CN115298193A - 串联树脂反应器的肽合成仪 - Google Patents

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Abstract

本文教导了一种固相肽合成（SPPS）装置和使用其制造肽的方法。所述系统包含至少两个反应器，各反应器包括一定量的SPPS树脂。这些反应器串联安置。将脱保护试剂添加到第一反应器中，然后序贯转移到第二和第三反应器，由此用于将受保护N‑基团脱保护。将洗涤溶剂添加到第一反应器中，然后转移到第二反应器，并将这一操作重复数次。同样地，将氨基酸活化酯溶液序贯添加到第一、第二和第三反应器，由此用于将氨基酸偶联到脱保护N‑基团上。将洗涤溶剂添加到第一反应器中，然后转移到第二反应器，并在下一个周期前将这一操作重复数次。串联反应器的使用减少所需的总溶剂。在线LCMS也用于监测在固相树脂粒子内发生的反应的进程和性质。

Description

串联树脂反应器的肽合成仪
技术领域
本公开涉及一种用于合成制造肽的新系统和方法。更具体地，本公开涉及作为固相肽合成的一部分使用串联的树脂反应器作为将肽偶联在一起的机制的装置。
背景
固相肽合成（“SPPS”）是最常用于合成多肽和氨基酸序列的方法和系统。SPPS涉及将活化氨基酸（其通常是序列中的末端或最后一个氨基酸）偶联到固体载体上。这种固体载体通常是（例如用NH2基团）官能化的聚合物树脂珠。末端氨基酸（通常借助F-moc、BOC或其它保护基保护其NH2末端）与树脂反应以使树脂上的官能化基团与末端氨基酸的活化COOH基团反应并结合。以这种方式，将末端氨基酸共价连接到树脂上。
然后，在下一步骤中，将末端氨基酸的NH2末端脱保护，由此暴露其NH2基团以供下一个反应。相应地，引入新氨基酸。这种新氨基酸的NH2末端借助保护基（如F-moc、BOC或另一保护基）保护。因此，当加入这种新氨基酸时，来自这种新氨基酸的活化酯与末端氨基酸的最新脱保护的NH2基团反应，由此将这两个氨基酸偶联在一起。一旦这种新氨基酸已经偶联，其同样具有受保护的NH2基团，这可随后脱保护并与下一个氨基酸反应。通过一再进行这种重复迭代的过程，可构建整个氨基酸序列。一旦已构建整个序列，可将该序列从树脂上解偶联（裂解）并脱保护，由此产生氨基酸结构。（应该指出，通过这种方法添加的各种氨基酸（R1、R2等）的侧链可借助如BOC、叔丁基或三苯甲基等基团进行正交保护以防止这些侧链在氨基酸合成过程中发生反应。一个或多个氨基酸也可具有“侧链”或其它基团作为其结构的一部分，其也可能必须受到保护。但是，本领域技术人员会意识到在合成过程中如何构建、保护和随后脱保护这样的侧链或其它基团。
尽管这种SPPS法在商业上使用并且仍然是肽合成中的标准，但其缺点在于昂贵且耗时。添加的每个氨基酸都必须脱保护和偶联，这是困难的并通常导致使用大量溶剂。更糟糕的是，这些溶剂中的许多是不环保的。
因此，找出解决这些缺陷的一个或多个的使用SPPS的新方式将是一种改进，尤其是在肽的商业制造中。如果这样的系统能更环保并降低制造成本，将是进一步的进步。实际上，本实施方案明确地减少废物量以及所用溶剂和试剂的量。本文公开了这样的方法和系统。
概述
一种用于将氨基酸“X”活化酯偶联到附着于SPPS树脂的氨基酸的受保护N-基团（如NH2末端）上的方法和系统。通常，该系统包括一系列串联布置的反应器。在一些实施方案中，两个或更多个反应器串联布置。在一个优选实施方案中，三个或更多个反应器串联布置。
各反应器含有一定量的附着于肽合成树脂的受保护N-基团。这种受保护N-基团可以是氨基酸的NH2基团或可以是存在于或共价连接到树脂本身，例如但不限于Sieber酰胺或Rink Amide树脂上的NH2基团。也可使用其它类型的树脂，如Wang树脂或CTC（氯三苯甲基氯）树脂。
该方法中的第一步骤涉及将第一量的脱保护试剂添加到第一反应器中并允许这种试剂接触受保护N-基团。然后，将这种第一量的脱保护试剂从第一反应器转移到第二反应器并将第二量的脱保护试剂转移到第一反应器。将第一量的脱保护试剂从第二反应器中除去并将第二量的脱保护试剂从第一反应器转移到第二反应器。然后将这种第二量的脱保护试剂从第二反应器中除去。
使第一和第二反应器与第一和第二量的脱保护试剂接触的目的在于，这种脱保护试剂将与受保护N-基团反应，并且单独地或共同地，在第一和第二反应器中都发挥作用以将附着于肽合成树脂的受保护N-基团脱保护。因此，通过添加第一和第二量的脱保护试剂，第一和第二反应器中的N-基团都被去保护并且能够偶联到另一个氨基酸。将第一量的洗液添加到第一反应器中，然后转移到第二反应器，然后转移到废物中。将洗涤周期重复数次。用溶剂进行的洗涤可使用常用于SPPS的绿色溶剂或更环保的溶剂。这样的绿色洗涤溶剂包括乙腈（ACN）、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、2-MetHF（2-甲基四氢呋喃）和CPME（环戊基甲基醚），或溶剂混合物如NBP/THF 2/1 v/v，在此举例说明。这些化学反应也可在ACN、ACN/DMSO或正丁基吡咯烷酮中进行，它们也是绿色溶剂。
相应地，将第一量的氨基酸“X”和第一量的溶剂添加到第一反应器中，然后在一定时间后，从第一反应器转移到第二反应器。应该指出，添加到反应器中的该量的氨基酸“X”实际上是氨基酸X的“活化酯”，由此促进偶联反应。但是，为了简写，其在本文中可能简单地称为将“一定量的氨基酸X”添加到反应器中，但本领域技术人员会认识到，其是活化酯。或者，可将未活化的氨基酸添加到反应器中，然后加入活化溶液以使氨基酸反应并转化为活化酯。如本文所用，这也在“将氨基酸活化酯添加到树脂中”的含义内。
将第二量的氨基酸“X”和第二量的溶剂添加到第一反应器中。第一和第二量的氨基酸“X”活化酯，单独地或共同地，将氨基酸“X”偶联到第一反应器中的脱保护的N基团上（氨基酸“X”活化酯可以是任何氨基酸，包括希望添加到链中的官能化、衍生化或合成的氨基酸）。（如本文所用，有时提到将氨基酸“X”偶联，但是本领域技术人员会认识到，为了易于反应，最常使用的是活化酯）。
将第一量的氨基酸“X”和第一量的溶剂从第二反应器中除去，并将第二量的氨基酸“X”和第二量的溶剂从第一反应器转移到第二反应器。然后将第二量的氨基酸“X”和第二量的溶剂从第二反应器中除去。第一和第二量的氨基酸“X”，单独地或共同地，将氨基酸“X”偶联到第二反应器中的脱保护的N基团上。将第一量的溶剂洗液添加到第一反应器中，然后转移到第二反应器，然后转移到废物中。将溶剂洗涤周期重复数次。在第一量的溶剂洗液在第二反应器中的同时，第二量的溶剂洗液可在第一反应器中，依此类推。因此，在进行这些步骤后，氨基酸“X”已偶联到脱保护的N基团上，由此将氨基酸“X”添加到链中。当然，与其它SPPS系统一样，氨基酸“X”含有受保护的NH2基团，因此可以重复上述过程（例如以上述方式将NH2基团脱保护并将新氨基酸偶联到其上）。因此，通过重复这一过程，可构建所需氨基酸序列和/或肽。一旦合成完成，在第一反应器和第二反应器中都可以将构建的氨基酸释放（解偶联）到树脂。
尽管上述方法使用串联的两个反应器——各自具有树脂供应，但可设计其它实施方案，其中将也含有一定量树脂的第三反应器与前两个反应器串联。在这一实施方案中，在第三反应器中也必须进行脱保护步骤。因此一旦第一量的脱保护试剂从第二反应器中除去，将其添加到第三反应器中。将这种第一量的脱保护试剂从第三反应器中除去，然后将第二量的脱保护试剂——一旦已从第二反应器中除去——添加到第三反应器中。同样地，将第三量的脱保护试剂添加到第一反应器中，移动到第二反应器，然后移动到第三反应器。第一、第二和第三量的脱保护试剂的目的是，单独地或共同地，将第三反应器中的附着于肽合成树脂的受保护N-基团脱保护。以类似方式，至第三反应器的第一量的氨基酸“X”和第一量的溶剂在从第二反应器中除去后添加到第三反应器中。类似地，至第三反应器的第二量的氨基酸“X”和第二量的溶剂在从第二反应器中除去后添加到第三反应器中。第三量的氨基酸“X”和第三量的溶剂序贯循环经过第一、第二和第三反应器。第一、第二和第三量的氨基酸“X”，单独地或共同地，将氨基酸“X”偶联到第三反应器中的脱保护的N基团上。然后进行如上所述的洗涤步骤。因此，以这种方式，可在所有三个反应器中迭代构建氨基酸序列（通过对各氨基酸重复这些或类似步骤），然后在这三个反应器的每一个中从树脂上释放。
因此，本实施方案提供串联安置的各种反应器并将试剂添加到第一反应器中，然后接连和序贯移动到第二反应器，然后第三反应器等等。通过串联安置这些反应器，各反应器可含有一定量的用于SPPS的树脂，该SPPS用于构建肽序列。但是，通过以这种方式安置反应器，需要较少量的溶剂（洗涤材料）。同样地，可能需要较少量的偶联试剂，因此带来浪费更少且更高效环保的方法。
附图简述
在结合附图考虑以下详述时，本领域技术人员将显而易见本公开的特征和优点。
图1是用于将氨基酸“X”偶联到附着于本文所用的肽合成树脂的受保护N-基团上的系统和方法的图解视图；
图2是用于将氨基酸“X”偶联到附着于本文所用的肽合成树脂的受保护N-基团上的系统和方法的图解视图；
图3是用于将氨基酸“X”偶联到附着于本文所用的肽合成树脂的受保护N-基团上的系统和方法的图解视图；
图4是与图3的系统一起使用的在线LCMS的系统和方法的图解视图；
图5是如本实施方案中所用的串联的三个反应器的透视图；
图6显示可使用本实施方案制成的肽；和
图7显示可使用本实施方案制成的肽。
详述
为了利于理解本公开的原理，现在参考附图中所示的实施方案，并使用具体词汇对其进行描述。尽管如此，要理解的是，无意由此限制本发明的范围。
现在参考图1，用于将氨基酸“X”偶联到附着于肽合成树脂的受保护N-基团上的系统100的图解视图。系统100实施本文概述的方法并且是设计为生产肽和/或氨基酸序列的改良SPPS系统。系统100包含至少两个反应器，它们被描绘为第一反应器106和第二反应器108。这些反应器106、108串联布置。可以使用多于两个反应器。实际上，在图1所示的系统100中，也串联布置第三反应器112。也可使用多于三个反应器。
各反应器包含一定量的树脂116。树脂包括受保护N-基团120（如受保护NH2基团）。在一些实施方案中，用于该受保护N-基团的这种保护基是Fmoc基团。SPPS领域的技术人员会认识到可用作树脂116的树脂的类型，包括Seiber和Rink酰胺树脂。作为SPPS工艺的一部分，受保护N-基团必须“脱保护”以使其可与氨基酸反应（并因此用于构建肽/氨基酸序列）。因此，进行脱保护过程。这种脱保护通过添加第一量的脱保护试剂126进行。（这种第一量的脱保护试剂126用箭头进行图形化表示）。在一些实施方案中，脱保护试剂可以是哌啶，但也可使用其它材料/试剂。
可以搅拌第一量的脱保护试剂126并允许与第一反应器106中的树脂116上的受保护N-基团120反应一段时间。（本领域技术人员会意识到如何确定此处所需的确切时间配额）。然后，将第一量的脱保护试剂126从第一反应器106中除去并转移到第二反应器108（如箭头128所示）。可以搅拌这种第一量的脱保护试剂126并允许与第二反应器108中的树脂116上的受保护N-基团120反应一段时间。同时，将第二量的脱保护试剂130添加到第一反应器106中并允许以类似的方式反应。
一旦这些反应已经完成（或换言之，分配的时间已到），将第一量的脱保护试剂126从第二反应器108中除去并转移到第三反应器112（如箭头136所示）。同样地，将第二量的脱保护试剂130从第一反应器106中除去并转移到第二反应器108（如箭头140所示）。然后将第三量的脱保护试剂134添加到第一反应器106中。此时，允许第一反应器106、第二反应器108和第三反应器112中的反应继续。
在第一反应器106、第二反应器108和第三反应器112中的这些反应结束后（或换言之，分配的时间已到），将第一量的脱保护试剂126从第三反应器112中除去。将第二量的脱保护试剂130从第二反应器108中除去并转移到第三反应器112（如箭头144所示）。可以将第三量的脱保护试剂134从第一反应器106中除去并添加到第二反应器108中（如箭头146所示）。
在一些实施方案中，从第三反应器112中除去的这种第一量的脱保护试剂126可送往另外的反应器（如果该实施方案包括另外的反应器）。在另一些实施方案中，收集这种第一量的脱保护试剂126并送往废物。已循环经过第三反应器112的第二和第三量的脱保护试剂130、134也是如此。在另一些实施方案，包括图1中所示的实施方案中，这种第一量的脱保护试剂126（和随后第二和第三脱保护试剂130、134）可送回第一反应器106（如箭头148所示）以便可视需要进行脱保护的另外迭代。（要注意，如果将脱保护试剂送回第一反应器，这种方法更可能是分批反应并且可能较低效）。
将第三量的试剂134从第一反应器106中除去并转移到第二反应器108。这种量的试剂134随后以上文概述的方式循环经过第二反应器108和第三反应器112（尽管未显示第三量的试剂134从第二反应器108送往第三反应器112的箭头）。
本领域技术人员会认识到，可按需要对第一、第二或第三量的脱保护试剂126、130、134进行泵送校正以使每个量中（和每个反应器中）的试剂体积保持一致或接近一致。
如本领域技术人员显而易见，添加到第一、第二和第三反应器106、108、112中的脱保护试剂126、130、134的目的是，单独地或共同地，发挥作用以将附着于肽合成树脂116的受保护N-基团120脱保护。通过使用以本文概述的方式串联循环经过的试剂量将N-基团串联脱保护，N-基团可准备好用于偶联反应以将N-基团偶联到另一个氨基酸（如下文更详细描述）。
如果需要，一旦不受保护，附着于树脂116的N-基团可用溶剂如DMF“洗涤”。也可使用其它溶剂，包括NBP（N-丁基吡咯烷酮）、NMP（N-甲基-2-吡咯烷酮）、DMSO、乙酸酯和醚，如MeTHF（甲基四氢呋喃），或溶剂混合物，如NBP/THF 2/1 v/v，在此举例说明。这样的洗涤可以以上文对脱保护试剂126、130、134概述的相同方式进行。换言之，可将第一量的洗涤溶剂添加到第一反应器106中，随后循环经过第二和第三反应器108、112。同样地，第二和第三量的洗涤溶剂同样可循环经过反应器106、108和112。这种洗涤步骤可以是迭代的以致可能有5、8或10个不同的洗涤周期（每次将相同量的溶剂或新的量的溶剂添加到第一反应器中）。（尽管本文中没有详细描述，但洗涤步骤可能是重要的并可在每个脱保护和偶联步骤后进行）。同样地，泵校正也可用于确保添加到反应器中的洗涤溶剂的每次的量几乎一致。
现在参考图2，现在使用系统100描述氨基酸的偶联。每个树脂116已如上文概述脱保护（和任选洗涤）。相应地，树脂116被显示为包括无保护N-基团120a（而非图1中所示的受保护N-基团120）。
将第一量的氨基酸“X”150添加到第一反应器106中。这在图2中用箭头进行图形化表示。在图2中所示的实施方案中，第一量的氨基酸“X” 150已经与第一量的溶剂152以及第一量的其它试剂154预混。更具体地，第一量的氨基酸“X” 150在其添加到第一反应器106之前已经与其它试剂154和溶剂152混合。在另一些实施方案中，第一溶剂152和/或其它试剂154也可在第一量的氨基酸“X” 150之外序贯和/或同时添加到第一反应器106中。在一些实施方案中，第一量的溶剂152可以是DMF。在一些实施方案中，其它试剂154是用于“活化”氨基酸“X” 150和/或无保护N-基团120a和/或促进偶联反应的试剂。因此，在一些实施方案中，其它试剂154可以是DIC和oxyma。
一旦将氨基酸“X” 150（和第一量的溶剂152和其它试剂154）添加到第一反应器106中，允许偶联反应继续进行。这种反应在无保护N-基团120a和氨基酸“X”之间发生。在一段时间（例如30分钟或本领域技术人员理解如何计算/确定的一些其它设定时间量）后，可将第一量的氨基酸“X” 150从第一反应器106中除去（如箭头160所示）。在一些实施方案中，可将这种第一量的氨基酸“X” 150转移到第二反应器108。第一量的溶剂152和/或其它试剂154也可从第一反应器106中除去并转移到第二反应器108。
一旦在第二反应器108中，第一量的氨基酸“X”（以及第一溶剂152和/或其它试剂154）可用于与第二反应器108中的无保护N-基团120a反应。同样地，可将第二量的氨基酸“X” 170添加到第一反应器106中。（这种第二量的氨基酸“X” 170仍然可与其它试剂154和/或溶剂152预混）。在一段时间（例如30分钟）后，可将第一量的氨基酸“X” 150从第二反应器108中除去（如箭头164所示）。可将这种第一量的氨基酸“X” 150从第二反应器108转移到第三反应器112。如果使用第一量的溶剂152和/或其它试剂154，它们也将从第二反应器108中除去并转移到第三反应器112。可将第二量的氨基酸“X” 170从第一反应器106中除去（如箭头174所示）。可将这种第二量的氨基酸“X” 170从第一反应器106转移到第二反应器108。
