上）の不
混和性または部分混和性液体を分離する本発明の方法は、（１）傾斜位置で遠心
ローターの外周上に、１つの反応容器、または複数の反応容器からなるアレイ、
例えば、複数の反応ウェルからなる１つのアレイを有するマイクロタイタープレ
ートを位置決定すること（ここで、該容器（複数も可）は、液相の多層系を収容
している）；および（２）下層が容器の「ポケット」を満たし、上部液層が該容
器から排出されるような速度で遠心器のローターを回転させることを含む。本発
明の一の実施態様において、ローターは、回転軸に最も近い反応容器に対応する
半径に対する遠心力が重力よりも有意に大きくなり、かつ、下層が容器の「ポケ
ット」を形成し、上層が容器から排出されるような速度で回転する。「ポケット
」の容量は、（ｉ）傾斜度、（ｉｉ）回転速度、および（ｉｉｉ）回転軸から特
定の反応容器までの距離により決定される。これらのファクターの適当な組合せ
は、ポケット中に保持される残存液体の容量を決定し、したがって、上層除去の
完全性を決定する。しかしながら、反応ブロックの多容器集成装置（例えば、マ
イクロタイタープレート）における全ての反応容器が同程度に上部液層の除去を
受けるのが望ましいので、遠心分離の間の反応容器の「ポケット」中の液面の角
度ができる限り回転中心に対して９０度に近いことが重要である。一の実施態様
において、除去された液相は、遠心器の壁上に回収される。別の実施態様におい
て、除去された液相は、遠心ローターの外周に取り付けた「収集ポケット」また
は一連の「収集ポケット」中に回収される。本発明の装置は、１つの反応容器ま
たは複数の反応容器からなるアレイ、例えば、マイクロタイタープレートを遠心
器のローターに取り付けるのに適したホルダーを含んでおり、ここで、該ホルダ
ーは、ホルダーの片側に沿って適所に置いた「収集ポケット」と称されるくぼみ
または溝を１個またはそれ以上含んでおり、該収集ポケットは、ホルダーおよび
取り付けられた反応容器が遠心ローターにより回転させられた場合に、反応容器
、例えば、マイクロタイタープレートのウェルから排出される液体を回収および
保持するのに十分な容量を有する。本発明によると、該ホルダーは、１個または
個々のマイクロタイタープレートまたは複数のマイクロタイタープレートを保持
することができ、ここで、各プレートは、複数の容器からなるアレイを含んでい
る。１個またはそれ以上のホルダーを遠心器のローターに取り付けることができ
る。別の実施態様において、本発明の装置は、（ａ）並行抽出法および／または
フッ素含有相有機合成法に適した複数の反応容器からなるアレイを傾斜位置で回
転させることができる遠心器；（ｂ）液体分配装置；および（ｃ）液相を添加し
、遠心分離により反応容器から上層液相を除去する命令プログラムを該プログラ
ムに従って処理するコンピューターを含む並行抽出法および／またはフッ素含有
相化学合成法用の自動集積装置または系である。

【００１６】一般に、本発明の方法および装置は、コンビナトリアル化学合成法における使
用を見出す。導入のために、コンビナトリアル化学プロトコールは、最終化合物
を合成するための構成ブロックの中間化合物および／または部分合成中間化合物
への段階的な逐次付加を規定する。固相合成法において、最終化合物は、合成段
階ごとに単純な機械的手段の使用により中間化合物、部分合成中間化合物を分離
できる固相支持体に付着させて合成される。典型的な固相支持体としては、中間
化合物（または最終化合物）を共有的に付着させるために機能化され、例えば、
種々のガラス、プラスチックまたは樹脂から製造された、マイクロビーズを包含
する直径３０ミクロンないし３００ミクロンのビーズが挙げられる。

【００１７】 WO 99/25470（出典明示により本明細書の記載とする）には、固相の粒子（マ
イクロビーズ）がマイクロタイタープレートのような反応容器中に収容されてい
る、固相合成反応における遠心器の使用が開示されている。合成は、生体高分子
の「構成ブロック」の段階的な付加、次いで、反応容器から液相を排出するにも
かかわらず固相を「ポケット」中に捕らえておく遠心分離により行なわれる。

【００１８】この概念は、ディファレンシャルフェーズ（differential phase）合成反応に
も同様に適用できる。フッ素含有合成法（fluorous sythesis）について記載さ
れているが、当業者は、これらの技法が他の相依存性合成法にも同様に作用する
ことを認識するであろう。

【００１９】フッ素含有相合成法の原理は、固相合成法と非常に類似している。フッ素含有
相合成法において、試薬の１つを高フッ素含有ブロック（「フッ素含有テール（
fluorous tail）」）に付着させ、確実にこの反応体が常にフルオロカーボンを
ベースとする溶媒層中にとどまる傾向を有するようにする。いくつかのフルオロ
カーボンをベースとする溶媒が有機溶媒および水の両方と混和できず（または部
分的にしか混和できず）、この相がほとんどの場合に最高密度を有する相である
という事実により、その特性を用いて固相合成法の原理を模倣することができる
。フッ素含有相合成技法が非常に初期の開発段階であるという事実により、コン
ビナトリアル合成法に適用するための一般的なプロセスは推測することができる
だけである。フッ素含有相コンビナトリアル合成法は、以下の工程に従って進行
する。第一段階において、反応容器にフッ素含有相、例えば、ベンゾトリフルオ
リドを充填し、「フッ素含有テール」（高い割合でフッ素原子を含有するブロッ
ク）を付着した合成の第１成分（本明細書にて「第１構成ブロック」と称するこ
ともある）を全てのウェルにデリバリーする。次いで、複数の構成ブロック付加
工程を行なう（その全ては、所望の化合物を合成するように選択されたシーケン
スにおいて以下の下位工程の反復実施を含む）。まず、付加のために選択された
構成ブロック部分（例えば、「第２構成ブロック」、「第３構成ブロック」など
）を含有する十分量の溶液を、構成ブロック部分が中間化合物（フッ素含有テー
ルを有する化合物）に対してモル過剰に存在するように正確に反応容器に添加す
る。さらに反応容器に添加される活性試薬および他の試薬および溶媒により反応
を開始させ促進させる。次いで、反応容器を、制御温度で、構成ブロック付加反
応または転位を実質的に完了させるのに十分な時間、典型的には、５分間〜２４
時間インキュベートする。随意に、このインキュベーションの間に、反応容器を
断続的にかきまぜるかまたは撹拌することができる。最後に、構成ブロック付加
の最終下位工程において、次の構成ブロックの付加のために、反応液を除去し、
完全に洗浄し、フッ素含有相を水および／または有機溶媒で洗浄する（添加およ
び遠心分離による除去を繰り返す）ことにより再状態調整することにより、フッ
素含有テールに付着した中間化合物を有するフッ素含有相を含有する反応容器を
調製する。制限は、フッ素含有相が、常に、多層（多相）であり得る系の下相を
形成しなければならないということである。