可将第三量的氨基酸“X” 180添加到第一反应器106中。（这种第三量的氨基酸“X”180仍然可与其它试剂154和/或溶剂152预混并可来自与第一量150和/或第二量170相同的批次）。允许反应继续进行以使第一、第二和第三反应器106、108、112中的无保护N-基团120a与氨基酸“X”反应并偶联到氨基酸“X”上。一旦这一反应完成或在一段时间后，可将第一量的氨基酸“X”从第三反应器112中除去并送往废物或再循环回第一反应器106（如箭头188所示）。（这样的再循环使得这种反应更像分批，因此较不合意。实际上，如果需要分批模式，更好的是将反应器并联耦合）。以类似方式，可将第二量的氨基酸“X” 170转移到第三反应器112（并如箭头166所示发生反应）并且可将第一量的氨基酸“X” 180转移到第二反应器108和随后转移到第三反应器112（并允许在各反应器中反应）。以这种迭代方式，该反应“串联”进行并且第一、第二和第三量的氨基酸“X” 150、170、180循环经过反应器106、108、112。以这种方式，氨基酸量150 170 180，单独地或共同地，用于与第一、第二和第三反应器106、108、112中的无保护N-基团120a反应并将氨基酸“X”偶联到脱保护N基团120a上。
在一些实施方案中，可能有利的是，在溶液从一个反应器转移到下一个反应器（例如从第一反应器106转移到第二反应器108或从第二反应器108转移到第三反应器112）之前过滤溶液。本领域技术人员会意识到这种过滤可如何进行。
要认识到，使用如本文概述的串联反应器可提供用于脱保护和/或洗涤步骤的溶剂量的减少。例如，如果使用传统分批处理，脱保护反应需要哌啶在DMF中的20%溶液。将这种溶液分成10个体积，每个分批反应器用这种溶液反应3次。这导致每个反应器使用大约30L/kg。但是，如果三个反应器如本文所教导串联使用，哌啶在DMF中的20%溶液仍基于各反应器中的树脂量分成10个体积，并经过该系列的三个反应器反应3次（迭代）。为了使反应器2和3经受的哌啶当量数大于或等于批量（batch），可以使用10 L/kg的第四个装料。在此，哌啶溶液的总量为40/3 = 13.3 L/kg，减少了2.25倍。
过量氨基酸数越高和氨基酸成本越高，使用串联反应器进行偶联就越有利。例如，Lys20 IV解偶联试剂的价格可能为大约$20/克；因此，减少过量试剂的量可显著节省成本。但是，由于反应溶液在树脂中的滞留，过量当量（excess equivalents）的数目越低，并联运行偶联反应越有利，以防止一定百分比的过量当量在没有稀释的情况下输送到下一个反应器。如果过量的氨基酸当量为大约2或更小并且如果它们是标准的廉价氨基酸，则选择并联运行偶联反应但串联运行脱保护和洗涤。
应该指出，在一些实施方案中，串联反应器的数量越大，每公斤产物所需的总溶剂和试剂越少。这类似于流动化学原理，即越大数量的串联CSTR（连续搅拌釜反应器）越接近理想活塞流。在一些实施方案中，由于在减少废物与设备成本之间的权衡，相信串联三个反应器可能是最佳的。换言之，可以设计这样的实施方案，其中通过串联多于3个至5个反应器达到收益递减。为了在洗涤结束时实现相同的最大残留试剂浓度，串联的3个反应器可将溶剂需求与单批处理相比减少一半。当然，可设计其它实施方案，其中使用多于三个或多于五个反应器。可设计其中串联使用两个反应器的其它实施方案。
在一些实施方案中，可能需要通过质量测量所有试剂装料（reagent charges）并使用（由St. Louis Missouri USA的Emerson公司提供的）DeltaV分布式控制系统（而非基于Windows的用户界面）。这是因为在DeltaV中归档也是自动完成，并且该系统可创建已执行的主批记录。此外，在DeltaV系统中，大部分操作通过远程访问进行，这可从世界上任何有互联网的地方实现。DeltaV系统可设置为在过程中发生重要步骤时或在有任何事情需要注意时向操作人员、化学家、工程师和分析师的手机发送描述性文本消息，随后在大多数情况下远程处理。最好的市售实验室研究规模SPPS技术的常见问题之一是在肽构建过程中的某个时刻的控制系统崩溃、错过装料（miss charges）或错误输出。错过试剂装料（reagentcharges），因为它们借助液位传感器完成。相比之下，该系统可设计为通过来自称重秤的质量进行所有试剂装料。单个实验通常需要运行多于一个月，例如如果肽具有多于30个氨基酸。在一个月实验接近结束时的氨基酸错误装料意味着实验必须重新开始，并且连同浪费的材料一起浪费了一个月（或合成所需的其它时间）。DeltaV自动化不太可能发生这种情况，因为其设计得更可靠和稳健，因为其是GMP生产的行业标准。
在进一步实施方案中，由于其在线分析，该系统可被设计为提供比其它市售合成仪多得多的过程信息和了解。树脂上的肽的在线LCMS（液相色谱/质谱法）同时量化所有平行反应器中的所有脱保护和偶联的反应转化率和动力学。计时与化学过程集成，因为运行该过程的同一个DeltaV系统也运行在线分析。因此，工作人员可能不需要在实验室中采集和分析样本以作出前向处理决策。
为了获得在线LCMS系统，可以执行以下步骤：
1. 从树脂反应器中取出1.0 mL浆料
2. 在小反应器中立即用TFA裂解（从取出样品到开始用TFA裂解的时间为大约2分钟）
3. 在LC（液相色谱）稀释剂中稀释裂解肽溶液并混合
4. 穿过实验室输送溶液并存放在LC进样环路上（无气泡）
5. 切换环路以在LC上注入样品
6. 将废树脂珠从裂解反应器冲洗到废物中
7. 用溶剂清洗样品阀和管道。
但是，应该指出，为了实施这种在线LCMS，流垂直向上经过进样阀以使它们被无气泡地完全填充。两个三通阀用于将浆料样品从样品环路转出并将其吹入裂解和脱保护区。单个螺线管输气管连接到这两个阀的致动器，以使它们正好同时切换，这对于每个样品得到正好1毫升浆料可能是重要的。然后，浆液一路经过样品区，然后继续向上越过样品阀。这可能是重要的，以致即使反应器的粘度和浆料密度从一个步骤到下一个步骤变化并且经过阀之后的流动距离变化时，样品阀也被代表性的浆料密度充满。来自反应器的浆料样品管一直向上到样品阀。这是重要的，以致稍后在反向泵送回反应器时，该管道干净。其最大限度减少夹带并防止固体堵塞。稀释cart每次完成样品后，使用溶剂冲洗样品阀。否则，它们最终会被固体堵塞。溶剂在远离阀的向后方向进入样品阀与蠕动泵之间，然后向前推进经过阀。溶剂段塞（solvent slugs）每次一路冲入裂解区以清除树脂固体。经过阀之后，浆料继续朝上坡方向流动。这个上坡方向的流动足够长，以致有足够的裕度确保代表性的样品进入样品环路，但浆料不会越过顶点并开始向下流回。如果这样，其会到达蠕动泵，这可导致夹带问题，还会磨碎树脂，以造成反应器中的过滤性问题。蠕动泵位于样品环路的下坡部分之后，而非样品环路的上游。当其位于样品环路的上游时，其造成夹带问题并磨碎树脂，以引起反应器过滤性问题。可以使用阀（其可以定制），在阀体上焊接额外端口，以使稀释溶剂直接在球顶部进入并向上推送，这将稀释溶剂与裂解溶液完全混合并且还扰动沉积在球顶部的树脂床。
现在一起参考图1和2，现在描述肽序列中的下一个氨基酸的添加。该序列中的这种下一个氨基酸可被指定为“Z”，意味着其可以是所需的任何氨基酸（如上所述，氨基酸“X”也可以是所需的任何氨基酸）。上文概述的步骤和过程用于将氨基酸“X”偶联到树脂上。（因此，氨基酸“X”成为肽序列中的第一个氨基酸）。一旦这种氨基酸“X”已经偶联并附着于树脂，第一、第二和/或第三反应器106、108、112中的树脂可用溶剂洗涤。这种溶剂通常是上文概述的相同溶剂。这种洗涤可以本文概述的序贯（例如串联）方式进行。因此，例如，可将第一追加量的溶剂添加到第一反应器106中，在第一反应器106中搅拌，然后转移到第二反应器108（并用于洗涤第二反应器108中的树脂），然后转移到第三反应器112。同样地，一旦将第一追加量的溶剂从第一反应器106中除去，可将第二追加量的溶剂添加到第一反应器106中（并循环经过其它反应器）。（第三量的追加溶剂也可同样循环经过该系统）。换言之，洗涤步骤可以以上文概述的顺序和方式进行。
一旦反应器106、108、112已经用溶剂洗涤，可将第一追加量的脱保护试剂添加到第一反应器106中，然后（在一段时间后），从第一反应器106中移出并添加到第二反应器108中。这种第一追加量的脱保护试剂随后（在一段时间后）也从第二反应器108中除去。将第二追加量的脱保护试剂添加到第一反应器106中，反应一段时间，然后从第一反应器106中除去并转移到第二反应器108，在其中反应，然后从第二反应器108中除去（和然后以本文概述的方式添加到第三反应器112中）。这种第一和第二追加量的脱保护试剂（和第三追加量的脱保护试剂），单独地或共同地，发挥作用以将第一和第二反应器中的氨基酸“X”的受保护N-基团脱保护。
在这种与脱保护试剂的反应后，（附着于树脂的）氨基酸“X”准备好偶联到所需序列中的下一个氨基酸“Z”。因此，以本文概述的方式，进行以下步骤：
将第一量的氨基酸“Z”添加到第一反应器106中；
将第一量的氨基酸“Z”转移到第二反应器108；
将第二量的氨基酸“Z”添加到第一反应器106中，其中第一和第二量的氨基酸“Z”，单独地或共同地，将氨基酸“Z”偶联到第一反应器106中的氨基酸“X”的脱保护N基团上；
将第一量的氨基酸“Z”从第二反应器108中除去；和
将第二量的氨基酸“Z”从第一反应器106转移到第二反应器108；和
将第二量的氨基酸“Z”从第二反应器108中除去，
其中第一和第二量的氨基酸“Z”，单独地或共同地，将氨基酸“Z”偶联到第二反应器108中的氨基酸“X”的脱保护N基团上。
本领域技术人员会认识到，氨基酸“Z”也可使用这些系列的反应器和试剂以类似方式与第三反应器112中的氨基酸“X”反应（依序加入各氨基酸）。因此，以这种方式构建氨基酸序列。然后迭代重复该过程，以如SPPS合成中已知的那样添加下一个氨基酸，再下一个，等等。
现在参考图3，显示用于将氨基酸“X”偶联到附着于肽合成树脂的受保护N-基团上的系统300的另一实施方案的图解视图。具体地，系统300包括多个储罐301，它们被设计为容纳一定量的氨基酸。具体地，要添加到肽链中的每个特定氨基酸可具有其自己的单独储罐301。此外，每个罐301可具有其自己的泵303，其被设计为将氨基酸（可溶解在溶液中）从储罐301泵出到活化反应器307中。具体地，泵303将氨基酸溶液经由管线309泵出罐301，进入管线311，并进入反应器307。本领域技术人员会意识到如何连接这种管道/管路和泵303以实现氨基酸溶液从各个罐301到反应器307的这种转移。在图3中仅显示3个不同的氨基酸罐301。可根据需要使用更多。
任选地，一个或多个流量传感器313可连接到管线309和/或泵303以感测经过管线（并进入反应器307）的氨基酸的流量，从而可按需要调节量、流速、流动定时等。此外，阀317可用于将氨基酸流转移回进料容器301以启动泵。本领域技术人员会意识到如何使用阀和/或惰化排气系统（inerting vent system）327，根据需要，惰化排气系统（inerting ventsystem）327还可为安全起见而包括排气口329以及溢流容器。
类似地，系统300包括多个储罐353，它们被设计为容纳一定量的其它试剂，如DIC、oxyma等和其它洗涤溶剂。此外，每个罐353可具有其自己的泵355，其被设计为将液体从储罐353泵出到活化反应器307或任何过滤反应器306、308、312中。本领域技术人员会意识到如何连接这种管道/管路和泵355以实现这种转移。在图3中仅显示3个不同的进料罐353。可根据需要使用更多。
任选地，一个或多个流量传感器359可连接到来自泵355的管线以感测经过管线的流量，从而可按需要调节量、流速、流动定时等。此外，阀357可用于将流转移回进料容器353以启动泵。本领域技术人员会意识到如何使用阀和/或惰化系统（inerting system）363，根据需要，惰化系统（inerting system）363还可为安全起见而包括排气鼓泡器361以及溢流容器。
如上所述，系统300包括活化反应器307。活化反应器307通常位于第一反应器306、第二反应器308和第三反应器312的上游。活化反应器307可任选包括搅拌器333，其被设计为混合活化反应器307内的内容物（溶液）。也可将温度探针335添加到活化反应器307中。也可（任选）包括与夹套345关联的循环器341。
可以设计活化反应器307以使其通过将氨基酸溶液与DIC和oxyma预混而“活化”氨基酸溶液。本领域技术人员会意识到可以如何将DIC和oxyma（和/或溶剂和一些其它活化剂和碱）添加到反应器307中。
系统300还包括脱保护溶液容器371，其容纳脱保护试剂。（在图3中所示的实施方案中，脱保护试剂是哌啶，尽管也可使用其它材料）。一个或多个阀369和泵365可被设计为将脱保护试剂（经由管线367）泵送至第一反应器306（经由输入管线379）。泄压阀381可任选添加到管线367。此外，在容器371内可任选使用压力传感器385。根据需要，可任选使用附加阀383作为容器371的排气系统的一部分。
用于溶剂（在这种情况下可以是DMF或一些其它溶剂）的储存容器371a也可用作系统300的一部分。储存容器371a可包括（任选地）压力传感器373以测量溶剂的压力。一个或多个阀375和泵377可用于输送溶剂容器371a。溶剂经由管线381输送到活化反应器307、第一反应器306、第二反应器308或第三反应器312。流量传感器383可（任选地）用于测量经过管线381的流量。可根据需要任选使用附加排气阀386。
如同上述实施方案，第一、第二和第三反应器306、308、312包含容纳在其中的一定量的树脂（如Sieber树脂）并串联布置在活化反应器307的下游。出于安全目的，这些反应器可包括惰性顶空计量氮气供应（inert headspace metered nitrogen supply）403和一个或多个排气溢流容器401。如本领域技术人员会意识到，可以设计其它排气口和/或安全措施。
如上所述，将溶剂溶液经由一个或多个管线381连接到第一、第二和第三反应器306、308、312的每一个以及连接到活化反应器307。一个或多个阀405可以控制溶剂流入这些容器的每一个。在另一些实施方案中，这些反应器的每一个的溶剂进入点可以是“喷雾球（spray ball）”或能够将溶剂高效引入容器以及能使溶剂“冲洗”容器侧面（和可能位于其上的任何固体）由此确保所有树脂适当混合并暴露于试剂和洗涤溶剂的其它喷雾构件（spray feature）。（实际上，在添加每种特定氨基酸之间“洗涤”反应器306、308和312中的树脂时，通常建议以这种方式用溶剂喷洒反应器306、308和312）。
如上所述，离开活化反应器307的溶液经由出口底部端口和相连管道离开。在该出口管线的流中可任选存在流量传感器409、一个或多个控制流的阀411以及泵413。此外，出口管线可包括一个或多个阀415，其允许自动化以选择性控制经过管线的溶液流，以使该溶液可被引导到废物419或被引导到第一、第二和/或第三反应器306、308、312。（通常，系统300运行以使第二和第三反应器308、312与第一反应器306串联，以使流首先进入第一反应器306，但是阀415（其可以是三通阀（或二通阀或四通阀等）使用户能够控制该流并在需要时对其进行修改）。
这种系统300中所用的第一、第二和第三反应器306、308和312与上述那些类似和/或相同。这些反应器306、308和312可任选各自包括搅拌器421和温度传感器423。第一、第二和第三反应器306、308和312包括充当用于构建肽的基底的树脂。这种树脂包括受保护N-基团，其可借助来自容器371的脱保护试剂脱保护，然后与活化的氨基酸溶液（其在反应器307中活化）反应，由此将这种氨基酸偶联到序列/树脂（使用SPPS技术）。通过序贯进行这些步骤，可根据需要添加来自罐301的不同氨基酸。
如上所述，第一反应器306、第二反应器308和第三反应器312可串联安置。相应地，第一量的活化氨基酸在第一反应器306中反应，然后将该量以上文概述的方式序贯送往第二和第三反应器308、312（并将新的量的活化溶液添加到第一反应器306中）。为了促进这种流动，各反应器306、308、312可包括过滤器427以确保固体肽树脂珠和/或固体形成肽（solid forming peptide）保留在反应器306、308、312中。可任选地和/或根据需要使用流量传感器433、阀437和泵435以在第一、第二和第三反应器306、308、312之间引导这种“串联”流。同样地，取样装置441可定位在整个系统中的任何地方（或视需要的多个取样装置441）以对流经系统300的物质进行取样，从而确保其正确运行或检查废物料流以确定何时洗涤充分。
应该指出，在图3的实施方案中，阀437可被设计为使得第一、第二和第三反应器306、308、312的输出可依序串联流动和/或可通向废物419。这样做以使自动化可以控制所需流动。此外，在图3中，来自第三反应器312的输出管线显示为通向废物419。如上所述，实施方案可被设计为当反应器306、308和312和/或活化反应器307用溶剂洗涤时，溶剂重复使用（并送回反应器），由此使该系统更环保。同样地，活化氨基酸溶液可流过第一、第二和第三反应器306、308和312，然后再次再循环经过相同的反应器（和/或活化反应器307）（多次，根据需要）——作为再次实施反应的手段（但如果需要，更好的是并行运行反应）。例如，在添加每种特定氨基酸之间“洗涤”树脂时，这种洗涤通常在10个不同的洗涤步骤中进行。如果这样，前2至8次洗涤可用预先使用的溶剂进行，因为尽管这种溶剂可能有杂质，但其对于前几批洗涤而言足够“干净”，然后用纯溶剂进行最后几次洗涤（2至8次洗涤）。来自最后2至8次洗涤的洗涤溶剂收集在再循环容器中以用于下一个循环的前2至8次洗涤。这样，整个洗涤过程中使用的溶剂量减少。
现在参考图4，显示系统500，其是可与图1-3的实施方案结合使用的在线LCMS系统。具体地，系统500被设计为对溶液和上述反应器中的固相树脂结合的肽样品进行测量，由此为操作人员提供关于系统中正在发生的情况的实时信息。
系统500包括裂解溶液罐503。在许多实施方案中，这种裂解溶液是TFA，其被设计为从树脂上裂解形成的肽（并因此从树脂上分离出形成的肽）。TFA也可用于淬灭偶联反应。阀518p、518q和518s如图4中所示用于控制TFA溶液（或裂解溶液）流入该系统。还可能存在裂解溢流区507，其包括管线508以及溢流容器509和测量区511（以及连接到氮气供应522的阀518r）。这种系统507被设计为测量TFA的所需量并将所有多余的量送回储存容器503。本领域技术人员会意识到如何实施这些安全措施（safety features）和/或流动措施（flowfeatures）以控制TFA溶液流。这可能涉及使用一个或多个阀518。
系统500还包括混合罐510（其可以是500毫升容器）。混合罐510可从由阀518a控制的溶剂管线512接收来自反应器溶剂（其可以是DMF）的浆料样品。这些管线512（连同阀518b和518a）能够从反应器（无论是活化反应器，还是上述第一、第二或第三反应器）中回收浆料。管线512可具有1/8英寸的内径和1/4英寸的外径。管线512和阀518a和518b也允许将气体（来自氮气供应522）添加到该系统以及“泵循环（pump around）”回路中。阀518a还允许材料流向反应器回路（reactor return）524和从反应器525流出。阀518b允许根据需要从集管526获得DMF（溶剂）。管线512的目的是提取反应浆料的样品（例如1毫升），以使其可添加到罐510中。阀可用于确保材料流出反应器525，（和如有必要，向上流动）以使浆料不会到达泵，以防止树脂珠的研磨。相应地，通过切换阀和使用氮气，可以提取浆料并通过向后泵送将剩余部分送回反应器525，没有在泵中研磨树脂。本领域技术人员会意识到如何做到这一点。
除浆料样品外，进入混合罐510的另一进料来自稀释剂供应520，其根据需要添加溶剂或其它材料以稀释1毫升样品。这种稀释剂供应520经由管线528连接到混合罐。也可使用稀释剂溢流系统527。该系统527还可包括稀释剂溢流区529，其包括管线528以及溢流容器529和测量区521（以及连接到氮气的阀518e和518l）。阀518h控制流入溢流容器529的流。这种稀释剂溢流系统527被设计为测量稀释剂的所需量并将所有多余的量送回储存容器520。本领域技术人员会意识到如何实施这些安全措施（safety features）以及如何控制稀释剂溶液流。
一旦在混合罐510中，裂解和稀释的样品将经由管线540流向阀518m。该管线540将材料（通常是从树脂上裂解的肽或生长的氨基酸序列）送往HPLC 544以供分析。可在HPLC的上游使用储存罐541（其可以是300毫升容器）以通过重力从液体中分离气泡并根据需要储存样品。
混合罐510可根据需要连接到管线550（和阀518j）以将混合罐510排气。传感器551，如压力或温度传感器（或其它传感器）可测量该管线（或通常该系统中——如果安置在系统500中的其它位置）中的条件。压力传感器551在自动化序列中用作何时前进到下一步骤的指示。
通常，在混合罐510中混合30分钟以留出时间将肽脱保护后（和稀释后），可经由管线555从混合罐510中提取出材料并允许沉积在阀518k处或附近。一旦将阀518k打开，液体和/或废树脂珠可经由管线555流入废物546。腐蚀剂鼓泡器（caustic bubbler）557可用作清洗可能在管线555中的任何TFA的安全机构。根据需要，氮气或其它气体可经由管线561和阀562添加到废物546中以促进这种洗涤。还可以添加其它安全措施（safety features），如气液分离罐（knockout pot ）569。气液分离罐569被设计为使鼓泡器液体无法吸回该系统。如图4中所示，这种气液分离罐569也可经由管线580连接到供应氮气或其它气体的氮气供应581以使569、546和557保持惰性化。
本领域技术人员会意识到应使用图4中概述的系统500从反应器中取样的频率。在一些实施方案中，在偶联反应进行的过程中，可以规则的间隔进行取样，如每45分钟一次。在另一些情况下，可能以其它间隔进行取样，如每60分钟一次或在洗涤步骤的过程中。当然，本领域技术人员可设计其它取样频率。
在另一些实施方案中，在将活化反应器的内容物添加到第一反应器之前，可自动进行从活化反应器中取样。这样做的原因是为了验证已添加到活化反应器中（并且随后将添加到第一、第二和第三反应器中）的氨基酸是所需的氨基酸——例如该序列中的下一个氨基酸。这样做的原因在于，例如，如果25个氨基酸已经反应在一起并且添加了“错误”的氨基酸，那么整个肽序列将是错误的，肽的合成不得不从头开始（从一开始）。因此，为了防止这种错误，氨基酸在其投入偶联反应前自动取样，由此将添加“错误”氨基酸的机会减至最低。
现在参考图5，显示图1中所示的反应器106、108和112的透视图。如图5中可见，树脂120是多孔的，以致一些活化酯溶液（如本文概述）可吸收在孔隙中并继续反应（如本文概述）。
本实施方案的另一方面在于在线LCMS系统可与第一反应器一起使用。这可以是本文所述的在线LCMS系统，与本文所述类型的串联反应器系统的第一反应器一起使用。可以设计其它实施方案，其中在线LCMS系统与单个反应器一起使用，其在一些实施方案中可以是分批反应器。该LCMS系统的优点在于可在反应过程中的各种时间（如反应开始、中间和/或结束）自动提取精确样品（如1毫升）。用户能够编程何时自动提取样品。提取的样品可用于测试反应如何进行且反应是否完成。这样的取样可在活化、反应步骤的过程中和/或在洗涤步骤的过程中进行。通过使用这种LCMS，可能不需要Kaiser试验（其通常用于监测肽偶联的进程）（由此节省成本和时间）。取样还可提供对反应的实时监测，这在生产规模下尤其有价值。尽管目前存在Mettler Toledo smaplers之类的取样器，但这种设备并未用于SPPS反应器，并且不包括用于裂解和脱保护、稀释、混合、与废树脂珠分离、输送到LCMS和存放在LCMS切换环路上的装置和方法。图4中所示的在线LCMS系统的自动化序列的详细程序如下。
Cart 491 肽合成的蠕动取样序列
更新: 2020年12月15日
通过排气（venting down）开始. 阀打开:
打开618A、518k [618A、518k]
等待用户输入时间“Vent PSI Read Dly”
等待直至PT < “Vent Low”
关闭618A、518k [ ]
样品
打开阀518j [518j]
命令样品蠕动泵开始“forward”
等待用户输入时间“Pump1 Time1”
命令样品蠕动泵停止
接通阀518a（三通阀连向样品） [518a、518j]
等待“AB open time”
切断阀A（三通阀返回到反应器 / racetrack） [518j]
命令样品蠕动泵改变方向为“backwards”
等待用户输入时间“Pump1 CCW time”
命令样品蠕动泵停止
添加裂解溶液
打开518r、518s [518j、518r、518s]
等待5秒以将裂解溶液瓶加压
关闭518r、518s [518j]
打开518q [518j、518q]
等待5秒以将裂解溶液测量区排气
关闭518q [518j]
打开518p [518j、518p]
等待用户输入时间“P Open Time”
关闭518p [518j]
打开518r、518s [518j、518r、518s]
等待用户输入时间“S Open time”
关闭518s [518j、518r]
打开518q [518j、518q、518r]
等待用户输入时间“Q Open time”
关闭518r、518q [518j]
脱保护
等待“Deprotect Time”
同时等待
每个“Mix Delay Time”（用户输入参数）
打开阀L、618A [518j、L、618A]
等待“Mixing Time”（用户输入参数）
关闭阀L、618A [518j]
关闭阀518j [ ]
测量稀释剂
打开G [G]
等待用户输入时间“G Open Time”
关闭G [ ]
打开518e、518h [518e、518h]
等待用户输入时间“DEH Open Time”
关闭518h [518e]
打开518r、518q以将混合罐加压 [518e、518q、518r]
等待直至PT > Mix Pot Close
关闭518r、518q [518e]
打开M1、M2 [518e、M1、M2]
等待直至PT < LVS Empty / M2 Cls
关闭M1 M2 [518e]
混合裂解样品和稀释剂
打开阀618a [518e、618a]
等待直至PT > 用户输入设定点“Mix Pot Close”
关闭阀618a [518e]
沉积（Settling）
等待用户输入“settling time”
转移到HPLC
打开阀M1 [518e、M1]
等待直至PT < “M1 Close PSI”
关闭阀M1 [518e]
从混合罐中排空剩余浆料
打开618a [518e、618a]
等待直至PT > 用户输入设定点“Mix Pot Close”
关闭618a [518e]
打开518k [518e、518k]
等待直至PT reads < “Vent Low”
关闭518k [518e]
如果Agilent:
样品存放在HPLC上
打开618a [518e、618a]
等待直至PT > 用户输入设定点“mix pressure”（与上文相同的设定点）
打开M1 [518e、618A、M1]
等待“M3 Open Delay”
打开M3 [518e、618A、M1,M3]
等待“M3 Open Time”
关闭M3、618a、518e、M1 [ ]
向HPLC发送信号以提取样品
排气
打开618a、518q、518k [618a、518k、518q]
等待用户输入“Vent PSI Read Dly”
等待直至PT reads < “Vent Low”
关闭518q、618a、518k [ ]
等待直至下一个命令样品
泵洗涤
在最后一个偶联或脱保护样品后进行.
接通阀518a（三通阀连向混合罐） [518a]
打开阀518b (DMF) [518a、518b]
命令样品蠕动泵运行“forward”达到用户输入时间
命令样品蠕动泵停止
关闭阀518b [518a]
切断阀518a（三通阀返回到反应器 / racetrack） [ ]
阀洗涤:
命令样品蠕动泵运行“reverse” 1秒
命令样品蠕动泵停止
接通阀518a（三通阀连向混合罐） [518a]
打开518k阀 [518a、518k]
等待5秒
关闭518k阀 [518a]
切断阀518a（三通阀返回到反应器 / racetrack） [ ]
重复阀洗涤3次
命令样品蠕动泵运行“reverse”达到用户输入时间
命令样品蠕动泵停止。
实施例1
通过固相肽合成（SPPS）构建tirzepatide
tirzepatide（图6）含有39个氨基酸的主链，通过线性固相肽合成（SPPS）实现其合成。tirzepatide合成通过首先使用如下所述的串联反应器法构建如图7中所示的39-mer主链中间体进行。要注意，在tirzepatide合成过程中，39-mer主链中间体（图7）经由连接于丝氨酸-39的-NH2基团连接到固体载体（如本文所述的Sieber树脂）上。
表1列举39个氨基酸的每一个用于构建tirzepatide主链的顺序。例如，丝氨酸是主链合成中使用的第一个氨基酸，其是存在于tirzepatide的位置39的氨基酸。在线性SSPS中从Ser39至Aib2使用的每个氨基酸的氮都被α-氮上的9-芴甲氧羰基（Fmoc）保护，除了Tyr1，其被α-氮上的叔丁氧羰基（Boc）保护。对于如表1中所示的侧链保护基团，氧用叔丁基（tBu）保护，氮用三苯甲基（Trt）、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-叉基)-3-甲基丁基（ivDde）或Boc保护。
表
Figure 153973DEST_PATH_IMAGE001
. 用于通过SPPS构建Tirzepatide的39个氨基酸的顺序
氨基酸(AA)添加顺序 肽上的AA位置 AA名称 用于偶联步骤的AA
1 39 丝氨酸 Fmoc-Ser(<i>t</i>Bu)-OH
2 38 脯氨酸 Fmoc-Pro-OH
3 37 脯氨酸 Fmoc-Pro-OH
4 36 脯氨酸 Fmoc-Pro-OH
5 35 丙氨酸 Fmoc-Ala-OH
6 34 甘氨酸 Fmoc-Gly-OH
7 33 丝氨酸 Fmoc-Ser(<i>t</i>Bu)-OH
8 32 丝氨酸 Fmoc-Ser(<i>t</i>Bu)-OH
9 31 脯氨酸 Fmoc-Pro-OH
10 30 甘氨酸 Fmoc-Gly-OH
11 29 甘氨酸 Fmoc-Gly-OH
12 28 丙氨酸 Fmoc-Ala-OH
13 27 异亮氨酸 Fmoc-Ile-OH
14 26 亮氨酸 Fmoc-Leu-OH
15 25 色氨酸 Fmoc-Trp(Boc)-OH
16 24 谷氨酰胺 Fmoc-Gln(Trt)-OH
17 23 缬氨酸 Fmoc-Val-OH
18 22 苯基丙氨酸 Fmoc-Phe-OH
19 21 丙氨酸 Fmoc-Ala-OH
20 20 赖氨酸-ivDde Fmoc-Lys(ivDde)-OH
21 19 谷氨酰胺 Fmoc-Gln(Trt)-OH
22 18 丙氨酸 Fmoc-Ala-OH
23 17 异亮氨酸 Fmoc-Ile-OH
24 16 赖氨酸 Fmoc-Lys(Boc)-OH
25 15 天冬氨酸 Fmoc-Asp(<i>t</i>Bu)-OH
26 14 亮氨酸 Fmoc-Leu-OH
27 13 2-氨基异丁酸 Fmoc-Aib-OH
28 12 异亮氨酸 Fmoc-Ile-OH
29 11 丝氨酸 Fmoc-Ser(<i>t</i>Bu)-OH
30 10 酪氨酸 Fmoc-Tyr(<i>t</i>Bu)-OH
31 9 天冬氨酸 Fmoc-Asp(tBu)-OH
32 8 丝氨酸 Fmoc-Ser(<i>t</i>Bu)-OH
33 7 苏氨酸 Fmoc-Thr(<i>t</i>Bu)-OH
34 6 苯基丙氨酸 Fmoc-Phe-OH
35 5 苏氨酸 Fmoc-Thr(<i>t</i>Bu)-OH
36 4 甘氨酸 Fmoc-Gly-OH
37 3 谷氨酸 Fmoc-Glu(<i>t</i>Bu)-OH
38 2 2-氨基异丁酸 Fmoc-Aib-OH
39 1 Boc-酪氨酸 Boc-Tyr(<i>t</i>Bu)-OH
串联反应器法
如下制备哌啶在DMF中的20体积%溶液：通过添加DMF将哌啶（800 mL）稀释至4.0 L的体积，以获得20体积%的溶液。
如下制备oxyma在DMF中的0.68 M溶液：将(羟基亚氨基)氰乙酸乙酯（oxyma，386.85 g，2.722 mol）溶解在DMF中直至4.0 L的体积，以获得0.68 M溶液，然后将氮气以2SCFH鼓过该溶液。
如下制备DIC在DMF中的0.60 M溶液：将N,N'-二异丙基碳二亚胺（340.8 g，2.700mol）溶解在DMF中直至4.5 L的体积，以获得0.60 M溶液，然后将氮气以2 SCFH鼓过该溶液。
如下制备丝氨酸在DMF中的0.375 M溶液：将FMOC-Ser(tBu)-OH（431.3 g，1.318mol）溶解在DMF中直至用DMF达到3.0 L的体积，摇动以溶解，然后将氮气以2 SCFH鼓过该溶液。以类似的方式，制备表1中所示的每个氨基酸的0.375 M溶液。
如下制备反应系统：为三个大小相等的反应器配备过滤网以在泵出溶液时保留固体树脂。标记反应器“RB1”、“RB2”和“RB3”并添加Sieber树脂（500 g，0.70 mmol/g，350mmol），在反应器之间等分。将1500 mL DMF添加到各反应器中并在室温下搅拌24小时以使树脂溶胀。