【００２０】洗浄は、典型的には、洗浄溶媒の添加および除去のサイクルを３〜７回含む。
随意に、付加工程の間に、１つのフッ素含有テールに付着した複数の中間化合物
の混合物を合成するために１つの反応容器に複数の構成ブロックを添加すること
ができ、また、別法として、複数の化合物を１つの反応容器中で合成することが
できるように、個々の反応容器の内容物を合わせ、分配することができる。

【００２１】所望の数の構成ブロック付加工程の後、フッ素含有テールに付着した最終化合
物が反応容器中に存在する。最終化合物は、フッ素含有テールに付着したまま使
用でき、また、別法として、フッ素含有テールから切り離し、抽出により精製す
ることができる。フッ素含有相合成プロトコールの例は以下の参考文献にて見る
ことができる：Curran, D.P. (1996) Combinatorial organic synthesis and ph
ase separation: Back to the future. Chemtracts: Org. Chem., 9, 75-87；Cu
rran, D.P., & Hoshino, M. (1996) Stille couplings with fluorous tin reac
tants: Attractive features for preparative organic synthesis and liquid-
phase combinatorial synthesis. J. Org. Chem., 61, 6480-6481；Curran, D.P
. (1998) Fluorous synthesis: An alternative to organic synthesis and sol
id phase synthesis for the preparation of small organic molecules. Canc.
J. Sci. Amer., 4, S73-S76；Curran, D.P. (1998) Strategy-level separatio
ns in organic synthesis: From planning to practice. Angew. Chem. Int. Ed
., 37, 1175-1196；Ogawa, A., & Curran, D.P. (1997) Benzotrifluoride: A u
seful alternative solvent for organic reactions currently conducted in d
ichloromethane and related solvents. J. Org. Chem., 62, 450-451；Studer,
A., Jeger, P., Wipf, P., & Curran, D.P. (1997) Fluorous synthesis: Fluo
rous protocols for the Ugi and Biginelli multicomponent condensations. J
. Org. Chem., 62, 2917-2924；Studer, A., & Curran, D.P. (1997) A strateg
ic alternative to solid phase synthesis: Preparation of a small isoxazol
ine library by“fluorous synthesis”. Tetrahedron, 53, 6681-6696；Studer
, A., Hadida, S., Ferritto, R., Kim, S.Y., Jeger, P., Wipf, P., & Curran
, D.P. (1997) Fluorous synthesis: A fluorous-phase strategy for improvin
g separation efficiency in organic synthesis. Science, 275, 823-826。本
明細書中の全て参考文献に関して、これらは、明確に出典明示によりそれらの全
内容を本明細書の記載とする。

【００２２】したがって、好ましい実施態様において、本発明は、フッ素含有相有機合成プ
ロセスを包含する並行抽出法の間に密度が異なる不混和性または部分混和性液相
を分離する方法を提供する。当該方法は、（１）傾斜位置で遠心ローターの外周
上に、１個の反応容器、または複数の反応容器からなる１個もしくはそれ以上の
アレイ、例えば、１個またはそれ以上のマイクロタイタープレートを位置決定し
（ここで、該容器は、密度が異なる不混和性または部分混和性液相を収容してい
る）；（２）下相が容器の「ポケット」中に保持され、上部液相（複数も可）が
容器から排出されるような速度で遠心器のローターを回転させることを含む。遠
心ローターの外周に複数の容器が一列だけ置かれている場合には、重力に対する
遠心力の比は、全ての容器中の液相の分離に使用される「ポケット」の容量を決
定し、非常に低い比率（例えば、１：１）であっても、成功裏に使用することが
できる。重要なファクターは、遠心分離速度の再現性だけである。

【００２３】本発明の一の実施態様において、遠心器のローターは、回転軸に最も近い反応
容器に対応する半径に対する遠心力が重力よりも有意に大きくなり、下部液相が
容器の「ポケット」中に保持され、上部液相（複数も可）が容器から排出される
ような速度で回転する。「ポケット」の容量は、（ｉ）傾斜度、（ｉｉ）回転速
度、および（ｉｉｉ）回転軸から特定の反応容器までの距離により決定される。
多容器集成装置または複数の容器からなるアレイ（例えば、マイクロタイタープ
レート）における全ての反応容器は、同程度に上部液相の除去を受けるのが望ま
しいので、遠心分離の間の反応容器の「ポケット」中の液面の角度ができる限り
回転軸に対して９０度に近いことが重要である。本発明において用いる場合、「
重力よりも有意に大きい」なる用語は、この力が少なくとも約５〜３００ｘＧ、
好ましくは、約１０〜３００ｘＧ、さらに好ましくは、約１００〜３００ｘＧで
あることを意味する。言い換えれば、遠心器は、重力に対する遠心力の比、すな
わち、相対遠心力（ＲＣＦ）が少なくとも約５〜３００、好ましくは、約１０〜
３００、より好ましくは、約１００〜３００であるような速度で回転する。個々
の容器が回転中心から異なる距離で置かれている場合、１よりも有意に大きいＲ
ＣＦの値が必要である。全ての容器中の液体の均一な分配を行なうためには、全
てのウェルからできる限り多くの上部液相を除去することが重要である。非撹乱
状態における液体に対する遠心器にて達成できる液面の角度の理論値は９０度で
ある。これには、上記の比（ＲＣＦ）の値が無限大に到達することが必要である
。実用上の理由のために、８９度（比１００：１）〜８５度（比１８：１）の差
異が許容できる。この数値の許容性は、「ポケット」容量の絶対値を決定する傾
斜度に依存する。傾斜が大きいほど、「ポケット」容量が大きくなり、種々の半
径での異なる比に対する許容度が大きくなる。「固定傾斜（fixed tilt）」遠心
器における傾斜の最大の可能な値は４５度であるが、この傾斜は、ウェル中の液
体の最大容量が理論的な「ポケット」の容量と等しいので、全く非実用的である
。

【００２４】「動的調整傾斜（dynamically adjustable tilt）」遠心器（プレートが停止
状態で水平であり、回転の間は限界位置まで「スイングアウト」する遠心器）の
場合、より高度な傾斜が可能である。本発明の方法の一の実施態様の一の形態に
よると、使用する反応容器がマイクロタイタープレートにおける規則正しい複数
のウェルからなる１つまたはそれ以上のアレイである場合、遠心器のローターは
、回転軸に最も近いウェルの半径に対する遠心力が約５〜３００ｘＧ、好ましく
は、約１０〜３００ｘＧ、さらに好ましくは、約１００〜３００ｘＧであり、プ
レートの傾斜角が約１〜４５度、好ましくは、５〜２０度、さらに好ましくは、
５〜１５度となるような速度で回転する。本発明の方法のこの実施態様の別の形
態によると、使用する反応容器がマイクロタイタープレートにおける複数のマイ
クロウェルからなる１つまたはそれ以上のアレイである場合、遠心器のローター
は、回転軸に最も近いウェルの半径に対する遠心力が約５〜３００ｘＧ、好まし
くは、約１０〜３００ｘＧ、さらに好ましくは、約１００〜３００ｘＧであり、
プレートの傾斜角が約２〜２５度、好ましくは、２〜１０度となるような速度で
回転する。一の実施態様において、上部液相は、遠心器の壁上に回収される。別
の実施態様において、上部液相は、「収集ポケット」または一連の「収集ポケッ
ト」中に回収される。図１は、本発明の方法に従って行なわれた容器の「ポケッ
ト」における下部液層の保持および上部液層の排出を例示する。図２は、遠心分
離によりマイクロタイタープレートのウェルのような容器から除去された上部液
層の経路を例示する。マイクロタイタープレートの各ウェルの上端部にあるまっ
すぐな縁は、液体が遠心プレートのエッジに近いウェルに入るのを防止する −
このウェルはより高く、縁の壁はプレートの底部の方に向かって傾斜している。
大きい矢印は、遠心力および重力により得られるベクターを表す。細く曲がりく
ねっている線の小さい矢印は、反応容器から除去された液体の流れの方向を示し
ている。図３は、内向リップを有する容器が、本発明の方法に従って回転した場
合、下部液相を保持する「ポケット」を「創り出す」本発明の別の実施態様を例
示する。図１の左側の部分は、遠心分離前の容器中の下部液相および上部液相を
例示する。図１の右側の部分は、回転中の下部液相層を保持して含有するポケッ
ト（および上部液層の除去）を例示する。詳細に上記したとおり、１個の反応容
器、１個のマイクロタイタープレートまたは複数のマイクロタイタープレートを
本発明の方法に使用することができる。

【００２５】ディファレンシャルフェーズ合成法に加えて、本発明は、「逆傾斜（reverse
tilt）」合成反応における使用を見出す。この実施態様において、反応容器は、
例えば、マイクロタイタープレートフォーマットにおいて、回転軸から離れる方
向に傾斜する：すなわち、反応容器の開口端が回転軸から離れた方に向けられる
。負（または「逆」）の傾斜（回転軸から離れる方向への傾斜）は、ウェルの全
ての液体内容物を除去させる。これは、種々の理由で行なわれる。第１の実施態
様において、これは、表面（改質された表面）への結合が研究されており反復洗
浄により過剰な試薬の除去が必要である場合、例えば、生物学的アッセイにおい
て、ウェルの洗浄に適用できる。

【００２６】「逆」傾斜の使用についての好ましい実施態様は、ウェルに堅固に付着した物
質上で合成が行なわれる状況である；すなわち、該物質は、当該プロセスにおい
て使用される遠心分離条件下で反応容器から排除されない。好ましい実施態様に
おいて、該物質は、合成が行なわれる固体支持体で満たされた「ティーバッグ」
型の物質、または、織物様物質であり得る；これらの支持体の例は、米国特許第
5,202,418号を参照のこと（出典明示により本明細書の記載とする）。