通用程序A - F-moc脱保护和DMF洗涤过程: 向RB1中加入哌啶溶液（20体积%在DMF中，1365 mL）并在室温下搅拌30 min。将哌啶溶液从RB1泵送到RB2，然后向RB1装载另一份哌啶溶液（20体积%在DMF中，1386 mL）并将反应器RB1和RB2搅拌30 min。在搅拌时间结束时，将哌啶溶液从RB2泵送到RB3，将哌啶溶液从RB1泵送到RB2，然后向RB1装载另一份哌啶溶液（20体积%在DMF中，1407 mL）。将所有三个反应器在室温下搅拌30 min。将哌啶溶液从RB3泵送到废物，然后将哌啶溶液从RB2泵入RB3，然后将哌啶溶液从RB1泵入RB2。将RB2和RB3在室温下搅拌30 min。将哌啶溶液从RB3泵送到废物，然后将哌啶溶液从RB2泵送到RB3。将RB3在室温下搅拌30 min，然后将哌啶溶液从RB3泵送到废物。以这种方式，哌啶溶液已泵送经过串联的三个反应器三次并且每次搅拌各30分钟。
在所有三个份额的哌啶溶液已搅拌经过所有三个反应器并送往废物收集后，将DMF（1218 mL）添加到RB1中并在室温下搅拌5 min。然后将该溶剂从RB1泵入RB2并将DMF（1208 mL）添加到RB1中。这两个容器都在室温下搅拌5 min。将该溶剂从RB2泵送到RB3并从RB1泵送到RB2。将DMF（1758 mL）添加到RB1中并将所有三个容器在室温下搅拌5 min。重复这一相同程序直至DMF溶剂的份额已泵送经过串联的三个反应器（每次都将DMF溶剂从RB3泵送到废物），每个反应器总共洗涤8次，总共使用12.66 L（11.95 kg）DMF。平均DMF洗涤体积为1580 mL。目标洗涤体积为每次洗涤1400 mL，因此对于肽合成中的后续氨基酸，调节泵和进料罐压力，以使后续装料接近1400 mL。
通用程序B –氨基酸活化和偶联过程: 向标记为“RA”的夹套反应器中加入丝氨酸溶液（0.375 M在DMF中，774 g）、oxyma溶液（0.68 M在DMF中，422 g），然后DIC溶液（0.60 M在DMF中，506 g）。将溶液在15℃下搅拌30min以获得活化丝氨酸溶液，然后将这种溶液添加到RB1中。重复这一过程以在反应器RA中制备活化丝氨酸溶液并将其添加到RB2中，然后再次重复该过程并将活化丝氨酸溶液添加到RB3中。3个反应器各自在偶联反应的过程中具有大约2200-2300 mL的总浆料体积，这等于活化酯溶液加上溶胀树脂的体积。将反应器RB1、RB2和RB3在室温下搅拌8小时，然后从所有三个反应器中沥出溶剂。
以与通用程序A类似的方式用DMF溶剂串联洗涤反应器RA、RB1、RB2和RB3，每个反应器总共洗涤7次。前3次洗涤在泵入RB1之前泵送到RA中的喷雾球（spray ball）。因此前3次洗涤串联经过RA、RB1、RB2和RB3。但是，在每次从RA中泵出洗液时，将一小部分溶剂冲洗液从RA泵送到RB3（~30 mL），然后将一小部分溶剂冲洗液从RA泵送到RB2（~30 mL），然后将大部分溶剂泵送到RB1（~1340 mL），然后抽空RA和RB3之间的管道并抽空RA和R2之间的管道。这冲洗并清空RA和每个树脂反应器之间的传输管道和阀。然后，对于第4次至第7次洗涤，将一小部分DMF溶剂泵送经过RB3的喷雾球（100 mL），然后将一小部分DMF溶剂泵送经过RB2的喷雾球（100 mL），然后将1400 mL DMF溶剂泵送经过RB1的喷雾球。目的是从各反应器的壁上冲掉固体树脂粒子。用于偶联后的洗涤的溶剂总量为10.69 L（10.09 kg）。对于39mer肽主链合成中的后期氨基酸，将经过喷雾球喷入RB2和RB3的DMF量减少到~50 mL。
对于表1中列举的每个氨基酸，从脯氨酸38至Boc-酪氨酸1，使用通用程序A进行先前偶联的氨基酸的Fmoc脱保护，然后使用通用程序B偶联。对于丝氨酸39以及接下来的38个氨基酸的偶联，使用通用程序B，化学计量列在表2中。当表2中指出时，根据通用程序B以表2中给出的化学计量制备另外的活化酯并再偶联。搅拌偶联反应直至实现>99%的转化率。
表2. 氨基酸、oxyma和DIC在各反应器中相对于树脂的摩尔当量
Figure 136360DEST_PATH_IMAGE002
Figure 916097DEST_PATH_IMAGE003
Figure 373623DEST_PATH_IMAGE004
Figure 187995DEST_PATH_IMAGE005
在偶联后使用平均10次DMF洗涤（见表8）。在制造运行中，建议进行7次洗涤以节省时间和溶剂。
从位置37的脯氨酸偶联开始，为在线LCMS提取自动化样品。在进入偶联步骤的15、75、180、324、503和684分钟从RB3中提取含固体树脂的自动化样品。在脱保护步骤的过程中也在各种时间从RB3中提取自动化样品。对于每个样品，通过自动化的泵和阀从反应器中提取1.0毫升浆料样品。样品用25毫升TFA稀释并间歇混合30分钟反应时间，从树脂珠上裂解肽并从肽上除去保护基团。接着，将样品与75毫升4:1 DMSO:乙腈混合。该稀释溶液存放在2µL LC切换环路中并注射到柱上。
调节20%哌啶/DMF洗涤次数和搅拌时间以实现如通过LCMS测定的≥99%转化率。对于Ser39至Leu26，20%哌啶/DMF的搅拌时间为30分钟；对于Trp25和Gln24，其为40分钟；对于Val23至Leu14，其为50分钟。对于Aib13，5次洗涤搅拌50分钟，另外3次洗涤搅拌90分钟。对于其余氨基酸（Ile12至Boc-Tyr1），前3次20%哌啶/DMF洗涤搅拌20-30分钟，然后在第4次哌啶洗涤进入串联的第一反应器时搅拌更长的时间。对于Pro36和Gly34，进行如通用程序A中概述的额外脱保护和洗涤步骤。要指出的是，通常用20%哌啶/DMF搅拌30分钟三次就足以实现≥99%转化率，这将节省这一程序的制造运行中的时间、溶剂和试剂。
调节哌啶脱保护步骤后的DMF洗涤次数以确保在用下一个氨基酸进行偶联程序之前，洗涤料流含有通过气相色谱（GC）分析测得的<600 ppm的哌啶。在哌啶脱保护步骤后使用的平均洗涤次数为11次洗涤（见表7）。这通常用10次洗涤实现，因此建议在制造运行中在哌啶脱保护步骤后使用10次DMF洗涤。
表3显示在39-mer肽主链合成全程中的在线LCMS取样时间和计算的%转化率。图4显示在线LCMS的自动化取样、裂解、脱保护、稀释和存放cart的过程和仪表流程图。
表3. 在线LCMS样品和反应%转化率
样品 %转化率
75 min偶联Pro 37 94.5
180 min偶联Pro 37 99
300 min偶联Pro 37 99.8
498 min偶联Pro 37，在洗涤过程中提取 99.6
在8次30分钟哌啶洗涤后的脱保护Pro 37 99.8
75 min偶联Pro 36 89.8
180 min偶联Pro 36 99.1
480 min偶联Pro 36 99.6
在用额外1 eq 200 min再偶联后 99.6
在用额外1 eq 216 min再偶联后，在洗涤过程中取样 100
在8次30分钟哌啶洗涤后的脱保护Pro 36 99.7
75 min偶联Ala 35 70.9
280 min偶联Ala 35 99.2
在用额外1 eq 121 min再偶联后 99.3
在用额外1 eq 243 min再偶联后 99.2
在3次30分钟哌啶洗涤后的脱保护Ala 35 99.4
在进入第4次30分钟哌啶洗涤15分钟后的脱保护Ala 35 99.8
在进入第6次30分钟哌啶洗涤15分钟后的脱保护Ala 35 99.9
在6次30分钟哌啶洗涤后的脱保护Ala 35 100
15 min偶联Gly 34 36.6
75 min偶联Gly 34 65.5
180 min偶联Gly 34 98.7
360 min偶联Gly 34 99.3
在用额外1 eq 15 min再偶联后 100
在用额外1 eq 60 min再偶联后 100
在进入第3次30分钟哌啶洗涤15分钟后的脱保护Gly 34 99.5
240 min偶联Ser 33 100
360 min偶联Ser 33 99.7
453 min偶联Ser 33 99.6
466 min偶联Ser 33，洗涤过程中的样品 99.9
120 min偶联Ser 32 99.2
240 min偶联Ser 32 98.9
360 min偶联Ser 32 100
在用额外0.5 eq 15 min再偶联后 100
在用额外0.5 eq 60 min再偶联后 100
在用额外0.5 eq 110 min再偶联后 100
在用额外0.5 eq 2h再偶联后，洗涤过程中的样品 100
在进入第3次30分钟哌啶洗涤15分钟后的脱保护Ser 32 99.3
在进入第5次30分钟哌啶洗涤15分钟后的脱保护Ser 32 99.4
在6次30分钟哌啶搅拌后的脱保护Ser 32 99.3
60 min偶联Pro 31 74.6
110 min偶联Pro 31 93.2
180 min偶联Pro 31 99.8
240 min偶联Pro 31 99.7
进入Pro 31的第3次30分钟脱保护15分钟 99.5
进入Pro 31的第5次30分钟脱保护15分钟 99.3
在8次30分钟哌啶搅拌后的脱保护Pro 31 99.5
60 min偶联Gly 30 55.6
120 min偶联Gly 30 70
180 min偶联Gly 30 101.9
240 min偶联Gly 30 98.2
360 min偶联Gly 30 98.4
在用额外1 eq 85 min再偶联后，在洗涤过程中取样 99.7
进入Gly 30的第3次30分钟脱保护15分钟 99
进入Gly 30的第5次30分钟脱保护15分钟 99.5
在6次30分钟哌啶搅拌后的脱保护Gly 30，在洗涤过程中取样 99.7
60 min偶联Gly 29 45.1
120 min偶联Gly 29 74.1
180 min偶联Gly 29 98.3
240 min偶联Gly 29 98.8
360 min偶联Gly 29 99.2
在用额外1 eq 167 min再偶联后，在洗涤过程中取样 99.4
进入Gly 29的第3次30分钟脱保护15分钟 99.5
进入Gly 29的第5次30分钟脱保护15分钟 99.4
在8次30分钟哌啶搅拌后的脱保护Gly 29 99.6
60 min偶联Ala 28 52.4
120 min偶联Ala 28 78.2
180 min偶联Ala 28 98.1
240 min偶联Ala 28 98.4
360 min偶联Ala 28 98.9
在用额外1 eq 120 min再偶联后 99.4
在用额外1 eq 180 min再偶联后，在洗涤过程中提取 99.6
进入Ala 28的第5次30分钟脱保护15分钟 99.9
在8次30分钟哌啶搅拌后的脱保护Ala 28 99.9
60 min偶联Ile 27 72
120 min偶联Ile 27 91.4
180 min偶联Ile 27 97.7
240 min偶联Ile 27 98.6
360 min偶联Ile 27 99.1
进入Ile 27的第3次30分钟脱保护5分钟 99.8
进入Ile 27的第5次30分钟脱保护5分钟 100
在8次30分钟哌啶搅拌后的脱保护Ile 27 100
75 min偶联Leu 26 74.6
135 min偶联Leu 26 84.8
进入Leu 26的第3次30分钟脱保护5分钟 101.4
75 min偶联Trp 25 100
135 min偶联Trp 25 99.8
195 min偶联Trp 25 100
255 min偶联Trp 25 100
360 min偶联Trp 25 100
391 min偶联Trp 25，洗涤过程中的样品 100
进入Trp 25的第2次40分钟脱保护5分钟 97.4
进入Trp 25的第3次40分钟脱保护5分钟 99.2
进入Trp 25的第5次40分钟脱保护5分钟 98.7
在6次40分钟哌啶搅拌后的脱保护Trp 25 100.1
75 min偶联Gln 24 93.6
135 min偶联Gln 24 98.6
195 min偶联Gln 24 99.9
255 min偶联Gln 24 100
360 min偶联Gln 24 100
75 min偶联Val 23 93.8
135 min偶联Val 23 99.2
195 min偶联Val 23 99.2
255 min偶联Val 23 99.5
350 min偶联Val 23 99.5
在用额外1.5 eq 60 min再偶联后 99.6
在用额外1.5 eq 221 min再偶联后，在洗涤过程中提取 99.7
进入Val 23的第2次50分钟脱保护5分钟 95.8
进入Val 23的第3次50分钟脱保护5分钟 100.3
进入Val 23的第4次50分钟脱保护5分钟 100
在5次50分钟哌啶搅拌后的脱保护Val 23 100
75 min偶联Phe 22 98.9
135 min偶联Phe 22 99.1
195 min偶联Phe 22 99.5
255 min偶联Phe 22 99.4
360 min偶联Phe 22 99.7
在用额外1.5 eq 120 min再偶联后的Phe 22偶联 99.8
进入Phe 22的第2次50分钟脱保护5分钟 94.8
进入Phe 22的第3次50分钟脱保护5分钟 99.5
进入Phe 22的第4次50分钟脱保护5分钟 100
在5次50分钟哌啶搅拌后的脱保护Phe 22 100
75 min偶联Ala 21 78.2
135 min偶联Ala 21 96.2
195 min偶联Ala 21 99
255 min偶联Ala 21 99.5
360 min偶联Ala 21 99.8
在用额外1.5 eq 120 min再偶联后的Ala 21偶联 99.7
在用额外1.5 eq 216 min再偶联后的Ala 21偶联 99.8
在5次50分钟哌啶搅拌后的脱保护Ala 21 100
75 min偶联Lys-ivDde 20 73
135 min偶联Lys-ivDde 20 82.4
195 min偶联Lys-ivDde 20 92
255 min偶联Lys-ivDde 20 95.1
360 min偶联Lys-ivDde 20 98
448 min偶联Lys-ivDde 20 98.3
565 min偶联Lys-ivDde 20 99.1
在用额外1.5 eq 60 min后的Lys-ivDde 20偶联 99
在5次50分钟哌啶搅拌后的脱保护Lys-ivDde 20 98.1
75 min偶联Gln 19 65.5
135 min偶联Gln 19 79.7
195 min偶联Gln 19 90.7
255 min偶联Gln 19 96.2
360 min偶联Gln 19 98.9
在用额外1.5 eq 60 min再偶联后的Gln 19偶联 99.4
在用额外1.5 eq 180 min再偶联后的Gln 19偶联，在洗涤过程中提取 99.6
进入Gln 19的第2次50分钟脱保护5分钟 93.8
进入Gln 19的第3次50分钟脱保护5分钟 99.1
进入Gln 19的第4次50分钟脱保护5分钟 99.6
在5次50分钟哌啶搅拌后的脱保护Gln 19 99.8
75 min偶联Ala 18 81.8
135 min偶联Ala 18 97.1
195 min偶联Ala 18 99.1
255 min偶联Ala 18 99.5
360 min偶联Ala 18 99.7
在用额外1.5 eq 60 min后的Ala 18偶联 99.8
在用额外1.5 eq 180 min后的Ala 18偶联，在洗涤过程中提取 99.9
在用额外1.5 eq 180 min后的Ala 18偶联，在第二联合洗涤过程中提取 99.9
进入Ala 18的第2次50分钟脱保护5分钟 87.2
进入Ala 18的第3次50分钟脱保护5分钟 98.5
进入Ala 18的第4次50分钟脱保护5分钟 99.6
在5次50分钟哌啶搅拌后的脱保护Ala 18 99.7
75 min偶联Ile 17 68.6
135 min偶联Ile 17 85.7
195 min偶联Ile 17 91.7
255 min偶联Ile 17 93.9
360 min偶联Ile 17 96.5
在用额外1.5 eq 60 min再偶联后的Ile 17偶联 98.3
在用额外1.5 eq 180 min再偶联后的Ile 17偶联，在洗涤过程中提取 99.2
在用额外1.5 eq 60 min二次再偶联后的Ile 17偶联 99.6
在用额外1.5 eq 600 min二次再偶联后的Ile 17偶联 99.5
在用额外1.5 eq 689 min二次再偶联后的Ile 17偶联，在洗涤过程中提取 99.8
进入Ile 17的第1次50分钟脱保护5分钟
进入Ile 17的第2次50分钟脱保护5分钟 90.3
进入Ile 17的第3次50分钟脱保护5分钟 99.5
进入Ile 17的第4次50分钟脱保护5分钟 99.7
在5次50分钟哌啶搅拌后的脱保护Ile 17 99.9
75 min偶联Lys 16 82.3
135 min偶联Lys 16 91.2
195 min偶联Lys 16 96.5
255 min偶联Lys 16 99
360 min偶联Lys 16 99.5