【００２７】好ましい実施態様において、反応容器自体の１つまたはそれ以上の改質された
表面上で合成が行なわれる。この実施態様において、合成反応用の支持体として
マイクロビーズのような固体支持体または高密度の相（dense phase）を使用す
るよりもむしろ、合成反応用の固相として反応容器の実表面を使用する；液体試
薬を添加し、反応させ、次いで、残存液体を遠心分離により除去する。すなわち
、マイクロタイタープレートのような反応容器は、合成用の固体支持体として機
能化される。この実施態様において、反応容器は、合成させるように改質するこ
とができるいずれの物質であってもよい；基質に可能な物質としては、ガラスお
よび改質もしくは機能化ガラス、プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレンお
よびスチレンと他の物質とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ
ブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）Ｊなどを包含する）、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリコーンおよび改質シリコーンを包含するシリカをベースとした物質、カーボン、金属、無機ガラス、およびプラスチック、および種々の他のポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【００２８】チオール、アミン、カルボキシルなどの化学反応性基を有するある種のポリマ
ーのような固体支持体表面の機能化は、一般に当該技術分野において知られてい
る。次の構成ブロックの付加のためのこれらの表面化学のいくつかの例としては
、脂肪族および芳香族アミンを包含するアミノ基、カルボン酸、アルデヒド、ア
ミド、クロロメチル基、ヒドラジド、ヒドロキシル基、スルホネートおよびスル
フェートが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【００２９】これらの官能基を用い、一般に、アミノ機能化支持体、スルフヒドリルリンカ
ーなどの使用が挙げられるがこれらに限定されるものではない公知の化学を用い
て、かなり多数の種々の構成ブロック部分を容器に添加することができる。ＳＰ
ＤＰ、マレイミド、α−ハロアセチルおよびピリジルジスルフィドのような当該
技術分野で知られている多くのスルフヒドリル反応性リンカーがある（例えば、
1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers
, pages 155-200 を参照のこと；出典明示により本明細書の記載とする）。同様
に、構成ブロック上および表面上のアミノ基は、リンカーを用いて付着させるこ
とができる；例えば、ホモ二官能価およびヘテロ二官能価リンカーを包含する多
数の安定な二官能価基が当該技術分野においてよく知られている（Pierce Catal
og and Handbook, pages 155-200 を参照のこと）。さらなる実施態様において
、カルボキシル基（表面または構成ブロック由来）は、よく知られているリンカ
ー（Pierce catalog を参照のこと）を用いて誘導体化することができる。例え
ば、カルボジイミドは、アミンのような良好な求核試薬による攻撃のためにカル
ボキシル基を活性化する（Torchilin et al., Critical Rev. Therapeutic Drug
Carrier Systems, 7(4): 275-308(1991) を参照のこと、出典明示により本明細
書の記載とする）。さらに、好ましい方法は、反応容器から合成後に切断できる
系を包含する。

【００３０】当業者により認識されるように、機能化は、以下に概略記載するとおり、行な
う合成法に依存する。

【００３１】当業者により認識されるように、逆傾斜の実施態様において、実質的には、い
かなる固相合成反応も行なうことができる。好ましい実施態様は、ペプチド合成
、核酸合成、および小分子合成を包含するがこれらに限定されるものではない有
機合成を包含する。

【００３２】好ましい具体例として、ペプチドを合成する。本明細書中の「ペプチド」とは
、少なくとも２個のアミノ酸がペプチド結合を介して結合したものを意味する。
ペプチドは天然に存するアミノ酸がペプチド結合によってできていてもよく、あ
るいは合成ペプチド様構造を有するものであってもよい。側鎖は（Ｒ）または（
Ｓ）配置のいずれであってもよい。好ましい具体例においては、アミノ酸は（Ｓ
）またはＬ−配置である。天然に存在しない側鎖を用いるならば、非アミノ酸置
換基を用いて、例えば、インビボ分解を妨げ、または遅らせることができる。

【００３３】ペプチドの段階的固相合成が周知である。代表的な固相コンビナトリアルプロ
トコルは、ペプチドをポリマー樹脂に結合させる合成に関するものであり、Ｌａ
ｍら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２−８４；米国特許第５５１０２４
０号；Ｌａｍら、１９９４、Ｓｅｌｅｃｔｉｄｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂｅ
ａｄ−ｂｉｎｄｉｎｇｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄ：ＡＣｏｍｐａｎｉ
ｏｎｔｏＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６：３７２−３８０の
記載に従ってなされる。もう一つ別の代表的なプロトコルは、ベンゾジアゼピン
基の合成に関するものであり、Ｂｕｎｉｎら、１９９２、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．、１１４：１０９９７−１０９９８および米国特許第５２８８５１
４号の記載に従ってなされる。さらに、Ｎ−置換グリシンを付加してペプトイド
を形成するプロトコルの場合、例えば、Ｓｉｍｏｎら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：９３６７−９３７１；Ｚｕｃｋｅｒ
ｍａｎｎら、１９９２、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：１０６４
６−１０６４７；ＷＯＰＣＴ９４／０６４５１（Ｍｏｏｓら）を参照のこと；
最近では、小型分子ライブラリーの合成方法が、例えば、Ｋｒｃｈｎａｋおよび
Ｌｅｂｌ、１９９６、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉｖｅｒｓｉｔｙ、１：１９３−
２１６；Ｅｌｌｍａｎ、１９９６、Ａｃｃｏｕｎｔ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、２９
：１３２−１４３；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９６、Ａｃｃｏｕｎｔ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｒｅｓ．２９：１２３−１３１；Ｆｒｕｃｈｔｅｌら、１９９６、Ａｎａｅ
ｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、３５：１７−４２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９
９６、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、９６：５５５−６００；Ｒｉｎｎｏｖａら、１９９
６、Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、６１：１７１−
２３１；Ｈｅｒｍｋｅｎｓら、１９９６、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５２：４５
２７−４５５４に報告されている。代表的な構成ブロックおよび試薬は、アミノ
酸、ヌクレオシド、他の有機酸、アルデヒド、アルコールなど、ならびに二機能
性化合物、例えば、ＫｒｃｈｎａｋおよびＬｅｂｌ、１９９６、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＤｉｖｅｒｓｉｔｙ、１：１９３−２１６に示される化合物である。

【００３４】好ましい具体例として、本発明の方法および組成物を用いて核酸を合成する。
本明細書に記載の「核酸」または「オリゴヌクレオチド」あるいは文法的等価物
とは、少なくとも２個のヌクレオチドが一緒に共有結合したものを意味する。一
般に、本発明の核酸はホスホジエステル結合を有しているが、ある場合には、以
下に示すように、例えば、ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ４９（１０）：１９２５（１９９３）およびその中の引用文献；Ｌ
ｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００（１９７０）；Ｓ
ｐｒｉｎｚｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９（１９７７）；
Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：３４８７（１９
８６）；Ｓａｗａｉら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１９８４）、Ｌｅｔｓ
ｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）
；およびＰａｕｗｅｌｓら、ＣｈｅｍｉｃａＳｃｒｉｐｔａ２６：１４１（１
９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．１９：１４３７（１９９１）；および米国特許第５６４４０４８号）、ホ
スホロジチオエート（Ｂｒｉｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２
３２１（１９８９））、Ｏ−メチルホスホロアミダイド結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ
、ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｕｅｓ：ＡＰｒａ
ｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅ
ｓｓを参照のこと）およびペプチド核酸骨格および結合（Ｅｇｈｏｌｍ、Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５（１９９２）；Ｍｅｉｅｒら、Ｃｈ
ｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８（１９９２）；Ｎｉｅｌｓｅ
ｎ、Ｎａｔｕｒｅ３６５：５６６（１９９３）；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｎａｔ
ｕｒｅ３８０：２０７（１９９６）を参照のこと、そのすべてを出典を明示す
ることで本明細書の一部とする）を含む別の骨格を有していてもよい、核酸アナ
ログも含まれる。他の核酸アナログは、陽性骨格を有するもの（Ｄｅｎｐｃｙら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６０９７（１９９５
））；非イオン性骨格を有するもの（米国特許第５３８６０２３号、第５６３７
６８４号、第５６０２２４０号、第５２１６１４１号および第４４６９８６３号
；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｋｉら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ
ｉｓｈ３０：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃ
ｌｅｏｓｉｄｅ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ１３：１５９７（１９９４）；Ｃｈａ
ｐｔｅｒｓ２および３、ＡＳＣＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ５８０、「
ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＡｎｔｉｓｅｎ
ｓｅＲｅｓｅａｒｃｈ」、Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．ＤａｎＣ
ｏｏｋ；Ｍｅａｍａｅｋｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ
Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＮＭＲ３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））および非リボース骨格を有するもの（米
国特許第５２３５０３３号および第５０３４５０６号、ならびにＣｈａｐｔｅｒ
ｓ６および７、ＡＳＣＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ５８０、「Ｃａｒｂ
ｏｈｙｄｒａｔｅＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅ
ｓｅａｒｃｈ」、Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．ＤａｎＣｏｏｋに
記載されているものを含む）を包含する。１またはそれ以上の炭素環式糖を含有
する核酸もまた、核酸の定義の範囲に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）１６９−１７６頁を参照のこと）。数種類の核酸
アナログが、Ｒａｗｌｓ、Ｃ＆ＥＮｅｗｓ１９９７年６月２日、３５頁に記載
されている。これらの文献すべてを出典明示により本明細書の一部とする。リボ
ース−ホスフェート骨格にてこれらの修飾を行えば、かかる分子の生理学的環境
下での安定性および半減期を増加させることができる。

【００３５】当業者に明らかなように、これらの核酸アナログのすべてが本発明において有
用であることがわかる。加えて、天然に存する核酸とアナログの混合物を製造す
ることもできる；また、種々の核酸アナログと、天然に存する核酸およびアナロ
グの混合物との混合物を製造することもできる。

【００３６】核酸は、デオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドのいずれの組み合わせ、ウ
ラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イソシン、キサンチン、ハイ
ポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む、天然のおよび合成の塩
基のいずれの組み合わせを含有していてもよい。好ましい具体例は、標的配列よ
りも、他のプローブに対して相補的であるように設計された核酸において、イソ
シトシンおよびイソグアニンを利用するものである。というのも、米国特許第５
６８１７０２号に概説されるように、このことが非特異的ハイブリダイゼーショ
ンを減少させるからである。本明細書中で用いる場合、「ヌクレオシド」なる語
は、ヌクレオチドならびにヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログ、およびア
ミノ修飾ヌクレオシドまたはホスホルアミダイトヌクレオシドなどの修飾ヌクレ
オシドを包含する。加えて、「ヌクレオシド」は天然に存しないアナログ構造物
を包含する。かくして、例えば、１個の塩基を含有する各々のペプチド、核酸の
単位を本明細書においてヌクレオシドという。

【００３７】核酸の段階的合成は周知であり、一般に、保護された活性化ヌクレオシドモノ
マーを固体支持体に段階的に付加し、つづいて脱保護し、そして洗浄する工程か
らなる。一般に、Ｇａｉｔ、ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、Ｏｘｆ
ｏｒｄ、ＵＫ１９８４；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、出典明示により本明細書の一部と
する、を参照のこと。これは、通常、ホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネー
トヌクレオシドのいずれかを用いてなされる。これは、一般に、２つのうちの１
の方法にて行われる。当該分野にて知られているように、まず、リボースの５’
位を４',４−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）で保護し、つづいてジイソプロピル
アンモニウムテトラゾリドの存在下で２−シアノエトキシ−ビス−ジイソプロピ
ルアミノホスフィンと反応させるか、またはクロロジイソプロピルアミノ２'−
シアノエトキシホスフィンと反応させて、ホスホルアミダイトを得る；ただし、
当業者に公知であるように、他の方法を用いることもできる。Ｇａｉｔ、前掲；
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：２８１（１９８５）を参照のこ
と。これらを共に出典明示により本明細書の一部とする。