在用额外1.5 eq 60 min再偶联后的Lys 16偶联 99.7
在用额外1.5 eq 180 min再偶联后的Lys 16偶联 99.8
进入Lys 16的第2次50分钟脱保护5分钟 94.4
进入Lys 16的第3次50分钟脱保护5分钟 99.7
进入Lys 16的第4次50分钟脱保护5分钟 99.8
在5次50分钟哌啶搅拌后的脱保护Lys 16 100
75 min偶联Asp 15 89.6
135 min偶联Asp 15 98.7
195 min偶联Asp 15 99.2
255 min偶联Asp 15 99.5
360 min偶联Asp 15 99.6
在用额外1.5 eq 120 min再偶联后的Asp 15偶联 99.7
在用额外1.5 eq 360 min再偶联后的Asp 15偶联，在洗涤过程中提取 99.7
进入Asp 15的第2次50分钟脱保护5分钟 99.2
进入Asp 15的第3次50分钟脱保护5分钟 99.8
75 min偶联Leu 14 80
135 min偶联Leu 14 93.9
195 min偶联Leu 14 99.2
255 min偶联Leu 14 99.5
360 min偶联Leu 14 99.6
进入Leu 14的第2次50分钟脱保护5分钟 60.1
进入Leu 14的第3次50分钟脱保护5分钟 95.6
进入Leu 14的第4次50分钟脱保护5分钟 99.5
在5次50分钟哌啶搅拌后的脱保护Leu 14 99.8
75 min偶联Aib 13 66.4
135 min偶联Aib 13 79.9
195 min偶联Aib 13 88.3
255 min偶联Aib 13 89.4
360 min偶联Aib 13 94.5
474 min偶联Aib 13 96.4
在用额外1.5 eq 60 min再偶联后的Aib 13偶联 97.9
在用额外1.5 eq 180 min再偶联后的Aib 13偶联 98.1
在用额外1.5 eq 440 min再偶联后的Aib 13偶联 98.6
在用额外1.5 eq 600 min再偶联后的Aib 13偶联 99.3
在用额外1.5 eq 817 min再偶联后的Aib 13偶联 99.4
在用额外1.5 eq 1059 min再偶联后的Aib 13偶联 99.4
进入Aib 13的第2次50分钟脱保护5分钟 97
进入Aib 13的第3次50分钟脱保护5分钟 96.9
进入Aib 13的第4次50分钟脱保护5分钟 97.9
进入第6次脱保护（90分钟搅拌）5分钟 99.4
进入第7次脱保护（90分钟搅拌）5分钟 99.2
进入第8次脱保护（90分钟搅拌）5分钟 99.7
在8次哌啶搅拌后的脱保护Aib 13 99.7
75 min偶联Ile 12 54.9
135 min偶联Ile 12 58.8
195 min偶联Ile 12 62.8
360 min偶联Ile 12 70.7
600 min偶联Ile 12 79.1
897 min偶联Ile 12（进入再偶联60 min） 86.7
1137 min偶联Ile 12（进入再偶联5 h） 89.9
1437 min偶联Ile 12（进入再偶联10 h） 94
1837 min偶联Ile 12（进入再偶联16.7 h） 96.7
2337 min偶联Ile 12（进入再偶联25 h） 98.1
2789 min偶联Ile 12（进入再偶联32.5 h） 99
2946 min偶联Ile 12（进入二次再偶联15min） 99
3006 min偶联Ile 12（进入二次再偶联75min） 99.1
3171 min偶联Ile 12（进入二次再偶联240min） 99.1
3454 min偶联Ile 12（进入二次再偶联523min） 99.3
进入Ile 12的第3次20分钟脱保护5分钟 100.4
进入Ile 12的第4次脱保护2小时 99.6
Ile 12的第4次脱保护接近结束 100
75 min偶联Ser11 97.2
135 min偶联Ser11 99.1
进入Ser11的第3次20分钟脱保护5分钟 100
进入Ser11的第4次脱保护45分钟 99.6
在洗涤过程中提取的最终脱保护样品 99.7
75 min偶联Tyr10 93.7
135 min偶联Tyr10 98.3
195 min偶联Tyr10 99.3
255 min偶联Tyr10 99.5
360 min偶联Tyr10 100
589 min样品，进入再偶联60 min，Tyr10偶联 100
648 min样品，Tyr10偶联结束，洗涤过程中的样品 100
进入Tyr10的第3次20分钟脱保护5分钟(76min) 99.4
进入Tyr10的第4次脱保护45分钟(151min) 99.5
进入Tyr10的第4次脱保护2小时(226min) 99.7
进入Tyr10的第4次脱保护4小时(346min) 99.7
进入Tyr10的第4次脱保护6小时(466min) 99.7
进入Tyr10的第4次脱保护8小时(586min) 99.7
Tyr10的脱保护，洗涤过程中的样品(668min) 100
15 min偶联Asp 9 90.1
75 min偶联Asp 9 98.1
135 min偶联Asp 9 99.3
195 min偶联Asp 9 99.3
255 min偶联Asp 9 99.4
360 min偶联Asp 9 99.6
562 min样品，进入再偶联60 min，Asp9偶联 99.6
682 min样品，Asp9偶联结束，洗涤过程中的样品 99.6
851 min样品，Asp9偶联结束，洗涤过程中的样品 99.7
进入Asp9的第4次5分钟脱保护2分钟(71min) 100
进入Asp9的第4次脱保护1小时(129min) 99.6
Asp9脱保护结束，在洗涤过程中取样(221min) 99.6
75 min偶联Ser8 96.3
135 min偶联Ser8 97.9
195 min偶联Ser8 99.7
255 min偶联Ser8 99.5
360 min偶联Ser8 99.6
562 min样品（进入再偶联60 min）Ser8 99.7
682 min样品（进入再偶联180 min）Ser8 99.7
进入Ser8的第2次30分钟脱保护5分钟(60min) 99.9
进入Ser8的第3次30分钟脱保护5分钟(105min) 99.7
进入Ser8的第4次30分钟脱保护5分钟(149min) 99.8
进入Ser8的第4次脱保护2小时(264min) 99.8
进入Ser8的第4次脱保护4小时(384 min) 99.9
Ser8脱保护结束，洗涤过程中的样品(620min) 99.9
75 min偶联Thr7 99.7
135 min偶联Thr7 99.5
195 min偶联Thr7 99.7
进入Thr7的第2次30分钟脱保护5分钟(65min) 98.7
进入Thr7的第3次30分钟脱保护5分钟(115min) 99.7
进入Thr7的第4次30分钟脱保护5分钟(164min) 100
进入Thr7的第4次脱保护2小时(279min) 100
Thr7的最终脱保护，在洗涤过程中(453 min) 100
75 min偶联Phe6 96.7
135 min偶联Phe6 97.6
195 min偶联Phe6 99.1
255 min偶联Phe6 99.5
360 min偶联Phe6 99.3
485 min偶联Phe6 99.5
605 min偶联Phe6 99.2
725 min偶联Phe6 99.5
845 min偶联Phe6 99.5
903 min偶联Phe6，洗涤过程中的样品 99.5
进入Phe6的第3次30分钟脱保护5分钟(81min) 98.7
进入Phe6的第4次30分钟脱保护25分钟(136 min) 99.6
进入Phe6的第4次脱保护2小时(230 min) 99.6
进入Phe6的第4次脱保护4小时(350 min) 99.5
Phe6的最终脱保护，在洗涤过程中(441 min) 99.5
75 min偶联Thr5 99.3
135 min偶联Thr5 98.5
195 min偶联Thr5 99.3
255 min偶联Thr5 99.5
360 min偶联Thr5 99.5
486 min偶联Thr5 99.5
606 min偶联Thr5 99.6
726 min偶联Thr5 99.7
783 min偶联Thr5，在洗涤过程中 99.7
进入Thr5的第3次30分钟脱保护5分钟(81min) 99.9
进入Thr5的第4次30分钟脱保护25分钟(136 min) 99.2
进入Thr5的第4次脱保护2小时(230 min) 99.5
进入Thr5的第4次脱保护4小时(350 min) 99.8
Thr5的最终脱保护，在洗涤过程中(804 min) 100
195 min偶联Gly4 99.2
255 min偶联Gly4 99.1
360 min偶联Gly4 99.3
486 min偶联Gly4 99.4
606 min偶联Gly4 99.5
726 min偶联Gly4 99.4
846 min偶联Gly4 99.4
966 min偶联Gly4 99.4
1238 min偶联Gly4 99.4
1358 min偶联Gly4 99.6
1478 min偶联Gly4 99.5
1598 min偶联Gly4 99.6
1749 min偶联Gly4 99.6
进入Gly4的第3次30分钟脱保护5分钟(81min) 99.7
进入Gly4的第4次30分钟脱保护25分钟(136 min) 100
进入Gly4的第4次脱保护2小时(230 min) 100
进入Gly4的第4次脱保护4小时(350 min) 100
进入Gly4的第4次脱保护6小时(466 min) 100
Gly4的最终脱保护，在洗涤过程中(588 min) 100
75 min偶联Glu3 94.6
135 min偶联Glu3 98.6
195 min偶联Glu3 98.6
255 min偶联Glu3 99.1
360 min偶联Glu3 99
486 min偶联Glu3 99.3
606 min偶联Glu3 99
726 min偶联Glu3 99.2
846 min偶联Glu3 99.2
965 min偶联Glu3 99.4
1304 min偶联Glu3 99.4
进入Glu3的第3次30分钟脱保护5分钟(81min) 99.8
进入Glu3的第4次30分钟脱保护25分钟(136 min) 99.4
进入Glu3的第4次脱保护2小时(230 min) 100
进入Glu3的第4次脱保护4小时(350 min) 100
75 min偶联Aib2 95
135 min偶联Aib2 99.4
195 min偶联Aib2 99.6
255 min偶联Aib2 99.7
360 min偶联Aib2 99.7
进入Aib2的第3次30分钟脱保护5分钟(81min) 100
进入Aib2的第4次30分钟脱保护25分钟(136 min) 99.6
进入Aib2的第4次脱保护2小时(230 min) 100
进入Aib2的第4次脱保护4小时(350 min) 100
进入Aib2的第4次脱保护6小时(470 min) 100
Aib2的脱保护，洗涤过程中的样品 (559min) 100
75 min偶联Boc-Tyr1 86.8
135 min偶联Boc-Tyr1 94.8
195 min偶联Boc-Tyr1 98
255 min偶联Boc-Tyr1 99.4
360 min偶联Boc-Tyr1 99.6
485 min偶联Boc-Tyr1 100
由于解决了固体堵塞和夹带问题，对39mer肽合成过程中的在线LCMS自动化取样系统作出若干改进。从Pro37至Ser33，用位于反应器和三通取样阀之间的蠕动泵实现取样。但是，该泵会研磨树脂，以生成微细固体，其导致从RB3中排空液体时的缓慢过滤速率。减少树脂样品泵送时间并将泵移到三通阀后，以使树脂实际上不进入泵。在Ala21偶联和所有后续偶联的过程中，修改该系统以设置在每个样品后用DMF溶剂冲洗这2个自动化三通浆料样品阀的能力。为了防止三通样品阀被在每个序列结束时没有冲回反应器的固体堵塞，将DMF冲过样品阀，进入脱保护混合罐，然后从阀518k流出到废物中（图4）。
在合成过程中每隔一段时间，如上所述取出树脂样品以供分析，也取出样品以供离线的进一步研究。以基于质量平衡的mmol表示的各反应器中的树脂剩余量列在表4中。相应地，根据每个步骤剩余的树脂量调节装载到系统中的用于脱保护、脱保护后的DMF洗涤、氨基酸偶联和偶联后的DMF洗涤的材料量。要指出，在制造运行中，不太可能提取大样品以供离线分析并且树脂mmol基础不会显著变化。
表4. 在39mer肽合成全程中在取出样品后各反应器中的树脂mmol基础，由质量平衡计算
Figure 10458DEST_PATH_IMAGE006
Figure 339808DEST_PATH_IMAGE007
氨基酸偶联步骤中使用的氨基酸和偶联试剂溶液的质量显示在表5中。
表5. 氨基酸偶联步骤中使用的氨基酸溶液和偶联试剂的质量
Figure 538708DEST_PATH_IMAGE008
Figure 269904DEST_PATH_IMAGE009
Figure 263268DEST_PATH_IMAGE010
在哌啶脱保护后在一系列DMF洗涤中通过GC测得的哌啶浓度显示在表6中。
表6. 在哌啶脱保护后在DMF洗涤样品中通过GC测得的哌啶浓度
Figure 17597DEST_PATH_IMAGE011
Figure 816926DEST_PATH_IMAGE012
Figure 340311DEST_PATH_IMAGE013
Figure 770155DEST_PATH_IMAGE014
Figure 74098DEST_PATH_IMAGE015
Figure 349221DEST_PATH_IMAGE016
*BQL – 低于定量限。
在39-mer主链中间体（图7）的合成全程中用于脱保护的哌啶溶液洗涤和DMF洗涤的次数和质量显示在表7中。每毫摩尔树脂使用的这些溶液的质量(g)的计算（通过将质量除以如表4中所列的各步骤中存在的树脂的毫摩尔数来确定）也在表7中。
表7. 在39-mer主链中间体的合成全程中用于所有脱保护的洗涤次数和每毫摩尔树脂使用的试剂/溶剂质量
Figure 992692DEST_PATH_IMAGE017
Figure 390175DEST_PATH_IMAGE018
在39-mer主链中间体（图7）的合成全程中每毫摩尔树脂使用的偶联试剂的质量(g)、氨基酸偶联后的DMF洗涤次数和在这些洗涤中使用的每毫摩尔树脂的DMF质量(g)显示在表8中。如在表7中，表8中的每毫摩尔树脂使用的材料质量(g)通过将质量除以如表4中所列的各步骤中存在的树脂的毫摩尔数来确定。
表8. 在39-mer主链中间体的合成全程中用于所有氨基酸偶联的洗涤次数和每毫摩尔树脂使用的试剂/溶剂质量
Figure 119097DEST_PATH_IMAGE019
Figure 260228DEST_PATH_IMAGE020
表9显示在39-氨基酸主链中间体（图7）的合成过程中装载到反应容器中的材料量的总和。表9包括用于哌啶/DMF脱保护和此后的DMF洗涤、氨基酸偶联步骤和此后的DMF洗涤的总量，和Sieber树脂。
表9. 材料质量总和/mmol树脂
工艺步骤 所用材料的质量总和/mmol树脂（g / mmol）
脱保护步骤中所用的哌啶/DMF溶液 898.93
哌啶脱保护后的洗涤中所用的DMF 2045.57
偶联步骤中所用的氨基酸、oxyma和DIC溶液 601.87
氨基酸偶联后的洗涤中所用的DMF 1871.32
Sieber树脂 1.43
所用材料的质量总和/mmol树脂（g /mmol） 5419.12
在Boc-Tyr1偶联后，从所有3个反应器中取出树脂结合肽，通过用二氯甲烷洗涤而消溶胀，并且干燥。其余步骤在分批容器中手动进行，而非在自动化串联反应器中进行。在制造运行中，此时没有从反应器中取出树脂并在串联反应器中进行接下来的步骤。这减少所需的试剂和溶剂的量。
为了从Lys20上除去-ivDde保护基，在2升夹套过滤反应器中在氮气下将水合肼（5.34 g，68.3 mmol）和DMF（165 g）合并，然后加入干燥树脂（50.0 g，7.24 mmol）。在20℃下搅拌6小时，然后用DMF（5 × 500 mL；建议~100mL的洗涤体积应该足够）洗涤树脂，每次洗涤搅拌5分钟。
对于脂肪酸/接头偶联，通过在250 mL圆底烧瓶中装载式I的酸（3,6,12,15-四氧杂-9,18-二氮杂二十三烷二酸，22-{[20 -(1,1-二甲基乙氧基)-1,20-二氧代二十烷基]氨基}-10,19-二氧代-,2,3-(1,1-二甲基乙基)酯，(22S)；9.5 g，11 mmol）、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐（PYBOP；5.7 g，11 mmol）和DMF（50 g），制备活化酯。
Figure 758206DEST_PATH_IMAGE021
将混合物搅拌20分钟以溶解，然后加入2,4,6-三甲基吡啶（1.29 g，10.6 mmol）。将活化酯混合物在13.5至15.8℃下搅拌20分钟，然后将其添加到在25℃下的带有反应器夹套的过滤反应器中的树脂中，使用另外5 mL DMF冲洗和转移出烧瓶。将浆料搅拌29小时，然后沥出并用DMF（4 × 300 mL；~100mL洗涤体积应该足够）洗涤树脂，每次洗涤搅拌5分钟。将另一批如前制备的活化酯添加到反应混合物中并在25℃下搅拌19小时。沥干树脂并用DMF（4 × 300 mL；~100mL洗涤体积应该足够）和二氯甲烷（4 × 300 mL；~100mL洗涤体积应该足够）洗涤，每次洗涤搅拌4分钟。所用的PYBOP批次被确定为非最优品质，因此将另一批活化酯（使用新的一瓶PYBOP，在50克DMF中以先前试剂规模的1/3制备）添加到反应混合物中并在25℃下搅拌18小时。沥干树脂并用DMF（4 × 300 mL；~100mL洗涤体积应该足够）和异丙醇（4 × 300 mL；~100mL洗涤体积应该足够）洗涤，每次洗涤搅拌5分钟。在制造运行中，PYBOP应该具有高品质，并且仅单次装料的活化酯用于式I的中间体的偶联。将树脂在真空中在40℃下干燥整夜。
如下制备裂解混合物（cleavage cocktail）：在5升圆底烧瓶中将二硫苏糖醇（DTT；12.33 g，79.93 mmol）和水（17.63 g）合并。在玻璃压力瓶中装载TFA（538 g，4720mmol）并通过用5-10 psig氮气的4个压力吹扫周期进行惰性化。以2分钟为间隔将60克惰性化TFA以每份20克添加到5升圆底烧瓶中，然后将剩余TFA经2分钟添加到5升圆底烧瓶中。将三异丙基硅烷（9.37 g，59.2 mmol）和二氯甲烷（51 g）添加到5升圆底烧瓶中，并将混合物冷却到15℃。
为了将肽从树脂上裂解并脱保护，将干燥树脂装载到过滤反应器中并用二氯甲烷冲洗。将裂解混合物添加到过滤反应器中的树脂中，并搅拌4.5小时。从树脂中沥出反应溶液并将其添加到其中制备了裂解混合物的5升圆底烧瓶中。将二氯甲烷（206 g）添加到树脂中，搅拌5分钟，沥出溶液，并将其添加到5升圆底烧瓶中。在-15℃夹套设定点搅拌和冷却所得混合物。经1.5小时加入MTBE（754 g），其已通过用氮气鼓泡15分钟然后保持在缓慢氮气吹扫下而惰性化。将该浆料升温至-8℃并搅拌1小时，然后升温至0℃并搅拌1小时。在氮气下过滤浆料，不允许完全干燥，然后用MTBE（2 × 155 g）洗涤固体并在真空中干燥以得到粗制tirzepatide（38.7 g），其通过HPLC测定为40.9%效价（potency）。在-ivDde脱保护、与式I的酸偶联和从树脂上裂解的过程中，从混合物中提取样品，总共占起始树脂的0.34mmol。考虑到这一点和HPLC效价，这一过程中的tirzepitide的粗产率为48%。
分批工艺方法
为了比较，描述tirzepatide的分批制造工艺。将Fmoc Sieber树脂（17 kg，0.76mmol/g）装载到反应器中。该树脂用DMF溶胀，搅拌2小时，然后从树脂中滤出DMF。然后用DMF洗涤树脂总共两次。然后使用20% PIP/NMP处理将Fmoc保护的树脂脱保护。在最后一次PIP/NMP处理后进行取样以验证Fmoc脱除，从而通过UV分析确认>99% Fmoc脱除。在最终20% w/wPIP/NMP处理后，树脂床用DMF洗涤多次。然后使用以下用于每个氨基酸偶联和脱保护的一般条件构建肽主链：
Figure 529853DEST_PATH_IMAGE022
Fmoc脱保护:
肽反应器中的树脂用3次或4次装料的20% v/v PIP/NMP溶液处理。每次处理在树脂上搅拌30分钟，然后过滤以完成Fmoc保护基脱除。在最终20% v/v PIP/NMP处理后，树脂床用预先指定的DMF装料体积的DMF洗涤至少六次。
氨基酸活化:
将预先制备的12% w/w Oxyma Pure/NMP溶液装载到反应器中。然后加入所选Fmoc氨基酸。混合物在20 ± 5℃下搅拌直至Fmoc氨基酸完全溶解。然后在活化前将Fmoc-AA/Oxyma Pure/NMP溶液冷却到15 ± 3℃以确保控制该轻微放热的活化反应并将所得溶液温度保持在20 ± 5℃的指定范围内。然后通过添加DIC活化氨基酸溶液。然后将活化酯溶液搅拌20-30分钟，然后将溶液转移到含有在树脂上的肽中间体的反应器中。
偶联:
在预活化步骤完成后，将活化酯溶液转移到含有在树脂上的脱保护肽的反应器中以引发偶联反应。该肽偶联反应在20 ± 5℃下搅拌至少4小时。在所需搅拌时间后，将树脂浆料取样以确定偶联完成（IPC）。根据需要以特定间隔重复取样，直至获得通过（passing）的IPC结果。如果必要，执行再偶联操作。当偶联完成时，过滤肽反应器溶液内容物，然后将在树脂上的肽中间体用DMF洗涤数次以准备用于下一次偶联。
Ile (12)至Aib (13)偶联:
Fmoc-Ile(12)至Aib (13)偶联使用对称酸酐法进行，其使用6当量的Fmoc-AA、3当量的DIC。用于这一序列的活化时间延长到40-60分钟以确保形成活化的对称酸酐物类。需要延长的偶联搅拌时间（18小时）以实现如通过HPLC分析确定的反应完成（<1%未偶联）。
在39-氨基酸主链中间体(图7)的合成中使用的材料的概要:
在9 mL/g树脂下每个周期使用平均3.15次哌啶装料，密度为0.93 g/mL，平均26.4g/g树脂。在脱保护后在9 mL/g树脂下进行平均7.2次DMF洗涤，密度为0.945 g/mL，每个周期平均61.2 g/g树脂。对于氨基酸偶联，每个周期使用平均7.25 mL/g树脂的偶联溶液，密度为大约1 g/mL，每个周期平均7.25 g/g树脂。在偶联后，在9 mL/g树脂下进行平均5次DMF洗涤，密度为0.945 g/mL，每个周期平均42.5 g/g树脂。
每个周期总共使用平均137克材料/克树脂。对于为了生产39-氨基酸主链中间体（图7）而进行的39个周期，使用5356克材料/克树脂。由于Sieber树脂的摩尔容量为0.7mmol/g，每毫摩尔树脂使用的材料的总质量（包括树脂本身的质量）为大约7650 g/mmol。
Lys-ivDde(20)脱保护、偶联到式I、树脂的裂解、粗产物分离:
用于将Lys-ivDde脱保护、偶联式I的酸、树脂的裂解和粗制tirzepatide的分离的剩余步骤基本如对串联反应器制备所述进行。总体而言，以45重量%和64% HPLC面积%纯度制成45.39千克粗制tirzepatide。基于Sieber树脂的包含产率（contained yield）= 47%。
方法比较
通过tirzepatide的分批和串联反应器生产获得类似的粗产率（分别为47%和48%）。对于串联反应器法，每毫摩尔起始树脂使用5.42千克总材料（溶剂+试剂+树脂）生产39-mer主链中间体（图7）。在分批工艺方法中，每毫摩尔起始树脂使用7.65千克总材料。
实施例: 在DMF再循环和减少的试剂当量下制备片段
对串联三个反应器的设置进行改进，并用于合成含有tirzepatide主链的前10个氨基酸残基的肽，即GPSSGAPPPS-NH-树脂，但是，每个S氨基酸都受叔丁基保护。
该设备设置与图3中所示相同，只是进行了小调节，其中图3中的蠕动泵(435)被压力传输系统替代。该系统在转移罐（transfer can）上抽真空而非泵出溶剂，然后打开来自所需反应器（RB1、RB2或RB3）的进料阀。压力传感器用于确定反应器何时完全排空，因为一旦开始将氮气而非溶剂引入罐中，压力将会迅速增加。然后将转移罐加压，并打开通往所需反应器（RB2、RB3或废物/再循环）的阀。这种技术实现反应器的更快速和更完全的排空，以使排空后反应器中的残留溶剂较少，这改进树脂洗涤。另一个区别是添加在线GC（气相色谱仪）以测量哌啶从而确保充分清洗，和DMF再循环瓶。
关于与图3的系统的相似性，三个反应器串联设置，来自第一反应器的流出物传送到第二反应器，从第二反应器到第三反应器，并从第三反应器到废物。但是，只有洗涤操作串联进行。该实验还对Fmoc脱保护和氨基酸偶联反应都使用改进的条件。新的反应条件消除大部分过量试剂，并使得串联进行脱保护和偶联反应的概念具有极小的好处（ofminimal benefit）。对于Fmoc脱保护，仅使用一次20%哌啶/DMF装料。该装料的体积减少到大约4个体积（以起始干树脂装料为基础）。在这一点上，与单个反应器使用多于三次独立的9体积装料的原始方法相比，哌啶废物减少大约80%。串联进行这一操作的潜在哌啶节省被认为不值得，因为可能由第三反应器中的脱保护副产物（哌啶-二苯并富烯加合物）的积聚引起潜在问题。因此，每个反应器独立地操作以进行Fmoc脱保护反应。
为了进一步使PMI最小化，修改该系统以增加DMF再循环容器。（PMI是过程质量强度（Process Mass Intensity），被定义为用于制备指定量产品的材料总质量，因此用于制备1克产品的2000克材料是2000的PMI。）再循环容器用于收集Fmoc脱保护后的后半部分洗液并且在第三反应器的下游，因为所有洗涤串联进行。例如，再循环容器收集十次洗涤中的最后五次。收集的DMF具有大约1%的哌啶浓度。这明显低于脱保护反应后的反应器中的哌啶浓度，收集的DMF用于后续洗涤周期的前半部分。这使DMF得到更好的利用，提高废物料流中的平均哌啶浓度。由于需要洗涤（前述）在线LCMS设备以避免样品夹带，对洗涤增加额外的改动。LCMS设备洗涤在三个反应器的每一个中产生大约80毫升DMF。此后对每个反应器进行大约50毫升新鲜DMF的快速喷雾球洗涤（quick sprayball wash）以确保将壁上的任何树脂冲洗到树脂床中。将在线LCMS和喷雾球洗涤集成到串联反应器洗涤程序中，其中将使用的所有DMF转移经过串联的反应器，并计入最终PMI计算中。
先前在图3中，使用蠕动泵将材料从一个反应器转移到下一个反应器。有时蠕动泵没有完全排空反应器中的游离溶剂。这降低洗涤效率并增加PMI。因此，作出改变以使用压力传递从反应器中更好地排空所有液体。添加一个转移容器，连接到所有反应器、废物和DMF再循环容器。为了从反应器转移到转移容器，使用自动化序列。在转移容器上抽真空并打开转移罐的容器底部之间的阀。当转移容器中的压力达到预定的设定点时，阀关闭。将转移容器加压，打开通往目标容器顶部的阀并发生转移直至转移容器中的压力下降到设定值以下。
也增加洗涤溶液的在线分析。在废物管线中设置在线GC以便监测洗液中的残留哌啶。设置该程序以分析从第三反应器中洗出的最后三次洗液。另外，在线LCMS用于将洗液取样以确定在偶联后洗涤时的残留氨基酸。为了防止产率降低，在触发洗涤样品前允许树脂沉降。这防止树脂被取样，因为浸入管将在树脂上方的液体层中。
对每个周期获得精确的PMI计算。为了这一特定实验，所有的反应监测样品都取自第三反应器，因为由于洗涤效率较低，预计其由于残留材料量最高而具有最慢的反应。一旦反应器3中的反应完成，推定所有三个反应器都完成。这也有助于在线LCMS中的夹带问题，因为每个样品仅很少地受到夹带的影响。在5%夹带的假设下，由于5%的先前脱保护反应样品，100%完成的偶联反应可能仅测得95%完成。如果对三个反应器的每一个序贯取样，这种5%误差可能存在于每个样品中并在3小时后，反应仍然看似没有完成。如果仅对一个反应器进行取样，假设完全转化，第一个样品转化率为95%，但第二个样品测得99.75%转化率，并且在仅2小时后可停止反应。实验历史表明，反应超过必要时间与品质受损相关，尤其是在Fmoc脱保护反应中。相对于在反应完成时停止反应（没有过多的额外搅拌时间）可能带来的潜在质量改进，仅对一个反应器进行取样的风险被认为可忽略不计。
对于这一实验，目标是利用10个洗涤周期将哌啶浓度减少到2000 ppm。哌啶脱保护后的洗涤的结果显示在表10中。使用模型预测在10次洗涤和样品cart清洁周期后得到大约2000 ppm哌啶所需的洗涤装料量。该模拟利用先前的树脂溶胀和哌啶吸附实验数据。由于设备故障，一些样品被遗漏，但通常都达到2000 ppm的目标，唯一例外是最后一个周期。
表10: 哌啶洗涤结果
合成周期# AA脱保护 洗涤# 哌啶浓度(ppm)
1 Sieber树脂 10 1804
1 Sieber树脂 样品cart清洁 950
2 Ser 39 10 2100
2 Ser 39 样品cart清洁 1003
3 Pro 38 10 3605
3 Pro 38 样品cart清洁 1723
4 Pro 37 10 5215
4 Pro 37 样品cart清洁 2013
5 Pro 36 9 4164
5 Pro 36 10 4132
5 Pro 36 样品cart清洁 1715
6 Ala 35 9 3393
6 Ala 35 10 1605
7 Gly 34 9 3473
7 Gly 34 10 1452
8 Ser 33 9 3871
9 Ser 32 9 4069
9 Ser 32 样品cart清洁 1927
10 Pro 31 9 4982
10 Pro 31 10 4232
10 Pro 31 样品cart清洁 3048
在偶联反应后，该系统用三次洗涤装料连续洗涤。此后使用相同的样品cart清洁程序。没有开发出对残留AA的良好量化方法，因此随着肽生长和溶剂滞留的增加，每次洗涤装料使用越来越多的DMF。
在串联的第三反应器上进行反应监测。在线LC-MS系统如先前的实验中使用。在表11中给出脱保护结果。了解到该定量方法偏向于报告不足（under reporting）且样品分析比实际反应晚一个小时的事实，在停止反应并继续进行前期望98%的转化率。所有脱保护到加工样品两小时时都达到了继续进行的阈值。加工时间刚刚超过1小时。
表11: 脱保护反应结果
Figure 539878DEST_PATH_IMAGE023
对偶联反应进行类似的监测。在表12中给出结果。除Gly 30外的所有偶联都在不晚于获知两小时样品的结果时停止。Gly 30偶联的低转化率的普遍理论是在洗涤后存在高含量的残留哌啶。对Gly 30反应进行再偶联，再偶联迅速使偶联转化率达到99.2%，并停止反应。
表12: 偶联反应结果
Figure 422384DEST_PATH_IMAGE024
这一实验的主要焦点是用最少量的原材料制备优质材料。每个周期在脱保护中使用的材料量列在表13中。以g/mmol给出每个周期的材料量。由于肽的毫摩尔数在每个周期中减少，将10个周期的总材料用量相加并除以最终毫摩尔数或起始毫摩尔数都没有得到准确的数字。
表13: 用于脱保护的材料
Figure 837185DEST_PATH_IMAGE026
用于脱保护后的洗涤的DMF用量显示在表14中。表15列举对于三个反应器的每一个，用于每个周期的偶联试剂的摩尔当量。在表16中给出用于每个偶联周期的总材料。表17给出用于偶联后的洗涤的DMF用量。
表14: 用于脱保护后的洗涤的材料
Figure 779733DEST_PATH_IMAGE027
表15: 所用偶联试剂的摩尔当量
Figure 217667DEST_PATH_IMAGE028
表16: 所用的总偶联试剂
Figure 700601DEST_PATH_IMAGE029
表17: 用于偶联后的洗涤的DMF用量
Figure 173171DEST_PATH_IMAGE030
采用来自每个步骤的数据，生成概要，其中将原材料用量（按化合物计和总量）与当前的分批制造工艺进行比较。表18表明偶联试剂用量减少37%，而哌啶用量减少84%。用于洗涤的DMF是该工艺中的材料用量的绝大部分，远超过总质量消耗的90%，减少DMF消耗是这一实验的主要目标。与tirzepatide分批制造工艺的前十个周期相比，DMF用量减少79%。该新工艺技术的实验演示总共使用357 g/mmol的肽。相比之下，当前的分批制造工艺使用1690 g/mmol。这代表79%的总减少量。
表18: 在串联和分批中的10mer SPPS中使用的总材料
Figure 348937DEST_PATH_IMAGE031
在确定材料消耗减少接近80%后，该实验的最后一个部分是证明所得材料具有高品质。来自所有三个反应器的材料经过从树脂上软裂解（soft cleavage）肽，同时保留AA R基团上的所有保护基。表19中所示的HPLC分析显示经过所有三个反应器的高品质。有点令人惊讶的是，在品质和反应器之间绝对没有相关性。假说在于，经过三个反应器的纯度略有下降，因为串联的第三反应器没有像第一反应器那样多地洗涤。这一发现证明所用的洗涤策略超过足够的水平。理论上可以提高残留哌啶和AA的洗涤目标，这将允许进一步减少材料消耗。
表19: 各反应器的HPLC纯度数据
Figure 274168DEST_PATH_IMAGE032
实施例: 通过在DMF溶剂中的SPPS构建Terzepatide四聚体
以下Tirzepatide四聚体含有4个氨基酸：
Figure 498476DEST_PATH_IMAGE033
这种四聚体使用线性固相肽合成法（SPPS）合成，其通过下文所述的加载方法和串联反应器法实现。表20列举用于合成tirzepatide四聚体主链的4个氨基酸的顺序。要指出，最先使用加载方法如下所示将四聚体中间体的第一个氨基酸甘氨酸加载在2-氯三苯甲基氯（CTC）树脂固体载体上。（CTC树脂固体显示为以下圆圈）。