【００３８】好ましい具体例としては、逆傾斜方法を用いて、小型有機分子を合成する。当
業者に明らかであるように、文献中に種々の小型分子、特に固相支持体上の小型
分子のライブラリーに対する無数の合成例が記載されている；例えば、Ｐａｖｉ
ａら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９
６４（５）：６５９−６６６；Ｌｉｓｋａｍｐら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍ
ｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９６４（５）：６６７−６７２；
Ｔｏｎｇら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ
１９９６４（５）：６９３−６９８；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎ
ｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９６４（５）：７０９−
７１５、Ｆｒｅｉｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ１９９６４（５）：７１７−７２５；Ｂｏｌｔｏｎら、Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ１９９６３７（２０）３４３３−３４３６を
参照のこと。このすべてを出典明示により本明細書の一部とする。

【００３９】加えて、本明細書に記載のすべての逆傾斜法では、第１構成ブロックを表面に
付着させるのにリンカーを用いることが望ましい。したがって、本発明は逆傾斜遠心分離操作を用いる合成方法を提供する。この
具体例においては、予め機能的にした第１構成ブロックまたはその分子の第１構
成ブロックを付着するように製造した化合物のいずれかを含む反応容器またはア
レイの容器を設けてもよい。その後、複数の構成ブロックの付加工程を行う。そ
のすべては以下の下位工程を所望の化合物を合成するように選択された順序にて
繰り返して行う。第一に、付加するために選択された構成ブロック基が中間化合
物に対して１モルより多く存在するように、該構成ブロック基を含有する十分な
量の溶液を正確に反応容器に加える。試薬および要すれば他の試薬および溶媒を
活性化させ、それをまた反応容器に加えることで反応を開始かつ促進させる。つ
いで、反応容器を制御された温度で構成ブロック付加反応に十分な時間または変
形して実質的に完了するまでの時間、典型的には５分ないし２４時間インキュベ
ートする。所望により、このインキュベーションの間に、反応容器を断続的にか
き混ぜあるいは攪拌してもよい。最後に、構成ブロック付加反応の最後の工程に
おいて、本明細書に概説した「逆傾斜」遠心分離工程を用いて反応流体を除去し
、必要ならば完全に洗浄し、かつ修理して、次の構成ブロックを付加するための
反応容器を調製する。洗浄とは、典型的には、洗浄溶媒の添加および除去のサイ
クルを３ないし７回行うことをいう。所望により、付加工程の間に、一の反応容
器に結合した中間化合物の混合物を合成するために、複数の構成ブロックを一の
反応容器に添加してもよい。所望の数の構成ブロック付加工程を行えば、最終化
合物が反応容器中に存在する。ついで、その最終化合物を所望により反応容器支
持体より切断してもよく；また、反応容器それ自体をその後の反応に使用しても
よい。種々の例示的な反応が、出典明示により本明細書の一部とするＷＯ９９／
２５４７０に概説されており、それはペプチドおよび合成ペプチド、ベンゾジア
ゼピンおよび誘導体、ペプトイド、Ｎ−置換ポリアミドモノマーの反応を包含す
る。代表的な構成ブロックおよび試薬はアミノ酸、核酸、他の有機酸、アルデヒ
ド、アルコールなど、ならびに二機能性化合物である。

【００４０】本発明はまた本明細書に記載の有機合成用装置を提供する。本発明の装置は、
遠心分離機およびローターを含め、種々の部材からなる。一般に、ローターは少
なくとも１つのホルダー、好ましくは複数のホルダーを含み、その各々が少なく
とも１つの第１反応容器、好ましくは複数の反応容器を保持する。当業者に明らかなように、反応容器は種々の方法にて遠心分離に付すことがで
きる。好ましい具体例においては、反応容器は、個々の反応容器を含有するマイ
クロタイタープレートなどのアレイの形態の容器である。特に好ましい遠心分離
機は９６−ウェルおよび３８４−ウェルマイクロタイタープレートである。

【００４１】当業者に明らかなように、本発明の重要な態様の一つは、１またはそれ以上の
液相が遠心分離により反応容器から排出されることである。したがって、システ
ムを遠心分離に付し、排出した液体を収集することのできる、２つの主な方法が
ある。好ましい具体例において、マイクロタイタープレートを遠心分離機ローターに
取り付けるために用いられるホルダーは一連の収集ポケットを有しまたは含み、
遠心分離の間に容器から排出された液体を収集し、保有することができる。これ
らの収集ポケットは、排出された液体を収集かつ保有するための１またはそれ以
上の窪みまたは溝を含み得る。

【００４２】もう一つ別の好ましい具体例では、ホルダーは収集用ポケットを有していない
。この場合、排出された液体は遠心分離機の壁面に堆積する。この具体例におい
ては、一般に、遠心分離機の底部に収集用ポケットまたはリザバーを設け、排出
した液体の重力流により該液体がそのポケットにプールするように遠心分離機を
設計する。必要ならば、これを定期的に空にし、排出を可能とするポートまたは
バルブを設けることもできる。別法として、廃液リザバーに誘導する管またはパイプを有するように遠心分離
機を設計する；この管も、一般に、遠心分離機の底部にある。排出される液体の
重力流により、遠心分離機の外部に廃液を集めるようにすることができる。

【００４３】好ましい具体例において、ホルダーは傾斜した状態で反応容器を保有する。ホ
ルダーは１またはそれ以上の容器を固定された傾斜状態で保有していても、傾斜
角を柔軟に変更することのできる状態にて保有していてもよい。本明細書に記載されるように、回転軸に対してローターを傾斜させ、反応物の
相を保持することができる。また、合成反応が反応容器にしっかりと（例えば、
遠心分離の間に排出されないような力で）固定された物質に対してなされる場合
、または反応が反応容器その自体に対してなされる場合、ローターの傾斜は本明
細書に記載されるように回転軸から離す（「逆傾斜」）ことができる。