Figure 622290DEST_PATH_IMAGE034
表20 用于通过SPPS合成Tirzepatide四聚体的4个氨基酸的顺序
氨基酸(AA)添加顺序 肽上的AA位置 AA名称 用于偶联步骤的AA
1 4 甘氨酸 Fmoc-Gly-OH
2 3 谷氨酸 Fmoc-Glu(<i>t</i>Bu)-OH
3 2 2-氨基异丁酸 Fmoc-Aib-OH
4 1 酪氨酸 Boc-Tyr(tBu)-OH
其余3个氨基酸使用串联反应器法构建。甘氨酸、谷氨酸和2-氨基异丁酸的α-氮被9-芴甲氧羰基（Fmoc）保护，酪氨酸α-氮被叔丁氧羰基（Boc）保护。谷氨酸和酪氨酸的氧被叔丁基（tBu）保护。
加载方法
制备Fmoc-Gly-OH偶联溶液：在5000 mL样品瓶中，Fmoc-Gly-OH（142.7 g，480.0mmol）用DMF溶解到1.8 L溶液的体积。然后，加入N-乙基-N-异丙基-丙-2-胺（309 g，2390.9mmol）并将内容物搅拌5分钟。
树脂偶联
向10 L玻璃大型肽合成仪中加入CTC树脂（380 g，610 mmol，1.6 mmol/g）。加入DMF（2400 mL）并搅拌15分钟。沥出并弃置剩余溶液。该树脂用DMF（2400 ML）洗涤15分钟，搅拌两次。添加另外的N-乙基-N-异丙基-丙-2-胺（62 g，479.73 mmol）并在环境温度下搅拌总共18小时。在18小时结束后，沥出溶液并用DMF（1800 mL）洗涤树脂5次，每次混合5分钟。
树脂封闭（Capping）
将DMF（900 mL）、N-乙基-N-异丙基-丙-2-胺（145.8 g，1128 mmol）和甲醇（191 g，5960.9 mmol）添加到瓶中并在室温下搅拌2分钟。将溶液添加到树脂中并搅拌60分钟，此后沥出溶液。该树脂用DMF（1800 mL）洗涤5次，每次搅拌5分钟。此外，该树脂用DMF（1800 mL）洗涤5次，每次搅拌5分钟。将树脂转移到干燥盘并在真空下在35℃下干燥至恒重。
干树脂称重为473.37 g，通过NMR测得具有0.85 mmol/g的Fmoc-Gly-OH加载量。
串联反应器法
原材料制备
如下制备哌啶在DMF中的20体积%溶液：通过添加DMF将哌啶（2.0 L）稀释至10.0 L的体积，以获得20体积%的溶液。
如下制备oxyma在DMF中的1.25 mol/kg溶液：将(羟基亚氨基)氰乙酸乙酯（oxyma，195.69 g）溶解在DMF（905.91 g）中直至获得1.25 mol/kg溶液，然后将氮气以2 SCFH鼓过该溶液。
如下制备DIC在DMF中的1.25 mol/kg溶液：将N,N'-5二异丙基碳二亚胺（191.16g）溶解在DMF（1020.60 g）中直至获得1.25 mol/kg溶液，然后将氮气以2 SCFH鼓过该溶液。
如下制备谷氨酸在DMF中的0.40 mol/kg溶液：将Fmoc-Glu(tBu)-OH（162.85 g）溶解在DMF（755.15 g）中，摇动以溶解，然后将氮气以2 SCFH鼓过该溶液。
如下制备Fmoc-Aib-OH在DMF中的0.40 mol/kg溶液：将Fmoc-Aib-OH（119.50 g）溶解在DMF（798.51 g）中，摇动以溶解，然后将氮气以2 SCFH鼓过该溶液。
如下制备Boc-Tyr(tBu)-OH在DMF中的0.40 mol/kg溶液：将Boc-Tyr(tBu)-OH（123.89 g）溶解在DMF（794.11 g）中，摇动以溶解，然后将氮气以2 SCFH鼓过该溶液。
如下制备反应系统：添加CTC树脂（108 g，0.85 mmol/g，91.8 mmol），在反应器“RB1”、“RB2”和“RB3”之间等分。将350 mL DMF添加到各反应器中并在室温下搅拌2小时以使树脂溶胀。
通用程序A - Fmoc脱保护和DMF洗涤过程: Fmoc脱保护对于所有三个反应器RB1、RB2和RB3并行进行。更具体地，向RB1中加入哌啶溶液（20体积%在DMF中，202.4 g）并用5 mlDMF冲洗哌啶转移管线并开始搅拌。以类似方式，将205.4 g和205.2 g 20体积%哌啶溶液分别添加到RB2和RB3中并冲洗哌啶管线。然后，三个反应器在20℃下同时搅拌120分钟以并行进行脱保护。用于整个TZP四聚体构建的哌啶溶液装料概括在表21中。使用由取样cart支持的在线LC-MS监测脱保护反应。无法定量测定脱保护转化率，因为脱保护的四聚体中间体的质谱由于其低分子量而无法制表。但是，定性验证脱保护完成以确保Fmoc保护的四聚体的提取离子峰为零。
在脱保护后，使用压力传递系统将溶液从所有三个反应器沥出到废物罐。要指出，脱保护后的DMF洗涤使用串联反应器措施进行，即DMF洗涤溶剂首先装载到RB1中，然后转移到RB2和转移到RB3。为了除去树脂中的残留哌啶，用以下详细程序施加10个DMF洗涤周期。对于前5次DMF洗涤，将来自DMF再循环容器的再循环DMF以等分溶剂质量添加到RB1中并搅拌（即再循环容器中的DMF质量等分为5个洗涤周期并装载到RB1中）。在DMF再循环容器排空并且前五次DMF再循环洗涤完成后，为剩余5个洗涤周期装载来自DMF溶剂容器的新鲜DMF。将来自前5个洗涤周期的用过的DMF弃置到废物罐中，而来自剩余5个洗涤周期的用过的DMF溶剂收集到DMF再循环罐中，其再用于下一次氨基酸构建。在整个洗涤周期中施加5分钟搅拌时间。在完成10个洗涤周期后，施加额外的样品cart清洁周期，其中将100毫升新鲜DMF分别装载到三个反应器中。然后将来自RB1和RB2的DMF转移到RB3，其最终收集在DMF溶剂再循环容器中。用于脱保护后的DMF洗涤的材料概括在表22中。使用在线GC测量从最后三个洗涤周期排出的DMF溶液的哌啶浓度，其概括在表23中。在合成的全程将最终残留哌啶浓度控制在500 ppm以下。
表21 用于脱保护的材料
Figure 906641DEST_PATH_IMAGE035
表22 用于脱保护后的洗涤的材料用量
Figure 381484DEST_PATH_IMAGE036
表23 脱保护后的洗涤的残留哌啶浓度
合成周期 AA脱保护 洗涤# PPM
1 Gly 4 9th 无数据
1 Gly 4 10th 无数据
1 Gly 4 样品清洁洗涤 369.1
2 Glu 3 9th 535.7
2 Glu 3 10th 506.1
2 Glu 3 样品清洁洗涤 337.8
3 Aib 2 9th 555.8
3 Aib 2 10th 474.2
3 Aib 2 样品清洁洗涤 409.7
通用程序B –氨基酸活化和偶联过程: 向夹套反应器RA中加入谷氨酸溶液（0.4mol/kg，401.2 g）、oxyma溶液（1.25 mol/kg，128.5 g）、DIC溶液（1.25 mol/kg，141.2 g）。将溶液在20℃下搅拌30min以形成活化谷氨酸溶液并添加到RB1（225.4g）、RB2（225.4g）和RB3（227.4g）中。将反应器RB1、RB2和RB3在20℃下搅拌8小时，除了酪氨酸偶联（其中采用18小时偶联时间）。在达到偶联时间后，使用压力传递将溶液从所有三个反应器沥出到废物罐。在反应结束时，通过Kaiser试验确认偶联完成。用于偶联的材料用量概括在表24中，其详述在构建全程使用的当量比。
对于三个周期，在偶联后以通用程序A中的类似串联反应器方式使用新鲜DMF洗涤反应器RA、RB1、RB2和RB3。更具体地，通过喷雾阀将新鲜DMF溶剂添加到RA中，然后串联进入RB1、RB2和RB3。要指出，以与通用程序A类似的方式进行样品cart 清洁程序。此后，将来自三个DMF洗涤周期和另外的样品cart清洁周期的所有用过的DMF弃置到废物罐中。用于偶联后的DMF洗涤的材料概括在表25中。
表24 用于偶联的材料用量
Figure 409483DEST_PATH_IMAGE037
表25 用于偶联后的洗涤的材料用量
Figure 591066DEST_PATH_IMAGE038
TZP四聚体纯度分析方法
在Boc-Tyr 1偶联后，将树脂从所有三个反应器转移到干燥盘，通过用二氯甲烷洗涤而消溶胀并干燥。四聚体样品用tBu软裂解，Boc保护基保留在肽上，并通过以下方法分析其纯度。对于每500毫克在树脂上的肽，在闪烁瓶中加入10 mL 30%六氟-2-丙醇/二氯甲烷(v/v)。在旋转混合器上混合2小时。过滤并用10 ml二氯甲烷洗涤树脂饼。通过旋转蒸发浓缩成油。该四聚体油用50%乙腈/水(v/v)进一步稀释以供UPLC-MS分析。RB1、RB2和RB3的所得TZP四聚体纯度分别为99.23%、99.58%和99.39%。
用于TZP四聚体合成的分批工艺方法
为了与串联反应器技术进行比较，下面描述在600 mmol下的TZP四聚体分批工艺。要指出，单个分批反应器用于该分批工艺，以代替新技术所用的三个串联的分批反应器，材料用量概括在表26中。
Fmoc-Gly-OH加载
将CTC树脂（500 g）装载到反应器中。该树脂用DMF溶胀并搅拌。将Fmoc-Gly-OH与DMF/DCM一起添加到反应器中并加载2小时。沥出溶液并用DMF洗涤。将DMF/DIPEA/MeOH两次添加到反应器中并沥出以进行封闭（capping）并且各搅拌20分钟。Gly加载的树脂进一步用DMF洗涤。测定加载量为1.2 mmol/g。
Fmoc脱保护
Fmoc脱保护使用两次搅拌的20%哌啶/DMF。对于每次搅拌，使用80分钟反应时间并将脱保护试剂沥出和过滤。在脱保护反应完成后，用6.5体积的DMF洗涤8次，搅拌5分钟。使用四氯醌试验确认脱保护完成。
氨基酸活化
将oxyma溶液（2 eq.，1.25 mol/kg）添加到预活化反应器中，然后与另外的DMF溶剂一起加入氨基酸（2当量）以将氨基酸浓度稀释至0.4 mol/kg。然后将DIC溶液（2.2 eq.，1.25 mol/kg）添加到反应器中以开始活化。对Glu施加2小时活化时间，而15分钟搅拌用于Aib和Tyr。活化过程保持在20℃下。
偶联
将活化酯溶液转移到含有在树脂上的脱保护肽的反应器中。对Glu和Aib施加8小时搅拌时间，而Tyr偶联需要18小时。Kaiser试验用于确认反应完成。一旦偶联完成，沥出偶联溶液并使用3 x 6.5 vol. DMF洗涤除去残留的活化酯。
纯度分析
类似的软裂解（soft cleavage）分析方法与UPLC-MS一起用于测定分批工艺的TZP四聚体样品。测定纯度为99.6%。
表26 在600 mmol规模下用于TZP四聚体合成的制造分批工艺材料用量.
Figure 843056DEST_PATH_IMAGE039
方法比较
对串联反应器技术和分批法获得类似的TZP四聚体纯度（分别为99.3%和99.6%）。对于串联反应器法，每毫摩尔起始树脂使用118.9克总材料（溶剂、试剂，不包括树脂）生产TZP四聚体。在分批法中，每毫摩尔起始树脂施加218.8克总材料（溶剂、试剂，不包括树脂）。总体而言，新型串联反应器法与传统分批法相比能够减少45.7% PMI。
实施例 通过在N-丁基吡咯烷酮/呋喃绿色替代性溶剂中的固相肽合成（SPPS）构 建tirzepatide四聚体
在常规固相肽合成中使用显著量的有毒溶剂，如二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺和二氯甲烷，这对工业卫生和环境保护带来挑战。因此，对开发用于下一代SPPS技术的串联反应器法的具有PMI减少益处的更绿色的替代性溶剂很感兴趣。因为其优异的聚苯乙烯基树脂溶胀性、偶联试剂溶解度以及高偶联和脱保护反应性能，已经从广泛的预筛选研究中选择NBP/呋喃（特别优选四氢呋喃和2-甲基四氢呋喃）双重体系作为替代性绿色溶剂。为了与前一个实施例中使用DMF溶剂的TZP（terzepatide）四聚体合成进行背靠背比较，采用NBP/THF绿色替代性溶剂体系合成tirzepatide四聚体：
Figure 742878DEST_PATH_IMAGE040
。
使用下文描述的串联反应器法构建这种四聚体。氨基酸顺序显示在表27中，其中9-芴甲氧羰基（Fmoc）保护甘氨酸、谷氨酸和2-氨基异丁酸的α-氮，而叔丁氧羰基（Boc）和叔丁基（tBu）分别用于保护酪氨酸α-氮和谷氨酸的氧。要指出，在DMF溶剂实施例中在TZP四聚体合成中制备的Fmoc-Gly-OH加载的CTC树脂（加载量0.85 mmol/g）用于NBP/THF绿色溶剂实施例。详细加载方法可参考前述实施例。下面显示在NBP/THF溶剂体系中在CTC树脂上使用类似的串联反应器法构建其余3个氨基酸。
Figure 371306DEST_PATH_IMAGE041
表27 用于通过SPPS合成Tirzepatide四聚体的4个氨基酸的顺序
氨基酸(AA)添加顺序 肽上的AA位置 AA名称 用于偶联步骤的AA
1 4 甘氨酸 Fmoc-Gly-OH
2 3 谷氨酸 Fmoc-Glu(<i>t</i>Bu)-OH
3 2 2-氨基异丁酸 Fmoc-Aib-OH
4 1 酪氨酸 Boc-Tyr(tBu)-OH
使用NBP/呋喃替代性溶剂的串联反应器法
原材料制备
如下制备哌啶在NBP/THF中的20体积%溶液：通过添加NBP/THF（1.5:1 v:v）将哌啶（2.0 L）稀释至10.0 L的体积，以获得20体积%的溶液。
如下制备oxyma在NBP/THF（2:1，v:v）中的0.72 mol/kg溶液：将(羟基亚氨基)氰乙酸乙酯（oxyma，176.1 g）溶解在NBP:THF（2:1，v:v）（1545.1 g）中以获得0.72mol/kg溶液，然后将氮气以2 SCFH鼓过该溶液。
如下制备DIC在NBP/THF（2:1，v:v）中的0.72 mol/kg溶液：将N,N'-5二异丙基碳二亚胺（172.0 g）溶解在NBP/THF（2:1，v:v）（1721.3 g）中以获得0.72 mol/kg溶液，然后将氮气以2 SCFH鼓过该溶液。
如下制备谷氨酸在NBP/THF（2:1，v:v）中的0.35 mol/kg溶液：将Fmoc-Glu(tBu)-OH（175.8 g）溶解在NBP/THF（2:1，v:v）（1004.5 g）中，摇动以溶解，然后将氮气以2 SCFH鼓过该溶液。
如下制备Fmoc-Aib-OH在NBP/THF（2:1，v:v）中的0.35 mol/kg溶液：将Fmoc-Aib-OH（139.4 g）溶解在NBP/THF（2:1，v:v）（1045.9 g）中，摇动以溶解，然后将氮气以2 SCFH鼓过该溶液。
如下制备Boc-Tyr(tBu)-OH在NBP/THF（2:1，v:v）中的0.45 mol/kg溶液：将Boc-Tyr(tBu)-OH（139.4 g）溶解在NBP/THF（2:1，v:v）（1040.9 g）中，摇动以溶解，然后将氮气以2 SCFH鼓过该溶液。
如下制备反应系统：添加CTC树脂（108 g，0.85 mmol/g，91.8 mmol），在反应器“RB1”、“RB2”和“RB3”之间等分。将350 mL NBP/THF（1.5:1，v:v）添加到各反应器中并在室温下在20℃下搅拌1小时以使树脂溶胀。
通用程序A - Fmoc脱保护和NBP/THF洗涤过程: Fmoc脱保护对于所有三个反应器RB1、RB2和RB3在30℃下和在NBP/THF（1.5:1，v:v）中的20%哌啶溶液中并行进行特定时间量。然后将溶液沥出到废物罐并装载另外的哌啶溶液以进行脱保护搅拌，直至反应完成。更具体地，对于以Fmoc-Gly-OH为例的第一次脱保护搅拌，向RB1中加入哌啶溶液（20体积%在NBP/THF（1.5:1，v:v）中，209 g）并用5 ml NBP/THF（1.5:1，v:v）溶剂混合物冲洗哌啶转移管线并开始搅拌。以类似方式，将208.8 g和205 g 20体积%哌啶溶液分别添加到RB2和RB3中并冲洗哌啶管线。然后，三个反应器在30℃下搅拌45分钟以并行进行脱保护，此后沥出溶液。将在线LC-MS取样并定性验证Fmoc保护的四聚体的提取离子峰是否为零以确认反应完成。为了将Fmoc-Gly-CTC完全脱保护，向RB 1/2/3施加另外5次并行脱保护搅拌。对Glu 3和Aib 4脱保护采用类似的脱保护搅拌策略，进行两次脱保护搅拌，表28概括用于整个TZP四聚体构建的哌啶溶液装料。
NBP/THF（1.5:1，v:v）溶剂混合物在30℃下用于反应后的洗涤，采用类似的串联反应器和溶剂再循环策略。更具体地，在TZP四聚体构建的全程用10个NBP/THF洗涤周期洗涤RB1/2/3。将再循环容器中的用过的NBP/THF溶剂等分为5次装料，并序贯添加到RB1/2/3以用于前五个洗涤周期，每次搅拌5分钟。所有前五个用过的NBP/THF溶剂在使用后弃置到废物罐中。对于剩余5次洗涤，新鲜NBP/THF用于RB 1/2/3串联洗涤并收集到NBP/THF再循环容器中以准备用于下一次氨基酸脱保护后洗涤。最后，作为样品cart清洁周期，将NBP/THF以各100毫升装载到三个反应器中，并进一步收集到再循环容器中。表29概括用于脱保护后的洗涤的质量平衡，表30详述在合成全程的残留哌啶浓度，其对于所有周期都低于600 PPM。
表28 用于在30℃下脱保护的材料
Figure 672974DEST_PATH_IMAGE042
表29 用于脱保护后的洗涤的材料用量
Figure 33548DEST_PATH_IMAGE043
表30 脱保护后的洗涤的残留哌啶浓度
合成周期 AA脱保护 洗涤# PPM
1 Gly 4 9th 不可得
1 Gly 4 10th 不可得
1 Gly 4 样品清洁洗涤 416
2 Glu 3 9th 499
2 Glu 3 10th 无数据
2 Glu 3 样品清洁洗涤 348
3 Aib 2 9th 593
3 Aib 2 10th 506
3 Aib 2 样品清洁洗涤 不可得
通用程序B –在NBP/THF中的氨基酸活化和偶联过程: 对于活化和偶联反应，将NBP/THF体积比调节到2:1以实现更好的试剂溶解度。以Fmoc-Glu(tBu)-OH偶联为例，将谷氨酸溶液（0.35 mol/kg，786.4 g）、oxyma溶液（0.72 mol/kg，382.4 g）和DIC溶液（0.72mol/kg，420.6 g）添加到夹套反应器RA中并在30℃下搅拌70min以形成活化谷氨酸溶液并分别转移到RB1（531.9g）、RB2（529.7g）和RB3（533.9g）中。将反应器RB1、RB2和RB3在30℃下搅拌8小时，此后将溶液从所有三个反应器沥出到废物罐。在反应结束时，通过Kaiser试验检查偶联完成。由于Glu偶联在第一个偶联步骤后没有完成，进一步加入1.5当量比的Fmoc-Glu(tBu)-OH活化溶液以进行另外19小时偶联直至Kaiser试验通过。但是，剩余的Aib 2和Tyr 1偶联仅采用1个偶联步骤，搅拌时间分别为8小时和18小时。表31概括在偶联过程中的详细材料使用。
对于使用NBP/THF（1.5:1，v:v）溶剂的偶联后洗涤，采用三个洗涤周期以冲洗RA、RB1、RB2和RB3。更具体地，通过喷雾阀将新鲜NBP/THF溶剂装载到RA中，然后串联进入RB1、RB2和RB3三次。进行与脱保护后洗涤类似的样品cart清洁程序。所有用过的偶联后溶剂弃置到废物罐中。用于偶联后的NBP/THF洗涤的材料概括在表32中。
表31 用于偶联的材料用量
Figure 485914DEST_PATH_IMAGE044
表32 用于偶联后的洗涤的材料用量
Figure DEST_PATH_IMAGE045
结果概要
在Boc-Tyr 1偶联后，树脂用二氯甲烷洗涤并干燥。样品然后用30%六氟-2-丙醇/二氯甲烷（v/v）软裂解并分离以供UPLC-MS分析。RB1、RB2和RB3的所得TZP四聚体纯度分别为92.19%、94.64%和98.04%。主要杂质是谷氨酸添加。这主要归因于该实施例中采用的两次谷氨酸偶联策略。要指出，在Fmoc-Gly-CTC脱保护前较长的树脂溶胀时间（> 8小时）可缓解Gly 4脱保护和Glu 3偶联的挑战。例如，在1 mmol规模下使用NBP/2-MeTHF（1.5:1，v:v）绿色溶剂用12小时树脂溶胀获得99.6% TZP四聚体纯度。因此，在更优化的工艺条件下，使用NBP/呋喃绿色溶剂和串联反应器技术可实现显著的肽纯度改进。对于使用NBP/THF绿色溶剂的串联反应器法，每毫摩尔起始树脂使用252.71克总材料（溶剂、试剂，不包括树脂）生产TZP四聚体。使用DMF的常规分批法使用218.8 g/mmol，使用DMF的串联反应器法使用118.9mmol。使用NBP/THF的程序是新的并且未优化的，其使用的总溶剂多于使用DMF的程序。但是，对于任一溶剂体系，串联反应器仍使用比单个分批反应器少的溶剂。

Claims (41)

1.用于将氨基酸“X”偶联到附着于肽合成树脂的受保护N-基团上的方法，其包括：
获得第一反应器和第二反应器，第一反应器和第二反应器各自含有一定量的附着于肽合成树脂的受保护N-基团；
将第一量的脱保护试剂添加到第一反应器中；
将第一量的脱保护试剂从第一反应器中除去；
将第一量的脱保护试剂添加到第二反应器中；
将第二量的脱保护试剂添加到第一反应器中；
将第一量的脱保护试剂从第二反应器中除去；
将第二量的脱保护试剂从第一反应器中除去；
将第二量的脱保护试剂添加到第二反应器中；
将第二量的脱保护试剂从第二反应器中除去；
用溶剂洗涤第一和第二反应器中的肽合成树脂；
将第一量的氨基酸“X”活化酯添加到第一反应器中；
将第一量的氨基酸“X”活化酯从第一反应器中除去；
将第一量的氨基酸“X”活化酯添加到第二反应器中，
将第二量的氨基酸“X”活化酯添加到第一反应器中；
将第一量的氨基酸“X”活化酯从第二反应器中除去；
将第二量的氨基酸“X”活化酯从第一反应器中除去；
将第二量的氨基酸“X”活化酯添加到第二反应器中；
将第二量的氨基酸“X”活化酯从第二反应器中除去；和
用溶剂洗涤第一和第二反应器中的肽合成树脂。
2.权利要求1的方法，其中第一和第二量的氨基酸“X”活化酯中存在的氨基酸“X”本身具有受保护N-基团。
3. 前述权利要求任一项的方法，其进一步包括：
将第一量的脱保护试剂添加到第三反应器中，其中这种添加在将第一量的脱保护试剂从第二反应器中除去后进行，其中第三反应器含有一定量的附着于肽合成树脂的受保护N-基团；和
将第二量的脱保护试剂添加到第三反应器中，其中这种添加在将第二量的脱保护试剂从第二反应器中除去后进行。
4. 权利要求3的方法，其进一步包括：
将第一量的氨基酸“X”活化酯添加到第三反应器中，其中这种添加在将第一量的氨基酸“X”活化酯从第二反应器中除去后进行；和
将第二量的氨基酸“X”活化酯添加到第三反应器中，其中这种添加在将第二量的氨基酸“X”活化酯从第二反应器中除去后进行。
5. 权利要求4的方法，其进一步包括：
将第三量的脱保护试剂添加到第一反应器中，其中在已经将第二量的脱保护试剂从第一反应器中除去后将这种第三量的脱保护试剂添加到第一反应器中；和
将第三量的脱保护试剂从第一反应器转移到第二反应器，其中这种转移在将第二量的脱保护试剂从第二反应器中除去后进行；和
将第三量的脱保护试剂从第二反应器转移到第三反应器；和
将第三量的脱保护试剂从第三反应器中除去。
6.权利要求5的方法，其进一步包括：
将第三量的氨基酸“X”活化酯添加到第一反应器中，其中这种添加在将第二量的氨基酸“X”活化酯从第一反应器中除去后进行；
将第三量的氨基酸“X”活化酯转移到第二反应器，其中这种转移在将第二量的氨基酸“X”活化酯从第二反应器中除去后进行；
将第三量的氨基酸“X”活化酯从第二反应器转移到第三反应器；和
将第三量的氨基酸“X”活化酯从第三反应器中除去。
7. 权利要求6的方法，其进一步包括：
将第一量的氨基酸“X”活化酯从第三反应器中除去；和
将第一量的氨基酸“X”活化酯添加回第一反应器。
8. 权利要求7的方法，其进一步包括：
将第一量的脱保护试剂从第三反应器中除去；和
将第一量的脱保护试剂添加回第一反应器。
9.前述权利要求任一项的方法，其进一步包括将第一和第二反应器溶胀。
10.前述权利要求任一项的方法，其中将第一量的氨基酸“X”活化酯和第二量的氨基酸“X”活化酯与溶剂预混。
11.前述权利要求任一项的方法，其中通过将溶剂添加到反应器中而进行用溶剂洗涤第一和第二反应器。
12.权利要求2的方法，其中在已经将第二量的氨基酸“X”活化酯从第一反应器中除去后，所述方法进一步包括：
将第一追加量的脱保护试剂添加到第一反应器中；
将第一追加量的脱保护试剂从第一反应器转移到第二反应器；
将第二追加量的脱保护试剂添加到第一反应器中；
将第一追加量的脱保护试剂从第二反应器中除去；
将第二追加量的脱保护试剂从第一反应器转移到第二反应器；
将第二追加量的脱保护试剂从第二反应器中除去。
13.权利要求12的方法，其中在将第二追加量的脱保护试剂从第一反应器中除去后，进一步包括：
将第一量的氨基酸“Z”活化酯添加到第一反应器中；
将第一量的氨基酸“Z”活化酯转移到第二反应器；
将第二量的氨基酸“Z”活化酯添加到第一反应器中；
将第一量的氨基酸“Z”活化酯从第二反应器中除去；
将第二量的氨基酸“Z”活化酯从第一反应器转移到第二反应器；和
将第二量的氨基酸“Z”活化酯从第二反应器中除去。
14. 权利要求13的方法，其进一步包括：
将第一追加量的脱保护试剂添加到第三反应器中，其中这种添加在将第一追加量的脱保护试剂从第二反应器中除去后进行，其中第三反应器含有一定量的氨基酸“X”活化酯的受保护N-基团；和
将第二追加量的脱保护试剂添加到第三反应器中，其中这种添加在将第二量的脱保护试剂从第二反应器中除去后进行。
15. 权利要求14的方法，其进一步包括：
将第一量的氨基酸“Z”活化酯添加到第三反应器中，其中这种添加在将第一量的氨基酸“Z”从第二反应器中除去后进行；和
将第二量的氨基酸“Z”活化酯添加到第三反应器中，其中这种添加在将第二量的氨基酸“Z”活化酯从第二反应器中除去后进行。
16.前述权利要求任一项的方法，其中第一和第二反应器中的肽合成树脂是Seiber或Rink树脂。
17.前述权利要求任一项的方法，其中第一和第二反应器中的肽合成树脂是Wang树脂或CTC树脂。
18.前述权利要求任一项的方法，其中添加的氨基酸X的量为1.1至1.6当量。
19.将氨基酸“X”偶联到附着于第一反应器和第二反应器中存在的肽合成树脂的受保护N-基团上的方法，其包括：
将第一量的脱保护试剂添加到第一反应器中；
将第一量的脱保护试剂从第一反应器中除去；
将第一量的脱保护试剂添加到第二反应器中；
将第二量的脱保护试剂添加到第一反应器中；
将第一量的脱保护试剂从第二反应器中除去；
将第二量的脱保护试剂从第一反应器中除去；
将第二量的脱保护试剂添加到第二反应器中；
将第二量的脱保护试剂从第二反应器中除去；
将第一量的氨基酸“X”活化酯添加到第一反应器中；
将第一量的氨基酸“X”活化酯从第一反应器中除去；
将第一量的氨基酸“X”活化酯添加到第二反应器中；
将第二量的氨基酸“X”活化酯添加到第一反应器中；
将第一量的氨基酸“X”活化酯从第二反应器中除去；
将第二量的氨基酸“X”活化酯从第一反应器中除去；
将第二量的氨基酸“X”活化酯添加到第二反应器中；和
将第二量的氨基酸“X”活化酯从第二反应器中除去。
20.权利要求19的方法，其中第一和第二量的氨基酸“X”活化酯中存在的氨基酸“X”本身具有受保护N-基团。
21.权利要求18或19的方法，其进一步包括：
将第一量的脱保护试剂添加到第三反应器中，其中这种添加在将第一量的脱保护试剂从第二反应器中除去后进行，其中第三反应器含有一定量的附着于肽合成树脂的受保护N-基团；
将第一量的脱保护试剂从第三反应器中除去；
将第二量的脱保护试剂添加到第三反应器中，其中这种添加在将第二量的脱保护试剂从第二反应器中除去后进行；
将第三量的脱保护试剂添加到第一反应器中，其中在已经将第二量的脱保护试剂从第一反应器中除去后将这种第三量的脱保护试剂添加到第一反应器中；和
将第三量的脱保护试剂从第一反应器转移到第二反应器，其中这种转移在将第二量的脱保护试剂从第二反应器中除去后进行；
将第三量的脱保护试剂从第二反应器转移到第三反应器；
将第一量的氨基酸“X”活化酯添加到第三反应器中，其中这种添加在将第一量的氨基酸“X”活化酯从第二反应器中除去后进行；
将第一量的氨基酸“X”活化酯从第三反应器中除去；
将第二量的氨基酸“X”活化酯添加到第三反应器中，其中这种添加在将第一量的氨基酸“X”活化酯从第三反应器中除去后进行；和
将第二量的氨基酸“X”活化酯从第三反应器中除去。
22.权利要求21的方法，其进一步包括：
将第三量的氨基酸“X”活化酯添加到第一反应器中，其中这种添加在将第二量的氨基酸“X”活化酯从第一反应器中除去后进行；
将第三量的氨基酸“X”活化酯转移到第二反应器，其中这种转移在将第二量的氨基酸“X”活化酯从第二反应器中除去后进行；
将第三量的氨基酸“X”活化酯从第二反应器转移到第三反应器；
将第三量的氨基酸“X”活化酯从第三反应器中除去；
将第一量的氨基酸“X”活化酯添加回第一反应器，其中第一量的氨基酸“X”活化酯的这种添加在将第一量的氨基酸“X”活化酯从第三反应器中除去后进行。
23.将氨基酸“X”偶联到附着于肽合成树脂的脱保护N-基团上的方法，其包括：
获得第一反应器和第二反应器，第一反应器和第二反应器各自含有一定量的附着于肽合成树脂的脱保护N-基团；
将第一量的氨基酸“X”活化酯添加到第一反应器中；
将第一量的氨基酸“X”活化酯从第一反应器中除去；
将第一量的氨基酸“X”活化酯添加到第二反应器中；
将第二量的氨基酸“X”活化酯添加到第一反应器中；
将第一量的氨基酸“X”活化酯从第二反应器中除去；
将第二量的氨基酸“X”活化酯从第一反应器中除去；
将第二量的氨基酸“X”活化酯添加到第二反应器中；和
将第二量的氨基酸“X”活化酯从第二反应器中除去。
24. 权利要求23的方法，其进一步包括用溶剂洗涤第一反应器和第二反应器。
25.权利要求22或23的方法，其进一步包括
将第一量的氨基酸“X”活化酯添加到第三反应器中，其中这种添加在将第一量的氨基酸“X”从第二反应器中除去后进行，其中第三反应器含有一定量的附着于肽合成树脂的受保护N-基团；
将第一量的氨基酸“X”活化酯从第三反应器中除去；和
将第二量的氨基酸“X”添加到第三反应器中。
26. 权利要求25的方法，其进一步包括：
将第三量的氨基酸“X”添加到第一反应器中，其中在已经将第二量的氨基酸“X”从第一反应器中除去后将这种第三量的氨基酸“X”添加到第一反应器中；和
将第三量的氨基酸“X”从第一反应器转移到第二反应器，其中这种转移在将第二量的氨基酸“X”从第二反应器中除去后进行。
27.权利要求26的方法，其进一步包括：
将第二量的氨基酸“X”从第三反应器中除去；
将第三量的氨基酸“X”从第二反应器转移到第三反应器；
将第三量的氨基酸“X”从第三反应器中除去；和
将第一量的氨基酸“X”添加回第一反应器，其中在已经将第一量的氨基酸“X”脱保护试剂从第三反应器中除去后将第一量的氨基酸“X”添加回第一反应器。
28.将附着于肽合成树脂的受保护N-基团脱保护的方法，其包括：
获得第一反应器和第二反应器，第一反应器和第二反应器各自含有一定量的附着于肽合成树脂的受保护N-基团；
将第一量的脱保护试剂添加到第一反应器中；
将第一量的脱保护试剂从第一反应器中除去；
将第一量的脱保护试剂添加到第二反应器中；
将第二量的脱保护试剂添加到第一反应器中；
将第一量的脱保护试剂从第二反应器中除去；
将第二量的脱保护试剂从第一反应器中除去；
将第二量的脱保护试剂添加到第二反应器中；和
将第二量的脱保护试剂从第二反应器中除去。
29.权利要求28的方法，其进一步包括用溶剂洗涤第一反应器和第二反应器。
30.权利要求28或29的方法，其进一步包括：
将第一量的脱保护试剂添加到第三反应器中，其中这种添加在将第一量的脱保护试剂从第二反应器中除去后进行，其中第三反应器含有一定量的附着于肽合成树脂的受保护N-基团；
将第一量的脱保护试剂从第三反应器中除去；和
将第二量的脱保护试剂添加到第三反应器中，其中这种添加在将第二量的脱保护试剂从第二反应器中除去后进行。
31. 权利要求30的方法，其进一步包括：
将第三量的脱保护试剂添加到第一反应器中，其中在已经将第二量的脱保护试剂从第一反应器中除去后将这种第三量的脱保护试剂添加到第一反应器中；和
将第三量的脱保护试剂从第一反应器转移到第二反应器，其中这种转移在将第二量的脱保护试剂从第二反应器中除去后进行。
32.权利要求31的方法，其进一步包括：
将第二量的脱保护试剂从第三反应器中除去；
将第三量的脱保护试剂从第二反应器转移到第三反应器；
将第三量的脱保护试剂从第三反应器中除去；和
将第一量的脱保护试剂添加回第一反应器，其中在已经将第一量的脱保护试剂从第三反应器中除去后将第一量的脱保护试剂添加回第一反应器。
33.用于将附着于肽合成树脂的受保护N-基团脱保护的系统，其包含第一反应器和第二反应器，第一反应器和第二反应器各自含有一定量的附着于肽合成树脂的受保护N-基团。
34.用于将氨基酸“X”偶联到附着于肽合成树脂的脱保护N-基团上的系统，其包含第一反应器和第二反应器，第一反应器和第二反应器各自含有一定量的附着于肽合成树脂的受保护N-基团。
35.用于将氨基酸“X”偶联到附着于肽合成树脂的脱保护N-基团上的系统，其包含第一反应器和LCMS装置，其中所述系统从反应器中自动取样浆料，并将肽从树脂上裂解和将官能团脱保护。
36.如权利要求35中的系统，其中在反应开始、中间或结束时从反应器中输出样品。
37.如权利要求35中的系统，其中在反应开始、中间和结束时从反应器中输出样品。
38.如权利要求35中的系统，其中所述反应器是分批反应器。
39.如权利要求35中的系统，其中所述系统不使用Kaiser试验。
40.如权利要求35中的系统，其中所述系统也将裂解肽溶液在液相色谱稀释剂中稀释，将溶液输送到液相色谱进样环路，和将废树脂珠从裂解反应器冲洗到废物中。
41.如权利要求40中的系统，其中所述溶液液相色谱进样环路不含气泡。
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