【００４４】好ましい具体例において、各ホルダーは一セットまたはアレイだけの反応容器
を含有する。かくして、例えば、ホルダーは反応容器を位置付けるための溝また
はレールを有していてもよく、例えば、ホルダー中にマイクロタイタープレート
を有していてもよい。また、反応容器は「積み重ね」または「積層」されていて
もよい。しかしながら、単一のセットまたはアレイの反応容器、例えば、個々の
マイクロタイタープレートを遠心分離機の周辺部に設けることで、液体分配オー
トマット（例えば、ＰａｃｋａｒｄＣａｎｂｅｒｒａ、Ｔｅｃａｎ、Ｈａｍｉ
ｌｔｏｎ、その他）と簡単にインターフェイスするという利点がある。液体分配
装置は遠心分離合成装置の頂部に置くことができる。反応容器の設計に適合する
フォーマットにて同時に分配することのできる液体分配システムが特に好ましい
；例えば、反応容器が９６ウェルマイクロタイタープレートの形態の場合には、
液体分配システムは９６チャネル装置であることが好ましい。

【００４５】液体分配システムはまた、一連のリザバーおよびデリバリー用の管を有するこ
とができる；例えば、液体分配システムは、溶媒または試薬の溶液を異なるボト
ルから分配装置のニードルの下に位置するプレートにデリバリーすることのでき
る、９６チャネル液体分配装置を有していてもよい。例えば、核酸合成の場合、
好ましい具体例として、各ヌクレオシドについて別々の試薬瓶が挙げられる。好ましい具体例では、液体分配システムは連続システムであり；すなわち、反
応容器が遠心分離機にある場合に液体をその反応容器に配分し；試薬を添加する
ために反応容器を遠心分離機から取り外すことはない。一般に、液体分配システ
ムは遠心分離機と一体となっており；液体は遠心分離機の蓋を外すことなくデリ
バリーされる。

【００４６】加えて、本発明の装置はさらにその部分の合成を制御するためにプロセッサー
またはコンピューターを含むことができる。例えば、コンピューターを用いて、
液相、試薬、溶媒、洗浄液などを反応容器に段階的に添加し、つづいて液体を反
応容器から除去する遠心分離工程を指示するプログラムで処理することができる
。かくして、本発明は、プログラムを貯蔵するためのメモリーを有する、プログ
ラムの制御下でコンピューターにより実行される方法を提供する。そのプログラ
ムは、液体分配システムを用いて試薬を反応容器に添加し、必要ならばインキュ
ベートさせ、所定の時間および所定の速度で遠心分離により未反応の試薬および
液体を除去し、要すれば洗浄工程および反復工程を行うように指示されている。

【００４７】上記した部材に加えて、遠心分離機はまた、付加的な部材を含んでいてもよい
。例えば、遠心分離機は、一連の反応容器が特定の方向にある場合にコンピュー
ターおよび液体分配システムにシグナルを送るためのセンサー、およびローター
を液体をデリバリーするための正確な方向に回転させるためのモーターを含むこ
とができ、それらもまたコンピューターの制御下とすることができる。さらには
、ホルダーまたはローターの傾きを調整できる場合には、その遠心分離機はコン
トローラーおよびセンサーを利用して傾斜度を調整することもできる。

【００４８】この連続装置は、フッ素含有相の合成方法のための「遠心分離合成装置」とし
て有用である。本発明の方法および装置は、本明細書に記載されるように、多くの用途に有用
であることがわかる。好ましい具体例において、本発明の方法および装置は、有利には、フッ素含有
相有機合成による化合物のコンビナトリアルライブラリーまたはメガアレイを手
動でまたは自動で調製するのに有用である。当業者によく知られているように、
かかるコンビナトリアルライブラリーまたはメガアレイには、多くの用途、特に
医薬上のリード化合物の選択、医薬上のリード化合物の最適化、および医薬の同
定および／または単離という用途がある。液／液相を分離するための本発明の方
法および装置はまた、有利には、他の方法により合成または得られた化合物のア
レイを並行して抽出および精製するのに用いることもできる。分析化学における
他の用途（抽出、脱塩または試料を並行調製する他の手段）、生物化学における
他の用途（試料の並行処理）が考えられる。

【００４９】容器のアレイから液体を完全に除去できることは、容器の表面（付着した試薬
または細胞培養物により修飾された表面）に結合しているものを調査するという
生物学的スクリーニングに適用することができる。この場合は、遠心分離の間の
容器の傾きは「リバースド」であり、すなわち、遠心分離の間に「ポケット」は
形成されない。この場合には、例えば、かなり多数の結合アッセイを行うことが
できる。例えば、ＥＬＩＳＡ型アッセイは、頻繁に、種々の既知化学的操作を用
いて抗体を付着させたマイクロタイタープレートフォーマットにて行われる。試
料を添加し、要すれば洗浄しながら、試薬部材を添加して本発明を利用すること
ができる。さらには、該装置は、この具体例において、蛍光リーダーなどの付加
的部材を含むこともできる。特に核酸およびペプチド合成が強調されているが、同様に逆傾斜反応を上記し
た合成反応に用いることもできる。

【００５０】実施例：下層液相の移動を伴わない上層液相の除去エタノールのトルエンで飽和した水中１０％溶液をマイクロタイタープレート
のウェルに分配した（４０μＬ／ウェル）。酢酸エチル（１５０μＬ）をウェル
に繰り返して分配し、マイクロタイタープレートを１分間振盪し、傾斜した状態
にて遠心分離に付した。図５は２工程の並行抽出処理の前後におけるウェルのＵ
Ｖスペクトルを示し、それは芳香族炭化水素による汚染が完全に除去されたこと
を示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、本発明の方法による、容器の「ポケ
ット」中における２つの混合しない液相の分離ならびに上の液相の排出を説明す
る。図１Ａは、遠心分離前の容器中の上の液相および下の液相を示す。図１Ｂお
よび図１Ｃは、回転中に保持された下の液相を含むポケット（ならびに上の液相
の除去）を示す。

【図２】図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、遠心分離により、マイクロタイター
プレートのウェルのごとき容器から除去される液体の経路を示す。マイクロタイ
タープレートの各ウェルの上端のまっすぐな縁は、遠心プレートのエッジに近接
したウェルに液体が入るのを防止する−このウェルは背が高く、縁の壁がプレー
トの底方向に傾斜している。大きな矢印は遠心力および重力により生じるベクロ
ルを示す。細い線の小さな矢印は除去された液体の流れる方向を示す。

【図３】図３Ａおよび３Ｂは本発明の別の具体例を示し、本発明の方法に
より、回転した場合に、内側に向いた縁を有する容器が「ポケット」（その中に
下方の液体が保持される）を「作り出す」具体例を示す。

【図４】図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、ウェルが「逆」傾斜して傾いており
、遠心分離中に「ポケット」ができない状況を示す。結果はウェルからのすべて
の液体の完全な除去である。

【図５】図５は、芳香族炭化水素によるコンタミネーションを完全に除去
する、２工程の並行抽出の前後におけるウェルのＵＶスペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）液体または液体混合物を入れた複数の反応容器を、回
転軸から離れて傾いた位置にある遠心ローターの周囲にあるホルダー中に置き；
ついで（ｂ）液体が該容器から排出される速度でローターを回転させることを特徴とする、少なくとも１つの反応容器から液相を除去する方法。
【請求項２】固相有機合成中に用いられる請求項１記載の方法。
【請求項３】該固相有機合成がペプチドの合成である請求項２記載の方法
。
【請求項４】該該固相有機合成が核酸の合成である請求項２記載の方法。
【請求項５】工程（ａ）および（ｂ）を繰り返すことをさらに特徴とすし
、有機分子が合成される請求項１記載の方法。
【請求項６】該反応容器が少なくとも１つのマイクロタイタープレートを
含むものである請求項１記載の方法。
【請求項７】該ローターが複数のホルダーを含むものである請求項１記載
の方法。
【請求項８】該ホルダーが、該容器から排出された液体を集め、保持する
に十分な体積を有する少なくとも１つの収集ポケットを含むものである請求項１
記載の方法。
【請求項９】該排出された液体が、該遠心分離機に管で接続された廃液リ
ザーバー中に集められる請求項１記載の方法。
【請求項１０】（ａ）第１の構成ブロックが連結されている反応容器を用
意し、（ｂ）遠心ローターの周囲にあるホルダーに該容器を置き、（ｃ）第２の構成ブロックを該容器に付加し、ついで（ｄ）該液体が容器から排出される速度でローターを回転させることを特徴とする化合物の合成方法。
【請求項１１】該反応容器が回転軸から離れて傾いているものである請求
項１０記載の方法。
【請求項１２】該反応容器がマイクロタイタープレートの一部である請求
項１０記載の方法。
【請求項１３】工程（c）および（d）を繰り返すことをさらに特徴とし、
有機部分が合成されるものである請求項１０記載の方法。
【請求項１４】さらなる構成ブロックを付加する前に該固体支持体を洗浄
することをさらに特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１５】該構成ブロックがアミノ酸である請求項１０記載の方法。
【請求項１６】該構成ブロックがヌクレオチドである請求項１０記載の方
法。
【請求項１７】（ａ）該液体を入れた複数の反応容器を遠心ローター周囲
にあるホルダーに置き、ついで（ｂ）多層系の下層が容器の「ポケット」中に保持され、上層が該容器から排
出される速度で遠心ローターを回転させることを特徴とする、少なくとも２つの混合しないあるいは不完全に混合する液体
の分離方法。
【請求項１８】該複数の容器がマイクロタイタープレートを含むものであ
る請求項１７記載の方法。
【請求項１９】該ローターが複数のホルダーを含むものである請求項１７
記載の方法。
【請求項２０】該ホルダーが、排出された液体を集め、保持するに十分な
体積を有する少なくとも１つの収集ポケットを含むものである請求項１７記載の
方法。
【請求項２１】該上層が、該遠心分離機に管で接続された廃液リザーバー
中に集められる請求項１７記載の方法。
【請求項２２】該ホルダーが、該反応容器を回転中心から離して傾けて保
持するものである請求項１７記載の方法。
【請求項２３】傾斜角が２５度未満である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】回転軸に最も近い容器に対応する半径上の遠心力が重力よ
りも実質的に大きくなる速度で該ローターが回転されて、多相系の下層が容器の
「ポケット」を満たし、多層系の上層が容器から排出される、請求項２２記載の
方法。
【請求項２５】回転軸に最も近い容器に対応する半径上の遠心力が少なく
とも２０ｘＧとなる速度で遠心ローターが回転される請求項２２記載の方法。
【請求項２６】回転軸に最も近い容器に対応する半径上の遠心力が少なく
とも５ないし３００ｘＧとなる速度で遠心ローターが回転される請求項２２記載
の方法。
【請求項２７】ａ）反応容器を回転軸から離して傾けて保持するように設
計されたローター；およびｂ）該反応容器から排出された液体を保持するように該遠心分離機に接続され
た廃液リザーバーを含む遠心分離機を含む装置。
【請求項２８】該廃液リザーバーが管により該遠心分離機に接続されてい
る請求項２７記載の装置。
【請求項２９】該ローターが複数のホルダーを含み、各ホルダーが少なく
とも１つのマイクロタイタープレートを保持するように設計されている請求項２
７記載の装置。
【請求項３０】液体分配システムをさらに含む請求項２７記載の装置。
【請求項３１】該液体分配システムが遠心分離機中に組み込まれている請
求項３０記載の装置。
【請求項３２】コンピューターをさらに含む請求項２７記載の装置。